Vai trò và ý nghĩa các xét nghiệmsinh học phân tử trong trong nghiêncứu và chẩn đoán bệnh nhiễm trùng

Phạm Hùng Vân*

*Bác Sĩ Y Khoa, Tiến Sĩ Y Học. Giảng viên Bộ Môn Vi Sinh, Khoa Y, Đại Học Y Dược TP. HCM,Phó Phòng Thí Nghiệm Trung Tâm Đại Học Y Dược TP.HCM.

Cần xét nghiệm kịp thời và nhạy cảm hơn để chẩn đoán phát hiện

các tác nhân vi sinh gây bệnh

q Xét nghiệm tìm AFB khôngxác định được lao

q Khá nhiều trường hợp laophổi mà soi không thấy, cấykhông ra

q Các trường hợp lao ngoàiphổi rất khó chẩn đoán xácđịnh như lao màng não, laokhớp, lao màng bụng, laomàng tim, lao xương

q Phải có kết quả kháng sinhđồ sớm để biết có đa khángkhông

Xét nghiệm PCR cho Lao

TB-PCR đã được nghiên cứu đánh giá là hữu dụng lâm sàng

PCR Culture AF stainingPulmonary TB

Se 94% 77% 64%Sp 97% 99% 90%

Extrapul. TBSe 75% 67% 27%Sp 99% 100% 61%

TB meningitisSe 48% 39% 9%Sp 100% 100% 100%

KIT, Amsterdam, 1996

Phát hiện BKSo sánh PCR với ZN trên 132 mẫu đàm

Dương Âm

PCR

22 1

9217

39 93

23

109

132(30%)

(17%)

Nguyễn Văn Thịnh - 2002

RT-PCR chẩn đoán sớm sốt Dengue và SXH Dengue

0102030405060708090

100

N4 N5 N6 N11

39%

56%

72%

100%

Độ nhạy của MAC-ELISA theo ngày bệnh

Vuõ Thò Queá Höông (2000)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

IgM(Keùo daøi 30-60 ngaøy)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

IgG (laàn ñaàu)(Keùo daøi suoát ñôøi)

IgG (caùc laàn sau)(Keùo daøi suoát ñôøi)

-3 -2 -1 0

Viremia ñaït raát cao trongnhöõng ngaøy ñaàu

100 beänh nhaân SXHSo saùnh keát quaû giöõa PCR vaø IgM theo ngaøy beänh

0

20

40

60

80

100

N2 (n=31) N3 (n=32) N4-N7 (n=37)

99% 95%85%

61%

75%84%

IgMPCR

PCR coù khaû naêng phaùt hieän SXH ngay trong nhöõng ngaøy ñaàu cuûa beänh

Nguyeãn Vaên Thònh vaø CS., 2004

0102030405060708090

100

100 beänh nhaân SXHSo saùnh keát quaû giöõa PCR vaø IgM theo tieåu caàu

<100.000/mm3

98% 82%88%93%

67%

38%

IgMPCR

100.000-150.000/mm3

>150.000/mm3

PCR coù khaû naêng phaùt hieän SXH ngay caû khi chöa coù bieán ñoåi soá löôïng TCaàu

Nguyeãn Vaên Thònh vaø CS., 2004

Cần một giải pháp toàn diện để chẩn đoán/theo dõi điều trị

viêm gan B và viêm gan C mạn tính

WHO 2001

Nhiễm viêm gan siêu vi B (HBV)

Xét nghiệm sinh học phân tử cho viêm gan B

qPCR định lượng HBV-DNA

HBsAg [+]

HBVDNA [+]

qHBVDNA

≥105

ALT

ALT↑ ALT Normal

Biopsieor Fibroscan

AFP

Bất thường

Điều trị

qHBVDNA/3th

LamR, AdfR≥105

Phát hiện đột biến precore

Phát hiện đột biến kháng thuốc

PCR phát hiện HBV-DNA và định lượng

ALT 19u/ml: NữALT 33u/ml: Nam

Ann Intern Med. 2002;137:1-9. Updated Definitions of Healthy Ranges for Serum Alanine Aminotransferase Levels. Daniele Prati, MD; Emanuela Taioli, MD, PhD; et Al.

