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Adenoviren und DNA-Tumorviren
Rainer G. Ulrich
Friedrich-Loeffler-Institut
Institut für neue und neuartige Tierseuchenerreger
D-17493 Greifswald - Insel Riems
Vorlesung: „Molekulare Virologie“, WS 2018/2019
1. EINLEITUNG
(Nichttaxonomische) Klassifizierung von Viren
nach infiziertem Wirt: Bakterien, Pflanzen, Pilze, Tiere, Mensch
DNA-Viren bei Wirbellosen und Wirbeltieren
Struktur und Klassifizierung von DNA-Viren
Klassifikation von Viren nach der Art der mRNA-
Synthese (Baltimore-Klassifikation)
Gruppe I: dsDNA. Genomform aller
Lebewesen (Papilloma-,
Polyoma-, Adeno-, Herpes-,
Poxviridae)
Gruppe II: ssDNA. Enthält DNA sowohl
positiver als auch negativer
Polarität (Parvoviridae)
Gruppe III: dsRNA (Reoviridae)
Gruppe IV: (+)ssRNA. Sie wirkt direkt als
mRNA (Picorna-, Toga-, Flavi-,
Calici-, Coronaviridae)
Gruppe V: (-)ssRNA. Sie wirkt als Matrize
zur mRNA-Synthese (Bunya-,
Arena-, Rhabdo-, Paramyxo-,
Orthomyxo-, Filoviridae)
Gruppe VI: (+)ssRNA, die in DNA
zurückgeschrieben und ins
Zellgenom eingebaut wird
(Retroviridae)
Kleine DNA-Viren und Adenoviren: Übersichtstabelle
Virusfamilie Parvoviridae Polyomaviridae Papillomaviridae Adenoviridae
Virusgröße 18-26 nm 40-45 nm 55 nm 80-110 nm
Genom ssDNA, linear dsDNA, zirkulär dsDNA, zirkulär dsDNA, linear
Genomlänge 4,8-5,6 kB ca. 5,2 kBp ca. 8 kBp 36-38 kBp
Kodierungs-strategie
eine Leserichtung, überlappende ORF
ambisense, überlappende ORF
eine Leserichtung, überlappende ORF
ambisense, überlappende ORF
Hülle keine keine keine keine
Kapsid ikosaedrisch, VP1, VP2, (VP3)
ikosaedrisch, VP1, VP2, VP3
ikosaedrisch, L1, L2
ikosaedrisch, Pentonbasisprotein (pIII), Fiberprotein (pIV), Hexonprotein (pII), u.a.
Replikation „rolling hairpin“-Modell
bidirektional, semikonservativ
bidirektional, semikonservativ
semikonservativ
Replikationsort Zellkern Zellkern Zellkern Zellkern
Replikations-enzym
zelluläre DNA-Polymerase
zelluläre DNA-Polymerase
zelluläre DNA-Polymerase
virale DNA- Polymerase
Übertragung Tröpfchen, fäkal-oral, vertikal, Blutprodukte
Schmierinfektion Hautkontakt, sexuell, perinatal
Aerosol, fäkal-oral, kontaminierte Gegenstände und Flüssigkeiten
Wirtsspezifität hoch (hoch) hoch niedrig
Humanpatho-gene Vertreter
Parvovirus B19, Humanes Bocavirus, (Parv4)
JCPyV, BKPyV, WU-PyV, KI-PyV, MCPyV und 9 weitere (3.1. 2018)
HPV 1-225 (4.12. 2018)
Arten (Subgenera) A-G, Genotypen (HAdV) 1-90 (7.1. 2019)
Erkrankungen Ringelröteln, Erkrankungen des Respirationstraktes und des Gastro- intestinaltraktes
PML bei HIV-Infektion, Organ-abstoßung nach Nierentransplan-tation
Papillome, Karzinome
Erkältungen und andere Erkrankungen des Respirationstraktes, gastrointestinale Erkran-kungen, Keratokonjunktivitis
2. FAMILIE ADENOVIRIDAE
Genus Mensch Tier
Mastadenovirus Spezies A-G, Adenoviren von Rind,
Serotypen Schwein, Hund, Affe, Pferd,
HAdV-1 bis -53 Nagetieren, Fledermäusen,
Delphin, Seelöwe
Aviadenovirus Vogel-Adenoviren (Ente)
Atadenovirus Adenoviren von Schlange,
Eidechse, Ente, Papageien,
Opossum, Schaf, Rind
Siadenovirus Adenoviren von Frosch,
Pute, Fasan, Pinguin,
Kohlmeise
Ichtadenovirus Störadenovirus
Familie Adenoviridae
