ANALISIS KUALITAS SPERMA IKAN

Oleh:Nama : Wiwin HadiantiNIM : B1J014029Rombongan : VIKelompok: 1Asisten : Indri Muhati

LAPORAN PRAKTIKUM PERKEMBANGAN HEWAN

KEMENTERIAN RISET TEKNOLOGI DAN PENDIDIKAN TINGGIUNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMANFAKULTAS BIOLOGIPURWOKERTO2015I. PENDAHULUANA. Latar BelakangIkan Nilem termasuk ikan bertulang keras (Osteichthyes). Ikan Nilem hidup di air tawar dan dapat hidup dengan baik pada daerah dengan ketinggian sekitar 500800 meter di atas permukaan laut dan lebih suka di perairan jernih. Ukuran tubuh ikan dewasa antara 15-20 cm dengan berat berkisar antara 100-200 gram. Ikan Nilem merupakan salah satu sumber protein bagi manusia (Jasin, 1989). Ikan Nilem merupakan ikan peliharaan yang berasal dari sungai. Ikan Nilem dalam perairan bebas biasanya memijah pada akhir musim penghujan di daerah-daerah yang berpasir dan berair jernih, di kolam. Pemijahan Ikan Nilem dapat dilakukan sepanjang tahun dengan cara mengatur kondisi lingkungan (Asmawi, 1989).Ikan Nilem mempunyai organ reproduksi yaitu testis yang berwarna putih. Testis terdapat sepasang yang digantungkan oleh jaringan ikat yang disebut meserchium, terletak pada rongga perut di depan gelembung renang. Testis mempunyai struktur yang terdiri dari saluran berongga (tubulus longitudinalis) yang banyak sekali terdapat pada ciste seminiferus. Ciste tersebut memiliki dinding yang berisi sel-sel spermatogonium yang disebut primordial germinal cell, Tidak jauh dari arah ciste di sekeliling sel spermatozoa (spermatogonium, spermatosit I, spermatosit II, spermatosit III) ditemukan sel-sel sertoli. Sel sertoli berfungsi sebagai pemberi makan sel bakal spermatozoa, pemakan sel spermatozoa yang mati, memberi cairan tubulus dan berfungsi sebagai kelenjar endokrin (penghasil hormon estrogen), di luar tubulus terdapat sel interstitial sebagai penghasil hormon androgen. Hormon androgen yang paling kuat pengaruhnya adalah hormon testosteron yang berfungsi menentukan tanda-tanda kelamin jantan, menentukan tingkah laku kelamin jantan dan merangsang spermatogenesis (Jamieson, 2009).Ikan Nilem jantan masak kelamin setelah berumur 8 bulan. Berat testis lebih ringan dibanding berat ovarium pada ikan yang sama umurnya. Sepasang testis dapat menghasilkan sekitar 1-1,5 ml milt dalam keadaan ejakulasi alami, tetapi pada striping hanya 1 ml. Setiap 1 ml milt mengandung 200-300 juta spermatozoa. Milt Ikan Nilem setelah diejakulasikan dan bersentuhan dengan air lalu menggumpal. Milt harus diencerkan dengan larutan Ringer sampai 100 kali. Pengenceran ini dapat memperpanjang daya hidup spermatozoa Ikan Nilem (Rugh, 2010).Sel spermatozoa secara umum terdiri atas dua bagian besar, yaitu kepala dan ekor. Ukuran spermatozoa ikan memiliki panjang kepala 2-3 mikrometer dan panjang total 40-60 mikrometer. Kepala spermatozoa mengandung DNA yang berperan dalam penyimpanan dan menerjemahkan informasi genetik yang dibawa oleh spermatozoa (Nuah, 2011).Menurut Asmawi (1989) Ikan Nilem adalah ikan yang memenuhi persyaratan sebagai hewan uji analisis sperma dikarenakan berbagai alasan berikut:1. Proses pembuahan terjadi di luar tubuh Ikan Nilem betina.3. Hewan yang mudah disadap telur maupun sperma masaknya.4. Mudah dibedakan antara ikan jantan dan betina.6. Mudah dioviposisikan. 7. Ikan Nilem mudah didapatkan. 8.Telur maupun sperma yang dihasilkan setiap siklus reproduksi jumlahnya cukup banyak. Praktikum analisis sperma memerlukan suatu alat yang dapat digunakan untuk menghitung jumlah sperma normal dan abnormal. Alat yang dimaksud adalah haemocytometer. Haemocytometer berbentuk persegi panjang dimana terdapat dua liang sebagai tempat cairan sperma. Haemocytometer sangat diperlukan dalam praktikum analisis sperma karena dapat digunakan dalam menghitung jumlah sperma yang normal dan abnormal dan juga sperma yang motil dan non motil (Jamieson, 2011).B. TujuanTujuan dari praktikum analisis sperma ini adalah untuk melakukan analisis sperma dan menentukan kualitas spermatozoa Ikan Nilem jantan.

