ADN recombinante

Dr. Luis A. Mora B.Cátedra de BioquímicaUCIMED

IMPORTANCIA BIOMÉDICA

Diagnóstico

Medicina forense

Terapia génica

Producción de medicamentos

insulina

factores de la coagulación

activador del plasminógeno

hormona de crecimiento

Producción de vacunas

Antihepatitis B

IMPORTANCIA BIOMÉDICA

Diagnóstico de enfermedades genéticas con cambios en la secuencia de

ADN.

Identificación de las bases moleculares de la enfermedad

Hipercolesterolemia Familiar

• Drepanocitosis

• Talasemias

• Fibrosis Quística

• Distrofia Muscular

ESTRUCTURA MOLECULAR DEL ADN

Forma

Componentes

Apareamiento de las bases

Pares de bases en genoma haploide humano. 3x109

Longitud de genes. 3x103

Empacamiento del ADN

EXPRESIÓN GENÉTICA DEL ADN

Replicación

Transcripción (Exones e intrones)

Traducción

Síntesis de proteínas

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

Aislamiento del ADN

Desnaturalización

Manipulación

Endonucleasas

Polimerasas

Formación de moléculas quiméricas

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

También conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces fosfodiéster del material genético a partir de una secuencia de nucleótidos que reconocen (diana de restricción ) ; estos tienen entre 4 y 12 pb.Arber, Nathans y Smith, 1978, Nobel de Medicina. E. coli. Insulina humana.Las mismas permiten cortar ADN de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas (se leen igual en ambas direcciones). Esto produce dos extremos: romos y cohesivos o escalonados. Estos pueden unirse por ligasas.ADN vector: capaz de replicarse independientemente del de la célula anfitriona: plásmidos. De organismos procarióticos (bacterias), donde actúan como un mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su ADN, lo cual sirve para distinguir entre el ADN extraño y el ADN propio. No pueden cortar ADN metilado.Isoesquizómeros: distintas, de diferentes especies, idéntica diana , dejan el mismo extremo cohesivo pero no cortan en el mismo sitio.

 

Tipo 1: Restricción (cortan) y modificación (metilan).Al reconocer cortan al azar en sitios distintos , ya sea corriente arriba o abajo, dejan extremos cohesivos. Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte (unas 1000 pb), S adenosil metionina (SAM) y Mg +2 como cofactores.

 Tipo 2: Sólo restricción. Otras enzimas metilan. Cortan de manera consistente y predecible en el sitio que reconocen o muy cerca de él. Por ello son muy utilizadas en clonación, pues se pueden recuperar secuencias conocidas. Sólo requieren Mg++ como cofactor.  No necesitan ATP.

Tipo 3 : Restricción y modificación. Se utiliza una enzima oligomérica que realiza todas las actividades. Cortan de 25 a 27 pb lejos del sitio restrictivo, dejando extremos cohesivos. Requieren dos secuencias de reconocimiento de orientación opuesta en la misma cadena de ADN. Necesitan ATP, Mg y SAM.

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Nomenclatura

 Se asigna según el origen bacteriano. Consiste en:

1)Tres letras que corresponden al nombre científico del microorganismo: Escherichia coli (Eco)

2) La cepa o estirpe si la hubiere. ( EcoR, aislada de la cepa RY13 de E. coli )

3) En números romanos para distinguir si hay más de una endonucleasa aislada de una misma especie. No confundir con el tipo o clase de enzima.

4) Todas deberían llevar delante una R de restricción o M de metilasa según la función pero usualmente se omite.

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Las enzimas de restricción al cortar el DNA pueden producir 2 tipos de cortes:  1. Cohesivos o pegajosos:   GAATTC GGATCC AAGCTT CTTAAG CCTAGG AACGAA EcoRI BamHI HindIII

2.  Abruptos:   AATATT CCCGGG TTATAA GGGCCC  SspI SmaI

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Definición

VectoresPlásmidosPlásmidos

bacterianosADN circular de doble bandaInserción de 6-10 Kb

FagosFagosviralesADN lineal de doble bandainserción de 10-20 Kb

CósmidosCósmidosSon plásmidos con características de fagosADN circular de doble bandainserción de 35-60 Kb

YACSon cromosomas artificiales de levaduras

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

Propiedades de los vectores

Replicaciones independientes del ADN de la célula hospedera

Secuencias de ADN conocidas

Copias únicas

Cromosoma más pequeño que el del hospedero

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

Definición:

1. m. Biol. Conjunto de células u organismos genéticamente idénticos,

originado por reproducción asexual a partir de una única célula u

organismo o por división artificial de estados embrionarios iniciales.

2. m. Biol. Conjunto de fragmentos idénticos de ácido desoxirribonucleico

obtenidos a partir de una misma secuencia original.

CLONACIÓN

CLONACIÓN

Gracias