Phylogenetische Verwandtschaft von Adenoviren
Neuer Adenovirusserotyp – HAdV-52
Aufbau und Größe:
Membran:
Capsid:
Genom:
Wirtsspezifität:
Ikosaedrisch
ca. 80-110 nm
Nicht vorhanden
252 Capsomere:
240 Hexone
12 Pentone + Fiber
Lineare dsDNA, 35-38 kbp
Hohe genetische Stabilität
niedrig
Adenoviren: Eigenschaften
Adenoviren: Struktur des Kapsids
Adenoviren: Struktur des Kapsids
Adenoviren: Strukturproteine
Genomorganisation
Genomorganisation: Ambisense-Kodierung
Genomorganisation bei den AdV-Genera
Splicing früher mRNAs
Replikationszyklus der Adenoviren: Übersicht
Replikationszyklus der Adenoviren
DNA-Replikation der Adenoviren
Hauptprodukte der E1-Region (IE-Region)
Eigenschaften und Funktionen von Adenovirusproteinen
Vorläuferprotein des terminalen Proteins; TP ist kovalent gebunden;
wirkt als Primer bei der Initiation der DNA-Synthese
Virale DNA-Polymerase
80 kD
140 kD
E2B
Bindet an einzelsträngige DNA; aktiv bei DNA-Replikation phosphoryliert 72 kD E2A
Sehr frühes Protein; Bindung an p53, Transformation zusammen mit
E1A; Regulation des RNA-Transports zusammen mit E4/34 kD
phosphoryliert 1.55 kD E1B
Sehr frühes Protein; Transaktivator, Zinkfingermotiv, Bindung an
Histon-Acetyltransferasen; Bindung an Tumorsuppressorprotein
Rb105; Transformation zusammen mit E1B
phosphoryliert 1.40 kD E1A
Funktion Modifikation Molekular
gewicht
Proteine
Wirkt zusammen mit E4-ORF6 und E1B/55 kD bei der Regulation des
mRNA-Transports
11 kD E4-ORF3
Cytoplasmatisches Protein; Funktion unbekannt 17 kD
136 AS
E4-ORF2
Induktion von Mammatumoren bei HAdV-9 infizierten Ratten 125 AS E4-ORF1
Interaktion mit E1B/55 kD und Abbau von p53, Regulation des mRNA-
Transports vom Kern ins Cytoplasma; verstärkt die E1A- und E1B-
vermittelte Transformation
34 kD E4-ORF6
Bindet an Proteinphosphatase 2A, beeinflusst Phosphorylierung zellulärer
und viraler Proteine, wirkt so regulierend auf die Transkription zellulärer
und viraler Proteine
14 kD E4-ORF4
E3-Region: Funktion der Proteinprodukte
Eigenschaften und Funktionen von Adenovirusproteinen
Vorläuferprotein des terminalen Proteins; TP ist kovalent gebunden; wirkt
als Primer bei der Initiation der DNA-Synthese
Virale DNA-Polymerase
80 kD
140 kD
E2B
Bindet an einzelsträngige DNA; aktiv bei DNA-Replikation phosphoryliert 72 kD E2A
Sehr frühes Protein; Bindung an p53, Transformation zusammen mit E1A;
Regulation des RNA-Transports zusammen mit E4/34 kD
phosphoryliert 1.55 kD E1B
Sehr frühes Protein; Transaktivator, Zinkfingermotiv, Bindung an Histon-
Acetyltransferasen; Bindung an Tumorsuppressorprotein Rb105;
Transformation zusammen mit E1B
phosphoryliert 1.40 kD E1A
Funktion Modifikation Molekular
gewicht
Proteine
Wirkt zusammen mit E4-ORF6 und E1B/55 kD bei der Regulation des
mRNA-Transports
11 kD E4-ORF3
Cytoplasmatisches Protein; Funktion unbekannt 17 kD
136 AS
E4-ORF2
Induktion von Mammatumoren bei HAdV-9 infizierten Ratten 125 AS E4-ORF1
Interaktion mit E1B/55kD und Abbau von p53, Regulation des mRNA-
Transports vom Kern ins Cytoplasma; verstärkt die E1A- und E1B-
vermittelte Transformation
34 kD E4-ORF6
Bindet an Proteinphosphatase 2A, beeinflusst Phosphorylierung
