ab initio structure predictions using a hierarchical approach applied to 434 cro and the drosophila...

7
Abstract. A discrete-state ab initio protein structure prediction procedure is presented, based on the assump- tion that some proteins fold in an hierarchical way, where the early folding of independent units precedes and helps complete structure formation. It involves a ®rst step predicting, by means of threading algorithms and local structure prediction methods, the location of autonomous protein subunits presenting favorable local and tertiary interactions. The second step consists of predicting the structure of these units by Monte Carlo simulated annealing using several database-derived po- tentials. In a last step, these predicted structures are used as starting conformations of additional simulations, keeping these structures frozen and including the com- plete protein sequence. This procedure is applied to two small DNA-binding proteins, 434 cro and the Drosophila melanogaster homeodomain that contain 65 and 47 residues, respectively, and is compared to the nonhier- archical procedure where the whole protein is predicted in a single run. The best predicted structures were found to present root-mean-square deviations relative to the native conformation of 2.7 A Ê in the case of the home- odomain and of 3.9 A Ê for 434 cro; these structures thus represent low-resolution models of the native structures. Strikingly, not only the helices were correctly predicted but also intervening turn motifs. Key words: Protein folding ± Monte Carlo simulated annealing ± Database-derived potentials 1 Introduction Ab initio protein structure prediction, where the only input is the amino acid sequence, is still a largely unsolved problem, despite many interesting approaches and progresses. The diculty resides in the enormous size of the conformational space to be explored, which excludes an exhaustive search, and in the imperfectness of the potentials used to evaluate the free energy of the conformations generated. The problem is that the more simpli®cations are made to reduce the conformational space and thus to render the problem more tractable, the less precise the potentials and thus the predictions become. The most accurate approach, at least in principle, consists of solving numerically the classical equations of motion for all atoms in a protein, using semiempirical potentials to evaluate the interactions between the atoms. However, besides the imperfectness of the potentials and the problems related to numerical integration over large timescales, the main obstacle for such molecular dynamics simulations is the astronomical computer time needed. These simulations are thus, and will probably remain for a long time, restricted to small systems and supercomputers [1]. There is thus a need for faster ab initio prediction methods, whose purpose is to yield low-resolution 3D structures that could be re®ned afterwards by more ac- curate procedures, such as restricted molecular dynamics simulations. This need is quite crucial as the number of sequences determined grows much faster than the number of structures determined. Such ab initio prediction methods have been developed for several decades, devising and exploiting diverse tech- niques. To reduce the conformational space to be ex- plored, hierarchical approaches have been developed. One of them consists of predicting ®rst the secondary structures and then their assembly into a compact fold [2±4]; however, it suers from the fundamentally limited scores of secondary structure predictions [5]. The buildup procedure is another type of hierarchical approach. It predicts the lowest free-energy conformations of small segments and assembles them to reconstruct the full pro- tein [6±8]; its limited success is in part due to its assump- tion that all protein regions are dominated by local interactions along the sequence. Promising extensions of this approach have been developed in which both local Correspondence to: D. Gilis e-mail: [email protected] Contribution to the Symposium Proceedings of Computational Biophysics 2000 Regular article Ab initio structure predictions using a hierarchical approach applied to 434 cro and the Drosophila homeodomain Dimitri Gilis, Marianne Rooman IngeÂnierie BiomoleÂculaire, Universite Libre de Bruxelles, CP 165/64, 50 av. Roosevelt, 1050 Bruxelles, Belgium Received: 6 July 2000 / Accepted: 8 September 2000 / Published online: 21 December 2000 Ó Springer-Verlag 2000 Theor Chem Acc 2001) 106:69±75 DOI 10.1007/s002140000221

Upload: dimitri-gilis

Post on 10-Jul-2016

212 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

��������� � ������������ � ����� �� ���� ����������������� � �� ������ �� ���������� ���� � ��� ������� � ��� � �� �� ����� � �� �� � ���������� �������� ��� ���� � ����� � ����������� ����� ���������� ����� � ������ ��������� � ���� �� �� ��� ���� ���� ���� ����������� �� ���� � �������� �� �������� � �� ��������� �������� � ���� ��� ��� � ��� � ��� � � �� �� ���� �������� ���������� �� ���� � ���� ������� �������� ��� ��� ��� �� ���� � ������ ����������� ��� ��������� � ����� ����� �� � ��� ��� �������� ������� ����� ������ ������������ � �������� �� ��� ����� ����� ��������� ���������� �� ����� ������� � �� ���� �� � ����� �� ������� ���������� ����� ���������� �� �� �� ��������� ��� � ������ �� ���� ��!������ ���� �� ������ �� ������ � �� ���� "#�������� �� ������ $%$ �� �� ��� ������������� ���� � �� � ��� ��� � ���� &' �� $(��������� ������������� �� �� � ����� � ��� � ����������� �� ������ ����� ��� �� �� �� ���� �� ����������� ������ ���� ��� ���� ��������� ���������� ���� � ���� ������� � �����!��� ������ �� ������� � �������� � �� ���� � � )�( �* �� ��� ��� � ��� � �� � ��� �� � %�+ �* � � $%$ �� , ����� ���������� ������������� � ���� ���� � � ���� � ��� ����� �����������-���������� � � ��� ��� ������� ���� � ������� ������������ �� ����������� ���� � �����

� � ���� .� ���� � ����� / � ��� ��� ��������������� / "����������� � �������

� ���� ����� �

�� ����� �� ���� ��������� �������� �� ����� ��� �������� �� ��� ��� ��� ��!������ �� ����� ������

��� ���� �� ����� ������� ��� ����������� ��� ������ �� �������� ��� ��0����� ������� �� ��� �� �� ���� � � ��� � �� ���� �� ���� � �� �1�� ���� ������1������ � �1������� ������ �� �� ��� ������������� � ��� � ������� ���� � ������ ��� ���� ������ � ���� �� ���� �� ��������� ��� �� ���� �� ��� ��� � ������������ �� �� ��� � ������ ��� � �� ���� ������ �� ���� � ������ ��� �� ���� � �� ����������� ���� ������� ��� � ������� �� ���� ��� �������� ����� ��� ��� � �� ������ ��� ��� � ���� ������������ � ������ � � ����� ���������� ��� ��������!��� �� � � �� � � � �� � �� �� �� ����� ����������������� � ������� � ������ ��� �������� ��������� ��� � ��� 2 ������ ������� ��� ������������� � ��� � ������� �� ��� �� ����� ������ � ���������������� � ��� ���� ���������� ��� ��� ������ � ����� � ������ ������� ������� �� �� ��� ��� � ����� ������ ���� ������� ����� ������� �� �� ����� ������ �� ���� ����� � � � �� ����� ���������� � ����������� �� ������ ������� 345�

����� �� ���� ���� � � ����� � ����� �������� ����� ��� �� �� ���� �� �� � ����� � ���� ���� � %"���������� ��� � ��� �� ������ �������� �� � �� ������ �� �������� ���� � ���������� � ������ �������������� ��� ���� ���� �� !���� ������ � ��� ������ � ��!������ ���������� �� �� ���� ����� ��� ��������� � ���������� �����������

-��� � ����� �������� ����� �� ��� ���� ����� ���� � ������ ������� �������� �� �1�� ����� ������� ������!���� � ������ ��� � �� ���� �� ���� � �� �1�� ���� ���������� ��� ���� ��� ���� ����� ����6�� � ���� � ������ � ���������� ���� ��� ��� �������������� �� ���� ����� ������� ��� � ���� � ��3)/$5, � ������ �� ��7��� �� � ��� ����������� ��������� ��� � ��� ���� ��������� �������� �� 3'5� ��� ��������� ������ �� � ���� ���� � ���������� ��� ��� ���������� ��� � ���� ���������� � �� ���� �� � ������������ �� �������� ���� � ��� ������� ��� ���� �� ���� 3&/85, ��� ������� ������� �� �� ��� ��� � ��� ������� � ��� �� �� ���� ���� �� �� � ������ �� � ���������� �� � �� ��� ��!������ .� ������ �1����� �� ����� ��� �� ��� ���� ����� ��� �� ����� � �� � ��

�������������� ��9 "� :��������9 ������;��������

� �������� � � ��� -��� ���� .� �������� � � ������ ��<� ������� )===

�� ��� ������

�� ����� �������� ������� �� ����� � ����������� ���� ��� ������� ��� �� ��� �� ��������� � � � ����

������� ������ ������� ���

����> ������ <� � ��> ������� ?���������> @���� �� <��1������ �. 4&'A&$� '= �� B ������� 4='= <��1������ <������

B�������9 & C��� )=== A��������9 8 -�������� )=== A .�������� �����9 )4 "������� )===� -�������D���� )===

��� � ���� ��� E)==4F 4=&9&+/('"6� 4=�4==(A�==)4$====))4

�� � �� �� �������� �� �� ���� ��� �� ��� 3+5 ���������� � ����� � ����� � ��������� � ������ �������� ����� ������� ������� �� � �������� ���� � 34=5�

# ����������� ��� ���� ���� ����� ��� � �� ���� �� ���� � �� ������� � ������ ������� ������� �� ���� ��������� ������ ������ �� �� �� ���� 3445���� � �� ���� ���� ������� ������!�� �� � ��� ��� E��F 34)5� �� ����� ���� � ��� �� �������� ��� ����� ������� � ��G����� �� ����� � ��� < �� ��������� 34%/4(5� � ����� ������� �� � �� ������ �������� ������� 3485� � �������� � ������� ��������� �������������� �� ���� ���� ���� 34+/))5� �� ���������� ����� ��� � ��� � � ����� �� � � �� ���� �� ����� ������� �� ����� 3)%� )$5� ��� � �� ���� �� ������ �� �� ������� �� ������ ��� �� ���� � ������� 34$�)'� )&5� �� ����� � �������� � ������� � ����� � ��� ���� ���������� 3))� )(� )85� � �� ��������� ���������������� �� � �������� ��!����� ��������� 3)(5�

��� ���� ������ � ����� � ����� ���� �� �� ��� ������ ��� ����� �������� ������� ��� ��������� ���� ����� �������� �� ���� ���� ������ ��� ��-. ���������� 3)+5 �������� ��� �1���� �� ���� ��������� � �������� ��� ��� ��� � ��� �� !���� ������ �� � �������� ����������� 6��� � � � �� �� ���� �������� ����� � �������� �� � ���� � � ��� ��� �� ���� �� � ���� �!��� E���F ������ �� � ���� ��� $ �� ' �* � ��������� � )' �� $= ��������� ������������� ��� ������������ ���� ����� ���� ������� �� ����� �� ��������� ������ ���� ����� �� ����� � ������� � ���������� �� �� ����� ����� ���� � � ��� ���� �� ������� �������

�� ���� ������ �� ��� �� � ����� �������� �� � �� ���� �� ����� ����� ���������� �� ������ ��� ����� �� ���������� � ��� ��� �� � B��� 34=5� ���������� ������� �� ������������ � ����������� �� ����� � �������� �� "#�������� �� ����� ���� ����1��������1 E2�2F ����� $%$ �� � �� � �� � ���� H� ���� � ��� � ��� �� ������ ��� ��� �� ������ ��� �� ���������� �������� � � �� �� �� �����,���� ���� �� � �������� ����������

! "������ � �� � � �

��� �������� � �� � � � ���� ���� �� ����� ��� �������� ������ ��� ���� �� � �������� ����������� � ����������� ����� �� � �� � ���� ����� �� ��� ������ ��������� �� ���� ��� ���� � ��� ���� �� �� ������ � � �� � ��� ��������� � ��� � ����� �� ����, �� ���� ������ � ������ ����� � �� �� 3%=5� ����� ����� ��������� ����� �� � ����� ��� ���� ��������� ��������,���� � �������� ������ ��� �� �� ��!����� � ��� ���� ��� ��� �� ���� � ������ � ���� ����� �� ��������������� ������� �� � ��� � �� �� ����� � ������ �� � ������������ � ������� ���������� � �� ��������� �������� ��� ��� ���������� � ����� ���� �� ����� �� ���� ��� ������� �� B��� 3%45� �� ��� � �� �� �� � � � ��� ��� �� �� ��!������ ����� �� ��� ������� � ������ � ����������� ��� ��������� ��!����� ������� I����� ��������� �� ���� ����� �� ��������������� ������� �� � ��� ���������� ��!������ �����

