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manual to counting urinary elements

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  • I Mestrado Anlises Clnicas

    Joana Selada Domingues - 1 -

    IINNTTRROODDUUOO

    A actividade profissional decorreu no Laboratrio de Anlises Clnicas (LAC)

    Maria Celeste Formosinho Fernandes, com sede na Rua Egas Moniz, Lisboa.

    Este LAC possui um corpo tcnico qualificado para executar as valncias de

    Imunologia, Endocrinologia, Bioqumica, Hematologia e Microbiologia, constitudo

    pelo Director Tcnico, especialista em Anlises Clnicas pela Ordem dos

    Farmacuticos, trs especialistas em Anlises Clnicas, tcnicos de anlises clnicas,

    auxiliares de laboratrio, assistentes de consultrio e de limpeza.

    Os servios encontram-se completamente informatizados, possuindo uma rede

    de computadores com terminais ligados directamente aos aparelhos, o que permite a

    informatizao dos servios desde a abertura de fichas at emisso de boletins,

    passando pelo envio directo dos pedidos e retorno dos respectivos resultados para a

    ficha do utente. Softlab foi o programa informtico escolhido pelo laboratrio.

    O laboratrio encontra-se apetrechado com moderno equipamento automatizado.

    As metodologias a aplicar so escolhidas em funo do desempenho pretendido, de

    forma apropriada s condies do laboratrio, e de acordo com o equipamento e

    reagentes.

    O funcionamento passa pelo atendimento dos utentes com a organizao do

    dossier do utente, por via informtica. Procede-se recolha dos produtos biolgicos,

    segundo as regras exigidas para o efeito, e de acordo com o tipo de anlises solicitadas.

    Os equipamentos so preparados diariamente, no que respeita a reagentes,

    calibradores e controle, segundo as recomendaes do fabricante para cada tipo de

    aparelho. As anlises, na sua grande maioria, so realizadas em equipamentos

    automatizados, os resultados so validados pelos especialistas e/ou tcnico superior.

    O LAC adoptou um Sistema de Gesto da Qualidade, so aplicados e cumpridos

    os requisitos da Norma NP EN ISO 9001:2000, das Normas para o Laboratrio Clnico

    da Ordem dos Farmacuticos e do Manual de Boas Prticas Laboratoriais.

  • I Mestrado Anlises Clnicas

    Joana Selada Domingues - 2 -

    TTCCNNIICCAASS // EEQQUUIIPPAAMMEENNTTOOSS UUTTIILLIIZZAADDOOSS

    BBIIOOQQUUIIMMIICCAA

    Equipamento Parmetro

    Tcnica Manual Clculo Urinrio/Renal

    Contagem de Addis

    Espermograma

    Grau de Digesto das Fezes

    Pesquisa de Drogas de Abuso - Canabinides,

    Herona, Morfina, Opiceos

    Pesquisa de Protenas de Bence Jones

    Pesquisa de Protenas na Urina

    Pesquisa de Sangue Oculto nas Fezes

    Sedimento Urinrio

    Microtech 672 Electroforese de Protenas

    Modular Analytics SWA cido Flico

    cido rico

    Albumina

    -Amilase

    Alanina-aminotransferase - ALT/GPT

    Aspartato-aminotransferse - GOT/AST

    Bilirrubina Directa

    Bilirrubina Total

    Clcio

    Colesterol

    Creatinafosfoquinase - CPK e CPK-MB

    Creatinina

    Desidrogenase lctica - LDH

    Fosfatase cida

    Fosfatase Alcalina - ALP

    Fosfatase cida No Prosttica

    Ferritina

    Ferro

    Fsforo

  • I Mestrado Anlises Clnicas

    Joana Selada Domingues - 3 -

    Gama-Glutamiltransferase - GGT

    Glucose

    Hemoglobina glicosilada

    Imunoglobulinas

    Insulina

    Ionograma - Potssio, Sdio, Cloro

    Lipoprotenas de alta densidade - HDL

    Lipoprotenas de baixa densidade LDL

    Lipoprotenas de muito baixa densidade -

    VLDL, Lpidos totais

    Magnsio

    Paratormona PTH

    Protenas totais

    Transferrina

    Triglicridos

    Ureia

    Vitamina B12

    Urisys 2400 Urina tipo II

    11.. CCLLCCUULLOO UURRIINNRRIIOO

    Colorimtrico

    1.1. Fundamento do mtodo

    Determinao semi-quantitativa dos componentes mais importantes do clculo

    urinrio: clcio, oxalato, fosfato, magnsio, amnia, cido rico e cistina.

    O mtodo tritimtrico usado para o clcio e o mtodo colorimtrico para os

    restantes componentes.

    Clcio: a determinao titrimtrica com soluo titriplex (sal dissdico do cido

    etilenodinitrotetractico) sendo usado o cido calconcarboxilico como indicador.

    Oxalato: o complexo corado formado pelo ferro (III) e cido sulfosalicilico

    descolorado pelo oxalato.

  • I Mestrado Anlises Clnicas

    Joana Selada Domingues - 4 -

    Amnio: com a adio do reagente de Nessler (tetraiodomercurato de potssio),

    o amnio d origem a uma soluo amarela acastanhada.

    Fosfato: o cido fosfomolibdico formado pela adio de molibdato de amnio

    reduzido a molibdnio azul pela aco de agentes redutores. (disulfito de sdio, sulfato

    4-metilaminofenol)

    Magnsio: em meio tamponado o magnsio reage com um reagente corado (1-

    azo-2-hidroxi-3-(2,4-dimetil-carboxanilido)-naftaleno-1-(2-hidroxibenzeno-5-sodio

    sulfonato) para formar um complexo vermelho.

    cido rico: em meio tamponado o cido molibdatofosfrico reduzido pelo

    cido rico formando azul de molibdnio

    Cistina: a cistina reduzida a cistena pelo sulfito de sdio. Em meio alcalino a

    cistena origina uma colorao vermelha na presena de nitroprussiato de sdio.

    Os componentes determinados encontram-se na forma dos seguintes elementos,

    nos quais os clculos so baseados: Oxalato de clcio (CaC2O4.H2O), fosfato de

    magnsio e amnio (MgNH4PO4.6H2O), hidrogeno fosfato de clcio (CaHPO4.2H2O),

    fosfato triclcico (Ca10(PO4)8(OH)2), urato de amnio, cido rico e cistina. (bula

    Merckognostics)

    22.. CCOONNTTAAGGEEMM DDEE AADDDDIISS

    Contagem em Cmara

    2.1. Fundamento do mtodo

    A contagem de Addis uma medida quantitativa da excreo de eritrcitos,

    leuccitos e cilindros na urina colhida perodo de 12 horas. A excreo de protenas e a

    densidade da amostra tambm so determinadas. Permite a monitorizao doena renal.

    Medir o volume da amostra de urina de 12 horas. Homogeneizar e medir 10ml.

    Centrifugar, rejeitando o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 1ml de soro

    fisiolgico. Homogeneizar e encher a cmara de contagem. Contar isoladamente as

    hemcias, leuccitos e cilindros nos 9 quadrados de 1mm.

  • I Mestrado Anlises Clnicas

    Joana Selada Domingues - 5 -

    N= S/V n V/10

    N = n de cada elemento no volume total

    S = vol. cm3 da suspenso soro fisiolgico (1 cm3)

    V = vol. cm3 onde foi feita a contagem (0.0009 cm3)

    V = volume total de urina

    N = n cilindros (pequena ampliao), n hemcias (grande ampliao),

    n leuccitos (grande ampliao)

    33.. EESSPPEERRMMOOGGRRAAMMAA

    3.1. Fundamento do mtodo

    Amostra:esperma colhido at 30 min antes. Abstinncia de 3-4 dias.

    Avaliao dos seguintes parmetros fsicos e exame microscpico:

    - pH: avaliao do pH com papel indicador;

    - Tempo de liquefaco: tempo de passagem de gel a lquido aps colheita;

    - Viscosidade: 30 minutos aps a colheita avaliar a viscosidade; homogeneizar a

    amostra, com uma pipeta Pasteur tomar uma alquota e deixar cair

    espontaneamente; se a queda ocorrer gota a gota a viscosidade normal;

    - Exame microscpico directo: assinalar a presena de espermatozides,

    aglutinao, clulas epiteliais, leuccitos, eritrcitos, clulas de

    espermatognese, cristais de fosfato de espermina, muco e Trichomonas.

    Quando no se observam espermatozides, centrifuga-se todo o volume

    ejaculado, despreza-se o sobrenadante e observa-se o sedimento ao microscpio;

    - Mobilidade: realizar um exame a fresco entre lmina e lamela aquecidas a

    37C, observar vrios campos com a objectiva de 40 contando pelo menos 200

    espermatozides; avaliar o movimento classificando em rectilneo rpido, lento,

    in situ ou imveis;

    - Vitalidade: os espermatozides mortos so permeveis eosina enquanto os

    vivos permanecem incolores; misturar uma gota de esperma com uma gota de

    Giemsa a 10%, deixar em contacto 20 segundos, fazer o esfregao e observar ao

    microscpio.

  • I Mestrado Anlises Clnicas

    Joana Selada Domingues - 6 -

    - Morfologia: observar no exame microscpico os espermatozides normais ou

    anormais (alteraes da cabea, do colo, da cauda ou alteraes mistas);

    - Contagem em cmara: clculo do nmero de espermatozdes/mL = n

    espermatozides contados 100.000.

    44.. GGRRAAUU DDEE DDIIGGEESSTTOO DDAASS FFEEZZEESS

    Exame macroscpico, microscpico, caracteres fsicos

    Para este exame o utente deve submeter-se a um regime alimentar em que

    entrem hidratos de carbono, gorduras e protenas.

    4.1. Fundamento do mtodo

    O estudo do grau de digesto das fezes permite apreciar o estado da funo

    digestiva e rapidez do trnsito intestinal.

    As fezes devero ser avaliadas em relao aos caracteres fsicos: consistncia,

    forma, cheiro, cor e reaco (pH).

    No exame macroscpico dever ser realizada a pesquisa de elementos anormais:

    muco, sangue, ps, parasitas, fibras musculares, gordura, detritos vegetais

    Para o exame microscpico, depois das fezes bem homogeneizadas, preparar

    uma soluo com soro fisiolgico. Fazer trs preparaes, uma s com soro fisiolgico

    e fezes, outra com lugol e fezes e a terceira com sudam III e fezes. Proceder ao

    reconhecimento dos seguintes elementos:

    - Resduos alimentares de origem animal (fibras musculares, gorduras)

    - Resduos alimentares de origem vegetal (amido, cristais, celulose digestvel e

    no digestvel)

    - Substncias de origem intestinal (muco, leuccitos, hemcias e clulas epiteliais)

    55.. PPEESSQQUUIISSAA DDEE DDRROOGGAASS DDEE AABBUUSSOO

    Imunocromatografia

    5.1. Fundamento do mtodo

  • I Mestrado Anlises Clnicas

    Joana Selada Domingues - 7 -

    Amostra: Urina colhida no laboratrio.

    Imunoensaio cromatogrfico baseado no princpio de vnculos competitivos. As

    drogas que podem estar presentes na urina competem com a droga conjugada para

    formar pontes com o anticorpo.