II. MATERI DAN METODEA. MateriAlat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah object glass, cover glass, mikroskop cahaya, bilik hitung (haemocytometer), cavity slide, pipet tetes, tissue, pengukur waktu, micrometer, spuit injeksi tanpa jarum, beaker glass, well plate, hand counter dan tusuk gigi.Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah Milt Ikan Nilem, larutan NaCl 0,9% fisiologis, pewarna eosin, akuades. B. MetodeMetode yang dilakukan dalam praktikum ini adalah 1. Cara Stripping :a) Ikan dipegang dengan bagian ventral ada di bawah dan bagian dorsal menghadap ke atas,b) Tangan kanan menutupi kepala, sedangkan tangan kiri menyangga ekor.c) Bagian lubang urogenital dilap dengan tisud) Abdomen ikan diurut dari anterior kearah posterior menuju lubang urogenital hingga pada lubang tersebut keluar cairan berwarna putih susu (milt)e) Milt yang keluar langsung disedot dengan menggunakan spuit injeksi tanpa jarum.2. VolumeMilt ikan nilem yang tertampung pada spuit injeksi diukur volumenya dengan langsung membaca skalanya.3. Warna:Diamati secara visual dengan latar belakang warna putih4. Bau:Dibaui dengan cara dikipas-kipaskan dengan tangan, jangan dihirup langsung. 5. pH:Derajat keasaman (pH) diukur dengan menggunakan kertas pH, dengan cara mencelupkan kertas pH kedalam sampel sperma, diamkan beberapa saat, kemudian cocokkan perubahan warna yang terjadi dengan tube.6. Cara pengenceran milt :a) Sampel milt diambil 0,05 ml dimasukkan di dalam cawanb) Larutan NaCl fisiologis sebanyak 9 ml dicampurkan ke dalam cawan (perbandingan antara sampel dengan larutan pengenceran harus selalu 1:9).c) Dihomogenkan dengan menggunakan batang pengaduk sampai benar-benar homogen.d) Sperma yang sudah diencerkan ini merupakan sperma dengan pengenceran 10 Xe) Sperma pengenceran 10x diambil dengan menggunakan spuit yang lain sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam cawan yang berbedaf) Larutan ringer 9 ml dicampurkan ke dalam sperma tersebut.g) Sperma dengan pengenceran dua kali ini, merupakan sperma dengan pengenceran 100x.h) Pengenceran dilakukan lagi untuk mendapatkan sperma dengan pengenceran 1000x dan 10.000x.7. Motilitas Spermatozoaa) Milt yang sudah diencerkan 1000x diambil dengan menggunakan pipet tetesb) Milt diteteskan di atas objek glassc) Ditetesi dengan aquades, kemudian di homogenkand) Ditutup dengan cover glass dan diamati dengan menggunakan mikroskope) Bergerak atau tidak bergerak, ditentukan presentase motilitasnya.8. Menghitung jumlah total spermatozoaa) Milt yang sudah diencerkan 1000x diambil dengan menggunakan pipet tetesb) Diteteskan di bilik hitung Haemocytometer yang sudah ditutup dengan cover glass melalui sela-sela paritnya.c) Hitung jumlah sperma menggunakan lima kotak sedang di dalam kotak besar yang di bagian tengah.d) Jumlah total spermatozoa dihitung dengan Rumus : total spermatozoa = (Rata-rata 5 kotak sedang x pengenceran x 2,5.105) sel/ml.9. Viskositas spermaa) Sperma ikan nilem diletakkan pada mangkuk kecil, Sperma diambil kemudian ditaruh lagi menggunakan tusuk gigi tetapi dengan kecepatan pelan dan dilakukan berulang-ulang sampai mendapatkan kekentalan spermab) Dihitung berapa lama waktu yang dibutuhkan untuk sperma benar-benar mengental.

