ACARA IVAMPLIFIKASI DNA MENGGUNAKAN PCR

A. Pendahuluan1. Latar Belakang

PCR adalah suatu metode in vitro yang digunakan untukmensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primeroligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapitdua target DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesanamplifikasi sekuens DNA yang diperoleh menyebabkan teknik inisemakin luas penggunaannya.Polymerase Chain Reaction (PCR) adalahmetode untuk amplifikasi (perbanyakan) primer oligonukleotidadiarahkan secara enzimatik urutan DNA spesifik. Teknik ini mampumemperbanyak sebuah urutan 105-106-kali lipat dari jumlah nanogramDNA template dalam latar belakang besar pada sequence yang tidakrelevan (misalnya dari total DNA genomik).

Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai PolymeraseChain Reaction (PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untukmelipatgandakan suatu sekuens nukleotida tertentu secara in vitro.Metode ini dikembangkan pertama kali oleh Kary B. Mulis pada tahun1985. Metode ini sekarang telah banyak digunakan untuk berbagai macammanipulasi dan analisis genetic. Pada awal perkembanganya metode inihanya digunakan untuk melipatgandakan molekul DNA, tetapi kemudiandikembangkan lebih lanjut sehingga dapat digunakan pula untukmelipatgandakan dan melakukan kuantitas molekul mRNA.

PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri daritiga tahap berurutan, yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA templat,penempelan (annealing) pasangan primer pada DNA target danpemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikaalisisoleh DNA polimerase. Konsep asli teknologi PCR mensyaratkan bahwabagian tertentu sekuen DNA yang akan dilipatgandakan harus diketahui

terlebih dahulu sebelum proses pelipatgandaan tersebut dapat dilakukan.Sekuen yang diketahui tersebut penting untuk menyediakan primer, yaitusuatu sekuens oligonukleotida pendek yang berfungsi mengawali sintesisrantai DNA dalam reaksi berantai polimerasi.

2. TujuanPraktikum Amplifikasi DNA menggunakan PCR bertujuan untuk :

a. Untuk mengetahui apa yang dimaksud dengan Polymerase ChainReaction (PCR).

b. Untuk mengetahui apa saja tahapan-tahapan Polymerase ChainReaction (PCR).

c. Untuk mengetahui alat dan bahan apa saja yang dibutuhkan dalamPolymerase Chain Reaction (PCR).

d. Untuk mengetahui apakah komponen-komponen yang dibutuhkandalam proses Polymerase Chain Reaction (PCR).

e. Untuk mengetahui apa saja variasi dari Polymerase Chain Reaction(PCR).

3. Waktu dan Tempat PraktikumPraktikum Amplifikasi DNA menggunakan PCRdilaksanakan

pada hari Senin, 20 April 2015 pukul 11.15-13.15 WIB di LaboratoriumBioteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta.

B. Tinjauan PustakaPenanda molekuler yang banyak digunakan dalam analisis keragaman

genetik tumbuhan, salah satunya adalah RAPD (Random AmplifiedPolymorphic DNA). Marka molekuler ini dapat berbasis PCR (PolymeraseChain Reaction) yang banyak digunakan dalam mengidentifikasi keragamanpada tingkat intraspesies maupun antarspesies. Teknik ini digunakan untukmengidentifikasi genotipe tumbuhan, karena memiliki kelebihan dalampelaksanaan dan analisisnya. Kelebihan teknik RAPD lebih murah, mudahdilakukan, cepat memberikan hasil, menghasilkan polimorfisme pita DNAdalam jumlah banyak dan mudah memperoleh primer acak yang diperlukanuntuk menganalisis genom semua jenis organisme (Fajarwati et al. 2012).

PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah suatu metode enzimatisdigunakan untuk amplifikasi DNA dengan cara in vitro. Proses PCRmemerlukan beberapa komponen utama, yaitu DNA cetakan, Oligonukleotidaprimer, Deoksiribonukelotida trifosfat (dNTP), Enzim DNA Polimerase, dansenyawa buffer. Proses PCR menggunakan menggunakan alat termosiklusyaitu sebuah mesin yang memiliki kemampuan untuk memanaskan sekaligusmendinginkan tabung reaksi dan mengatur temperatur untuk tiap tahapanreaksi. Tahapan penting dalam proses PCR yang selalu terulang dalam 30-40siklus dan berlangsung dengn cepat yaitu denaturasi, anneling, danpemanjangan untai DNA (Yusuf 2010).

PCR (Polymerase Chain Reaction) atau reaksi berantai polimeraseadalah suatu metode enzimatis untuk memperbanyak secara eksponensialsuatu sekuen nukleotida tertentu secara invitro. PCR pertama kalidikembangkan oleh Kary Mullis pada tahun 1985 seorang peneliti dariCETUS Corporation. PCR dapat melipat memperbanyak molekul DNA danmemisahkan gen-gen; kelebihan metode ini adalah suhu yang dapat tinggidan rendah dengan cepat selain itu PCR juga bekerja dengan komponen yangjumlahnya sedikit (Sasika et al. 2011).

Metoda PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkanjutaan kali dari jumlah semula, sekitar 106-107 kali. Setiap urutan basanukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap nsiklus PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Kunci utamapengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanyapada urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target(Fatchiyah 2012).

Amplifikasi DNA genom dilakukan dengan cara tabung PCR berisiPuRe TaqTM Ready To-GoTM berbentuk butiran (Kit) (GE Healthcare)dilarutkan dengan ddH2O lalu ditambahkan 2,5 l RAPD primer dan 1 l

DNA contoh sehingga total larutan untuk tiap reaksi menjadi 25 l. Masing-

masing tabung berisi contoh diamplifikasi dengan pemanasan pendahuluanpada 95C selama 5 menit sebanyak satu siklus diikuti 45 siklus yang terdiri

atas pemanasan untuk denaturasi pada 95C selama 1 menit, anealing padasuhu 36C selama 1 menit, pemanjangan pada suhu 72C selama 2 menit, danpada siklus terakhir ditambah waktu pemanjangan pada suhu 72 C selama 10menit (Andriana 2009).

Perkembangan teknik penanda molekuler makin maju dengan adanyareaksi amplifikasi DNA menggunakan metode PCR (Polymerase ChainReaction) dan kemudian dipisahkan pita DNA-nya dengan elektroforesis.Berbagai jenis penanda DNA berbasis PCR dan elektroforesis sederhanaseperti RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA), STS (Sequence TagSite), SSR (Simple Sequence Repeat), telah banyak digunakan untuk analisissidik jari DNA tanaman dengan bermacam-macam tujuan (BLP 2011).

C. Alat, Bahan dan Cara Kerja1. Alat

a. PCR tubeb. PCRc. Tabung eppendorfd. Thermacycle

2. Bahan

a. Primer mix

b. Aquabidestc. DNA template

d. PCR mix3. Cara Kerja

a. Menyiapkan PCR tube kemudian memasukkan 10 ml PCR mixb. Memasukkan 7l aquabidest dan memasukkan 2l DNA templatec. Memasukkan 1 l primer mix kemudian menghomogenkan larutan

dengan menggojogd. Memasukkan ke dalam PCR dan melakukan denaturasi dengan suhu

95oCe. Melakukan anneling dengan suhu 37oC selama 45 menit kemudian

ekstension dengan suhu 72oC selama 1 menit

f. Pemanjangan akhir suhu 72oC selama 7 menit dan mengulangi prosestersebut hingga 35 siklus lalu menyimpan suhu 4oC

D. Hasil dan Pembahasan1. Hasil Pengamatan

PCR Mix

Primer mix

DNAtemplate

Aquadest

PCR Mix

1. Menyiapkan 4 bahan utama yang disebut PCR primeryang terdiri dari taq DNA polymerase, Mgcl2, DNTPSdan buffer ekstruksi sebanyak 10 l yang dimasukkan kedalam microtube