    Durante o teste, a amostra de urina migra por aco capilar, se a droga no

    estiver presente na amostra, no ocorrer a saturao das pontes do anticorpo. As

    partculas revestidas de anticorpo sero capturadas por conjugado da droga imobilizado

    e uma linha colorida visvel aparecer na regio da linha teste. Se a droga estiver

    presente na amostra, no se formar uma linha visvel, pois ocorrer uma saturao de

    todas as pontes de anticorpo anti-droga.

    66.. PPEESSQQUUIISSAA DDEE PPRROOTTEENNAASS DDEE BBEENNCCEE JJOONNEESS

    Turbidimetria

    6.1. Fundamento do mtodo

    As protenas de Bence Jones so protenas anormais que apresentam

    precipitao a 40-60C, redissolvendo-se a temperaturas de 100C.

    Aparecem com grande frequncia em pacientes com mieloma mltiplo, podendo

    surgir tambm em processos neoplsicos do osso, leucemias e nefrite crnica.

    Centrifugar a amostra de urina de 24 horas. Em tubo de ensaio colocar cerca de

    4ml de urina e 1ml do tampo de acetato e misturar. O pH final dever ser de 5.

    Colocar em banho-maria a 56C durante 15 minutos. Um precipitado indica a

    presena de protenas Bence Jones.

    Caso haja turvao ou precipitao, aquecer o tubo em banho de gua fervente

    por 3 minutos e observar a diminuio da turvao. A protena Bence Jones redissolver-

    se- a 100C.

    Um aumento da turvao ou precipitao ao ferver indicar a presena de

    albumina e globulina, que ir mascarar o resultado. Neste caso, filtrar o contedo do

    tubo imediatamente aps retir-lo do banho fervente e observar o filtrado. Se for claro e

    se tornar turvo medida que arrefece e voltar a ficar claro quando retorna temperatura

    ambiente a prova positiva para a protena de Bence Jones.

  • I Mestrado Anlises Clnicas

    Joana Selada Domingues - 8 -

    77.. PPEESSQQUUIISSAA DDEE PPRROOTTEENNAASS NNAA UURRIINNAA

    Turbidimetria

    7.1. Fundamento do mtodo

    Proteinria definida como o aumento da quantidade de protenas na urina.

    Apenas uma pequena parte das protenas est presente na urina (20 a 150mg/dia), sendo

    a maioria albumina. O restante consiste, na quase totalidade, na proteina Tamm-

    Horsfall, provavelmente secretada pelos tubulos distais. O aumento da permeabilidade

    da membrana glomerular tem como primeiro sinal o aumento da albuminria. A perda

    de selectividade demonstrada pelo aparecimento na urina de protenas de elevado peso

    molecular. A diminuio da reabsoro tubular sugerida pelo aumento da

    concentrao de protenas de baixo peso molecular na urina. (1)

    A pesquisa protenas realizada pela adio de cido sulfossalicilico amostra

    de urina. Em caso positivo haver turvao proporcional quantidade de protenas Esta

    tcnica baseia-se no princpio da desnaturao proteica com formao de meta-

    protenas.

    Se o resultado da pesquisa anterior for positivo dever proceder-se ao

    doseamento da protena. O reagente de Esbach, formado por cido picrico e cido

    citrico, utilizado para este doseamento. Atravs de um albuminmetro, onde se junta a

    urina acidificada e o reagente de Esbach, mede-se a altura do densimetro na escala em

    g%0.

    88.. PPEESSQQUUIISSAA DDEE SSAANNGGUUEE OOCCUULLTTOO NNAASS FFEEZZEESS

    Imunocromatografia

    8.1. Fundamento do mtodo

    As causas mais comuns de sangue oculto nas fezes so a lcera pptica, a

    gastrite erosiva, o carcinoma gstrico, o carcinoma e plipos adenomatosos do clon.

  • I Mestrado Anlises Clnicas

    Joana Selada Domingues - 9 -

    A membrana encontra-se coberta com anticorpo anti-hemoglobina na regio da

    linha teste. Durante o teste a amostra reage com a partcula coberta com anticorpo anti-

    hemoglobina. A mistura migra por cima da membrana por aco capilar para reagir com

    o anticorpo anti-hemoglobina, originando uma linha colorida. A presena da linha

    colorida indica um resulta positivo, enquanto a sua ausncia indica um resultado

    negativo.

    99.. MMIICCRROOTTEECCHH 667722 PPCC ((DDEENNSSIITTOOMMEETTRRIIAA))

    O Microtech 672 PC (figura 1) um sistema completamente automatizado,

    concebido para a anlise electrofortica de rotina. Realiza todos os passos necessrios

    para a separao electrofortica de seroprotenas, lipoprotenas e hemoglobina, em

    pequenas tiras suportadas de acetato de celulose, recorrendo leitura densitomtrica das

    amostras e padres.

    9.1. Fundamento do mtodo

    Amostra: Soro

    A anlise do padro electrofortico das protenas pode elucidar acerca de vrias

    situaes patolgicas, como sejam, o pico gama monoclonal e policlonal, a ponte do

    cirrtico, perfil de inflamao, entre outras. A razo albumina/globulina tambm poder

    alertar para a possibilidade de determinadas alteraes devidas a inflamao, cirrose

    heptica, glomerulonefrite e sndrome nefrtico.

    O termo electroforese refere-se migrao de partculas com carga num meio

    lquido sobre a influncia de um campo elctrico.

    A tcnica de electroforese separa as protenas sricas com base na premissa de

    que as espcies proteicas tm diferentes mobilidades quando sujeitas a um campo

    elctrico. Cada molcula possui uma carga elctrica devido presena de grupos

    carregados positiva e negativamente. A carga total dita as caractersticas de migrao

    das espcies a um dado pH. (1)

  • I Mestrado Anlises Clnicas

    Joana Selada Domingues - 10 -

    Figura 1

    A electroforese de zona em acetato de celulose ocorre em vrias etapas:

    aplicao das amostras (soro), migrao, colorao, descolorao, diafanizao,

    secagem e leitura pela luz de digitalizao. As protenas so separadas a um pH alcalino

    (8,9) utilizando o princpio de electroforese de zona em suporte adequado, acetato de

    celulose. O tampo confere carga negativa s protenas e determina a passagem de

    corrente. Esta primeira fase, separativa, consiste na migrao das protenas no sentido

    ctodo nodo a diferentes velocidades, quando sujeitas a um campo elctrico. A

    mobilidade da albumina superior da globulina alfa 1, seguindo-se a alfa 2, beta e

    finalmente a fraco gama, permitindo assim separar as vrias fraces. Quando a

    migrao est completa, as protenas so ento sujeitas a um processo de colorao com

    Vermelho S de Ponceau. O corante, Ponceau S, cora as fraces proteicas de vermelho,

    tendo igual afinidade para todas as fraces. A colorao s possvel em meio

    fortemente cido. Os banhos com descolorante permitem a descolorao de tudo o que

    no seja protenas. A tira ento sujeita a uma leitura por densitometria e os resultados

    apresentados graficamente. Os resultados so obtidos em percentagem, percentagem

    essa que em funo da rea corada e da intensidade da cor.

    1100.. MMOODDUULLAARR AANNAALLYYTTIICCSS SSWWAA ((FFOOTTOOMMEETTRRIIAA//EEQQLL//IISSEE))

    O Modular Analytics SWA (figura 2) um sistema completamente

    automatizado, controlado por software e destinado a anlises de bioqumica e

    imunoensaios. Foi concebido para determinaes quantitativas e qualitativas in vitro

    usando uma ampla variedade de testes para anlise.

  • I Mestrado Anlises Clnicas

    Joana Selada Domingues - 11 -

    Figura 2

    O sistema descrito constitudo por 5 unidades hardware: uma unidade de

    controlo, uma unidade central (core), um mdulo ISE, um mdulo P e um mdulo E.

    Efectua anlises fotomtricas no mdulo P, anlises de electroquimioluminiscncia no

    mdulo E e testes selectivos para ies no mdulo ISE.

    A unidade core transporta as amostras atravs de cada mdulo analtico,

    possuindo um leitor de cdigos de barra da amostra e permitindo a utilizao de

    diversos tipos de tubos de amostra, primrios ou secundrios, com diferentes alturas e

    volumes. Apresenta uma rea de entrada para amostras de urgncia., com prioridade na

    pipetagem.

    O mdulo ISE (figura 3) confere ao sistema um mtodo electrnico, por

    potenciometria indirecta, para analisar amostras de sdio, potssio e cloro. Os principais

    componentes consistem em trs cartuchos de medio, um elctrodo de referncia, trs

    pipetadores, um poo de diluio e uma unidade de desgaseificao. Pode processar at

    900 testes por hora.

  • I Mestrado Anlises Clnicas

    Joana Selada Domingues - 12 -

    Figura 3

    O mdulo P (figura 4) proporciona ao sistema um mtodo fotomtrico, capaz de

    analisar at 800 testes in vitro por hora. Os principais componentes so o sistema de

    pipetagem, o sistema de reagentes, o sistema do disco de reaco e a rea das teclas de

    funo. O sistema de medio fotomtrica possui uma lmpada de halognio tungstnio,

    como fonte de luz, e um espectrofotmetro de comprimento de onda mltiplo. Quanto

    s caractersticas deste sistema, tem capacidade para reagentes com cdigos de barra,

    armazenamento refrigerado para 90 frascos de reagente, 160 cuvetes de reaco semi-

    descartveis, funes de manuteno automatizadas, notificao de calibrao

    automtica, qumicas de parmetro de ponto final, cintica e isoenzima, branco de

    amostra automtico, qumicas no lineares (logit-log de trs, quatro e cinco parmetros).

    Figura 4

  • I Mestrado Anlises Clnicas

    Joana Selada Domingues - 13 -

    O mdulo E (figura 5) um sistema de imunoensaio multi-teste com acesso

    aleatrio e com capacidade para 170 testes por hora. Os principais componentes

    consistem nas reas de reagente, medio, consumveis e preclean. Apresenta

    capacidade para reagentes com cdigos de barra, armazenamento regulado por

    temperatura para 25 embalagens de reagente, 1008 cuvetes e pontas de ensaio

    descartveis, funes de manuteno automatizadas, assim como notificao de

    calibrao automtica.

    Figura 5

    Os principais benefcios que este equipamento apresenta devem-se juno da

    qumica clnica e imunologia num s aparelho; optimizao do fluxo de amostras,

    com transporte prioritrio de emergncia; ao fluxo flexvel de informao; solues

    flexveis com actualizao possvel, sistema back up, mascara de mdulos.

    Com a reduo de manipulao por parte do operador h uma reduo efectiva

    da probabilidade de erros no laboratrio e um aumento de segurana.

    O facto de poder ter todos os reagentes a bordo refrigerados evita a manipulao

    e aumenta a estabilidade dos mesmos, o que melhora a reprodutibilidade dos resultados.

    10.1 ELECTROQUIMIOLUMINISCNCIA (EQL) / MODULO E

    10.1.1 Fundamento do mtodo

    EQL um processo no qual espcies altamente reactivas so geradas a partir de

    precursores estveis na superfcie de um elctrodo, reagindo depois umas com as outras

  • I Mestrado Anlises Clnicas

    Joana Selada Domingues - 14 -

    levando produo de luz. A EQL baseia-se no uso de um complexo de rutnio e

    tripropilamina, sendo o produto final quimioluminiscente.

