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COLORACION
TM PATRICIA TOLEDO RODRIGUEZ
ACIDO PICRICO
MECANISMOS GENERALES DE COLORACION
• FISICO
• FISICO - QUIMICO
• HISTOQUIMICO
MECANISMO FISICO
1.- colorante es más soluble en el tejido que en el disolvente, ej tinciones de grasas.
2.-impregnaciones: una precipitación selectiva se forman agregados insolubles, quedando atrapado entre la malla de células y fibras que constituyen los tejidos.
IMPREGNACION
MECANISMO FISICO-QUIMICO
• formación de uniones intermoleculares por atracción electroestática (cargas contrarias) o por fuerzas de tensión superficial (debidas a las fuerzas de gravitación generadas al disponerse las moléculas muy próximas entre si)
MECANISMO HISTOQUIMICO
• están basados en el desarrollo de una reacción química entre el colorante (comúnmente un leucoderivado) y la estructura objeto de tinción de forma que al interaccionar ambos produce un nuevo cromógeno responsable del color obtenido.
• PROGRESIVA / REGRESIVA
• DIFERENCIACION
DIFERENCIACION
Es el proceso mediante el cual extraemos el exceso de colorante de una placa histológica posterior a la tinción de la misma. La diferenciación se puede realizar con agua, alcohol, ácidos, bases, soluciones metálicas y combinaciones de estas entre otras. Todo dependerá del colorante que se utilice.
¿COMO SE UNE EL COLORANTE AL
SUSTRATO?
PARTICIPAN
• RELACIONES ELECTROESTATICAS
• ENLACES COORDINADOS
• MORDIENTES
• QUELANTES
• PUENTES DE HIDROGENO
• INTERACCIONES HIDROFOBICAS
• IMPREGNACIONES
RELACIONES ELECTROESTATICAS
• En teoría se forma una sal insoluble entre el colorante y la molécula del tejido de carga opuesta; para hacer más permanente esta unión se usa una técnica complementaria denominada MORDENTACION.
• +++ - - -
•
ATRACCION ELECTROVALENTE
• Dye cationico
proteoglicanoproteina
H3N+
OSO3-
NH3+
SO3-
Dye anionico
TEJIDOS
• SULFATOS
– FOSFATOS
• CARBOXILOS
– FENOLES
FUERMENTE ACIDOS
MORDENTACION
• MORDIENTE = une un colorante a un sustrato
• MORDIENTE son iones metálicos capaces de unirse covalentemente a algunos colorantes para formar complejos (denominados complejos de coordinación)
MORDIENTE
• La molécula que se combina con el ion metálico se denomina LIGANDO. Un ligando tiene dos o más átomos posicionados para formar enlaces coordinados con el mismo ión metálico, se puede formar un complejo estable de tipo QUELATO.
MORDIENTE
• Aluminio - Hierro – Cromo -Molibdeno
• enlaces coordinados =complejos colorante+mordiente +sustrato.
MORDIENTE
• ANTES DURANTE
MORDIENTE
• MORDIENTE COLORANTE
MORDIENTE
• Diferenciación
• OH acido ss mordiente
MORDIENTE
• las coloraciones obtenidas son bastante resistentes a lavados de agua, alcoholes y ácidos débiles; como soluciones diferenciadoras suele utilizarse un ácido más fuerte (alcohol ácido 0,5%) o bien soluciones con mordiente aislado.
ENLACE COVALENTE
• En general el enlace covalente se forma entre el auxocromo y el sustrato (grupos OH o amino)
• COMPLEJO COLORANTE + MORDIENTE + SUSTRATO.
PUENTES DE HIDROGENO
colorante + sustrato
unión es bastante débil
Ss acuosas más débil
En soluciones no acuosas y en el caso de algunas coloraciones de fibras colágenas pueden tener una participación más importante.
FUERZAS DE VANDER WAALS
• Son atracciones electroestáticas entre los electrones de un átomo y el núcleo de otro.
• Se reconocen tres tipos de fuerzas:
• Keesom – Debye - London
• Son importantes para las tinciones de fibras elásticas (más detalle en la clase correspondiente).
Interacciones Hidrofobicas
• Colorante Tinción
• Hidrofóbico Hidrofóbico
• OH solvente
• “Disolución Diferencial”
INTERACCIONES HIDROFOBICAS
En histología se utilizan colorante hidrofóbicos para teñir sustratos hidrofóbicos, ej tinción de lípidos; los colorantes se disuelven en disolventes orgánicos moderadamente polares (alcohol 70%), el colorante Negro Sudan presenta una mayor capacidad de disolución en las grasas que en el disolvente moderadamente polar en el que se prepara, tiñen por “disolución diferencial”
IMPREGNACIONES
• en una impregnación se forman agregados metálicos insolubles que quedan retenidos en el tejido gracias a la malla molecular creada en el proceso de fijación.