Phát hiện đột biến precore

Schering-Plough

Nhiễm viêm gan siêu vi C (HCV)

Nhiễm HCV (100)(Phase cấp)

Mạn tính85% (85)

Xơ gan20% (17)

Ung thư ganXơ gan tiến triển

25% (4.5)

Khỏi15% (15)

Ổn định80% (68)

Diễn tiến chậm75% (13)

Diễn tiến nhiễm HCV

Genotype - 1Điều trị 48 tuần

Genotype non-1Điều trị 24 tuần

Định lượngHCV genotype

Không giảm hơn 2 log10Giảm hơn 2 log10 hay âm tính

HCV-RNA

Cuối điều trịHCV-RNA

Tuần 12 (4)Định lượng

Cân nhắc ngưng điều trị

Theo dõi sau 6 thángHCV-RNA

HCV RNA (+)Không đáp ứng

HCV RNA (+)Tái phát

HCV RNA (-)Đáp ứng

(2002 NIH Consensus Conference)

Xét nghiệm sinh học phân tử cho viêm gan C

RT-qPCR ñònh löôïng HCV-RNA

Ñònh genotype HCV

RT-qPCR ñònh löôïng HCV-RNA

RT-PCR phaùt hieän HCV-RNA

Thực tế đã đòi hỏi các nhà khoahọc, đặc biệt là các nhà y họcphải nhanh chóng phát triển vàứng dụng các kỹ thuật sinh họcphân tử hiện đại, nhất là PCR vàreal-time PCR vào chẩn đoán vàhổ trợ cho theo dõi điều trị bệnhnhân tại Việt Nam

PCR dựa trên nguyên tắc khuếch đại rồi phát hiện đọan DNA đặc hiệu nên đạt được độ nhạy và đặc hiệu cao

Target DNA

1 DenaturaN (94oC)

2 Anealing (55-65oC)

3 Extension (72o C)

1

2

3

4

n2n

PCR và real-time PCR làmột kỹ thuật mở nên đã vàđang trở thành một công cụtốt nhất áp dụng được trongchẩn đóan với giá thànhchấp nhận được

Ñònh danh döïa vaøo kieåu hình sinh vaät hoùa hoïc bieåu hieän töø caùc kieåu gen

Xaùc ñònh döïa vaøo kích thöôùc ñoaïn gen hay moät trình töï ñaëc hieäu cuûa ñoaïn gen

Nuoâi caáy PCR

PCR chính laø nuoâi caáy phaân töû khueách ñaïi ñoaïn gen

Ø Phoøng thí nghieäm PCR trong phaùt hieäntaùc nhaân VSV gaây beänh chính laø phoøngthí nghieäm vi sinh vôùi vai troø nuoâi caáyphaân töû töông töï phoøng thí nghieäm visinh vôùi vai troø nuoâi caáy boä gene.

Ø Do vaäy phaùt trieån PCR phaùt hieän taùcnhaân vi sinh vaät gaây beänh phaûi phaùttrieån taïi phoøng thí nghieäm vi sinh

q Tác nhân virus cần phải phát hiện để sớm có biện pháp theo dõi (Dengue, HPV), điều trị (HSV), theo dõi hiệu quả điều trị (HIV/AIDS), hay phòng ngừa (H5N1, H1N1, SARS)

q Tác nhân vi khuẩn nhưng các phương pháp truyền thống không nhạy, không kịp thời (Chlamydia, Lậu kinh niên)

q Các tác nhân gây dịch và sẽ không an toàn nếu làm xét nghiệm với các phương pháp vi sinh truyền thống tại các phòng xét nghiệm lâm sàng chưa có an toàn cấp độ 3 (H5N1, H1N1, SARS, tác nhân khủng bố sinh học)

Phát hiện và hay định lượng tác nhân vi sinh vật gây nhiễm trùng trên người và động vật

PCR và real-time PCR là một hệ thống mở do vậy đãcho phép người sử dụng tiếp cận bằng cách thiết kế vàchế tạo các thuốc thử hay bộ xét nghiệm dùng trongchẩn đóan. Tuy nhiên vì phải áp dụng cho chẩn đóancho nên khi tiến hành thực hiện xét nghiệm PCR, ngườilàm xét nghiệm phải chú ý các chuẩn mực kiểm sóatcác sai lầm trong quá trình làm xét nghiệm và ngườicho chỉ định cũng như sử dụng kết quả cũng phải quantâm đến các chất lượng này cũng như quan tâm đếncác đánh giá ý nghĩa của xét nghiệm

Làm thế nào để áp dụng PCR một cách chính xác và hiệu quả?