    As reaces de quimioluminiscncia que levam emisso de luz a partir do

    complexo de rutnio so iniciadas electricamente, aplicando voltagem aos complexos de

    rutnio que so ligados a micropartculas revestidas com estreptavidina.

    10.1.1 a) cido Flico/Vitamina B12

    O cido flico intervm em muitas reaces metablicas como transportador de

    grupos carbono. A deficincia em cido flico pode ocorrer por m absoro intestinal,

    ingesto insuficiente, aumento das necessidades (gravidez, doena maligna) ou por

    interferncia de outros frmacos (metotrexato, por exemplo). A vitamina B12 est

    envolvida na maturao dos eritrcitos e no metabolismo geral das clulas somticas. A

    deficincia em vitamina B12 pode estar associada falta de factor intrnseco, pode ser

    secundria a patologias gastro-intestinais (gastrectomia, inflamao, etc.). (1)

    O mtodo para a determinao do cido flico e vitamina B12 baseia-se no

    princpio da competio.

    A amostra (soro para o cido flico; soro ou plasma para a vitamina B12)

    incubada com os reagentes de pr-tratamento. Uma nova incubao da amostra com a

    protena de fixao do folato/factor intrnseco marcada com rutnio, forma um

    complexo de folato/vitamina B12, cuja quantidade depende da concentrao do analito

    na amostra. Aps a incorporao das microparticulas revestidas de estreptavidina e de

    folato/vitamina B12 marcado com biotina, os locais no ocupados da protena de fixao

    do folato/ factor intrnseco marcado com rutnio so ocupados, formando-se um

    complexo entre a protena de fixao do folato/ factor intrnseco marcada com rutnio e

    o folato /vitB12-biotinilado. O complexo formado liga-se fase slida pela interaco da

    biotina e da estreptavidina. A mistura da reaco aspirada para a clula de leitura,

    onde as micropartculas so fixadas magneticamente superfcie do electrodo. Os

    elementos no ligados so removidos. A aplicao de uma corrente elctrica ao

    elctrodo induz uma emisso quimioluminiscente que medida por um

    fotomultiplicador.

    10.1.1 b) Ferritina/Paratormona (PTH) /Insulina

  • I Mestrado Anlises Clnicas

    Joana Selada Domingues - 15 -

    A ferritina consiste no complexo ferro-apoferritina, o qual uma das formas

    principais de armazenamento de ferro no organismo. A paratormona uma hormona

    peptdica que estimula os osteoclastos a aumentar os nveis de clcio no sangue. A

    determinao da paratormona til no diagnstico diferencial de hipo e hipercalcmia,

    em doentes com insuficincia renal e na avaliao da funo da paratiroide em

    desordens do metabolismo sseo e mineral. A insulina uma hormona proteica que

    diminui as concentraes sricas de glucose. A principal aplicao clnica do

    doseamento da insulina a avaliao de indivduos com diabetes mellitus que requerem

    tratamento com insulina. (1)

    O doseamento da ferritina, PTH e insulina recorre tcnica de sandwich.

    A amostra (soro ou plasma), um anticorpo monoclonado biotinilado especfico

    anti-ferritina/PTH/insulina e um anticorpo monoclonal especfico anti-

    ferritina/PTH/insulina marcado com o complexo de rutnio reagem entre si e formam

    um complexo sandwich. Aps a incorporao das micropartculas revestidas de

    estreptavidina, o complexo formado liga-se fase slida pela interaco da biotina e da

    estreptavidina. A mistura da reaco aspirada para a clula de leitura, onde as

    micropartculas so fixadas magneticamente superfcie do elctrodo. Os elementos

    no ligados so removidos. A aplicao de uma corrente elctrica ao elctrodo induz

    uma emisso quimioluminiscente que medida por um fotomultiplicador.

    10.2 IMUNOENSAIO DE INIBIO TURBIDIMTRICA/MODULO

    10.2.1. Fundamento do mtodo

    A hemoglobina glicosilada consiste numa molcula de hemoglobina ligada a um resduo

    de acar, permitindo realizar um controlo da glicmia a longo termo. (1)

    Este mtodo utiliza brometo de tetradeciltrimetilamnio (TTAB) como detergente no

    reagente hemolisante para eliminar a interferncia dos leuccitos, uma vez que o TTAB

    no faz a lise dos leuccitos. Todas as variantes de hemoglobina que so glicadas no

    terminal N da cadeia e que apresentam regies reconhecveis por anticorpos idnticas

    s da HbA1c so determinadas com este ensaio. Assim, ao contrrio do que acontece

    com os mtodos cromatogrficos, o estado metablico dos doentes diabticos que

    apresentem hemoglobinopatias ou uremia pode ser determinado com o presente ensaio.

  • I Mestrado Anlises Clnicas

    Joana Selada Domingues - 16 -

    A glicohemoglobina (HbA1c) da amostra (sangue total) reage com o anticorpo

    anti-HbA1c e forma complexos antignio-anticorpo solveis. Os polihaptenos reagem

    com o excesso de anticorpos anti-HbA1c, formando um complexo anticorpo-

    polihapteno insolvel que pode ser determinado turbidimetricamente.

    A concentrao de hemoglobina determinada num segundo canal. A

    hemoglobina libertada na amostra hemolisada convertida num derivado que tem um

    espectro de absoro caracterstico que medido bicromaticamente.

    10.3 IMUNOTURBIDIMETRIA/MODULO P

    10.3.1. Fundamento do mtodo

    O uso de anticorpos especficos para quantificao das protenas sricas tornou-

    se uma valiosa ferramenta de diagnstico. As propriedades de disperso da luz dos

    agregados de antignio-anticorpo foram observadas pela primeira vez por Pope e

    Healey, em 1938. Ritchie utilizou leituras turbidimtricas para quantificar protenas

    especficas. Lizana e Hellsing descreveram a intensificao da polimerizao com

    polietilenoglicol (PEG) para melhorar a sensibilidade e aumentar a taxa de formao do

    complexo Ag-Ac, permitindo a rpida progresso da reaco at ao fim e reduzindo o

    risco de falsos negativos em amostras que contenham antignio em excesso. (bula

    Roche)

    Concentraes elevadas de antignio podem originar o efeito de hook, do qual

    resultam falsas concentraes baixas. (1)

    10.3.1 a) Albumina

    A albumina tem como funo principal manter a presso osmtica nos espaos

    intra e extravascular. Nveis elevados ocorrem em desidratao aguda, enquanto a

    diminuio dos seus nveis ocorre em situaes variadas como inflamao, doena

    heptica, perda urinria, perda gastrointestinal, ascite e edema. (1)

    O aumento de excreo urinria de albumina (microalbuminria) precede e

    altamente preditivo de nefropatia diabtica. (1)

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    Os anticorpos anti-albumina reagem com o antignio na amostra (soro, plasma

    ou urina) e formam complexos antignio-anticorpo. Estes, aps a aglutinao, so

    determinados por turbidimetria.

    10.3.1. b) Imunoglobulinas

    Alteraes nos valores das imunoglobulinas podem ocorrer por infeces

    crnicas, infeces por parasitas, doenas autoimunes ou doenas hepticas. O aumento

    monoclonal pode dever-se a proliferao maligna ou benigna de um nico clone. A

    deficincia em imunoglobulinas est associada a linfomas, mielomas, sndrome

    nefrtico, enteropatia, queimaduras, entre outras causas. (1)

    Este teste baseia-se no princpio da aglutinao imunolgica para a determinao

    quantitativa de imunoglobulinas. Os anticorpos anti-Ig A, G ou M reagem com o

    antignio na amostra (soro ou plasma) e formam um complexo Ag-Ac. Aps a

    aglutinao, a determinao feita por turbidimetria.

    Podem ocorrer resultados falsamente baixos devido a um excesso de antignio

    (efeito zona). Estes antignios bloqueiam o anticorpo impedindo a formao do

    complexo Ag-Ac. Esta situao pode ser detectada aps diluio apropriada da amostra.

    As chamadas paraprotenas secretadas nas gamopatias monoclonais

    (imunoglobulinmia monoclonal) podem diferir das respectivas imunoglobulinas de

    origem policlonal, na composio e tamanho dos seus aminocidos. Tambm neste

    caso, a ligao ao anticorpo pode ser prejudicada. Assim, as amostras de soro de

    pacientes com um diagnstico clnico incerto devem ser sujeitas a uma electroforese de

    protenas para identificar um eventual excesso de antignio ou gamopatia monoclonal.

    10.3.1 c) Transferrina

    A avaliao dos nveis plasmticos de transferrina til no diagnstico

    diferencial da anemia e monitorizao do tratamento da anemia ferropnica. (1)

    O doseamento da transferrina baseia-se no princpio da aglutinao imunolgica.

    Os anticorpos anti-transferrina reagem com o antignio na amostra (soro ou plasma) e

    formam um complexo antignio-anticorpo. Aps a aglutinao, a determinao feita

    por turbidimetria. A adio de PEG permite a progresso rpida da reaco at ao fim e

    aumenta a sensibilidade.

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    Antignio transferrina + anticorpo anti-transferrina complexo antignio-anticorpo

    10.4 POTENCIOMETRIA/MODULO ISE

    10.4.1. Fundamento do mtodo

    A potenciometria a medio da diferena de potencial entre dois elctrodos

    numa clula electroqumica. Um elctrodo consiste num condutor metlico em contacto

    com uma soluo electroltica. (1)

    Os elctrodos selectivos so sensores com capacidade para medir directamente

    fluidos biolgicos. Os elctrodos selectivos de ies medem sdio, potssio e cloro

    (amostra de soro).

    O potencial de cada elctrodo medido relativamente a um elctrodo de

    voltagem estvel fixa por cloreto de prata, o elctrodo de referncia. Um elctrodo

    selectivo de io desenvolve uma voltagem que varia com a concentrao do io ao qual

    responde. A relao entre a voltagem desenvolvida e a concentrao do io detectado

    logaritmica, sendo expressa pela equao de Nernst.

    10.5 TESTE COLORIMTRICO

    10.5.1. Fundamento do mtodo

    Nas anlises colorimtricas, pela comparao da cor de uma amostra com a de

    um padro, em circunstncias adequadas, podemos saber a concentrao de uma dada

    substncia na amostra. (2)

    A espectrofotometria consiste na medio da intensidade luminosa da luz a um

    comprimento de onda seleccionado, designando-se de espectrofotometros os

    equipamentos que seleccionam o comprimento de onda desejado. Os testes

    colorimtricos baseiam-se na medio das variaes de absoro na zona visvel (entre

    400 e 700 nm). (1)

    10.5.1 a) Bilirrubina Directa

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    A bilirrubina resulta do catabolismo do heme. O aumento de bilirrubina d

    origem a ictercia, a qual pode ter diferentes causas como hemlise, doena

    hepatocelular, obstruo intra ou extraheptica, hereditrias e fisiolgicas (neonatal). (1)

    O doseamento qumico o mais comum na determinao da bilirrubina, sendo

    utilizado o cido sulfanlicodiazotado o qual consiste em cido sulfanlico e nitrato de

    sdio, diazoreagente.

    Depois da introduo do mtodo diazo para a determinao da bilirrubina por

    Ehrlich, em 1883, foram propostas vrias modificaes com o objectivo de melhorar a

    reaco. Em 1938, Jendrassik e Grof apresentaram um teste que produziu resultados

    fiveis. As vantagens deste mtodo so a maior preciso e a interferncia reduzida por

    pigmentos.