III. HASIL DAN PEMBAHASANA. Hasila. Parameter Makroskopis:1. Volume: 1 ml2. Viskositas: 9 menit/ 540 detikTabel 1 Akumulasi Data Pengamatan Viskositas Rombongan VIK1K2K3K4K5K6Rata-rata

Viskositas9 menit

7 menit 2 menit19 detik3 menit22 detik2 menit24 detik3 menit45 detik278 detik

3. Bau: Bau amis4. Warna: Putih Susu5. pH: 8b. Parameter Mikroskopis:1. Motilitas: Sperma motil 80% , non motil 20%Tabel 2. Akumulasi Data Pengamatan Motilitas Spermatozoa Rombongan VIK1K2K3K4K5K6Rata-rata

Presentase sperma motil (%)80%40%50%90%30%90%63,3%

Presentase sperma non motil (%)20%60%50%10%70%10%36,6%

2. Jumlah total spermatozoaTabel 3. Akumulasi Data Pengamatan total Spermatozoa Rombongan VIK1K2K3K4K5K6Rata-rata

Total spermatozoa(sel/mL)4,15.8,65.6,95.4,45.4,2.1,7.5,01.

Perhitungan: (kelompok masing-masing)Pengenceran: 10.000 kali Total Spermatozoa = rata-rata 5 kotak x pengenceran x 2,5 x 105 sel/ml= 16,6 x 2,5.x 10.000 = 4,15.

Gambar 1. Bilik Hitung Haemocytometer

9. Morfologi spermatozoa

1

2

3

4

Gambar 2Gambar 3Keterangan: Gambar 2: Morfologi SpermatozoaGambar 3: Mikroskopis Morfologi SpermatozoaKeterangan Gambar:1. Nukleus2. Kepala3. Leher4. Ekor10. Kesimpulan/ diagnosa:Berdasarkan hasil pengamatan analisis sperma ikan, diperoleh hasil meliputi parameter makroskopis yaitu sperma dengan volume 1 ml, viskositas selama 9 menit/ 540 detik dengan rata-rata dalam rombongan selama 4,6 menit/278 detik. Sperma berbau amis, berwarna putih susu dengan pH 8. Kemudian, selain parameter makroskopis ada juga parameter mikroskopis meliputi motilitas sperma dengan nilai 80% sperma motil dan 20% sperma non motil dengan rata-rata dalam rombongan 63,3% dan 36,6%. Jumlah total spermatozoa yang didapat dengan rumus perhitungan yaitu 4,15. dengan rata-rata dalam rombongan yaitu 5,01.. Hasil pengamatan yang diperoleh menunjukkan bahwa sperma Ikan Nilem tersebut berkualitas baik.