Đảm bảo chất lượng khi áp dụng PCR cho chẩn đóan

Đảm bảo chất lượng của việc áp dụng PCR trong chẩn đoán

Chỉ định xét nghiệm PCRLấy và chuyên chở mẫu thử đến phòng xét nghiệm

Thực hiện xét nghiệm PCR tại phòng thí nghiệmPhúc trình kết quả xét nghiệm đến lâm sàng

Phân tích các kết quả xét nghiệmSử dụng các kết quả trong chẩn đoán và điều trị

Lấy và chuyển mẫu thử đi làm xét nghiệm PCR/realtime PCR

Chuẩn bị mẫu thử và tách chiết nucleic acid từ mẫu thử

Thực hiện phản ứng khuếch đại nucleic acid (PCR/real-time PCR)

Làm thí nghiệm để đọc kết quảPhân tích kết quả

Các vấn đề kỹ thuật trong lấy và gửi mẫu thử

Các vấn đề kỹ thuật trong tách chiết nucleic acid (NA)

Các vấn đề kỹ thuật trong khuếch đại NA

Các vấn đề kỹ thuật trong thí nghiệm đọc KQ và trong phân tích KQ

Sử dụng kết quả xét nghiệm PCR/real-time PCR

Các vấn đề kỹ thuật trong sử dụng kết quả

Vấn đề ngăn ngừa nhiễm

chéo và loại trừ ngoại nhiễm

sản phẩm khuếch đại

Qui trình xét nghiệm PCR và các điểm kiểm sóat chất lượng

Để đảm bảo được một xét nghiệm PCR chính xác thì trước hết phải kiểm sóat cho được khâu lấy mẫu, vận chuyển mẫu, và lưu giữ mẫu cho đến khi làm xét nghiệm.

Lấy, lưu trữ và chuyên chở mẫu thử

q Đúng vị tríq Đúng thời điểmq Đúng cáchq Đúng vật chứa Tinh sạch sinh học,

dùng một lầnq Đúng lưu trữ và chuyên chở

Lạnh hay đông lạnh

Đảm bảo có mặt VSV trong mẫu thử

Để đảm bảo có mặt nucleic acid của tác nhân vi sinh vật cần phát hiện và nucleic acid này không bị ly giải hay bị ức chế

Tránh ức chế

Vật liệu lấy mẫu

Các kiểm soát chất lượng tại phòng xét nghiệm

Bệnh phẩm

PCR

Kết quả

Tất cả các thuốc thử được pha chế hay cung cấpđược kiểm tra chất lượng phải có bằng chứngkiểm tra chất lượng cho thấy phương pháp kiểmtra như thế nào, cách đánh giá thế nào là đạt, vàkết quả kiểm tra chất lượng của thuốc thử đó.

Phải có đủ các chứng ở dạng bền vững để giúpngười sử dụng kiểm soát độ nhạy của các thànhphần trong bộ thử nghiệm và qui trình thử nghiệm

Người sử dụng các thuốc thử này phải kiểm trakhi nhận thuốc thử và lưu lại cho đến khi dùngxong

Một ví dụ kết quả kiểm tra chất lượng PCR mix dành cho PCR phát hiện HBV và PCR phát hiện M. tuberculosis

Đối với người làm xét nghiệm thì cũng phải có cácchứng và chuẩn để kiểm tra chất lượng của cáckhâu làm xét nghiệm bao gồm cả kiểm tra chấtlượng của các thuốc thử đang dùng có còn giữđược chất lượng hay không, kiểm tra các bước xétnghiệm có cơ sót không, và trong real-time PCRcòn phải đánh giá độ chính xác của định lượng

Bệnh phẩm

Chuẩn bị

Tách chiết nucleic acid

Chạy PCR

Phát hiện sản phẩm PCR

Kiểm sóat độ nhạy của khâu tách chiết NA

Kiểm sóat nguy cơ ngọai nhiễm trong quá trình

tách chiết NA

Kiểm sóat độ nhạy của quá

trình khuếch đại

Kiểm sóat nguycơ ngọai nhiễm vàức chế trong quátrình khuếch đại

Kiểm sóat độ chính xác của định lượng (qPCR

STD

-1

STD

-2

STD

-3

C[-]

+ IC

Sam

ple

+IC

PCR

Mẫu Internal Control (IC)

NA extraction

Internal Control (IC)

NA extraction

C[-]