    O cido sulfanlico diazotado, produzido a partir da reaco do nitrito de sdio

    acidificado com cido sulfanlico, reage com a bilirrubina da amostra (soro ou plasma)

    para formar azobilirrubina. No ensaio da bilirrubina directa, apenas a bilirrubina

    conjugada reage com o cido sulfanlico diazotado. A intensidade da cor vermelha do

    corante azo formado directamente proporcional concentrao de bilirrubina directa

    (conjugada) e pode ser determinada fotometricamente.

    Bilirrubina + io diaznio azobilirrubina.

    Os problemas que podem surgir na determinao da bilirrubina esto associadas

    sua fotosensibilidade, que aumenta com a temperatura, uma vez que a luz cinde pontes

    de hidrognio tornando-a mais solvel. A hemoglobina um interferente negativo, deve

    sempre rejeitar-se a amostra hemolisada.

    10.5.1 b) Bilirrubina total

    A determinao da bilirrubina total baseia-se no mtodo desenvolvido por

    Wahlefeld et al., no qual utilizado um detergente para acelerar a reaco e prevenir a

    precipitao da protena. O reagente diazo utilizado o 2,5-diclorofenil diaznio

    tetrafluoroborato (DPD) que, em condies de acidez, se liga muito rapidamente

    bilirrubina da amostra (soro ou plasma) e forma azobilirrubina. A intensidade da cor da

    azobilirrubina produzida proporcional concentrao de bilirrubina total e pode ser

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    medida fotometricamente. O procedimento simples e correlaciona-se bem com o

    mtodo de Jendrassik-Grof.

    10.5.1 c) Clcio

    Certas patologias podem estar associadas ao aumento ou diminuio nas

    concentraes de clcio no sangue. Algumas causas comuns de hipocalcmia so a

    insuficincia renal crnica, hipoparatiroidosmo, osteomalcia e hemorragia aguda. A

    hipercalcmia pode estar associada a doenas malignas, alteraes da tiride e

    hiperparatiroidismo. (1) (3)

    A determinao do clcio baseia-se na reaco deste com a complexona de o-

    cresolftalena em soluo alcalina. A intensidade da cor do complexo prpura formado

    directamente proporcional concentrao de clcio da amostra (soro, plasma ou urina) e

    medida fotometricamente.

    10.5.1 d) Creatinina

    A creatinina produzida a nvel endgeno e libertada a velocidade constante,

    sendo os nveis plasmticos mantidos em limites estreitos. A sua clearence renal um

    indicador de taxa de filtrao glomerular. (1)

    O mtodo de Jaff Compensado baseia-se na reaco de Jaff descrita por

    Popper et al, em 1886, e modificada por Bartels. Esta verso modificada tem uma

    sensibilidade mais elevada e melhor preciso do que o mtodo Jaff original. a

    reaco mais usada para dosear a creatinina.

    Em soluo alcalina, a creatinina da amostra (soro, plasma ou urina) forma um

    complexo amarelo-laranja com picrato, o complexo de Janovski. A intensidade da cor

    directamente proporcional concentrao de creatinina e pode ser medida

    fotometricamente. Nos ensaios em que utilizado o branco de amostra cintico, a

    interferncia da bilirrubina minimizada. O complexo de cor vermelha medido entre

    500 e 520nm. O io picrato absorve significativamente a inferior a 500 nm, logo a

    leitura do complexo deve ser a superior a 500 nm.

    A desvantagem do mtodo Jaff devem-se s numerosas interferncias que

    podero ocorrer, desde a temperatura, uma vez que a altas temperaturas (> 30C) a

    glucose, cido rico e cido ascrbico reagem com o picrato, originando uma

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    interferncia positiva. Exige uma amostra livre de protenas, j que os grupos cetometil

    e cetometileno reagem com o picrato alcalino originando compostos altamente corados.

    Tambm podero ocorrer interferncias negativas, por oxidao de certos compostos na

    presena de bases fortes, formando-se produtos de degradao, bilirrubina e

    hemoglobina, que causam a interferncia. (1)

    Vrias tcnicas tm sido propostas no sentido de retirar interferentes, tendo

    como objectivo o aumento da especificidade. Uma dessas tcnicas o mtodo de Jaff

    cintico que se baseia no facto de certas substncias interferentes reduzirem lentamente

    o picramato alcalino, como glucose, cido ascrbico e cido rico, enquanto outras

    reagem mais prontamente, como cetoacidos (acetoacetato), piruvato, protenas e

    cefalosporinas. Assim, executa-se um mtodo espectrofotomtrico a 2 tempos (ensaio

    colorimtrico cintico): no primeiro tempo (20 seg.), temos interferentes que reagem

    rapidamente; no segundo tempo (80 seg.), reage tudo excepto os interferentes que

    reagem lentamente, depois dos 80 seg. (protenas e outros interferentes).

    2 tempo - 1 tempo = janela de creatinina

    10.5.1 e) Ferro

    A alterao do metabolismo do ferro est relacionada com vrias outras

    patologias, incluindo anemia, doena cardiovascular, hepatite crnica, doena renal

    terminal e infeces. (1)

    Foram descritos diversos mtodos fotomtricos para determinao do ferro.

    Todos eles tm em comum a libertao de ies de Fe3+ do complexo de transferrina,

    atravs do uso de cidos ou detergentes, seguida de reduo dos ies Fe3+ a Fe2+, com

    reaco dos ies Fe2+ para produo de um complexo corado.

    Assim, em condies acdicas (pH

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    A deficincia de magnsio est associada ao desenvolvimento de

    hiperirritabilidade neuromuscular com tetania, induo da secreo de PTH e arritmia

    cardiaca. Por outro lado, a hipermagnesmia manifesta-se por depresso do sistema

    neuromuscular. (1)(4)

    Este mtodo baseia-se na reaco do magnsio da amostra (soro, plasma ou

    urina) com o azul de xilidilo numa soluo alcalina com EGTA para mascarar o clcio

    na amostra. Em soluo alcalina, o magnsio forma um complexo prpura com o azul

    de xilidilo, um sal de diaznio. A concentrao de magnsio medida

    fotometricamente, atravs da diminuio da absorvncia de azul de xilidilo (ponto de

    viragem).

    10.5.1. g) Protenas Totais

    As alteraes mais comuns na concentrao de protenas, com relevncia para o

    laboratrio clnico, resultam da reaco de fase aguda, uma resposta inespecfica

    inflamao ou dano tecidular. (1)

    O biureto resulta da condensao de duas molculas de ureia, a quente.

    Observou-se inicialmente que quatro molculas biureto formavam um complexo de cor

    violeta com o cobre (Cu2+). Posteriormente, verificou-se que o mesmo ocorria com as

    protenas e pptidos, passando a utilizar-se este mtodo para o doseamento proteico. Na

    determinao de protenas pelo mtodo do biureto parte-se do pressuposto que todas as

    protenas reagem da mesma forma com o io cprico. (1)

    Em soluo alcalina, o cobre bivalente reage com as ligaes do pptido proteico

    e forma o complexo de biureto com o caracterstico tom prpura. O trtaro sdico-

    potssico impede a precipitao do hidrxido de sdio e o iodeto de sdio impede a

    auto-reduo do cobre. A intensidade cromtica, ou seja, o nmero de complexos

    formados, directamente proporcional concentrao de protenas da amostra (soro ou

    plasma) que pode ser determinada fotometricamente.

    Protena + Cu2+ Complexo Cu-protena

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    O mtodo do biureto simples, estvel, preciso, especfico (poucos

    interferentes), com baixa sensibilidade (1,5 a 12 g/dl), no sendo por isso adequado

    deteco de protenas na urina, mas o mtodo ideal para as protenas sricas. A

    linearidade bastante alargada e amostras com concentraes elevadas podem ser

    diludas a fim de se situarem na zona de linearidade. Os nicos interferentes so os

    dextranos de baixo peso molecular usados no tratamento da hipotenso como

    expansores de plasma.

    No caso de soros muito ictricos, lipmicos ou hemolisados (libertao de

    hemoglobina que actua como interferente positivo) necessrio preparar um branco de

    amostra para compensar a turvao ou cor.

    10.6 TESTE ENZIMTICO COLORIMTRICO/MODULO P

    10.6.1. Fundamento do mtodo

    As enzimas podem ser usadas como reagentes na determinao de um analto, ou

    serem elas prprias o analto a determinar. Tem sido crescente o uso de enzimas como

    reagentes analticos, uma vez que oferecem a vantagem de maior especificidade para o

    substracto a ser determinado. (1)

    Os mtodos enzimticos so mais rpidos, mais sensveis e menos trabalhosos

    do que os mtodos qumicos. Os reagentes enzimticos conservam-se bem quando

    liofilizados, no entanto, uma vez hidratados tm um perodo de utilizao muito

    reduzido pois difcil a sua conservao.

    10.6.1 a) Alfa-Amilase

    A amilase usada principalmente no despiste de doena pancretica. Alm da

    pancreatite aguda, esta enzima pode encontrar-se elevada nas situaes de ascite,

    peritonite, apendicite, doena neoplsica, colecistite e insuficincia renal. (1)

    O mtodo cintico descrito baseia-se num procedimento de clivagem pela alfa-

    amilase e hidrlise subsequente de todos os produtos de degradao a p-nitrofenol

    (cromforo) pela aco da alfa-glucosidase. A intensidade da cor do p-nitrofenol

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    formado directamente proporcional concentrao da actividade da alfa-amilase da

    amostra (soro, plasma ou urina), podendo ser determinada fotometricamente.

    -amilase

    5-etilideno-G7PNP + 5 H2O 2-etilideno-G5 + 2 G2PNP + 2-etilideno-G4 + 2 G3PNP +

    etilideno-G3 +

    -glucosidase

    2 G2PNP + 2 G3PNP + G4PNP + 14H2O 5 PNP + 14G

    10.6.1 b) cido rico

    O cido rico o principal produto do catabolismo das purinas. A hiperuricmia

    pode estar associada a consumo excessivo de purinas na dieta, doena maligna,

    psoriase, insuficincia renal crnica e deficinca primria em enzimas do metabolismo

    das purinas. Este aumento pode ser responsvel pelo sndrome de gota, o qual pode

    estar na origem de artrite e nefropatia. (1)

    No mtodo desenvolvido por Town et al, a amostra incubada com uma mistura

    de reagentes que contm ascarbato oxidase e um sistema de aclaramento. importante a

    eliminao do cido ascrbico, na reaco preliminar, de forma a impedir a interferncia

    deste na reaco subsequente com a peroxidase.

    A oxidao do cido rico pela uricase seguida pela reaco do perxido na

    presena de peroxidase com formao de um corante imino-quinona, cuja intensidade

    da cor vermelha proporcional concentrao de cido rico da amostra (soro, plasma

    ou urina), sendo determinada fotometricamente:

    uricase

    cido rico + 2 H2O alantona + CO2 + H2O2

    peroxidase

    2 H2O2 + H+ + 4-aminofenazona + TOOS corante diimino-quinona + 4 H2O

    TOOS: N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3-metilanilina

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    A uricase uma enzima oxidoredutase. A reaco tem de ocorrer em meio

    tamponado alcalino para que o CO2 passe a bicarbonato e as bolhas no interfiram na

    reaco.