Impregnación metálica
Colorantes
Núcleo
• Hematoxilinas
• Galocianinas
• Verde de Metilo
• Azul de Alizarina S
• Fucsina Básica
• Violeta de Cresilo
• Rojo Nuclear Extra
• Carmín
Citoplasma
• Eosina
• Cromotropo 2R
• Floxina
COLORANTES NUCLEARES
• Cel. Eucariontes: DNA + nucleoproteínas
• DNA: cromosomas, RNA y nucleólo
• Nucleoproteínas: histonas y protaminas
• Arginina y lisina básicas
HEMATOXILINAS
COLORANTE + SOLVENTE
OXIDANTE
GRUPOS AUXOCROMOS
SOLVENTE GENERAL
pH
COLORANTE
• HEMATOXILINA, CRISTALES ROSADO-AMARILLENTOS SOLUBLES EN AGUA Y ALCOHOL.
• HEMATOXILINA REQUIERE SER OXIDADA A HEMATEINA PARA SER COLORANTE.
• HEMATEINA ES DEBILMENTE ACIDA Y COLORACION ROJO VINOSA
OXIDACION HEMATOXILINA
OXIDANTES
• MADURACION DE LA HEMATOXILINA
• Agentes:
– Oxigeno ambiental (4 A 6 semanas)
– Oxido Rojo de Mercurio
– Yodato de Sodio/ Potasio
– Permanganato de Potasio minutos
– Dicromato de Potasio
– Clorato de Potasio
Maduración Inducida
• CRUCIAL TIEMPO DE ACCION Y CANTIDAD DE AGENTE OXIDANTE.
• GENERACION DE LEUCODERIVADO (exceso)
• COLORACION PARDA E INESPECIFICA (sobreoxidación)
Oxidación inducida
• Para 1 gr de Hematoxilina, se usa:
Oxido de mercurio 0,5 g
Yodato de sodio 0,05g
Permanganato de Potasio 0,177g
Dicromato de Potasio 0,28g
Clorato de potasio 0,11 g
SOBREOXIDACION
• OH HOOC O
OH O C
OH
O
Hematoxilina sobre oxidada
Hematoxilina sobreoxidada
ESTABILIDAD HEMATEINA
SOLVENTE ESTADO
ACUOSA NEUTRA SOBREOXIDACION
GLICERINA-ALCOHOL MAYOR DURACION
BASICAS ACELERAN OXIDACION
ACIDAS RETARDAN OXIDACION
AUXOCROMOS
• OH
• COOH
• NH2
• SH
• IONES METALICOS: Cr, Al, H, Mb, Pb,
Cu.
GRUPOS AUXOCROMOS
• INCREMENTAR CAPACIDAD TINTORIAL
• AFINIDAD POR NUCLEOS CELULARES
• CARÁCTER BASICO
• SALES METALICAS BI Y TRIVALENTES
AUXOCROMOS= ALUMBRES
ALUMBRE HEMATOXILINA
ALUMBRE POTASIO/AMONIACO
H. HARRIS
ALUMBRE POTASIO / AMINIACO
H. MAYER
ALUMBRE AMONIACAL H. DELAFIELD
ALUMBRE POTASIO / AMINIACO
H. EHRLICH
ALUMBRE ALUMINIO/POTASIO
• HEMALUMBRE
• pH -1 rojo
• Ph 1-5 amarilla
• pH +6 azul violácea
FORMACION LACA
Requiere de que en el colorante coexistan un grupo fenólico y carboxílico en posición orto, desplaza molécula de agua y forma la laca.
FORMACION LACA
• Existiría una atracción electroestática, pero los complejos lacados son estables formación de enlaces covalentes, que se genera entre el catión + aniones del tejido = laca/quelato
• Catión cromo y fierro mas estable que aluminio.
TINCION NUCLEAR
Lacas de hematoxilina ácidos fosfóricos (histonas)
Hemateína no lacada arginina ++
Después de tto. Con ácido se mantiene un grado de tinción nuclear.
SELECTIVIDAD DE TINCION
ACIDIFICANDO
HEMATOXILINA HARRIS
• HEMATOXILINA 1g + ETANOL ABS 10 ml, disolver calentando suavemente.
• ALUMBRE POTASICO 20 g + AGUA DESTILADA 200 ml, disolver en caliente, agregar Hematoxilina y llevar a ebullición. El hervir agregar OXIDO ROJO DE MERCURIO 0,5 g (exergónico), enfriar, filtrar. Antes de usar
• ACIDO ACETICO GLACIAL 10 ml(ss. Fría)
HEMATOXILINA DE MAYER
• Hematoxilina 1g+ agua destilada 1000 ml
• Disolver, agregar
• Yodato sódico 0,2 gr, disolver sin calentar.
• Alumbre potásico 50g + acido cítrico 1g + hidrato de cloral 50g
• Filtrar antes de usar.