zellulärer und viraler Proteine, wirkt so regulierend auf die
Transkription zellulärer und viraler Proteine
14 kD E4-ORF4
Proteine Molekular
gewicht
Modifikation Funktion
L-Bereich
L3-pII 120 kD Hexonprotein, im Capsomer als Trimer; induziert Bildung gruppen-
spezifischer Antikörper
L2-pIII 80 kD Pentonbasisprotein, Homopentamer
L3-pIIIa 66 kD phosphoryliert Pentonassoziiertes Protein
L5-pIV 62 kD glycosyliert Fiberprotein; liegt in der Fiber als Trimer vor; induziert Bildung
virusspezifischer Antikörper
L2-pV 48.5 kD phosphoryliert Nukleocapsidkomponente; interagiert mit dem Genom und der
Innenseite des Capsids
L3-pVI 23.4 kD phosphoryliert Hexonassoziiertes Protein; an der Innenseite des Capsids lokalisiert
L3 Protease
(Adenain)
23 kD Cysteinprotease; Freisetzung der Viruspartikel aus dem Endosom
pIX 11.5 kD Hexonassoziiert; an den Kontaktstellen der Hexoncapsomere
pXI/pXII 4.5/3 kD Hexonassoziiert; an den Kontaktstellen der Hexoncapsomere
Nichtstruktur
proteine
L4-100 kD Spätes Nichtstrukturprotein; Chaperon, aktiv bei Hexonassembly
pIVa2 50 kD Spätes Nichtstrukturprotein; Chaperon, aktiv bei Morphogenese
33 kD Spätes Nichtstrukturprotein; Chaperon, aktiv bei Morphogenese
Eigenschaften und Funktionen von Adenovirusproteinen
Adenovirus-assoziierte RNA
VA-RNA: ● zwei Gene für kleine, nicht Protein kodierende RNAs (VA-
RNA I und VA-RNA II)
● durch RNA-Polymerase III transkribiert
●160 nt lange RNAs mit ausgeprägter Sekundärstruktur
● VA-RNA I hemmt die zelluläre Proteinkinase R
(PKR, dsRNA-aktivierte Proteinkinase) und reguliert darüber
die Translation viraler Polypeptide
● VA-RNA I und VA-RNA II hemmen in der späten
Phase des Infektionszyklus die Regulation durch RNA-
Interferenz (mivaRNAs)
Adenovirus-assoziierte RNA
Humane AdV: Epidemiologie und Übertragung
Epidemiologie: ● weltweit verbreitet
● epidemisches, endemisches und
sporadisches Auftreten
Übertragung: ● Aerosole
● Kontaminierte Gegenstände und
Flüssigkeiten
● Fäkal-oral
Humane Adenoviren
Pathogenese: - infizieren bevorzugt Epithelzellen des Pharynx,
Dünndarms sowie Konjunktivalzellen
- Persistenz einiger Serotypen in Tonsillen und
benachbarten Lymphknoten
Klinik: - Erkältungen und andere Erkrankungen des
Respirationstraktes, Keratokonjunktivitis,
gastrointestinale Erkrankungen
- 50% der Infektionen verlaufen asymptomatisch
- Bedeutung bei immunsupprimierten Patienten
Humane Adenoviren: Diagnostik
1. Virusnachweis in Zellkultur
2. Nachweis von IgM-Antikörpern gegen die
viralen Strukturproteine
3. Nachweis Spezies-spezifischer Antikörper
mittels Immunoblot
4. Nachweis Serotyp-spezifischer Antikörper
mittels NT und HHT
5. Nachweis viraler Nukleinsäure mittels PCR
Humane Adenoviren: Prophylaxe und Therapie
Impfstoffe: Impfung gegen HAdV-4 und -7 beim
Personal des US-Militärs (Lebendvakzine,
nur für US-Streitkräfte zugelassen)
Therapie: Cidofovir
Interferon-β (bei schwerer Keratokonjunktivitis)
Ribavirin (für alle Vertreter der Spezies C, die
meisten Vertreter der Spezies A, B und D)
Gentherapievektoren: Vor- und Nachteile
Charakteristika Retrovirus Adenovirus Adeno-assoziiertes
Virus
Wildtypvirus Einzelsträngige
RNA, 9.2 kb
Doppelsträngige
DNA, 36 kb