10 l

7 l Aquadest

2. Menambahakan aquades 7 l Cold H2O CH clumer

Primer

DNA template3. Menambahkan primer sesuai yang diinginkan sebesar 1l

4. Memasukkan microtube ke dalam PCR di dalam PCRakan terjadi 3 proses yaitu denaturasi annealing danextension.

5. Hasil Amplifikasi DNA diperoleh

2. PembahasanPCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua

primer, hanya di dalam tabung reaksi, tanpa perlu memasukkannya kedalam sel (in vivo). Pada proses PCR dibutuhkan DNA untai ganda yangberfungsi sebagai cetakan (templat) yang mengandung DNA-target (yangakan diamplifikasi) untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim DNApolimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primeroligonukleotida. Pada kondisi tertentu, kedua primer akan mengenali danberikatan dengan untaian DNA komplemennya yang terletak pada awaldan akhir fragmen DNA target, sehingga kedua primer tersebut akanmenyediakan gugus hidroksil bebas pada karbon 3. Setelah kedua primer

menempel pada DNA templat, DNA polimerase mengkatalisis prosespemanjangan kedua primer dengan menambahkan nukleotida yangkomplemen dengan urutan nukleotida templat. DNA polimerasemengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara OH pada karbon 3

dengan gugus 5 fosfat dNTP yang ditambahkan. Sehingga proses

penambahan dNTP yang dikatalisis oleh enzim DNA polimerase iniberlangsung dengan arah 53 dan disebut reaksi polimerisasi. Enzim

DNA polimerase hanya akan menambahkan dNTP yang komplemendengan nukleotida yang terdapat pada rantai DNA templat.

Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR(kependekan dari istilah bahasa Inggris polymerase chain reaction)

merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secaraenzimatik tanpa menggunakan organisme. DNA dapat dihasilkan dalamjumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkanberbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis olehKary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel padatahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukandi bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanyamemerlukan jumlah sampel yang kecil.

Prinsip kerja PCR, yaitu isolasi DNA sampel dari bahan klinisatau dari jaringan yang disimpan pada parafin, proses amplifikasi DNAyang telah diisolasi. Proses amplifikasi sendiri terbagi tiga tahapan yaitudenaturasi, annealing, dan elongasi. Tahapan denaturasi terjadi pada suhu970C. Pada proses ini terjadi denaturasi linearisasi DNA. Tahap keduaadalah penempelan primer atau annealing pada DNA target yang akandiperbanyak, membutuhkan suhu sekitar 550C. Tahap ketiga adalahelongasi (polimerisasi) membutuhkan suhu 720C agar siklus polimerisasilebih optimal (Sasika et al. 2011).

Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotidapendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantaiatau polimerisasi DNA. Jadi jangan membayangkan kalau PCR mampumenggandakan seluruh DNA bakteri E. coli yang panjangnya kira-kira 3juta bp itu. PCR hanya mampu menggandakan DNA pada daerah tertentusepanjang maksimum 10000 bp saja, dan dengan teknik tertentu bisasampai 40000 bp. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yangkomplemen dengan DNA template, jadi dirancang agar menempelmengapit daerah tertentu yang kita inginkan.

DNA memiliki kualitas yang baik bila nilai rasio absorbansi260/280 nm sebesar 1,8-2,0. Kualitas DNA yang baik menjadi syarat padaproses PCR. DNA yang sudah diukur konsentrasinya diencerkansehingga mendapatkan konsentrasi yang seragam untuk digunakandalama nalisis PCR. Selanjutnya dilakukan pengecekan kualitas DNA

dengan elektroforesis gel untuk mengetahui tingkat kemurnian DNA darikontaminan RNA dan keutuhan DNA hasil isolasi.

Dengan menggunakan teknik PCR, panjang fragmen DNA yangdapat diamplifikasi mencapai 35 kilo basa. Amplifikasi fragmen DNApendek (kurang dari tiga kilo basa) relatif lebih mudah dilakukan. Untukmengamplifikasi fragmen DNA panjang (lebih besar dari tiga kilo basa)memerlukan beberapa kondisi khusus, di antaranya adalah diperlukanpolimerase DNA dengan aktivitas yang kuat dan juga buffer PCR denganpH dan kapasitas tinggi (High-salt buffer).