B. PembahasanAnalisis kualitas sperma pada ikan adalah pemeriksaan tentang sifat-sifat, kualitas dan kuantitas sperma ikan. Analisis sperma yang dimaksud meliputi pemeriksaan jumlah milt yang dapat distriping dari seekor ikan jantan masak kelamin, kekentalan sperma, warna, bau, jumlah spermatozoa mati, motilitas (bila mungkin kemampuan gerak per menit) dan morfologi (ukuran dan bentuk kepala, ukuran ekor, berbagai penyimpangan, ada tidaknya akrosoma). Analisis sperma juga dilakukan untuk mengetahui bagaimana tahapan proses pembuahan, pewaktuan setiap tahapan pembuahan, dan dapat menentukan rasio spermatozoa dan ovum dalam pembuahan (Yatim, 1982). Pada dasarnya persentase sperma, motilitas sperma dan jumlah sperma menentukan kualitas dari sperma (check, 2011).Analisis sperma dapat dilakaukan pada semua hewan. Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya analisis ini bertujuan untuk mengetahui jumlah milt yang dapat distriping dari seekor ikan jantan masak kelamin, kekentalan sperma, warna, bau, jumlah spermatozoa mati, motilitas (bila mungkin kemampuan gerak per menit) dan morfologi. Pada pengamatan tersebut semua hewan memiliki sperma yang berbeda seperti pada organisme akuatik yang memilki perbedaan viskositas sperma terhadap organisme darat. Adapun teknik khusus dalam pengamatan sperma ikan, yakni dengan cara pembekuan sperma atau teknik cryopreservation. Teknik ini merupakan teknik penting dalam budidaya ikan, karena memfasilitasi prosedur reproduksi buatan, dengan sperma yang disimpan dalam nitrogen cair, perlu untuk menginduksi pemijahan dan mengumpulkan gamet (Viverios, 2011).Motilitas spermatozoa adalah parameter yang berguna untuk memperkirakan kelangsungan hidup spermatozoa. Sperma yang hidup adalah sperma yang bergerak cepat, lambat atau pergerakannya pada kepala atau ekor, sedangkan sperma yang mati adalah sperma yang tidak memperlihatkan pergerakan sama sekali baik kepala maupun ekor. Lama motilitas dan daya fertilisasi sperma tiap jenis ikan berbeda-beda, tetapi pada umumnya motilitas dan kemampuan sperma untuk membuahi telur adalah sejalan (Faqih, 2011). Motilitas spermatozoa sangat tergantung pada faktor lingkungan seperti pH, osmolaritas, jenis pengencer dan zat kimia yang terkandung didalamnya. Motilitas juga dipengaruhi oleh jenis spesies, media aktivasi, dan waktu setelah aktivasi (C. Fauvel et al., 2011). Parameter motilitas sperma tergantung pada endogen ATP terutama yang terakumulasi selama spermatogenesis ikan. Pengaruh salinitas pada motilitas sperma dan efek dari durasi penyimpanan adenilat sangat penting dalam memperoleh suatu pemahaman tentang mekanisme yang mendasari potensi keberhasilan reproduksi pada ikan (Groison et al, 2011).Dari hasil praktikum volume sperma yang dihasilkan sebanyak 1 ml. Hal ini tidak sesuai dengan pernyataan Hora dan Pillay (2012) bahwa rata-rata volume milt yang dapat dihasilkan satu ekor Ikan Nilem 30-50 ml dengan jumlah spermatozoa permililiter adalah 3,33x1011. Perbedaan volume sperma tersebut juga bergantung pada umur, ukuran dan frekuensi pengeluaran sperma (Jasin, 1989). Berdasarkan pernyataan Yatim (1982) bahwa volume normal semen sekali diejakulasi sekitar 2,0 sampai 3,0 ml, ada juga yang sampai 4,5 ml. Jika volume kurang dari 1 ml, ada kemungkinan tak baiknya prostate dan vesicular seminalis yang merupakan penghasil utama plasma semen. Konsentrasi atau jumlah spermatozoa/ml semen, dihitung dengan haemocytometer Neubauer (Omer, 2012). Hasil yang didapat pada praktikum menunjukan jumlah sel sperma sebanyak 4,15. sel/ml dengan motil 80%. Hal ini sesuai dengan pernyataan Yatim (1982) yang menyatakan bahwa konsentrasi 70-65 juta/ml, dengan range 0,1-600 juta/ml. Jumlah yang bergerak maju ialah jumlah semua spermatozoa hidup dikurangi jumlah spermatozoa mati, dianggap normal jika motil maju >40% lebih lanjut. Viskositas yang didapatkan pada praktikum yaitu pada waktu 9 menit atau 540 detik.Berdasarkan hasil percobaan didapatkan bahwa warna sperma Ikan Nilem berwarna putih susu. Hal itu sesuai dengan pernyataan Lagler (2011) bahwa Ikan Nilem jantan dapat mengeluarkan cairan semen yang berwarna putih susu. Berdasarkan hasil percobaan juga diketahui bahwa bau sperma ikan nilem berbau amis. Menurut Asmawi (1989), bau sperma ikan adalah langu. Bau amis yang tercium pada waktu praktikum adalah berasal dari bau ikan pada umumnya. Berdasarkan pengamatan pH, didapatkan bahwa pH dari sperma ikan adalah 8 berarti bersifat basa. Hal ini sesuai dengan pernyataan Sutisna dan Sutarmanto (2012) bahwa pH berkisar antara 7,0-8,0. Tingkat pH yang lebih dari 8 menunjukkan adanya radang akut kelenjar kelamin atau epididimis. Tingkat pH kurang dari 7 menunjukkan adanya penyakit kronis pada kelenjar atau epididymis. Tingkat pH yang sangat rendah menunjukkan adanya gangguan atau aplasia pada vesicular seminalis atau ductus ejaculatorius.Pewarnaan sperma untuk keperluan pengamatan morfologi tidak terikat hidup matinya sperma. Sel spermatozoa yang normal secara sitologi terbagi atas kepala dan