Einzelsträngige DNA,
5 kb
Insertionsgröße 8 kb 7.5 kb 4.5 kb
Titer (colony forming
units/ml)
106-10
7 10
8-10
10 10
6-10
8
Zielzellen Nur
teilungsfähige
Zellen
Teilungsfähige und
nicht teilungsfähige
Zellen
Teilungsfähige und
nicht teilungsfähige
Zellen
Genexpressionsdauer Langfristig Transient Transient bis
langfristig
Genexpressionsausmaß Mäßig Hoch Mäßig
Mögliche Hürden Mutationen nach
Insertion
Immunantwort des
Wirtes
Toxizität viraler
Proteine, Mutationen
nach Insertion
Mögliche
Wirtsimmunität
Nein Ja Ja
Replikationskompetent Nein Eventuell Ja
Virale Proteinexpression Nein Ja Nein
Entnommen aus N. Grewe (2005). Dissertation, Charité, Berlin
Adenoviren als Vektoren
- Deletion der E1-Region (Einbau heterologer Gene von
bis zu 4,7 kbp)
- Verpackungszelllinie (E1-Transkomplementation)
Problem: Bildung replikationsfähiger Adenoviren
Adenoviren als Vektoren: 1. Generation
Adenoviren als Vektoren: 2. Generation
- Umbau des E1-Deletionsvektors (E4-Region upstream von E1)
- bei Rekombination Verlust von E4
- nur inverted terminal repeats (ITR) und Signale für die
Verpackung der Virus-DNA im Vektor
ABER: - viele virale Genprodukte bei Überexpression
für Zellen toxisch
- Problem bei der Etablierung von Verpackungs-
zelllinien, die stabil rekombinante Viren
produzieren
Adenoviren als Vektoren: 3. Generation
Herstellung von Adenovirusvektoren
Kleine DNA-Viren und Adenoviren: Übersichtstabelle
Virusfamilie Parvoviridae Polyomaviridae Papillomaviridae Adenoviridae
Virusgröße 18-26 nm 40-45 nm 55 nm 80-110 nm
Genom ssDNA, linear dsDNA, zirkulär dsDNA, zirkulär dsDNA, linear
Genomlänge 4,8-5,6 kB ca. 5,2 kBp ca. 8 kBp 36-38 kBp
Kodierungs-strategie
eine Leserichtung, überlappende ORF
ambisense, überlappende ORF
eine Leserichtung, überlappende ORF
ambisense, überlappende ORF
Hülle keine keine keine keine
Kapsid ikosaedrisch, VP1, VP2, (VP3)
ikosaedrisch, VP1, VP2, VP3
ikosaedrisch, L1, L2
ikosaedrisch, Pentonbasisprotein (pIII), Fiberprotein (pIV), Hexonprotein (pII), u.a.
Replikation „rolling hairpin“-Modell
bidirektional, semikonservativ
bidirektional, semikonservativ
semikonservativ
Replikationsort Zellkern Zellkern Zellkern Zellkern
Replikations-enzym
zelluläre DNA-Polymerase
zelluläre DNA-Polymerase
zelluläre DNA-Polymerase
virale DNA- Polymerase
Übertragung Tröpfchen, fäkal-oral, vertikal, Blutprodukte
Schmierinfektion Hautkontakt, sexuell, perinatal
Aerosol, fäkal-oral, kontaminierte Gegenstände und Flüssigkeiten
Wirtsspezifität hoch (hoch) hoch niedrig
Humanpatho-gene Vertreter
Parvovirus B19, Humanes Bocavirus, (Parv4)
JCPyV, BKPyV, WU-PyV, KI-PyV, MCPyV und 9 weitere (3.1. 2018)
HPV 1-225 (4.12. 2018)
Arten (Subgenera) A-G Genotypen (HAdV) 1-90 (7.1. 2019)
Erkrankungen Ringelröteln, Erkrankungen des Respirationstraktes und des Gastro- intestinaltraktes
PML bei HIV-Infektion, Organ-abstoßung nach Nierentransplan-tation
Papillome, Karzinome
Erkältungen und andere Erkrankungen des Respirationstraktes, gastrointestinale Erkran-kungen, Keratokonjunktivitis
3. DNA-TUMORVIREN
Onkogene Viren
Viren, die – neben ihren charakteristischen
Viruseigenschaften -
die Fähigkeit besitzen, normale Zellen in Tumorzellen
umzuwandeln.