STD

-1

STD

-2

STD

-3

STD

-1

STD

-2

STD

-3

STD

-1

STD

-2

STD

-3

C[-]

+ IC

Sam

ple

+IC

PCR

Mẫu Internal Control (IC)

NA extraction

Internal Control (IC)

NA extraction

C[-]Internal Control (IC)

NA extraction

C[-]

STD

-1

STD

-2

STD

-3

STD

-1

STD

-2

STD

-3

Một xét nghiệm PCR định tính chuẩn mực

Một xét nghiệm qPCR định lượng chuẩn mực

Giá trị copies

của đường chuẩn

Một xét nghiệm qPCR định lượng chuẩn mực

Nếu làm xét nghiệm PCR với

• Các thuốc thử đã được kiểm tra chất lượng vớicác bằng chứng được lưu giữ, và

• Khi làm xét nghiệm PCR có thực hiện đượccác chứng kiểm sóat chất lượng và kết quảPCR cho thấy các chuẩn kiểm sóat chất lượngđều vượt qua được

Thì kết quả PCR luôn đảm bảo được sự chính xáctừ lúc bệnh phẩm được đưa vào xét nghiệm.

Sử dụng kết quả PCRKết quả PCR [+] có cho là bn đang bị bệnh không?

• Xác định được bệnh nhân bị nhiễm tác nhân gây bệnh

• Không khẳng định bệnh nhân bị bệnh mà còn tùy thuộc nhiều yếu tố:Vd: Bệnh lao cần thêm X-quang, lâm sàng

Viên gan B mạn tính cần thêm số lượng HBV-DNA và men gan

Sử dụng kết quả PCRKết quả PCR [-] có cho là bn không bị nhiễm?

• Xác định được tác nhân gây bệnh không có mặt trong bệnh phẩm thử nghiệm

• Không khẳng định bệnh nhân không nhiễm tác nhân gây bệnh:Vd: HBV-DNA [-] mà HbsAg [+]

HCV-RNA [-] mà anti-HCV [+]HIV-RNA [-] mà anti HIV [+]

Sử dụng kết quả PCRKết quả định lượng nên phân tích như thế nào?

• Không so sánh số copies mà chỉ nên so sánh giá trị Log vì chỉ khảng định khác biệt định lượng có ý nghĩa khi kết quả hai lần thử chênh nhau 100 lần

• Vd: 425,379,000 copies so với 117,318,000 copies4.25 Log 8 copies so với 1.17 Log 8 copies

• Nhận định như vậy sẽ tránh lạm dụng xét nghiệm định lượng

Chìa khóa cho chất lượng PCR áp dụng trong chẩn đoán

Thực tế cũng đòi hỏi các nhà khoahọc, đặc biệt là các nhà y họcngòai kỹ thuật PCR, phải nhanhchóng phát triển và ứng dụng cáckỹ thuật sinh học phân tử hiện đạikhác

Giải trình tự bằng điện di mao quản

CEQ-8000 ABI 3130XL

Giải trình tự là hệ thống mở rất sẵn sàng cho các xétnghiệm chẩn đoán

§ Xác định genotype

§ Phát hiện đột biến kháng thuốc (virus, vi khuẩn)

§ Phát hiện bệnh lý di truyền tiền sanh cho thai nhi

§ Phát hiện ung thư nhạy hay kháng thuốc

§ Phát hiện và định danh trực tiếp tác nhân vi sinh có trong mẫu bệnh phẩm mà không cần qua nuôi cấy

§ …

Xác định Genotype HCV

ØPhương pháp real-time

ØPhương pháp InoLIPA

ØPhương pháp giải trình tự

Real-time PCR được một số cơ sở ứng dụng tại VN thật sự chưa đáng tin cậy

Lý do: Thiết kế probe còn chéo các genotype khác nhau

?

?