ekor. Ekor terbagi menjadi bagian tengah atau leher, bagian utama dan bagian ujung. Ciri-ciri sel spermatozoa yang normal adalah :a. KepalaBentuk : bulat lonjong, gepeng.Dimensi : tebal : 1-2 mikron; panjang : 9 mikron.b. LeherBentuk: bulat, pendek.Dimensi: garis tengah 1 mikron; panjang 13 mikron.c. EkorBentuk: bulat, panjang.Dimensi: garis tengah 0.25-0.5 mikron. Bagian ujung mungkin bergaris tengah kurang dari 0.25 mikron, panjang 44-50 mikron (Partodiharjo,1990). Semen atau milt yang cukup jumlahnya dan baik kualitasnya adalah salahsatu faktor yang harus tersedia agar proses fertilisasi terjadi secara baik bagi spesies ikan. Beberapa sudah dapat mendeskripsikan karakteristik dari semen atau milt yang berkualitas, contohnya adalah daya tahan, motilitas dan komposisi cairan sperma. Cairan sperma memiliki komposisi yang unik, yaitu terdiri dari komponen organik dan anorganik. Kedua komponen tersebut sangat mempengaruhi kualitas dari sperma. Contoh dari komponen-komponen tersebut adalah mineral (potasium, sodium, magnesium, kalsium dan klorida), pH, protein, glukosa dan trigliserida. Komposisi cairan semen, motilitas dan daya tahan spermatozoa sangat mempengaruhi kemampuan spermatozoa itu sendiri dalam melakukan proses fertilisasi nantinya (Hajirezaee et al, 2009).Larutan yang digunakan antara lain larutan Ringer, digunakan untuk mengencerkan sperma agar sperma homogen (tidak menggumpal), dapat pula memperpanjang umur sperma dan digunakan untuk mengawetkan serta menempelkan sperma yang sudah mati maupun masih hidup yang berada pada object glass agar tidak rusak sedangkan larutan Giemsa digunakan sebagai pewarna sperma sederhana agar sperma dapat dilihat dengan mikroskop cahaya dengan mudah (jelas) baik yang normal maupun abnormal dan air (akuades) digunakan untuk aktivasi spermatozoa (Soeminto, 2002).Faktor-faktor yang mempengaruhi kualitas dan kuantitas spermatozoa yaitu:1.TemperaturAktivitas metabolisme dan gerakan spermatozoa akan normal pada temperatur tubuh dan akan meningkat kecepatannya di luar tubuh apabila temperaturnya di atas normal, temperatur lebih rendah memberikan motilitas spermatozoa yang lebih panjang.2. Kandungan zat makanan (karbohidrat)Kandungan zat makanan (karbohidrat) misalnya fruktosa merupakan substrat energi utama di dalam plasma semen yang diproduksi oleh kelenjar vesikularis. Fruktosa dapat dijadikan sumber energi untuk mendukung pergerakan dan ketahanan spermatozoa karena fruktosa meningkatkan aktivitas protein yang terdapat pada ekor spermatozoa, sebab ekor spermatozoa disusun oleh mikro tubulus yang mengandung substansi fiber yang disusun oleh protein dinein.Protein dinein penting karena mempunyai aktivitas ATP-ase. ATP-ase akan lancar dan menyebabkan peningkatan motilitas spermatozoa (Perry, 2011).3.Penggunaan larutan fisiologisMenurut Viverios (2010), fertilisasi dapat didukung oleh kualitas spermatozoa yang baik. Larutan fisiologis dapat menambah daya viabilitas dan motilitas spermatozoa. Penggunaan larutan fisiologis yang mengandung NaCl dan urea dapat mempertahankan daya hidup spermatozoa antara 20-25 menit.Djanuar (2013) menyatakan bahwa pada umumnya semua penyimpangan morfologi dari kerangka normal spermatozoa dianggap sebagai bentuk-bentuk abnormal. Abnormal ini diklasifikasikan dalam abnormalitas primer dan sekunder. Abnormal primer disebabkan oleh gangguan dalam testis (kelainan spermatogenesis di dalam tubuli seminiferus). Bentuk yang termasuk abnormalitas primer yaitu : kepala berukuran kecil, kepala rangkap dan membunyai dua ekor. Abnormalitas sekunder disebabkan karena perlakuan terlalu kasar, terlalu panas atau terlalu cepat didinginkan. Bentuknya yaitu : kepala lepas, ekornya patah dan ekornya bergelung, bengkok atau melipat. Semen atau milt yang cukup jumlahnya dan baik kualitasnya adalah salah satu faktor yang harus tersedia agar proses fertilisasi terjadi secara baik bagi spesies ikan. Beberapa studi sudah dapat mendeskripsikan karakteristik dari semen atau milt yang berkualitas. Contohnya adalah daya tahan, motilitas dan komposisi cairan sperma. Cairan sperma memiliki komposisi yang unik, yaitu terdiri dari komponen organik dan anorganik. Kedua komponen tersebut sangat mempengaruhi kualitas dari sperma. Contoh dari komponen-komponen tersebut adalah mineral (potasium, sodium, magnesium, kalsium dan klorida), pH, protein, glukosa dan trigliserida. Bagaimanapun, komposisi cairan semen, motilitas dan daya tahan spermatozoasangat mempengaruhi kemampuan spermatozoa itu sendiri dalam melakukan proses fertilisasi nantinya (Hajirezaee et al., 2009).Spermatozoa Ikan Nilem termasuk spermatozoa flagellata, karena mempunyai ekor flagellata yang panjang. Spermatozoa yang sudah matang terdiri dari kepala, leher dan ekor. Kepala sebagai penerobos jalan menuju dan masuk ke dalam ovum, dan membawa bahan genetis yang akan diwariskan kepada anak-cucu. Leher sebagai penghubung antara kepala dan ekor. Ekor untuk pergerakanmenuju tempat pembuahan dan untuk mendorong kepala menerobos selaput ovum(Yatim, 1982).