Immortalisierung und maligne Transformation
Eigenschaften transformierter Zellen
I. RNA-Viren Retroviridae
- akut transformierende (transduzierende) Retroviren/Oncornaviren
- Genus Deltaretrovirus: Langsam transformierende Viren (HTLV-1, HTLV-2)
Flaviviridae (Hepatitis C-Virus)
II. DNA-Viren Hepadnaviridae (Hepatitis B-Virus)
Polyomaviridae (Merkelzell-Polyomavirus)
Papillomaviridae (z.B. HPV-16 und HPV-18)
Adenoviridae
Herpesviridae (EBV=HHV-4, KSHV=HHV-8)
Tumorviren: eine Übersicht
Humane RNA- und DNA-Tumorviren
Onkogenität von Adenoviren in Nagetieren
Spezies Serotyp Onkogenität (Tier) Zelltransformation
A 12, 18, 31 hoch (Sarkome) +
D 9, 10 hoch (Adenome) +
B 3, 7, 11 gering (Sarkome) +
C - F alle anderen keine +
Tumorentstehung: multifaktorieller und mehrstufiger Prozess
Chemikalien,
Strahlung,
virale Faktoren
Targetproteine für DNA-Virus-Onkogene
DNA-Tumorvirus-Protein-Interaktion
Zellzyklus
Tumorsuppressor-Proteine
Zellzyklus-kontrollierende Proteine.
Proteine, die in die negative Regulation des Zellzyklus
involviert sind (Halten in der G1-Phase).
50% der Tumoren, einschließlich der durch Viren induzierten,
werden durch veränderte Tumorsuppressorgene verursacht.
Bei einer Veränderung des Proteins (mit Funktionsverlust)
kommt es zu einer nicht gegenregulierten Wachstumsstimulation.
Tumorsuppressor-Proteine
Tumorsuppressor-Protein p53
- Aktivität in der späten G1-Phase des Zellzyklus
(G1-Arretierung): kein Übergang zur S-Phase
- Unterstützung der Einleitung der Apoptose
- Core-Domäne des p53 ist extrem sensitiv für Aminosäure-
austausche (Funktionsverlust)
- Funktionsverlust durch Aminosäureaustausche oder Wechsel-
wirkung mit viralen Proteinen
DNA-Virus-Onkogene und p53
DNA-Virus-Onkogene und Rb-Proteine
Funktionen der zellulären Tumorsuppressorproteine
Rb105/Rb107
in nicht infizierten Zellen
Zellzyklus
Funktionen der zellulären Tumorsuppressorproteine
Rb105/Rb107
in HPV/AdV/PyV-transformierten Zellen
Zellzyklus
Eigenschaften der onkogenen
DNA-Viren
- die für die Transformation verantwortlichen Gene haben kein
zelluläres Homolog
- Viren besitzen eine geringe Transformationsrate (10-5)
- die für die Transformation verantwortlichen viralen Proteine
besitzen meist eine Kernlokalisation
- entweder produktive Replikation (Lyse der Zelle) oder nicht-
produktive Infektion mit Transformation der Zelle
- virale DNA ist entweder ins zelluläre Genom eingebaut oder
liegt episomal vor
DNA-Virus-Tumorigenese: Virusprotein-
Wechselwirkung mit Tumorsuppressor-Proteinen
Funktionelle Domänen des großen
T- Antigens von Polyomaviren
E7-Protein von HPV-16
Tumorbildung durch Papillomviren (HPV-16/HPV-18)
• Virale DNA:
– entweder episomal (selten) oder
– integriert, dadurch E2 defekt (E6 und E7 immer intakt)
• Virale Proteine:
– E2: Repressor bindet an Promotoren von E6 und E7 und
zelluläre Enhancer, außerdem an mindestens 7 zelluläre Proteine
– E6: bindet an p53, Degradation von p53, keine Apoptose,