HEMATOXILINA MAYER
• La laca de hematoxilina es muy selectiva para colorear la cromatina nuclear y, por tratarse de una tinción progresiva, no requiere de diferenciación posterior. Aprox. 10 minutos de tinción.
S 100/ H. Mayer
HEMATOXILINA ACIDA DE EHRLICH
• Esta solución tiene una baja concentración de alumbre, contiene glicerol para prevenir la sobre oxidación de la hemateína. Da una tinción nuclear algo menos intensa pero mas uniforme.
Hematoxilinas Alumínicas:
• Hemateína + iones Al = HEMALUMBRE.
• El Al +3 tiene afinidad por el DNA
• progresivos o regresivos
• diferenciación se realiza con soluciones ácidas
AZULAMIENTO
• hemalumbre es rojizo a partir de pH 6 , se debe alcalinizar el pH: abundante lavado en agua corriente o bien someter las láminas a una solución alcalina (bórax, carbonato de litio, etc), este proceso se denomina azulamiento o viraje.
HEMATOXILINA DE DELAFIELD
• Núcleos de azul suave, ideal para contrastes.
• hematoxilina 5 g + alcohol puro 25ml.
• solución acuosa saturada de alumbre de amonio 800 ml. Exponga la solución a la luz por dos días en una botella taponada con algodón. Filtre.Glicerina 100 ml. Alcohol metílico 100 ml Mezcle bien. Madurarción por dos meses.
• Sin diferenciación
• Sin azulamiento
• H de Mayer
• H de Delafield
HEMATOXILINA FERRICAS
• usan sales de Hierro, están la Hematoxilina de Weigert o Hendenhain, estás tienen un azul intenso a negro y son más resistentes a las soluciones ácidas, por lo que suelen utilizarse en las coloraciones tricromicas, las que requieren soluciones de ácidos para los colorantes posteriores. Pueden usarse en coloraciones progresivas y regresivas.
H. Ferrica de Weigert
• Coloración de 1 tiempo
• Cromógeno y mordiente se combinan y se vinculan con el tejido.
• SS de trabajo poco estable.
VG
H. ferrica
H. Ferrica de Heidenhaim
• Coloración de 2 tiempos
• 1° mordentación del tejido con alumbre ferrico y después se agrega la hemateína
CARMIN
• Colorante natural Cochinillas hembras
• Molécula compleja
• Tiñe como carmalumbre las mismas estructuras que las lacas de hemateína.
• Carmín 1% acuoso en alumbre amoniacal.
• Diferenciación con agua.
• Tiempos de tinción 1 a 24 horas.
FUCSINAS
• Uso en coloraciones tricrómicas
• Fucsina básica CI 42510 1% en agua destilada
SAFRANINAS
• De elección para coloración de cromosomas.
GALOCIANINAS Y AZUL DE CELESTINA B
• Colorantes básicos, derivados de oxacinas.
• Combinables con iones metálicos
• En ss actúan como anfóteros, tiñen estructuras ácidas / básicas según pH.
COLORANTES CITOPLASMATICOS
• Menos específicos
• Principalmente derivados Xanténicos
EOSINA
• Colorante ácido lo que le permite enlazarse con constituyentes celulares de carga positiva:
– Citoplasma
– Colágeno
– Fibras musculares
EOSINA
Aquellos componentes que se tiñen con eosina son conocidos como acidófilos o eosinófilos.
EOSINA
• La coloración resultante de la tinción con eosina es rosada-anaranjada para citoplasmas, y rojo intenso en el caso de los eritrocitos. Es fuertemente fluorescente, aunque esta característica es muy poco utilizada.
EOSINA
• Puede usarse en solución acuosa y alcoholica.
• Relacionado con diferenciación.
• HISTIDINA RESIDUOS
• LISINA BASICOS
• ARGININA + + + + +
XANTENICOS: EOSINA
EOSINA B EOSINA Y
Eosina Alcoholica
• STOCK
• Eosina Y 1 gr + Agua destilada 20 ml
• Disolver calentando lentamente, enfriar.
• Etanol 95% 80 ml
• SS TRABAJO
• 25 ml Stock + 75 etanol 80%
• Filtrar, antes de usar agregar 0,5 ml ácido acético glacial.
Eosina Acuosa
• STOCK
• Eosina Y CI 45380 5 g + Agua destilada 100 ml
• SS TRABAJO
• 1 parte Stock + 4 partes agua destilada
Eosina Precipitada
• Eosina Y 5 g+ agua destilada 1000 ml
• Disolver calentando suavemente. Enfriar. Agregar 8 ml HCl concentrado. Dejar pp por 24 hrs, lavar el pp 8 X 500 ml agua destilada. Secar el pp (37°c), disolver 800 ml etanol 95%.
• Tinción 30-60 seg.
I. Delgado eosina acidificada
I. Delgado
CROMOTROPO 2R
• Colorante azoico
• Coloración rojo brillante
• Uso 1% alcoholica.