Pada tahap denaturasi, pasangan untai DNA templat dipisahkansatu sama lain sehingga menjadi untai tunggal. Pada tahap selanjutnya,masing-masing untai tunggal akan ditempeli oleh primer. Jadi, ada duabuah primer yang masing-masing menempel pada untai tunggal DNAtemplat. Biasanya, kedua primer tersebut dinamakan primer maju(forward primer) dan primer mundur(reverse primer). Setelah menempelpada untai DNA templat, primer mengalami polimerisasi mulai daritempat penempelannya hingga ujung 5 DNA templat (ingat polimerisasi

DNA selalu berjalan dari ujung 5 ke 3 atau berarti dari ujung 3 ke 5

untai templatnya). Dengan demikian, pada akhir putaran reaksi pertamaakan diperoleh dua pasang untai DNA jika DNA templat awalnya berupasepasang untai DNA.

Pasangan-pasangan untai DNA yang diperoleh pada suatu akhirputaran reaksi akan menjadi templat pada putaran reaksi berikutnya.Begitu seterusnya hingga pada putaran yang ke n diharapkan akandiperoleh fragmen DNA pendek sebanyak 2n 2n. Fragmen DNA pendekyang dimaksudkan adalah fragmen yang ukurannya sama dengan jarakantara kedua tempat penempelan primer. Fragmen pendek inilah yangmerupakan urutan target yang memang dikehendaki untuk digandakan(diamplifikasi).

E. Kesimpulan dan Saran1. Kesimpulan

Berdasarkan pembahasan mengenai amplifikasi DNA denganPCR di atas dapat disimpulkan sebagai berikut:a. PCR (Polimerase Chain Reaction) adalah suatu teknik untk

mensintesis asam nukleat atau gen tertentu in vitro secara

enzimatis. PCR merupakan teknik yang sensitive, spesifik dansingkat.

b. Setiap amplifikasi PCR terdiri atas tiga tahap utama yaitudenaturasi, annealing dan ekstensi, beserta dua tahapan pendukungyaitu pra-denaturasi dan final elongasi.

c. Amplifikasi DNA harus menggunakan DNA dengan kualitas yangbaik. DNA memiliki kualitas yang baik bila nilai rasio absorbansi260/280 nm sebesar 1,8-2,0.

2. SaranSaran untuk praktikum Amplifikasi DNA menggunakan PCR

ini adalah sebaiknya praktikan secara langsung melakukanamplifikasi, sehingga para praktikan lebih jelas dalam metodeamplifikasi.

DAFTAR PUSTAKA

Ardiana DW 2009. Teknik Isolasi Dna Genom Tanaman Pepaya Dan JerukDengan Menggunakan Modifikasi Bufer CTAB. Buletin Teknik Pertanian14 (1): 12-16.

Badan Litbang Pertanian 2011. Metode PCR (Polymerase Chain Reaction)CaraMengidentifikasi Padi Bermutu Rasa Tinggi. Sinar Tani.

Fajarwati LI, Muh. Restu dan Tutik K 2012. Optimalisasi Suhu dan LamaInkubasi dalam Ekstraksi DNA Tanaman Bitti (Vitex Cofassus Reinw)serta Analisis Keragaman Genetik dengan Teknik RAPD-PCR. JurnalSains & Teknologi (3): 265 276.

Fatchiyah, Sri W, Estri LA, dan Sofi P 2012. Buku PraktikumTeknik AnalisaBiologi Molekuler. Malang: Universitas Brawijaya.

Sasika NS, Ratu S, Sri HH, dan Sukma N 2011. Perbandingan Beberapa MetodeMolekuler dalam Uji DNA HPV (Human Papillomavirus). JurnalTeknik 38(5): 356-358.

Yusuf ZK 2010. POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR). Saintek 5(6): 1-6.