Xaùc ñònh genotype HCVso saùnh giaûi trình töï vaø InoLIPA (234 maãu)

HCV – cDNA5’NC

Real-time TQ PCR

HCV2 HCV1

HCV3

PCR sequencing

Ethanol precipitation

PCR product# 240bp

Kết hợp định lượng và định genotype HCV (bằng giải trình tự)

Định genotype HCV hữu dụng lâm sàngchỉ có phương pháp giải trình tự 5’-NC

Phân bố genotype HCVKết quả 2000 mẫu thực hiện tại NK-BIOTEK 2009

Xác định genotype HBV Tìm đột biến kháng thuốc của HBV

BS nên cho chỉ định tìm đột biến kháng thuốc và genotype HBV khi bệnh nhân không đáp ứng điều trị lamuvidine

Phát hiện đột biến kháng thuốc của HBV

ØPhương pháp PCR-RFLP

ØPhương pháp real-time

ØPhương pháp giải trình tự

PCR product# 550bp

HBV – DNA264F 827R

PCR sequencing

827R

567bp

DTCS (Becman Coulter)

PCR95oC/5min94oC/30sec55oC/30sec72oC/1min72oC/10min

40X

Ethanol precipitation

CEQ 8000

Định genotype HBV và phát hiện đột biến kháng thuốc

Kỹ thuật giải trình tự vùng rt gene (Nam Khoa)

Phát hiện kháng Lamivudine, adefovirgiải trình tựgene PreS

Vừa phát hiện nhiều vị trí đột biến(kể cả heterozygote)

Vừa cho kết quả genotype

Định genotype HBV và phát hiện đ.biến YMDD lamivudine-Rkết quả trên 455 mẫu thực hiện 17/4/2007-17/4/2008

C31% B

69%

29.89

8.796.59

0.45

54.28

0

10

20

30

40

50

60

204 204+207 204+180 204+180+207 Khoâng ÑB

Promoter1762, 1764

Tỷ lệ phân bố các kiểu đột biến precore/core promoter phát hiệnđược trong 134 mẫu xét nghiệm tại NK-Biotek năm 2008

Quy trình xét nghiệm vi khuẩn kỵ khíkết hợp vi sinh kinh điển và giải trình tự gen 16S rRNA

Bệnh phẩm

Lấy và chuyên chở bệnh phẩm

Nuôi cấy hiếu khí và kỵ khí Chọn vi khuẩn kỵ khí

Định danh và kháng sinh đồ

Vi sinh kinh điển→ Lấy và chuyên chở bệnh

phẩm.→ Nuôi cấy phân lập tác

nhân nhiễm trùng kỵ khí.→ Kháng sinh đồ bằng

phương pháp pha loãng kháng sinh trong môi trường lỏng

Giải trình tự gen 16SrRNA để định danh vikhuẩn kỵ khí.

11% (n=2)

39% (n=7) 22% (n=4)

17% (n=3)

11% (n=2)

Tác nhân nhiễm trùng kỵ khí phân lập trên 59 bệnh nhân viêm xoang hàm

Peptostreptococcus:ð P. micros (1)

ð P. stomatis (1)

Veillonella

Prevotella buccae

Propionibacterium acnes

Streptococcus:ð S. aginosus (1)

ð S. constellatus (3)

ð S. gordonii (3)

Kiểm tra chất lượng Probiotic dùng cho người

Luận văn Thạc Sĩ CNSH 2008

Tổng kết các kết quả phát hiện và định danh nấm bằng kỹ thuật PCR và giảitrình tự 28s rDNA trong các mẫu bi nấm lấy từ mổ viêm xoang trên bệnh nhân

Luận văn Thạc Sĩ TMH 2008

Một ví dụ trong NSCLC(Non Small Cell Lung Cancer)

NSCLC(Non Small Cell Lung Cancer)

Tiên đoán hiệu quả trị liệu của EGFR tyrosine kinase inhibitor (Gefitinib, erlotinib)

1. Đột biến gene (codon 19, 20, 21): PCR và sequencing (từ DNA cho tưng exon hay tu mRNA cho nhiều exon)

2. Định lượng gene EGFR: FISH, real-time PCR

3. Định lượng biểu hiện gene (Hóa mô miễn dịch, real-time PCR định lượng mRNA

Phát hiện đột biến gene

• Mẫu sinh thiết tươi (phát hiện đột biến trên mRNA và trên từng exon của gene)

• Mẫu sinh thiết paraffin bloc (phát hiện đột biến trên từng exon của gene)

Phát hiện đột biến gene

Kết luận

• Sinh học phân tử ngày càng có nhiều ứng dụng thực tiễn trong chẩn đóan và điều trị

• Các phương pháp tiếp cận không phải quá khó và trang thiết bị cũng không phải quá đắt tiền

• Vấn đề chính yếu là: (1) phải có con người có khả năng xây dựng kỹ thuật và tổ chức phòng thí nghiệm, và (2) các nhà lâm sàng phải có đầy đủ tri thức để ứng dụng