    Esta reaco poder ter como interferentes certas substncias que actuam como

    dadores de H+, reagindo com o oxignio libertado, impedindo a oxidao do

    cromogneo. Tambm a hemoglobina pode actuar sobre o cromogneo prematuramente,

    resultando numa interferncia positiva.

    10.6.1 c) Colesterol

    Na bioqumica clnica, o termo lpidos refere-se ao metabolismo lipoproteico e

    ateroesclerose, uma das causas de doena cardiaca coronria. A reduo das

    concentraes plasmticas de colesterol reduz a incidncia de doena cardaca

    coronria. A hipercolesterolmia definida em termos de risco de doena cardiada

    coronria. (1)(3)

    O mtodo CHOD-PAP baseia-se na determinao da 4colestenona aps

    clivagem enzimtica do ster de colesterol pela colesterol-oxidase e medio

    subsequente, pela reaco de Trinder, do perxido de hidrognio formado. O colesterol

    determinado de modo enzimtico utilizando colesterol esterase e colesterol oxidase.

    colesterol esterase

    steres do colesterol + H2O colesterol + RCOOH

    Os steres de colesterol so clivados atravs da aco do colesterol esterase e

    produzem colesterol livre e cidos gordos.

    Colesterol oxidase

    Colesterol + O2 4colestenona + H2O2

    Com a ajuda da colesterol-oxidase, o colesterol transformado em

    4colestenona e perxido de hidrognio pela aco do oxignio.

    peroxidase

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    2H2O2 + 4-aminofenazona + fenol 4-(p-benzoquinona-monoimino)-fenazona+ 4 H2O

    O perxido de hidrognio produzido origina uma colorao vermelha atravs da

    reaco coma 4-aminofenazona e o fenol, sob a aco cataltica da peroxidase. A

    intensidade da cor directamente proporcional concentrao de colesterol da amostra

    (soro ou plasma com heparina ou EDTA), podendo ser determinada fotometricamente.

    Nesta ltima reaco, a reaco indicadora, recorre-se ao mtodo de Trinder.

    Este mtodo apresenta interferentes, como a bilirrubina que interfere

    negativamente. Sendo o colesterol usado para avaliar a colestase, situao em que a

    bilirrubina elevada (> 5mg), a interferncia anteriormente referida ser ainda mais

    importante.

    10.6.1 d) Colesterol HDL

    Na presena de sulfato de magnsio, o sulfato de dextrano forma selectivamente

    complexos hidrossolveis com LDL, VLDL e quilomicrons que so resistentes s

    enzimas modificadas por PEG.

    A concentrao de HDL determinada enzimaticamente, pela colesterol esterase

    e colesterol oxidase acopladas com PEG aos grupos amino.

    Sob influncia da colesterol esterase, os steres do colesterol so

    quantitativamente decompostos em colesterol livre e cidos gordos. Na presena de

    oxignio, o colesterol oxidado pela colesterol oxidase a colestenona e perxido de

    hidrognio. O perxido de hidrognio formado reage com a 4-amino-antipirina e com a

    N-(2-hidroxi-3- sulfopropil)-3,5-dimetoxianilina de sdio (HSDA) para formar um

    corante prpura-azul. A intensidade da colorao directamente proporcional

    concentrao de colesterol da amostra (soro ou plasma tratado com heparina) e

    medida fotometricamente.

    PEG-colesterol esterase

    ster do colesterol HDL + H2O colesterol + RCOOH

    Colesterol HDL + O2 4colestenona + H2O2

    2 H2O2 + 4-amino-antipirina + HSDA+ H+ + H2O pigmento prpura-azul + 5 H2O

    10.6.1 e) Colesterol LDL

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    Este mtodo usa um complexo de sulfato de ciclodextrina, sulfato de dextrano

    (MOPS, POD, HSDA) e magnsio para estabilizar as molculas de VLDL e

    quilomicrans. Um segundo reagente contm um detergente que forma micelas estveis

    com o HDL e as VLDL e quilomicrans previamente estabilizadas, inibindo a sua

    reaco com a colesterol esterase e oxidase. Aps a reaco do LDL da amostra (soro

    ou plasma tratado com heparina) com a colesterol esterase e oxidase, o perxido de

    hidrognio formado reage com 4-aminoantipireno formando um produto corado que

    medido fotometricamente.

    colesterol esterase

    steres colesterol LDL + H2O colesterol + RCOOH

    Colesterol LDL + O2 4colestenona + H2O2

    2 H2O2 + 4-amino-antipirina + HSDA+ H+ + H2O pigmento prpura-azul + 5 H2O

    10.6.1 f) Fosfatase cida e Fosfatase cida No Prosttica

    A fosfatase cida srica constituida por cinco isoenzimas produzidos,

    sobretudo, pelos eritrcitos, plaquetas, clulas reticuloendoteliais do bao e fgado e

    clulas epiteliais dos rins, osso e prstata. (1)

    A fosfatase cida no prosttica encontra-se aumentada nas situaes de

    hipermetabolismo sseo, nomeadamente, hiperparatiroidismo, doena de Paget e

    invaso maligna de tecido sseo. A fraco prosttica pode estar aumentada na

    existncia de doena maligna da prstata. (1)

    O ensaio utilizado consiste numa modificao do mtodo descrito por Hillmann.

    O 1-naftol libertado durante a hidrlise enzimtica do 1-naftilfosfato convertido num

    corante azico atravs de acoplao com o 2-amino-5-clorotolueno diazotado, sendo

    determinado por fotometria. A adio de 1,5-pentanediol aumenta a actividade da

    fosfatase cida prosttica (amostra de soro).

    Na determinao da fosfatase no prosttica, o tartarato utilizado como

    inibidor especfico da fosfatase cida prosttica.

  • I Mestrado Anlises Clnicas

    Joana Selada Domingues - 28 -

    Fosfatase cida

    1-naftilfosfato + H2O 1-naftol + fosfato

    1-naftol + 2-amino-5-clorotolueno corante azico

    10.6.1. g) Fosfatase Alcalina

    A determinao dos nveis sricos de fosfatase alcalina de particular interesse

    na avaliao da doena hepatobiliar e doena ssea associada ao aumento da actividade

    osteoblstica. (1)(3)

    Este mtodo baseia-se no ensaio desenvolvido por King e Armstrong. Na

    presena de ies magnsio e zinco, o fosfato de p-nitrofenilo (substracto) hidrolisado

    por fosfatases e forma fosfato e p-nitrofenol. O p-nitrofenol libertado proporcional

    actividade da ALP da amostra (soro ou plasma) e pode ser medido fotometricamente.

    ALP

    Fosfato de p-nitrofenilo + H2O fosfato + p-nitrofenol

    A grande dificuldade destes mtodos resulta das impurezas, quer do substracto

    quer dos tampes, que originam produtos de degradao inibidores da enzima. A

    utilizao de tampes amino-lcoois complica a cintica da reaco enzimtica, uma

    vez que a reaco ir depender no s da concentrao de substracto, mas tambm da

    concentrao do tampo aceitador de fosfato que actua como co-substracto. Os

    resultados esto muito dependentes da temperatura (a enzima degrada-se com o calor),

    tampo, pH. por isso uma determinao difcil de estandardizar.

    10.6.1 h) Gama-glutamiltransferase (GGT)

    A GGT tem origem no sistema hepatobiliar, estando a sua actividade elevada em

    todas as formas de doena heptica. O seu aumento mais marcado, 5 a 30 vezes o

    valor normal, em casos de obstruo biliar intra-heptica ou ps-heptica. a enzima

    heptica mais sensivel na deteco de ictercia obstrutiva, colangite e colecistite. (1) (5)

    Nesta determinao cintica a gama-glutamiltransferase da amostra (soro ou

    plasma) transfere o grupo -glutamilo da L--glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida para a

  • I Mestrado Anlises Clnicas

    Joana Selada Domingues - 29 -

    glicilglicina. A quantidade libertada de 5-amino-2-nitrobenzoato proporcional

    actividade de GGT e pode ser medida fotometricamente.

    -GT

    L--glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida + glicilglicina L--glutamil-glicilglicina + 5-

    amino-2-nitrobenzoato

    10.6.1 i) Triglicridos

    Os triglicridos constituem 95% do armazenamento de tecido gordo no

    organismo. As quilomicrons contm na sua composio 85% de triglicridos. (1)

    Todos os mtodos de quantificao dos triglicridos se baseiam na quantificao

    do glicerol. O mtodo GPO-PAP baseia-se no trabalho de Wahlefeld, utilizando uma

    lipoprotena lipase de microorganismos para a hidrlise rpida e completa dos

    triglicridos da amostra (soro ou plasma) a glicerol, seguida de oxidao para fosfato de

    dihidroxiacetona e perxido de hidrognio. O perxido de hidrognio produzido reage

    depois com 4-aminofenazona e 4-clorofenol sob a aco cataltica da peroxidase, para

    formar um corante vermelho (reaco de ponto final de Trinder), o qual ser

    determinado por fotometria.

    LPL

    TG + 3H2O glicerol + 3 RCOOH

    GK

    Glicerol + ATP glicerol-3-fosfato + ADP

    Mg2+

    GPO

    Glicerol-3-fosfato + O2 fosfato de dihidroxiacetona + H2O2

    peroxidase

    H2O2 + 4-aminofenazona + 4-clorofenol 4-(p-benzoquinona-monoimino)-fenazona +

    H2O + HCl

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    Joana Selada Domingues - 30 -

    Os mtodos enzimticos usam uma hidrlise enzimtica, por intermdio de uma

    lipase. Como vantagens apresentam a rapidez, ausncia de reagentes casticos e

    extraco com solventes orgnicos. No entanto, estes mtodos tambm tm

    desvantagens, no descontando o glicerol endgeno, que poder ser mais ou menos alto,

    consoante a liplise dos triglicridos ou o armazenamento no tecido adiposo. O glicerol

    endgeno pode aumentar 50 a 100 vezes em situao de stress (adrenalina), doena

    (diabetes, deficincia em glicerolquinase) ou infuses intra-venosas. (1)

    10.7 TESTE ENZIMTICO-UV/MODULO P

    10.7.1. Fundamento do mtodo

    O laboratrio clnico tem necessidade de avaliar alteraes na actividade ou

    concentraes de enzimas no soro que so predominantemente intracelulares e esto

    normalmente presentes em baixas concentraes. Pela deteco de alteraes nos nveis

    destas enzimas durante situaes patolgicas, possvel inferir a localizao e natureza

    da patologia. (1)

    A quantidade de substracto transformado em produto durante uma reaco

    catalizada por uma enzima pode ser medido por um mtodo analtico apropriado, como

    por exemplo alteraes nas caractersticas de absorvncia de um componente do sistema

    analtico. Os coenzimas NADH ou NADPH podem ser monitorizados por alteraes na

    absorvncia a 340nm, durante a oxidao ou reduo. (1)

    10.7.1 a) Alanina-aminotransferase/Transaminase glutamicapiruvica (ALT/GPT)

    As transaminases permitem a deteco de hepatites, mas apesar do aumento dos

    nveis sricos de AST e ALT nas situaes de leso da integridade do hepatcito, a ALT

    uma enzima mais especfica do fgado e a elevao das suas concentraes persistem

    por um perodo mais alargado do que a AST. (1) (5)

    A enzima ALT da amostra (soro e plasma) catalisa reaco de equilbrio a seguir

    descrita. O aumento do piruvato determinado numa reaco indicadora catalisada pela

    lactato-desidrogenase. O NADH oxidado a NAD. A velocidade de diminuio do

    NADH, medido fotometricamente, directamente proporcional velocidade de

    formao do piruvato e, logo, actividade da ALT (determinao cintica).