IV. KESIMPULAN DAN SARANA. KesimpulanBerdasarkan hasil pengamatan dan pembahasan, maka dapat diambil kesimpulan bahwa :1. Analisis spermatozoa dapat dilakukan dengan pengamatan mikroskopis (volume milt, jumlah spermatozoa/ml milt, viabilitas spermatozoa) dan pengamatan makroskopis (volume milt, warna, pH dan viskositas).2. Hasil pengamatan menunjukan volume milt yang diperoleh dari Ikan Nilem sebanyak 1 ml, viskositas terjadi selama 9 menit, milt berwarna putih susu, jumlah sperma yang motil 80%, jumlah sperma non-motil 20%, jumlah total spermatozoa yang diperoleh adalah 4,15 x 1010 sel/ml. 3. Hasil pengamatan yang diperoleh menunjukkan bahwa sperma Ikan Nilem tersebut berkualitas baik.B. SaranPraktikum analisis sperma kali ini sebaiknya dilakukan secara teliti dan cermat pada setiap paramater yang diamati karena pada pengamatan di mikroskop sering terjadi ketidakjelasan perhitungan sperma pada bilik hitung haemocytometer. Sebaiknya disediakan lebih banyak hewan uji, sehingga masing-masing kelompok memiliki jumlah semen untuk analisis yang lebih banyak.