������� ��� ��������� � �� � ��������� �� ��� �������7����� ����� �� ������� �����

���� �� � � � �� ���� � ��� ������� � ��� � ����� �� �� ����� � �� ������������� ���� � �� �� ������������ � ����� ���� �� � ����� � ���� ������ ���������� � �� / ��� ������ / �������� � ��� ����� ������� � ��� ���� �� �������� # �� ��� ������ ������ ��� �� ����� �� � ���� ������ � ��������� ���������� � �� ��� ��� �� ���� � � � ������ ���� ���� �����

J � � ����� �� �� �� ���� � ����������� �������� ��� �� ���� ����� �� �������� ������� �������� � ��� �� �� �� ���� ��!������

� �����#���� � $ ���������� ����� ����� %$ �� ��&

� �������� � ������ � �� ��� �� ��� � ������ � �� ����������� �������� � ���� �� �� � �� ��� ����� ��� �������� ��!������ �� ���� � �� �� ������� �������� ��� H� �������� ����� � � � �� �� ����� �� � ����� ��� ���� ��������� ��������� ������ ������ ���������� ��� ����0����� �������� �� �������� � �� �������� � �������� �� ����� � ���� ����� � ����������� � �� ��� J � ��� ���������� � ��� �� ������� ���������� �������� � � �� �� � ��������� � ��� ������������� �������� ��� �� � ��������� � �� �����!������

��� � ����������� �������� � ���� �� ���� ��.������ �� J���� 3%)5� ����� �� ���� ���������� ����������� � ������� � E�� �� �F � ����, ����� � ������ �� <� .� :� K� �� 6 �� � ��������� ������ �� ��������� � J��� 4� ����� �� � �� ���� � � �� ���������� �� ������������ .������ �������� �� ��� � ���� ����

'��� �� -�������� �������� � � �B6 �� 2 �� " ����� ����� ���� .������ �� J���� 3%)5� ��� ��� ��� ��!����� �� ������� ��� ���� ����� ��� ��1� ����� ����� ������� � ���� �� E�� �� �F� ��� � ����� ����� ��� �������� � �� �� �� <� .� :� K� �� 6 3%)5����� L ��������� ������������ E�� �� �F ������ 6 ������������� � �� ���� �� E� � =�F �� ��� ���� ��1 � ���� ����� �� ���� �� E� � 48=�F� � �� � ��������� � �� %4=������� �� ���� ��� ������������� < �� . �1������ ����� �� � ���� �������� � �� ���� ��� �� : �� K � ������ � � �� ���� ������ ����������� � �A� �� <A.� ��� ���� � ����� ����� ������ ����� ��� E�� �� �F � ���� �� ��� ����� ���������� ��� ��� ����� �������� �� � .������ �� ��� ����� ��� �������� �� � J������� ��� J���� �������� ��� � �� ������� ���� �� ���� �� ��� ���������� ��, �� ��� �����!���� ����� ��� �������� � ��� �������� �� ������� � ������ ������� = �� +� ���� ����� � ����� �� � � �������, ����� ������� � �� ��� � "--. 3$'5 ���������� � � ������ � � �� � ��� E�� �� �F ����� ����� �� ��� � � ��� �� �� ���� �

(=

������ � �� ���� �� � ����� ��!����� � ��� ���� ������������� � ��� � � ������� ���������� � �� �������� �� � �� ��� ���� E��� -���� $F �� ����� ����� ������ � � ��������� ���� ������� J���� ���� ���.������ �������� �� � �������� ��� ���� ��������� ��������� ��� �������� � ��� �������� �� �� ������� �� �������� ������� = �� + ����� � �������� -������� �������� � ������� ����� �� ������ � � �� ���������� �� ���� � ���� �1����� �� � ��� ���� � ��� ���� �� �� � ���� � ��� ���� ��������� � ��� � ����� �� ����3%)/%$5� ���� �������� � ����� �� � ������ � �1������ ������� � ���� ��� �������� � � ����� ��� ������ � � ������� �������� ��� �� ������� ��� ������ ��������� ���� �������� �� ������������ ��0����� � �������� ��� � �� ���� �� ���� �� � �������� ���� ���� � � ��� � �� ��

��� � �� ��� ����� � �� ������ ���� �� ����� ���J B� 3%'5� �� �� ����� �� �������� ��� ����� ��!����� �� ����� � �� �� �� ���� ���������� �� �� ��������� ��� ��!�����/��������� � ���������� � ��� ���� � ������������ ������� �� � ��� � � ������� ���������� ������� �� � �� �������� �� � �� ��� ����������������� E��� -���� $F� ��� ��������� ��������� �� ���� � ����� ��� ���� ������ �� � ����� ���J B� � �� � ��� � ������� �� �� ������ �� �� ��� ��!����� ��������������� ���� �� ��� ������ � � ����� ��������� ��� � ���� ��� 1���� �� �� ��� ����������� ������ ��� ��� ��� ��������� � �������� ��������� � ���������� ������, � ������ ��� ����� � ��� �� � ������ ��� ����� ����� ������� � �� ��� ���� ������ ���� ������ ��� ������ � ������� ���������� �� ��������� � ��� ���� � ))=== � ��� ����� ����� �������� �� ������� �� �� ������ ���

������� � �� �� �� ��!����� � ��� ����� � ����������� ���� ��������� �� .������ �� � ���� �� ��� ���� ��������� �������� ��������� � ������� � ������������ ��� ������� �������� �� J����� � �� �������� ���� ���� �� ����� ����� � �� ���� � � �� ���� � ���� ���������� � �� ���� �� �� � �� ���������� �� ���J B�� � ��� ���� � ��� � ���������� �� ������ � ���� � � ��� ���� � ��� ��������������� � � ������� ��� ��� ��� ������ ��� ��!�������� ��� ���� � �� �� ������� �������� �� �� ��� � �� ����� ��������� ���� �� ��� � � ������ � ������� ��������� ��� ��7����� ������ ����� �� ��������

� �� ����� $ ����� �������� ��

%" ��������� �������� �� �� ���� ���� �� ���� � ���������� ������� 3485 �� �������� �� E�����F ���� 3%45����� ���� �� ����������� �� )4 E�� ���F ��������� ����� � ���� � ��� ����� E�����F � �������� <� .�:� K� ��6E��� ������ � J��� 4F, ��� ����� � ���� ��� � ��� �� ������ �� ������� �������� ���������� �� ����� � ���E�� �� �F ����� ������� �� ��� � ������� ���� �� ��������������� ���� ����������� � �� ��0����� � �� ���� ���� ������ �� ���� ��� �������� � 3%&5� ���������� ���������� �� ������ ��� ��� �������� �� ����� �� � ��� ��� ��������� � ����� �� ������� ����� ������ ����������� �� ���� � �� )== M �� ��������� �������� �� ����������� � �� =�+�

�� ��� ���� � ��� ������� �� ��� ��� � ��������� �������� �� ��� ��� �������� �� ����� E�� �� �F����� �� � ������ ���� � ������ � �� ����� � �� ��� � � ��� ��������� ���������� � ������ ��� ����� � E�� �� �F � ����9 ��� ����� ���!����� �� ������ ��� ��� �� ������� � ��� � ��� ����� � ���� ���!�� � ��� � ����� ����� ���!����� ������� �� ����� ���� ��������� ������ ��� �� ���� �� ���� ��� ��������� � ��� ���� � ��� ��� E�� �� �F ������ �� ������� ������ ������� ��� ��� � �� ���� � �� ��G������6��������� ��� � ����� ���� ������� ��� �� ������� ����������������� � ������� ��������� �� ��� ��1� ������� ��� ��� ��������� �� ������� �� ��� �� �� � ������ ��� � ��� ��� ������� ��������� � �� ��� ���� � ��� ������� � �� ������� � ��� ���������� � �������� 34)5� ��� ��� ���������� �� �������� �� � ����� ������, �������� �� �� ��G����� �� ��� ��� ���������������� �� ��� �������� �� ��� ������

�� ����� � ������������ � ������� �� ������ �� ������� �� � ����� � 4$4 ������� ���� �� �������������� ��������� � � ��!����� �������� 3%(5� ���� ��� � � ������ 3%)5 ��������� � �� �������� �� � ����� ��!������ �� ���� ��� �� ��� ��� �� ��������� ��������� � �� �� ����� ���� �� � ��� ����� E�� �� �F� ����� �� �� � ������ �� � ��� ���!������� ���� ������ ��� ��� ���� �� � � ���� � � � �� ��� ��!����� � ���� � ��� ���� E�� �F� � � ���� �� � �� �� ���� ����� ���� �� � ��� ����� E�� �� �F � ����� � � ���� � � ���� ������ / 4 � ��� � N 4 � � 8 � ��� � N 8, ����� �� � ������� �� �������� � � � ��� �3O45 �� � ��� �3O85� ������������� ��� � ��������� ������ ��-E�F � ��!������ -� �� ��� � �� ���� ���� � ������ �� � ����� ���!������� ���� � 3%85

��-� ��� ���� � ���

��

�����4

4

����

� ������ �

� ���� �

� �� � �

����� � �� ��� ������ � �������� �� ��� ��!����� -� � ����� < �� ��� � ����� �� � �� � �� ���� ������������ ���� � �� � � ���������� 3%+5� ���� ���� �� � ��� � � ������� ��� ��� � �������� � ���� ������� �� ��� ���� �� 3 � 4� N 45 � 3 � 8� N 85 �� � ����� ���� �� �� �!�� � ��� ���� � �������1���� ��� ��� ���� �����

��� �� / �� � ������ �� ������� � ������ ���� ��� ��������� � ���� � ��� ���� E���F � � ���� � ��� � � �� ��� ��!����� � �� ������� �� ������������ ��� 3%'5� � ��������� �������� � �� ��� ��!������� � � ���� ��� �� ��� �� ����� �������� ���������� ������� ����� ���� ���� ����� ���� ��� ������!������� � ��� �������� ������� �� ��� ��1 � ���� �� � �� ��� ��!����� �� � ������ ��������������� ��� ���!������� � ��� �������� ������� ������� �������� �� � �� �� �� ������� ���� ������ � ������ � ������ �� � �� ��� ���� �� ��� �������� ��� ��� ����� � ������� � �� � �� ����� ���� ����� ���� ������ ������ �� ���� � ������ ��

��-�����

��� � �����

��4��

��� ����� �������

� �

� ����� ���� �

� ����� ���� ��

���� ��� �� ��������� �P� � GP ����������� � P�� �P � �P� � �P Q (� ��� �������� �� � � ��� ����� �������� ��

(4

���� ���� �� �������� ��� �������� ������� % �� 8 �*

��� )' ���� � =�)�* ����� �� ������� ��� �������������� ��� 8 �* , ��� ���� �� �� ���� � ��������� ��B��� 3%'5�

����� �� � ������� �� ������ ���� �������� � ��� ������ �� �� ��� ����� ���� ���� �� ������ �������

( )� �� $ �� �� ���� � � �������

H� � ��� � "#�������� � ���� � ��� 2�2 ����������� � �� �� ���� �� ���� ���������� �� ����������� ���� �� ��� ������ � "#�� �� �� ���� ���� �� ��� �� �� ���� �� � ���� $%$ �� ��� ������������� ���� � �� � ���� � ��� .� ���� "� <��3$=5 � ��� )�B6 3$45 �� 42"" 3$)5� ������������� H����� ����� � ����� �� ����� � �B6 �� 2 �� "������ �� �� ����� ��� � ��!����� �������� �� ����� � �� ��7����� 2�2 ����������� ���� � ���� &'�� '( ��������� ������������� 2 ������ ��� #��������� �� �������� �������� � 2 �� " ��� �!��������� ��������� �� � �������� � ���� "#� 3$%5 �� ������ ���� ��� ����, ��� ��� $( �������� 3�+� �''5 ������ � ��������� �B6 �� ��� ������� �� 2 �� " ��������� ��� �� � �� ���� ��� ����� ����1 �� ��� ��� ����� �����1 ��� ������ ��� ��� �G � �� �� � "#�� �� ������� �� ������ � �� � ����� ��� � ��� 2�2 �� ������ ������ ����� � ����1 �� ��� ��������� ����1 � �� ��� ������ ������� �� � �:<<� ���� 3$$5� ����� � ����� � �� ������� �� : �� < ����� � � ��� � ���� � ����E���� 4F� ��� ���� ������� ��� ���� �� ������� ���� � �:<<� ���� �� �B6� ��� �� �������� �� �� �������� ��7����� ������� � ������� ��� �������� � ���� �� ����� � ��� �� ��������� �� 2 �� "� �� �� ��<�<<<� ����� � �� �� � �� � ����� -���������� �������� �� ������� �� � ���� �� ���� �� ����� ������������ � � �� � ���� 3$$5�

* �� ����� �������� ������� � $ + � �

�� ���� ����� �� ������ .������ �� J���� � ���2 �� " ��!������ ��� ������� �� ������ �� ��

J��� 4� ��� ����� ������� 24� 2)� �� 2% �� ������������� �� � �� .������ �� J����� ����� ����������� ���� �� ������ � � �� ������ � �� ���� � ����� ������ � ��� ���� � ��� ����� ��� � ���� � ���� 2)2% ���� �� �� ���� ���������� �� � ������ ���242) ���� �� � � ��������� � ��9 .������ �� J����������� ��� �� �� 242) ������� � ������ ����1�

������ �� ��� ���� � �� ������ ���� ��� � ����� ����� � �� ��� ���J B�� �� �� ������� �� ������� ���� )� ��� 242) �� 2)2% �������� �� ��������� ��������� ���� ��� � ��� �3O45 � ������9 ��� �������������� ����� � ��� ��� �� �� ��� 4$�� ������������������ 2 ������ ������� ������� �� ���� ����������� ��� � ��� �3O85 � ������� ?���� ��� ���� � ���������� ����� 242) ��������� ������ � � � ����������� ��� ����� 2)2% ��������� ������ ��� �� ���%=4�� � ���� �� ����� ������� ��� ��� ��� ���� �� ������� 242) � ������ � ����� �� � � �� �, � ������� ��� ���J B� �������� �� �� � � ������� ���� �������� ��� � ��� � � �������� �� �� �� � ������ ��� ���� �� � � ������� ���� ��� ���� 242)2% ��!��������������� � ���� ��!����� � ����� ��� $( ��������� H����� � ������ ��� �� � ������������

��� ����� � ��� ���� � ���������� �� ��������� ������������ � 242) �� �� �������� �������� ���������� �� ������ �� �� ���� %� ��� ����� ��������� �� � ��� ��� ���������� ��������� ���� ������� � ��� ����� � �� ���� � �� $�+ �* � �� ��� ������� ��������� � �� %�& �* � ��� �� ���� � ��� ����� � �� ���� � �� =�8 ��� � ��4 ������ ��� ��� � ��� ��������� � ���� ������ � �� ���� �� ����� �� � ��������� � � ' �* �

��� ���� ��������� � �� ���� � � � 242) �� ����� ��� ������� � �� ���� � � ��� ��� �� ��������������� ������� �� ��������� ��� �� �� 2 �� " ��!������ �� ����� ������� ��� ��� ��������� 242) � �� ���� � �� ���� �� �� �1���� � � ��� ���� �� ��� �������������� ���� ��� �� �� ����� ���� 242) �� ����� ��� � ������� �� )�= ��� � ��4� ���� ���� � ���������� �� �� ��� ������ �� ���� ������� � �������� ��������� �� '�+ �* � �����, ��� � ���� ��������� � �� $�+ �* �

H� ���� � �������� ��� ��� �� � ��������� �� ���� ���� ��� �� �������� ������� ������� �� � ����� �� ��!����� ������� �� � ��� � � �� ���� ������ ����� ��� ������ � ������ ���� ������� � �������� � �� ���� � �� '�& �* �� �� ���� ��� ��������

,��� �� #���� �� ��������� ������ ��� ����� �� �������� �� ���E�����F � ��� � ��� �������� �� ��� ����� I���� �� �� � ��������� � ������� 3%(� $$5� ��� E�����F � ���� �� �� �� ����� ����� ������ � J��� 4� ����� � ��������� � �� ��� ������� ��� �� ������ � ���� � �� � �� ������� ��� �� �1������ � ����< �� .� ��� ��������� ����� �� ��� ����� ������ �� ������ 2 �� " ������� �� � E���� ), ���� %F ��������� �� ���� %�� �� ��� ��� �B6 ������� �� � ���� + ��������� �� ���� $���� ������ � � ������� ��������� ����� �� ��� ������ � �������������� ��� ����� � ���� �� � ��� ��� �������� ��

���� � ��� � #���� ���� � ���������������� �����

2 �� " 242) �<�<<<� E',4=F2)2% �:<<� E),)F

�B6 242) �:<<� =2)2% �:<<� 4=2%2$ �:�<�<<� 4=2$2' �:<<� =

,��� !� .������� �� � ���J B� 3%'5� J � ��� ����� ��!������� ��� � ������� ��� � ���� � � ��� ����� ��������� � �� �������� ���������� �� �����, ��� ������ � ���������� �� ������ �� ��������� �� � ����� ��� ������ � ��� �B6 242) �� 2)2%2$��������� �� 3�4�)$5 �� 34%�')5� �� �� �� � ��� 2 �� " 242)�� 2)2% ��������� �� 3�8��$=5 �� 3�))��'&5

� ��� �3O45

� ��� �3O85

���� #����� ����������

2 �� " 242) ) %+= 4 ))$(%2 �� " 2)2% 4$ %=( %=4 ))48%�B6 242) +&$ %8' $'4 )%$$4�B6 2)2%2$ 4 4 4 )4)+)

()

� ��� ��� ��� ������ ���� ��� ���������� �� ������� -���������� ��� ���� ��������� ��������� �� � ��������� � � � � � )�( �* � ���� ���������� ����� �� �������� �� J��� )� �� �� ��� �� ��� =�$ ��� � ��4

������ ��� ��� ��������� � �� ���� � ���� � ���� ���������� �� � ��� )= ������� �� ��� ��� ������ ������������� � ��� � ����������� �� ��������

2���� �� ���� ��� ��� �� ������� � � ���������� ������� 242) ������� � �������� ��� �� �� ��!����� ������������ �!�������� ���� ���� ������ � ������� ��� �� �� ������� H� �� ���� � ������ ��� ���� �� � ��� ������ ���� ��� �� �� ��!������ ����� ���� ������� ����� ��������

�� ���� �� ���� 4� ��� 242) �� 2)2% ����� ������� ���� ��������� �� ��� ������� ��� � �� �� ��� ���������� �� �� ��� � ����������� ��� ��� ��� ��������� ��� �<�<<<� � ��� ������ � �� � �� � ���������� � ������� �� ��� � ��� � ����������� �������� �� �� �� �� ���������� ���� ��� ��� �� �������� �:<<� 2�2 � ���� �� � ����� �� �� � ��� ���������� ��� �� ��� �� ����� � �� �������� ��� ������������� ��������� ��� ���� �� � �� ����� � ����������������� # �� ��� ����� � � ���� �������� �� ���� ����� �� � ��� ��������� � �� ���� �� ����������� � ����������� �� ��� ���� �� �� ��� �� � ��� ��������� ��� � ��� ��� ���� ���������� � � �� ����� � ��� �����

- �� ����� �������� ������� � $ ) .

� ��������� ����� ��� � �B6 � ��� � �� � �� ���� ���� ���� .������ �� J���� EJ��� 4F� .������� ������� �������� ��� ������� 24� 2)� 2%� �� 2$���� ������� ����1 2' � � ��� ����������� ������ � ������������ �� �������� 2' � �1������ �� 24 �� 2) �� ����� ������ � �� ����1� �� � ������ J���� ����������� ����1 2$ �� ��� ������� ��� ������� 24 ��2) � ���������� � �� ��������� ��������� 2����� �� ����!���� � �� � � � ���� � ���� �� �������� �������� ���� ����������� ����� �� �� ��������9 242)�� 2)2%2$�

� ������ ������� ����� ��������� �� �������������� ��������� ����� ��� �������� �� ����� ���J B�,��� ������� �� ����� �� ���� )� ��� ����� ��������� ���� 2)2%2$ ������� �� ��������� � � � ���� ����� �� � ��� � � ������� �� �� ��� ���� � ������������ ������� �� ���� ��������� � ������� � �� �������� ���� ���� � � �� � �� �� ������� �������� ����� � ������ ��� 242) ������� �� ��������� � ������������ ���� ��� � ��� � � � ���� ��� ���� � ������������ �� �� �������� ���� ��� ��� ��� ��� 242) ���� ����� ���� ��������� � ������ �� ��� � ��� � � ������� �J����� �� � ������ �� ��� ��������� �B6 � �� � �� ���2)2%2$ ��������

�� ��� �� ����� ��� ��������� � ��� � �� � �� ��������� �� �� �������� �������� ���� � ������ � � ��� � ��� � 3O85 �� ��� ���� � ������� ������� �� ���� � � �� ���� ��� ��� ������� �� �� ���� �������� ������� � ����� �� ������ �� �� ���� $� �������� ��� ������ � � ��� ��������� ���������� ����������� � ��� ����� � �� ���� � �� ' �* � �� ��� ������� �� �1���� ��� ������ �� �� )�8 �� +�% �* �

��� �� ����� �� ����� ���� ����� ��������� ������������� ������� �%+ �� �%( ��� � ��4� ��� ����

'��� !�� �� B���������� � � ��� ��������� ���������� � � ����� �����!��� E��F ������ � ���� ������� � ��� ������ �� ���� �� �������� ��� � ��� ����� ���������� ��� ������������ � ����� ��� � ��� ����� ��������� �� ��� ��� ������ � ������������ ���������� ��� ������ ���� �������� �� �#-�:2�E�-�F� � 2 �� " 3�+��''5� ��� ��� ������ � ������� ����������� ����� � �� ���� �� �� )�( �* � ��� E�� �� �F � ���� � ������������ ��������� �� E��� ����� ��������� �� J��� 4F9 ��������������<�<<<�����������:..���������:::��� � �B6 3�4�&%5� ��� ��� ������ � ������� ����������� ����� � �� ���� �� �� %�+ �* � ��� E�� �� �F � ���� ���� ��������� ��������� �� E��� ����� ��������� �� J��� 4F9����������.���.:..��������:..���������:�.�<.����������:<�..��<<:<

(%

��������� ��������� �� � � ��� ���� ��� � ���� ��� � ����� ���� �� ��� � ��� � ��������� ������� � � ����������� ������� ��� ��7����� ��������� � �� ���� ���

� ������� ��� �� �� �B6 ��!������ �� ������ ��������� �� �������� ��� ������� �� ������ � ������ ����������� ��� � �� � ��� �B6 ������� �� �� ��������������� ������� �� � ��� � � �� ���� ��� ������������� �� ������ � ������ � ����� � 2)2%2$��� ��!����� ������� � ����� ����� � ����1 24 � ����12' � � �� � ������ �� ���� ����� �� �������� ������� � ����� ������� ��!������ ����� ������� ������������ ��������� � ��� 2)2%2$ ��� ������ �1����� � ��� ���� ����� �� ��� ����� �������� � ��� 2)2%2$ ��������

��� ������� � ����� �� ����� � �� ������� �� ������� ���� $� H� � ��� ��� ��� ��� ������ �� ���� ������� � ��� ����� ��������� �� ������������ � ��� ������ ���� ��� ���������� �� ������ �� ����9 $�% ��$�8 �* ����� '�$ �� &�& �* � � �� �������� �� $�8� '�'��� &�4 �* ����� 8�$ �* � ��� �������� � �� ��� ������� ������� �� ������ ���� ����� ���� ����1 24 ������ ����1 2'� ����� �� ��������� � �1������ �� ���� ��� � � ������� �� � � ���� ���� � ���� �� ��� ��������������� ��� ����� ��� ������ � ������ ����� �������� � �� $�8 �* � ��� ��������� ��������� ��� � ����������� ��� ����� ��������� �� � ��� ������ � � %�+ �* �� �� �������� �� J��� )�� ��� �: �� �'8�&��� � ��4� ������ ��� ��������� � �� ���� � �� ���� ������� ���� �� � �'8�+ ��� � ��4� �� � ��������� � � '�= �* �

�� �� � ��� ���� ��� ������ � ��� ����� �� ������������� �� �� �� ������ E���� 4F� ��� 2)2% ��2%2$ ������ ����� �� �:<<� �� �:�<�<<� � ������� � ������� ��������� �� �� ��� ������� �� ����� ���������� 24 ���� 2' �� ������������ ���� � ��� � �� ���� � ������ ��� 242) �� 2$2' ����� �� � � ������������� �� ����� ��� ������� ���

/ �������� �

�� ��� �� ���� �������� ��� ������� � ��� � ����� ������� �� ���� � ������� ��� ���� ��������� ������������� ��� ������ �� ������� � ��� ����� � �� ���� � � )�( �� %�+ �* � � � ��� $( �������� � 2 �� " ����� &' �������� � �B6� ������������� ��� ������������ ������� � �������� � ���� ����������� �� ������������� � �� � �� ���� ��� �� �� ��!������ ������ � ����������� ������ �� ��� ��� � �B6� �� ���� ���� ������������ � �� � � ������� ��� ����� ������� 2)2%2$�� ����� ����� � ��� ������ � ��� ��� ���� �� "#��������� -���������� ��� �� ����� � ���� � �� �� ����:<<� �� �:�<�<<� ������ ���� ��������� � �������� � ��� �� ��� ���� ��������� � �� ���� �� ��� �� ����� ������� ��� �� ��� ��� � 2 �� "� ����� �� �� ������� �B6 �� � ������� ��� ����� �������� ��� � �������� � � ���� ����������� �� ��� � �� � �� ��� ������!������ ���� �������� ��� ��� ������� � �� � �� � ������� ��� ���� ��������� �������� ��A � � �� $=/'=�������� �� ��� ��� � ���� �� � � ����� ����� � ���

.�������� ������� J�1�� ������� -������ ��������� R���QO������������ � E�* F

������ � ����1 E�* F

4 2)2%2$ B�� � '�= O )�= )�8/+�%) 242)2%2$ B�� � &�& O )�' %�8/44�(% 2)2%2$2' B�� � '�$ O 4�= $�(/8�)$ 242)2%2$2' B�� � 8�$ O )�= $�8/44�&' 242)2%2$ 2)2%2$ 4 $�8 O =�' %�&/'�)& 2)2%2$2' 2)2%2$ 4 $�% O =�' %�8/'�8( 242)2%2$2' 2)2%2$ 4 '�' O =�( $�=/(�=8 242)2%2$2' 2)2%2$2' & &�4 O =�4 &�=/&�%+ 242)2%2$2' 242)2%2$ ( $�8 O =�% %�+/'�%

,��� �� �� ������� �� � �B6� #��� ����� � ������� ��� ������� ������� �� ��� ����� �� ���� ����� ��� ������� ���������� ������� �� � ���� $, ��� ������ ����� � ��� ���� � ������� ������� �� � ���� 4� ��� � ������ � � � ������� ���� �� ��� ��� ���� � ��� � 3O85 �� ���� � �������� ��� ����� ��� ������ ���� �� ����� ������ ������ � � � ����� ��� ������� ��� � ����

� ��� ������� �� �1���� ��� ������ ��� �� ����� �� ��� �� ������ �� � ������ ��� ��� ������ �� �� � ������ � ��� ��

� �� ���� � ������ ������ ���� �� ����� ?%<K-� 3$&5� ��������� � ��� 2)2%2$� 242)2%2$� 2)2%2$2$ �� 242)2%2$2' ��������� �� 34%�'%5� 3�4�'%5� 34%�&%5� �� 3�4�&%5

.�������� ������� -����1�� ������� -������ ��������� R���QO������������ � E�* F

�����������1 E�* F

4 242) B�� � $�+ O =�' %�&/'�$) 242)2% B�� � '�& O 4�8 )�(/(�+% 242)2% 242) 4 '�+ O 4�4 $�+/(�&

,��� �� � ��� ��� E��F ������� �� � 2 �� "� ����� ����� � ������� ��� ���� ��� ������� �� ��� ����� �� ���� ����� ���������� ���������� �� ����� �� � ���� $, ��� ������ ����� � ������� � ������� �� ����� �� � ���� 4� ��� � ������� ���� ����� ��� � ��� � ��� � 3O45 �� ���� � �������� ��� �������� ������ �� �� �� ����� ������ ������ �� � � ����� ���

������� ��� � ���� � ��� ������� �� �1���� ��� ������ ����� ����� �� ��� �� ������ �� � ������ ��� ��� ������ �� ��� ������ � ��� �� � �� ���� � ������ ������ ���� �� �����?%<K-� 3$&5� ��� ������ � ��� 242) �� 242)2% ��������� ��3�+��$=5 �� 3�+��''5

($

����������� 2��� � � ��� �� ����������� ����� �������� ���������� ��������� ��� ����� ��� ������ � �� � ��� �<�<<<� �����

�� ���� �� � ��� ��� ��� �� �������� �������������� �� ��� � � � ������ � ���� ��� ������� ������ � �� ���� �� ��� ������� �������� ��7����� � �� ���� �� �� ��� ��7����� ����� �� ��� ���� �� ���� �� ��� ����� �� �� ������ � � �� ��� ������� � ���1������� ��� � ������� �� � � � ���� ������� ������� �����7����� ���� ����� � �� ���� �� �� �� ��� �� ������� �� 4 ��� � ��4� �� ��� � �� ���� � ������������� ���� ��� ������ � ���� ������� � ��� ����� ��������� �� ������ � � ��� ���� ��� � ���� ��� � � �� ���� �� ����� �� ����� ��� � ��� ���� �� ��� ���� ���� ������ � �� ���� � � ��� ����� �� ������� � ����� �� ��� � ������� ��������� ����������� �� � ������ ����� ��7����� ������� �� ����� ������ ����������� �������� � �� ������������ � ��� ���� � ��������� ����������� ����� � �������� � �������� � ����� �������� �������� ��������� ���������� �� �� ���� � � � �������� � ������� ���������� � ������� ������� ���� �� ����� ������� �� ���� � �� ������ ����������� ���� � ��� ������

��������� ����� "�:� ������� �� � SSJ�B-�����������> TT���� � ��� H�� � B��� �� ��B� �� -��� � B������ ��� ����� ��� <����� #�� �� J��� � � -�������� B�������

$����

4� "�� U� M ���� .� E4++8F -������ )8)9 ($=)� B���� �� �C� B������ J� E4+(8F C � � <� � 44+9 '%(%� #�� M E4+8=F C � � <� � 4%89 (+($� EF � ��� JK� -�������� �CK� ��� � HB E4+8=F #����9 )8'9

%(8, E�F � ��� JK� -�������� �CK� ��� � HB E4+84F C � �<� � 4$89 )'%, E�F � ��� JK� -�������� �CK� ��� � HB E4+8)FC � � <� � 4'&9 8)4

'� K�������� J� J� V ���� �� ��� � . E4++&F .� ����� -�����J���� :���� )'9 4&+

&� D> �!�� �� -����� 2� E4+8'F <� � ������ )$9 4$%((� -�� � �� :����� @� -����� 2� E4++4F .� � #�� ��� -��

?-� 889 %&&48� -���� �C� 2������� �� @����� . E4++)F .� ���� -�� 49 &)'+� EF -�� �� M�� M ������� �� 2��� K� <��� " E4++(F C

� � <� � )&89 )=+, E�F -�� �� M�� B�� ���� �� M ������� ��J 1 <�� <���� 7 �� <��� " E4+++F .� ����� %$9 8), E�F-�� �� M�� < ���� B� B�� ���� �� <��� " E4+++F .� �����-���� %9 4(4

4=� -������� B� B �� :" E4++'F .� ����� ))9 8444� 6����� ��� "C E4+++F .� ����� -���� %9 48&4)� ���� � ��� #� B �������� �H� B �������� �#� ������ �2

E4+'%F C ���� .��� )49 4=8(4%� B�� �� -� ����� C E4++%F .� ����� -����� J���� :���� 4&9 84$� M ������ �� -� ����� C E4++$F .� ����� -����� J���� :���� 489

%%8

4'� M ������ �� -� ����� C E4++$F .� ����� -����� J���� :���� 489%'%

4&� 2����� ?2K� 6�� � U� 6������ C# E4+++F .� �����-���� J���� :���� %$9 $()

4(� -��� -- E4+++F <� ���� C (&9 4&$48� M��������� -� :���� �" C�� D����� �. E4+8%F -������ ))=9 &(44+� M�� 2� M������ �� 6�� � U E4+8+F .� ���� K�� %9 8')=� H��� � �� " ���� - E4+8+F .� ����� -���� J���� :���� &9 4+%)4� -�� �� M�� M ������� �� 2��� K� <��� " E4++(F C � �

<� � )&89 )=+))� -������ "�� :��� CB� J������� B�� ��"��� �� �K E4++8F

.� ����� -����� J���� :���� %%9 )$=)%� : ������ "K E4+8+F :������ �� ����� �� ������ ���� �� �

�������� �������� ����� �H������ B�����������������)$� .������� C�� � ��� C E4++&F ���� 6��� -����� <� � &9 ))()'� -� ����� C� M ������ � E4++=F -������ )'=9 44)4)&� C������ B@ E4++)F ���� 6��� -����� <� � )9 )$8)(� EF 6��� �B� M ������ �� -� ����� C E4++8F .� � #�� ��� -��

?-� +'9 4=)=, E�F 6��� �B� M ������ �� -� ����� C E4++8FC � � <� � )((9 $4+

)8� 6��� �B� M ������ �� B ������� .� ��� ���� <� -� ����� CE4+++F .� ����� -���� %9 4((

)+� 6���� ��� <�� CK� 2����� �� @ � ��� @� -����� � � E4+++F.� ����� -���� %9 4$+

%=� .������ �B� @�����-������� W� � �� B� H ����� .:E4++(F C � � <� � )()9 +'

%4� :���� "� B �� � E)==4F .� ����� -����� J���� :���� E�������F

%)� EF B �� �C� M ���� C.�� H �� -C E4++4F C � � <� �))49 +&4, E�F B �� �C� M ���� C.�� H �� -C E4++)F<� ��������� %49 4=))&

%%� B �� �C� H �� -C E4++)F <� ��������� %49 4=)%+%$� .���� �� �� ���� �� <����� �� ��7 ��� �� �����1 ��

B �� �C� 2����� M� M� ���� C� : ������ �� H �� -CE4++$F <� ��������� %%9 444'8

%'� M ���� C.�� B �� �C� H �� -C E4++$F C � � <� � )%'94'+8

%&� .�� <2� @����� � E4++'F C � � <� � )$+9 $+%%(� H���G��� B�� B �� �C� H �� -C E4++&F C � � <� � )''9

)%'%8� EF B �� �C� H �� -C E4++'F .� ���� K�� 89 8$+, E�F

B �� �� :���� " E4++8F K�� C <� ���� )'$9 4%'%+� . �� J� E4+(4F #���� )%$9 )(($=� EF <�������� J�� M �� �� �J� H������ :C<� ����� KJC��

<���� �"� B ����� CB� M����� 6� -���� ���� �� ����� �E4+((F C � � <� � 44)9 '%', E�F <���� 2�� H����� � C� J���W� :������� :� <�� �#� H������ 2� -������ � �#� < ���� .KE)===F #��� ����� B�� )89 )%'

$4� � ���� � �� H ������� �� 2���� � -� E4+8+F C � � <� �)='9 4(+

$)� M�������� �B� @�� <� �����<��� K� M ������ �<� .� �6E4++=F ���� &%9 '(+

$%� EF �� "2� :������� C�� H�� @2� #�������� �� J�������C� E4++$F <� ��������� %%9 4'='%, E�F � 1 �� �� ���� �� .C��� @� H� < ����� B� �� @������ 2�� �� ��� D���� .��M����� BC E4++'F <� � � #�B &9 )%, E�F ��� C2� .���� �.@ E4++(F <� ��������� %&9 ')&

$$� H���G��� B� B �� � E4++&F C � � <� � )&)9 )+$$'� M���� H� -���� � E4+8%F <� � ������ ))9 )'(($&� M���� H E4+(8F ��� ������� �� � %$9 8)(

('