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    Joana Selada Domingues - 31 -

    ALT

    L-alanina + -cetoglutarato piruvato + L-glutamato

    LDH

    Piruvato + NADH + H+ lactato + NAD+

    10.7.1 b) Aspartato-aminotransferase/Transaminase glutamicaoxaloactica (AST/ GOT)

    A enzima AST, alm de estar associada a doena heptica, pode tambm ser um

    indicador de enfarte do miocrdio, distrofia muscular e embolia pulmonar. (5)

    A enzima AST da amostra (soro ou plasma) catalisa a reaco de equilbrio a

    seguir descrita, com determinao cintica.. O aumento do oxaloacetato determinado

    numa reaco indicadora catalisada pela malato-desidrogenase. O NADH oxidado a

    NAD. A velocidade de diminuio do NADH, medida fotometricamente, directamente

    proporcional velocidade de formao do oxaloacetato e, logo, actividade da AST.

    AST

    L-aspartato + -cetoglutarato oxaloacetato + L-glutamato

    MDH

    Oxaloacetato + NADH + H+ L-malato + NAD+

    10.7.1 c) Creatinafosfoquinase (CPK)

    A actividade da CPK encontra-se elevada em diversas patologias do sistema

    musculo-esqueltico, cardiaco, sistema nervoso central e tiroide. (1) (6)

    O mtodo de ensaio utilizando o fosfato de creatinina e ADP foi inicialmente

    descrito por Oliver. A CPK rapidamente inactivada por oxidao dos grupos sulfidrilo

    no seu centro activo. A enzima pode ser reactivada pela adio de acetilcistena. A

    interferncia da adenilatoquinase prevenida atravs da adio de pentafosfato de

    diadenosina e AMP.

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    Joana Selada Domingues - 32 -

    CPK

    Fosfato de creatinina + ADP creatina + ATP

    HK

    Glucose + ATP glucose-6-P + ADP

    G6P-DH

    Glucose-6-p + NADP+ gluconato-6-P + NADPH+ + H+

    Formam-se quantidades equimolares de NADPH e ATP mesma velocidade. A

    taxa de formao de NADPH medida fotometricamente proporcional actividade de

    creatinafosfoquinase da amostra (soro ou plasma).

    10.7.1 d) Glucose

    A determinao da glucose permite o despiste de patologias associadas a hiper e

    hipoglicmia. A patologia mais pesquisada a Diabetes Mellitus constitui um grupo de

    desordens metablicas dos carbohidratos, no qual h intolerncia glucose, originando

    hiperglicmia. (1)

    Segundo os ltimos critrios da Direco-Geral da Sade, o diagnstico da

    Diabetes Mellitus baseia-se na glicmia em jejum 126mg/dl ou sintomas clssicos com

    glicmia ocasional 200mg/dl ou glicmia 200mg/dl, na PTOG com 75g de glucose,

    s 2 horas. A Tolerncia Diminuda Glucose apresenta glicmia de jejum

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    HK

    Glucose + ATP G-6-P + ADP

    A hexoquinase catalisa a fosforilao da glucose em glucose-6-fosfato por ATP.

    G-6-PDH

    G-6-P + NADP+ gluconato-6-P + NADPH + H+

    A frutose poder interferir neste ensaio, contudo, este acar no existe em

    jejum e, no ps-prandial, um indivduo normal tem nveis extremamente baixos e num

    tempo reduzido. Torna-se necessrio considerar esta interferncia positiva nas provas de

    sobrecarga em frutose. um mtodo muito especfico, sem interferncia dos redutores.

    10.7.1 e) Lactato desidrogenase (LDH)

    No laboratrio clnico, a LDH til na avaliao de enfarte do miocrdio,

    miocardite, insuficincia cardaca, hemlise, doena maligna e doena renal. (1)

    A LDH da amostra (soro ou plasma) catalisa a converso de piruvato em lactato

    e o NADH oxidado a NAD. A velocidade de reduo de NADH directamente

    proporcional actividade de LDH.

    LDH

    Piruvato + NADH + H+ lactato + NAD+

    10.7.1 f) Ureia

    A principal utilidade clnica da determinao srica da ureia baseia-se no clculo

    da razo ureia/creatinina usada na discriminao da urmia pr e ps-renal. (1)

    Em 1965, Talke e Schubert publicaram um mtodo totalmente enzimtico para

    determinao da ureia usando o sistema enzimtico acoplado urease/glutamato-

    desidrogenase (GLDH). O decorrente ensaio baseia-se neste mtodo, tendo sido

    optimizado para analisadores que permitem leituras cinticas.

    A ureia da amostra (soro, plasma ou urina) hidrolisada pela urease e forma

    CO2 e amnia. A amnia reage com o -cetoglutarato e o NADH na presena da GLDH

  • I Mestrado Anlises Clnicas

    Joana Selada Domingues - 34 -

    e produz glutamato e NAD+. A reduo da absorvncia causada pelo consumo do

    NADH medida fotometricamente.

    urease

    Ureia + H2O 2NH4+ + CO2

    GLDH

    -cetoglutarato + NH4+ + NADH L-glutamato + NAD+ + H2O

    A hidrlise enzimtica pela urease (amido hidrolase) e quantificao do io

    amnio, poder originar erros diferentes consoante se trate de uma amostra de urina ou

    soro porque a quantidade de amnio que existe nos dois diferente, sendo superior na

    urina. Tem ainda como inconveniente o facto do io amnio ser um contaminante do

    laboratrio e da gua, devendo ser desamoniada. Apresenta a vantagem de ser uma

    reaco muito especfica uma vez que a urease s reage com a ureia. Tendo em conta a

    possibilidade da ureia ser degradada por aco bacteriana, a amostra deve ser analisada

    poucas horas aps a colheita ou conservada por refrigerao. (1)

    10.8 TESTE UV/MODULO P

    10.8.1. Fundamento do mtodo

    Consiste na deteco de variaes de absorvncia na zona dos ultra-violetas.

    10.8.1 a) Fsforo

    A determinao da fosfatmia permite detectar situaes patolgicas associadas

    a hipofosfatmia, como o hiperparatiroidismo, alcalose respiratria, aumento da

    secreo de insulina; e a hiperfosfatmia, como a insuficincia renal,

    hipoparatiroidismo, acidose respiratria, entre outras. (1) (4)

    O mtodo do molibdato baseia-se na reaco do fosfato da amostra (soro plasma

    ou urina) com o molibdato de amnio e a formao de fosfomolibdato de amnio sem

    reduo. A adio de um acelerador provoca uma taxa de reaco mais rpida e a

    aplicao do branco da amostra produz resultados mais precisos.

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    Joana Selada Domingues - 35 -

    O fosfato inorgnico forma um complexo de fosfomolibdato de amnio,

    (NH4)3PO4(MoO3)12, com molibdato de amnio na presena de cido sulfrico. O

    complexo determinado fotometricamente na regio dos UV (340nm).

    1111.. UURRIISSYYSS 22440000 ((FFOOTTOOMMEETTRRIIAA DDEE RREEFFLLEECCTTNNCCIIAA))

    11.1. Fundamento do mtodo

    A anlise de urinas envolve trs princpios bsicos: a avaliao visual da cor e

    aspecto da amostra de urinas, a deteco de determinadas substncias usando tiras teste,

    e o exame microscpico do sedimento urinrio. No exame microscpico do sedimento

    urinrio confirmam-se alguns dos parmetros fornecidos pelas tiras teste e avalia-se a

    presena de clulas epiteliais, leuccitos, eritrcitos, cilindros e cristais (com semi-

    quantificao).

    O Urisys 2400 (figura 6) um sistema totalmente automtico de anlise de

    urinas, destinado determinao qualitativa ou semi-quantitativa in vitro de analitos da

    urina, incluindo leuccitos, nitritos, protenas, glicose, cetonas, urobilinognios,

    bilirrubina e eritrcitos, assim como o pH, a densidade especfica, a cor e o aspecto.

    As principais funes deste analisador incluem a identificao de amostras,

    distribuio automtica de tiras teste, pipetagem automtica de amostras e leituras

    fotomtricas. Est optimizado para analisar entre 100 a 1000 amostras de urina por dia.

    Figura 6

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    Joana Selada Domingues - 36 -

    O Urisys 2400 um fotmetro de reflectncia, os resultados dos testes baseiam-

    se na leitura da intensidade de luz reflectida pela tira teste. A cabea de leitura contm

    dodos de emisso de luz (LED) de trs comprimentos de onda diferentes. A leitura

    ocorre aps a reaco qumica e desenvolvimento de cor. A luz reflectida medida

    electro-opticamente. Um LED transmite luz com um comprimento de onda definido,

    num ngulo ideal, para a superfcie de uma banda reactiva. A luz incide na superfcie da

    banda reactiva e reflectida com uma intensidade que depende da cor da banda

    reactiva. Um detector de fotododo recebe a luz reflectida e transmite um sinal elctrico

    analgico para o conversor analgico-para-digital, o qual converte o sinal analgico

    num valor digital. Um microprocessador ajusta o valor digital e converte-o num valor

    relativo utilizando uma escala padronizada de calibrao. O microprocessador calcula

    um valor de reflectncia. O resultado semi-quantitativo da concentrao determinado,

    comparando o valor da reflectncia com o valor dos limites de intervalo.

    A leitura da densidade especfica efectuada numa clula de fluxo que

    preenchida com a amostra de urina. Um LED transmite luz clula de fluxo. Um

    dispositivo de carga acoplada determina o ngulo de reflexo total. O ndice refractivo

    da amostra calculado a partir do ngulo de reflexo total, utilizando uma curva de

    calibrao.

    O pH determinado por intermdio dos indicadores vermelho de metilo,

    fenolftalena e azul de bromotimol, que reagem especificamente com os ies H+. Os

    leuccitos so revelados pela presena das esterases granulocitrias, as quais

    decompem um ster indoxlico em indoxil, que reage com o sal de diaznio,

    produzindo um corante violeta. O teste para deteco de protenas baseia-se no princpio

    do erro proteico de um indicador de pH. O teste para nitritos baseado na prova de

    Griess. A determinao da glucose baseada na reaco especfica da glucose-

    oxidase/peroxidase (mtodo GOD/POD). O teste para os corpos cetnicos baseia-se no

    princpio da prova de Legal. Na determinao do urobilinognio e bilirrubina, estes

    reagem com um sal de diaznio originando um corante azico. A hemoglobina catalisa

    a oxidao do indicador atravs do perxido de hidrognio orgnico contido na zona

    teste, originando uma colorao azul-esverdeada.

    Nos casos em que o volume de amostra inferior a 200ml, a anlise pelo

    equipamento no possvel, sendo ento realizada a tcnica manual em que uma tira

    teste mergulhada na amostra e a leitura feita por comparao visual das cores obtidas

    com tabela respectiva.