Übergang in S-Phase ohne ausreichende Reparatur
– E7: bindet an Rb, Aufhebung der Repression des E2F,
deregulierte Zellteilung
1. Integration des HBV-Genoms
- Bildung von HBsAg und HBx-Protein möglich
- Störung zellulärer Funktionen infolge Insertionsmutagenese
2. HBx-Protein
- wirkt transaktivierend auf zelluläre Promotoren
- induziert Expression des HBsAg, dadurch Abfangen von
Antikörpern möglich; erhöhte Chronizität der Infektion
- Interaktion mit p53, Deregulation der Zellzykluskontrolle
(verfrühter Eintritt in die S-Phase)
- Zellteilungsstimulation über Proteinkinase C
3. Kofaktoren
- Aflatoxine bewirken Mutationen im Wirtsgenom
Hepatitis B-Virus und HCC
Burkitt-Lymphom und Epstein Barr-Virus
- Krebserkrankung ausgehend von B-Lymphozyten
- größte Bedeutung hat das endemische Burkitt-Lymphom in
malariaverseuchten Gebieten Afrikas (Inzidenz: 10 pro 100 000)
- befällt bevorzugt Kinder im Alter von drei bis acht Jahren
- extrem schnell wachsender Tumor (Bauchhöhle und Gesicht)
- in frühen Stadien erfolgreiche Chemotherapie-Behandlung möglich
Epstein Barr-Virus kausal an der Entstehung dieses Tumors beteiligt.
Epstein Barr-Virus: Transformierende Proteine
in vitro Infektion von B-Lymphozyten und Transformation zu Blasten.
Expression von 6 “nuclear antigens” (EBNA1, EBNA2, EBNA3A,
EBNA3B, EBNA3C, EBNALP),
drei Membranproteinen (LMP1, LMP2A, LMP2B) und
EBV-kodierten RNAs (EBER1 und EBER2).
EBNA1 und LMP1 sind von Bedeutung für die Immortalisierung
von primären B-Lymphozyten
EBNA2 - essentiell für die Etablierung der Latenz und die
Immortalisierung
- verstärkt Synthese von Cytokinen und Wachstumsfaktoren
Epstein Barr-Virus: Latenzzustände und Tumoren
Nach der Infektion wird das Genom episomal latent etabliert.
3 Typen von Latenz:
Typ 1-Latenz: nur das EBNA1-Protein exprimiert
(Burkitt-Lymphom)
Typ 2-Latenz: EBNA1-Protein, LMP1, LMP2A, LMP2B
exprimiert (Nasopharyngealkarzinom)
Typ 3-Latenz: EBNA1, EBNA2, EBNA3A, EBNA3B, EBNA3C,
LMP1, LMP2A, LMP2B exprimiert
(Lymphome assoziiert mit Immunsuppression)
Humanes Herpesvirus 8 (HHV-8) Genus Rhadinovirus der Unterfamile g-Herpesvirinae
Humanes Herpesvirus 8 = Kaposi-Sarkom assoziiertes
Herpesvirus (KSHV)
Kaposi-Sarkom (KS): maligne, von den Gefäßendothelien
ausgehende Systemerkrankung.
Klinische Formen:
1. klassisches Kaposi-Sarkom (meist bei älteren Männern)
2. Kaposi-Sarkom bei Immunsuppression
3. afrikanisches endemisches Kaposi-Sarkom
4. epidemisches HIV-assoziiertes Kaposi-Sarkom
“latency-associated nuclear antigen” (LANA)
interagiert mit p53 und Rb.
Überleben der Zellen durch Interaktion von LANA mit p53
vermittelt
- durch Verhinderung der Apoptose und
- durch Aufhebung der Repression der Zellproliferation.
HHV-8: Latenz und Transformation
Viren als Erreger menschlicher Tumorerkrankungen
Polyomaviren
Papillomviren
Virus Tumor Kofaktoren
MCPyV
Merkelzell-Karzinom
DANKSAGUNG
Dr. G. Flunker, Greifswald
S. Drewes, Riems
Vielen Dank für Ihre
Aufmerksamkeit!