DAFTAR REFERENSIAsmawi. 1989. Pemeliharaan Ikan dalam Keramba. Gramedia, Jakarta.Check JH, Bollendorf A, Pres M, Blue T. 2011. Standard sperm morphology as a predictor of male fertility potential. Arch Androl 192(28): 39-41. Djanuar, R. 2013. Fisiologi Reproduksi dan Inseminasi. Gajah Mada University Press, Yogyakarta.Faqih, A. Rahem. 2011. Penurunan Motilitas dan Daya Fertilitas Sperma Ikan Lele Dumbo (Clarias spp) Pasca Perlakuan Stress Kejutan Listrik. J.Exp.Life Sci 1(2): 56-110.Fauvel, C., Suquet, M., Cosson, J. 2011. Evaluation of fish sperm quality. Journal of Applied Ichthyology 26(5): 636643.Groison, A.L, Fauvel, C, Suquet, M, Kjesbu, Le Cozs, Mayer, J. Consson. 2011. Some characteristics of sperm motility in European hake. Merluccius, Berlin.Hajirezaee, S., Amiri, B.M., Mirvaghefi, A.R. 2009. Effects of Stripping Frequency on Semen Quality of Endongered Caspian Brown Trout, Salmotruttacaspius. American Journal of Veterinary Sciences 4 (3): 65-71.Hora dan Pillay. 2012. Biology of Farmed Fish. Sheffield Academic Press, England.Jamieson, B.G. M. 2009. Fish Evolution and Systematics: Evidence from Spermatozoa (With a survey of echinoderm and protochordate sperm and an account of gamete cryopreservation). Cambridge University Press, New York.Jasin, M. 1989. Sistematika Hewan (Invertebrata dan Vertebrata). Sinar Wijaya, Surabaya. Lagler, K. F. 2011. Ichthyology, Second Edition. John Willey & Sons Inc, USA.Nuah, Japet. 2011. Karakteristik Semen Ikan Ekonomis Budidaya : Mas (Cyperus carpio) dan Patin (Pangasius hypophthalmus), Universitas Lambung Mangkurat, Kalimantan Selatan.Omer, L.T., Sadiman, K.A., Faruk, A., Umit, G. 2012. Semen Analysis From A Point Of View Of Gynecologist And Recent Developments. Journal of Turkish Society of Obstetrics and Gynecology 9(1): 25-31.Partodiharjo, Soebadi. 1990. Ilmu Reproduksi Hewan. Mutiara Sumber Widya, Surabaya.Perry, J. M. 2011. Semi-Automated Scoring of Triple-probe FISH in Human Sperm: Methods and Further Validation. The George Washington University, Washington DC.Rugh, R. 2010. Experimental Emrbryology. Burger Publishing Company, Minnesota.Soeminto. 2002. Pembentukan Ikan Jantan Homogamet (XX) lewat Ginosenis dan Pemberian Andriol pada Ikan Nilem (Osteocillus hasselti CV). Fakultas Biologi Unsoed, Purwokerto.Sutisna, D. H. dan Sutarmanto. 2012. Pembenihan Ikan Air Tawar. Kanisius : Yogyakarta.Viveiros, A.F. Nascimento, L.H. Orfoa, Z.A. Isa. 2011. Motility and fertility of the subtropical fresh water fish streak edprochilod (Prochilodus lineatus) sperm cryopreservedin powdered coconut water. Elsevier. University of Lavras, ULFA.Yatim, W. 1982. Embryologi untuk Mahasiswa Biologi dan Kedokteran. Tarsito , Bandung.