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    Joana Selada Domingues - 37 -

    IIMMUUNNOOLLOOGGIIAA

    Endocrinologia

    Doseamentos hormonais Hormonas do Eixo Hipotlamo-epifisrio:

    FSH, LH, TSH, LH, Progesterona, Prolactina

    Hormonas da Tiride: T3, T4, FT3, FT4,

    Hormonas da Paratiride: Paratormona;

    Hormonas das Gnadas: Progesterona, Beta-

    hCG, 17-Beta-Estradiol, Testosterona

    Imunologia

    Imunoqumica Crioglobulinas (ttulo e pesquisa)

    Complemento (C3 e C4)

    Imunoglobulinas (IgG, IgM, IgA, IgE)

    Protena C reactiva (PCR)

    Waller-Rose

    Factor reumatide (FR)

    Auto Imunidade Anticorpos anti-nucleares (anti-ANA)

    Anticorpos anti-antignios nucleares extraveis

    (ENA): SS-A, SS-B, Sm, Rnp

    Anticorpos anti-DNA

    Anticorpos anti-tiroideus: anti-Tiroglobulina

    (TG), anti-Peroxidase da Tiride (TPO)

    Imunoserologia Anticorpos anti-HVC (Virus Hepatite C)

    Anticorpos anti-HBc, HBe, HBs; Antignios

    Hbe e HBs (Virus Hepatite B)

    Anticorpos anti-HVA (IgG, IgM) (virus

    hepatite A)

    Anticorpos anti-CMV (IgG, IgM)

    (citomegalovirus)

    Anticorpos anti-Clamydea Trachomatis (IgG,

    IgM)

    Anticorpos anti-Helicobacter pylori (IgG)

    Anticorpos anti-HIV I e II (vrus

    imunodeficincia adquirida)

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    Joana Selada Domingues - 38 -

    Anticorpos anti-Toxoplasma (IgG, IgM)

    Anticorpos anti-Rubola (IgG, IgM)

    Ttulo anti-estreptolisina O (TASO)

    Ag febril (Reaco de Widal)

    Sfilis (RPR)

    Brucelose (Rosa bengala)

    Marcadores tumorais Alfa-fetoprotena

    CEA, CA-19.9, CA-125, CA-15.3

    PSA, FPSA

    11.. AAGGLLUUTTIINNAAOO DDIIRREECCTTAA

    LE Teste em Latex

    O LE Teste utilizado na deteco dos anticorpos associados ao Lpus

    Eritematoso Sistmico (SLE). O soro dos doentes portadores de SLE contem quase

    sempre anticorpos dirigidos contra um ou vrios antignios nucleares. Estes anticorpos

    antinucleares (ANA), que podem ser da classe IgG, IgA ou IgM, esto presentes,

    aproximadamente, em 95% dos pacientes no tratados, mas no so completamente

    especficos para o diagnstico de SLE. Muitas vezes, a taxa de ANA em circulao

    corresponde actividade do SLE, mas por vezes no existe qualquer correlao. A

    utilizao deste teste permite, principalmente, excluir o diagnstico de SLE.

    A nvel dos dados laboratoriais, o SLE geralmente acompanhado de

    trombocitopnia, anemia hemoltica, dados compatveis com insuficincia renal,

    positividade para diversos auto-anticorpos e hipocomplementmia.

    1.1. Fundamento do mtodo

    As reaces de aglutinao e precipitao constituem a base de muitas das

    tcnicas aplicadas no laboratrio de imunologia. Enquanto as reaces de precipitao

    so quantificveis, as tcnicas de aglutinao so apenas semiquantitativas. A principal

    vantagem das reaces de aglutinao inclui a capacidade de avaliao visual do ponto

    final da reaco, sem necessidade de recorrer a equipamento especfico. As reaces de

    aglutinao podem ser classificadas em directa ou indirecta (passiva). Na tcnica

  • I Mestrado Anlises Clnicas

    Joana Selada Domingues - 39 -

    directa, clulas ou partculas antignicas insolveis so aglutinadas directamente pelo

    anticorpo. A aglutinao passiva refere-se aglutinao de clulas ou partculas inertes

    ligadas a antignios que so transportadores passivos de antignios solveis. (7)

    Este teste baseado numa reaco imunolgica entre as partculas de ltex

    revestidas de DNP (desoxiribonucleoprotena) e os anticorpos anti-DNP da amostra.

    Logo que a concentrao dos anticorpos nas amostras aumente, aparece uma

    aglutinao visvel a olho n. Trata-se de um teste qualitativo que poder ser semi-

    quantitativo por diluio da amostra.

    Amostra: Soro

    22.. AAGGLLUUTTIINNAAOO -- RROOSSAA BBEENNGGAALLAA

    Brucelloslide

    A brucelose uma zoonose transmitida aos seres humanos por animais

    infectados. Pode ser causada por qualquer uma das 4 espcies de Brucella: Brucella

    melitensis (a mais comum e mais virulenta) adquirida a partir de cabras, ovelhas e

    camelos; Brucella abortus, existente no gado ovino; B.suis, nos sunos, e B.canis, nos

    ces. transmitida mais frequentemente atravs da ingesto de leite e lacticnios no

    tratados, podendo ser contrado por inalao durante o contacto com animais, leses

    cutneas, auto-inoculao ou via conjuntival. Ocasionalmente pode ser transmitida por

    via interpessoal, durante o aleitamento e actividade sexual. Possui uma manifestao

    febril, sem padro distinto.

    O serodiagnstico clssico das infeces agudas por Brucella baseia-se na

    pesquisa e titulao dos anticorpos da classe M (aglutinantes) e IgG anti-antignios

    polissacardicos A e M da parede celular, utilizando as reaces imunolgicas de

    aglutinao directa de Huddleson (mtodo em lmina), de Rosa de bengala (mtodo em

    lmina) e de Wright (mtodo em tubo). (8)

    A reaco de Rosa de Bengala uma prova de aglutinao rpida executada em

    lmina que utiliza uma suspenso antignica corada pelo Rosa de bengala. um teste

    recomendado como procedimento de rastreio, para pesquisar a presena de anticorpos,

    essencialmente da classe IgG, anti-Brucella no soro dos doentes com suspeita clnica de

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    Joana Selada Domingues - 40 -

    Brucelose. Para alm de detectar a presena de anticorpos bloqueantes (IgG1 e IgG2),

    tem uma especificidade superior reaco de Huddleson e de Wright que se deve, em

    grande parte, utilizao de uma meio reactivo acidificado responsvel pela

    minimizao da aglutinao induzida pelos anticorpos da classe IgM. Por este facto

    positiva mais tardiamente do que a reaco de Huddleson e de Wright. Uma vez que a

    reaco positiva tanto nos doentes com Brucelose aguda como nos que apresentam

    infeces subagudas e crnicas considerado o teste clssico e de eleio para efectuar

    inquritos epidemiolgicos. (8)

    2.1. Fundamento do mtodo

    As tcnicas de rastreio para a pesquisa de anticorpos contra bactrias

    patognicas recorrem a reaces de aglutinao. A incubao da bactria fixada com o

    soro do paciente leva aglutinao das bactrias se o paciente desenvolveu uma

    resposta imune contra o agente. Estas tcnicas podem apresentar reaces cruzadas. No

    entanto, a sua execuo extremamente fcil e o custo baixo, pelo que continuam a

    ser utilizadas. (8)

    Este teste baseia-se no serodiagnstico da brucelose por aglutinao em carta

    (Ag Rosa Bengala). O antignio cido tamponado, corado com Rosa Bengala, permite

    uma deteco precoce das aglutininas especficas da brucelose (Brucella melitensis, B.

    abortus, B. bovis e B. suis).

    Falsos Positivos: indivduos recentemente imunizados contra a clera, infectados

    com Yersinia enterocolitica bitipo 9 ou Francisella tularensis.

    Falsos Negativos: Presena de anticorpos bloqueantes

    Amostra: Soro

    33.. AAGGLLUUTTIINNAAOO -- WWIIDDAALL

    As salmoneloses so infeces provocadas por microorganismos gram-negativos

    da famlia das enterobactrias, as Salmonelas. A serotipagem baseia-se na reactividade

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    Joana Selada Domingues - 41 -

    imunolgica dos antignios somticos, O, que so predominantemente

    lipopolissacridos, e dos antignios capsulares, H.

    As manifestaes clnicas e gravidade da infeco por microorganismos do

    gnero Salmonela iro depender do serotipo envolvido. Estas podem distinguir-se

    clinicamente em Salmonelas no tifides e tifides. O serotipo Salmonella typhi o

    responsvel pela febre tifide. Esta uma infeco sistmica, que se apresenta com

    febres altas, cefaleias e sem diarreia. Este serotipo tem o homem como nico

    reservatrio e pode existir em portadores saudveis. A sua transmisso feita por

    contacto directo homem-a-homem ou oral-fecal (alimentos e gua contaminados). Os

    serotipos paratyphi A, B e C, provocam uma sndrome semelhante febre tifide. O

    nico teste laboratorial especfico para o diagnstico da Salmonelose o seu isolamento

    em cultura. Existem no entanto mtodos de serodiagnstico que, apesar da sua reduzida

    inespecificidade e sensibilidade, continuam a ser muito solicitados, tais como o Teste de

    Widal.

    3.1. Fundamento do mtodo

    Antignios febris so usados em testes de aglutinao como complemento ao

    diagnstico de determinadas doenas febris, tais como doenas por Salmonella spp,

    Brucella spp e Ricketsieae. O soro do paciente testado directamente para anticorpos

    homlogos.

    O diagnstico serolgico de Widal utilizado nas febres tifo-paratifidicas

    quando a bactria, salmonela, no pode ser isolada. Baseia-se na pesquisa dos

    anticorpos anti-O e anti-H sricos pela utilizao das suspenses O e H da Salmonella

    typhi e paratyphi A, B, C, Salmonella typhi-murium e Salmonella enteritidis. O

    aparecimento das anti-O indica uma infeco recente. No indivduo vacinado apenas as

    aglutininas H persistem. Uma antibioterapia precoce pode impedir o aparecimento das

    aglutininas O. (9)

    A prova realizada em lmina apresenta resultados positivos quando se verifica a

    presena de aglutinao. Os resultados negativos traduzem-se na ausncia de

    aglutinao visvel. Define-se o ttulo como o inverso da maior diluio que d

    resultado positivo.

  • I Mestrado Anlises Clnicas

    Joana Selada Domingues - 42 -

    Tm relevncia clnica os ttulos em diluio igual ou superior a 1/80. Um

    aumento de ttulo entre amostras colhidas a tempos diferentes ser sugestivo de um

    diagnstico presuntivo.

    Falsos Positivos: O soro de doentes normais pode apresentar aglutinao

    positiva com Ags febris devido a imunizao prvia, infeco antiga ou pela presena

    de anticorpos relacionados com os antignios. Em geral, os ttulos encontrados nestas

    situaes sero inferiores e permanecero a um nvel constante. Os ttulos detectados

    como resultado de uma infeco activa ou imunizao recente com um organismo

    contendo antignios homlogos ser, geralmente, superior e tender a aumentar.

    Falsos Negativos: Tal como noutros imunoensaios podero verificar-se

    fenmenos de prozona. Nalgumas situaes no h desenvolvimento de aglutininas.

    Amostra: Soro

    44.. HHEEMMAAGGLLUUTTIINNAAOO GGEELL -- WWAALLLLEERR--RROOSSEE

    POLYARTEST

    A artrite reumatide e doenas relacionadas esto associadas produo de um

    grupo de imunoglobulinas, denominadas factores reumatides (FR).

    Os factores reumatides so um grupo heterogneo de auto-anticorpos dirigidos

    contra os determinantes antignicos da regio Fc das molculas de IgG. So importantes

    para o diagnstico da artrite reumatide mas tambm podem ser encontrados noutras

    doenas reumticas inflamatrias e em vrias doenas no reumticas: processos

    inflamatrios crnicos, doenas infecciosas como endocardite bacteriana subaguda,

    malria, sfilis, lepra, leishmaniose, tuberculose e variedades de doenas auto-imunes

    como o LES. Tambm so encontrados em pessoas saudveis acima dos 60 anos. (7)(10)

    Os auto-anticorpos ocorrem em todas as classes de imunoglobulinas (IgG, IgA,

    IgM monomrica) apesar dos mtodos analticos usuais serem limitados deteco dos

    factores reumatides do tipo IgM pentamrica.

    4.1. Fundamento do mtodo

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    Joana Selada Domingues - 43 -

    O Polyarteste utilizado como auxiliar no diagnstico imunolgico da artrite

    reumatide. A reaco baseada nas propriedades de hemaglutinao especficas do

    factor reumatide, como nas reaces do tipo Waller-Rose. O reagente consiste em

    glbulos vermelhos de carneiro sensibilizados por um soro de coelho anti-eritrcitos de

    carneiro. O factor reumatide humano aglutina estes eritrcitos de carneiro, devido a

    uma reaco cruzada entre a IgG do coelho e a IgG humana.

    As tcnicas de hemaglutinao utilizadas em serologia so tcnicas semi-

    quantitativas que consistem em incubar diluies variveis de anti-soro em presena de

    uma determinada concentrao de clulas.

    O ttulo no apenas influenciado pela quantidade de anticorpos, mas tambm

    pela sua afinidade. A multiplicidade destes factores explica porque a aglutinao

    fornece uma informao relativa que permite classificar o anti-soro, sem permitir uma

    estimao quantitativa dos anticorpos presentes.

    Um factor reumatide negativo no exclui o diagnstico de artrite reumatide.

    Aproximadamente 20% dos pacientes com artrite reumatide so seronegativos. Alguns

    destes pacientes podem ter factores reumatides IgG, IgA ou IgM monomrica.

    Inversamente, os factores reumatides tambm no aparecem s na artrite reumatide.

    Esto tambm presentes em 30% dos pacientes com LES, numa elevada percentagem

    (90%) de pacientes com sndrome de Sjgren e tambm em pacientes com escleroderma

    ou polimiosite. Os estudos epidemiolgicos mostram que um pequeno nmero de

    pessoas normais tambm tem factores reumatides.

    Falsos positivos: Nalgumas doenas crnicas infecciosas, como lepra e

    tuberculose. Na endocardite bacteriana subaguda ambos o teste pode se positivos

    durante a doena activa e reverter para negativo medida que o paciente melhora.

    Amostra: Soro

    55.. IIMMUUNNOOTTUURRBBIIDDIIMMEETTRRIIAA// MMOODDUULLAARR PP

    5.1. Imunoglobulinas

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    Observa-se uma diminuio na concentrao de imunoglobulinas em

    enteropatias com perdas proteicas, atravs da pele dos queimados e nas

    imunodeficincias adquirida e congnita. O aumento dos nveis de imunoglobulinas

    ocorre nas hepatopatias crnicas, doenas infecciosas e perturbaes autoimunes (artrite

    reumatide, LES). (10)

    5.1.1. Fundamento do mtodo

    Este teste baseia-se no princpio da aglutinao imunolgica para a determinao

    quantitativa de imunoglobulinas. Os anticorpos anti-Ig A, G ou M reagem com o

    antignio na amostra e formam um complexo Ag-Ac. Aps a aglutinao, a

    determinao feita por turbidimetria.

    Podem ocorrer resultados falsamente baixos devido a um excesso de antignio

    (efeito zona). Estes antignios bloqueiam o anticorpo impedindo-o de se formar o

    complexo Ag-Ac. Esta situao pode ser detectada aps diluio apropriada da amostra.

    As chamadas paraprotenas secretadas nas gamopatias monoclonais

    (imunoglobulinmia monoclonal) podem diferir das respectivas imunoglobulinas de

    origem policlonal, na composio e tamanho dos seus aminocidos. Tambm neste caso

    a ligao ao anticorpo pode ser prejudicada.

    Assim, amostras de soro de pacientes com um diagnstico clnico incerto devem

    ser sujeitas a uma electroforese de protenas para identificar um eventual excesso de

    antignio ou gamopatia monoclonal.

    Amostra: Soro ou plasma

    5.2. Anti-estreptolisina O (TASO)

    Os testes imunolgicos para a determinao de anticorpos especficos dos

    produtos metablicos estreptoccicos produzem informaes importantes sobre

    infeces anteriores por estreptococos. Os anticorpos so produzidos contra o patognio

    e os respectivos produtos metablicos. Um exemplo o anticorpo para a estreptolisina

    O, uma enzima produzida pelos estreptococos -hemolticos do grupo A de Lancefield,

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    Streptococcus pyogenes, um dos principais agentes da faringite. Procede-se

    determinao da anti-estreptolisina O aquando da ocorrncia de patologias txicas e

    sensibilizantes, como febre reumtica e a glomerulonefrite aguda ps-estreptoccica.

    Existem vrios mtodos para o doseamento da anti-estreptolisina O, como a aglutinao

    por ltex e inibio da hemlise.

    5.2.1. Fundamento do mtodo

    Este teste baseia-se no princpio da aglutinao imunolgica para determinao

    quantitativa de anti-estreptolisina O. A estreptolisina O (antignio) que reveste o ltex

    reage com os anticorpos da amostra e forma um complexo Ag-Ac por aglutinao. A

    determinao final feita por turbidimetria.

    possvel a ocorrncia de um efeito zona com concentraes elevadas de anti-

    estreptolisina O.

    Amostra: Soro ou plasma

    5.3. Factor Reumatide

    A artrite reumatide e doenas relacionadas esto associadas produo de um

    grupo de imunoglobulinas, denominadas factores reumatides (FR).

    Os factores reumatides so um grupo heterogneo de auto-anticorpos dirigidos

    contra os determinantes antignicos da regio Fc das molculas de IgG. So importantes

    para o diagnstico da artrite reumatide mas tambm podem ser encontrados noutras

    doenas reumticas inflamatrias e em vrias doenas no reumticas: processos

    inflamatrios crnicos, doenas infecciosas como endocardite bacteriana subaguda,

    malria, sfilis, lepra, leishmaniose, tuberculose e variedades de doenas auto-imunes

    como o LES. Tambm so encontrados em pessoas saudveis acima dos 60 anos. (8)

    Os auto-anticorpos ocorrem em todas as classes de imunoglobulinas (IgG, IgA,

    IgM monomrica) apesar dos mtodos analticos usuais serem limitados deteco dos

    factores reumatides do tipo IgM pentamrica.

    5.3.1. Fundamento do teste

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    Este baseia-se no princpio da aglutinao imunolgica para a determinao

    quantitativa de factores reumatides. A IgG (antignio) inactivada pelo calor, ligada a

    partculas de ltex, reage com os anticorpos FR na amostra e forma complexos Ag-Ac.

    Estes, aps a aglutinao, so determinados por turbidimetria.

    O procedimento clssico de quantificao dos FRs recorre aglutinao com

    eritrcitos de ovelha sensibilizados para IgG ou com partculas de ltex. Os problemas

    prprios destes mtodos semiquantitativos so a fraca preciso e reprodutibilidade

    interlaboratoriais, associadas a dificuldades de padronizao. Estes motivos levaram ao

    desenvolvimento de novos mtodos de ensaio, como a turbidimetria e imunoensaios

    enzimticos.

    Amostra: Soro ou plasma

    5.4. Protena C reactiva (PCR)

    A PCR uma glucoprotena que normalmente no se encontra presente no soro,

    sendo um indicador inespecfico de fase aguda. Esta protena aparece em infeces e

    agresses com inflamao. O doseamento da PCR utilizado para detectar processos

    inflamatrios sistmicos, avaliar o tratamento das infeces bacterianas com

    antibiticos, fazer a distino entre a forma activa e inactiva de doenas com infeco

    concomitante, por exemplo, em doentes que sofrem de SLE ou colite ulcerosa, para

    controlar terapeuticamente as doenas reumticas, avaliar a teraputica anti-inflamatria

    e para distinguir entre infeco e rejeio de transplante da medula ssea. (10)

    Mais recentemente verificou-se a sua utilidade no prognstico de risco

    cardiovascular em indivduos saudveis, com angina instvel e IAM, devido ao papel da

    inflamao na fisiopatologia da aterosclerose. No entanto, a sua utilizao na avaliao

    do risco cardiovascular implica a utilizao de ensaios que possuam sensibilidade igual

    ou inferior a 0.1 mg/dL.

    5.4.1. Fundamento do teste

    Este teste baseia-se no princpio da aglutinao imunolgica para a determinao

    quantitativa da protena C reactiva. Os anticorpos anti-PCR reagem com o antignio na

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    amostra e formam um complexo Ag-Ac. Aps a aglutinao, a determinao feita por

    turbidimetria.

    Amostra: Soro ou plasma

    66.. RREEAACCOO DDEE FFLLOOCCUULLAAOO

    RPR

    A sfilis uma infeco crnica sistmica causada por uma espiroqueta, o

    Treponema pallidum subespcie pallidum. habitualmente transmitida por via sexual

    (mas tambm de transmisso congnita) e caracteriza-se por episdios de doena activa

    interrompidos por perodos de latncia. Aps um perodo mdio de incubao de 2 a 6

    semanas, aparece uma leso primria frequentemente associada a linfoadenopatia

    regional (Sfilis Primria). Um estadio bacterimico secundrio, associado a leses

    cutneo-mucosas generalizadas (Sfilis Secundria) seguido por um perodo latente de

    infeco subclnica que pode durar muitos anos (Sfilis Latente). Em cerca de 1/3 dos

    casos no tratados segue-se um estdio tercirio, caracterizado por leses cutneo-

    mucosas, msculo-esquelticas e parenquimatosas, progressivamente destrutivas, aortite

    ou patologia sintomtica do sistema nervoso central (Sfilis Terciria). O Treponema

    pallidum um microorganismo fastidioso, no cultivvel em meios de cultura habituais,

    sendo a sua presena normalmente demonstrada de forma indirecta por testes

    serolgicos. Pode tambm ser detectado por observao microscpica directa das leses.

    Os anticorpos desenvolvidos em resposta a um contacto do organismo com o T.

    pallidum classificam-se como no Treponmicos e Treponmicos. Os anticorpos no

    treponemais aparecem entre 1 e 4 semanas aps a infeco e permanecem elevados at

    que se inicie a teraputica antimicrobiana ou quando o paciente entra na fase tardia da

    infeco. Uma vez iniciada a terapia antimicrobiana eficaz, os ttulos dos anticorpos no

    treponemais comeam a declinar, frequentemente atingindo nveis no detectveis antes

    do final do tratamento.

    6.1. Fundamento do mtodo

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    Joana Selada Domingues - 48 -

    O VDRL e o RPR (Rapid Plasma Reagin Test) so os dois testes no

    treponmicos mais comuns. Os anticorpos no treponmicos reagem com material

    lipoproteico das clulas lesadas e com a cardiolipina do Treponema, no sendo

    especficos para este (podem ser produzidos noutras situaes tais como doenas