POLSKIE TOWARZYSTWO BIOCHEMICZNE

Advances in BiochemistryTOM 48, NR 3, 2002

Chromosom Filadelfia . ............. 156Zagadka histonu H I ....................... 167Prion [ PSI] 175Wyciszanie ekspresji genów u roślin . 182Procesy komórkowe aaRS................. 189Niedobór cholesterolu — SREBP . . . 200Rola lipidów w MDR........................... 208Receptory nukleotydowe.................... 220Adenozyna — neuromodulatorem . . 230Recenzja.......................................... 239

http://rcin.org.pl

http://rcin.org.pl

WYDAWCAEditorPOLSKIE TOWARZYSTWO BIOCHEMICZNE Polish Biochemical Society ul. Pasteura 3,02-093 Warszawa, Polandtel/fax 658-20-99e-mail — ptbioch@nencki.gov.plwww.ptbioch.edu.pl

REDAKTOR SENIORSenior Editor ZOFIA ZIELIŃSKA tel. 831-24-03

REDAKTOR NACZELNYEditor in chiefGRAŻYNA PALAMARCZYK tel. 658-47-02

REDAKTORZYEditorsKRYSTYNA GRZELAK DANUTA HULANICKA ANDRZEJ JERZMANOW SKI ANDRZEJ KASPRZAK LILIANA KONARSKA ANNA SZAKIEL ADAM SZEW CZYK

BIURO REDAKCJIEditorial oiYiceSEKRETARZSecretaryHANNA LASKOWSKA poniedziałki, czwartki monday— thursday 14— 16tel. 659-85-71 w. 441 SKŁAD I ŁAMANIE TypesettingMAŁGORZATA BASAJ

RECENZENCI ZESZYTUReferees of this issue EWA BROJER (Warszawa) TADEUSZ CHOJNACKI (Warszawa) ANNA DYG AS (Warszawa) MICHAŁ KOMOSZYŃSKI (Toruń) BARBARA NAWROT (Łódź) ANDRZEJ PASZEWSKI (Warszawa) SŁAWOMIR PI KULA (Warszawa) PAWEŁ SABALA (Warszawa) KRZYSZTOF STAROŃ (Warszawa)

ADRES REDAKCJIAddressREDAKCJA KWARTALNIKA „POSTĘPY BIOCHEMII” ul. Pasteura 3, 02-093 Warszawa e-mail: postepy@nencki.gov.pl

Kwartalnik „Postępy Biochemii" wydawany z pomocą finansową Komitetu Badań Naukowych Indeksowany w Medline i Agrolibrex

S P I S T R E Ś C I

C O N T E N T S

Chromosom FiladelfiaPhiladelphia chromosomeIRENEUSZ MAJSTEREK, JANUSZ BŁASIAK.......................................................... 156

Zagadka histonu H IThe histone H I mysteryANDRZEJ T. W IERZBICKI.......................................................................................... 167

Prion [PSI] i jego wpływ na terminację translacji u drożdży Saccharomyces cerevisiaePrion [PSI] and its effect on termination o f translation in the yeast Saccharomyces cerevisiaeMAŁGORZATA JAKUBIEC, M AGDALENA B O G U T A ..................................... 175

Wyciszanie ekspresji genów i nowe narzędzia biologii mole­kularnej roślinG ene silencing and new tools in p lant m olecular b io logyMAREK KOTER, JACEK H E N N IG .......................................................................... 182

Udział syntetaz aminoacylo-tRNA w procesach komórkowychParticipation o f am inoacyl-tRNA synthetases in ce llu lar proces­sesM O N IK A KAM IŃSKA, A D R IA N N A ZAKRZEWSKA, M ARIA MADAJKA,JAN BARCISZEWSKI................................................................................................... 189

Niedobór cholesterolu sygnałem dla transdukcji informacji z endoplazmatycznego retikulum do jądra komórkowego — procesy proteolitycznego odszczepienia czynników transkryp- cyjnych z błon ERDepletion o f cholesterol in signal transduction from endoplasm ic to the cell nucleus — the proteolytic c leavage o f transcription factors from the ER membranesBOŻENA WIECZOREK, JADW IGA G N IO T-S Z U LŻY C K A ............................. 200

Rola lipidów błony komórkowej w zjawisku oporności wielole- kowej MDR i jego modulacjiThe role o f cell membrane lipids in multidrug resistance and its m odulationKRYSTYNA MICHALAK, ANDRZEJ B. H E N D R IC H ......................................... 208

Receptory nukleotydoweN ucleo tide receptorsEDYTA GENDASZEW SKA-DARMACH.................................................................. 220

Adenozyna — neuroprzekaźnik i neuromodulator w central­nym układzie nerwowymAdenosine — neurotransmitter and neurom odulator in central ne­rvous systemMAŁGORZATA R O M AN O W S KA, M ICHAŁ K O M O S Z Y Ń S K I..................... 230

RecenzjaReviewKRZYSZTOF Z A B Ł O C K I.......................................................................................... 239

155http://rcin.org.pl

Chromosom Filadelfia

Philadelphia chromosome

IRENEUSZ MAJSTEREK1, JANUSZ BŁASIAK2

Spis treści:

I. W prowadzenieII. Klonalny charakter białaczekIII. Chromosom Filadelfia

III-l.O b szar pęknięć chrom osom u 22 (BCR)III-2. Protoonkogen c-ABL

IV. Gen fuzyjny BCR/ABLV. Rola BCR/ABL w procesach kom órkowych

V-1. Stym ulowana przez BCR/ABL naprawa DNAV-2. Oddziaływ anie BCR/ABL z genem supresorowym

P53VI. Rola BCR/ABL w regulacji apoptozy V H .U wagi końcowe

Contents:

I. IntroductionII. Clonal nature o f leukem iasIII. Philadelphia chrom osom e

III-l. Breakpoint cluster region o f chrom osom e 22 (BCR)

III-2. Proto-oncogene c-ABLIV. BCR/ABL fusion geneV. Role of BCR/ABL in cellular processes

V-1. BCR/ABL-sûmw\2itt<\ DNA repairV-2. Interaction o f BCR/ABL with P53 tumour

suppressor geneVI. Role o f BCR/ABL in regulation of apoptosis VILConcluding remarks

W ykaz stosowanych skrótów: 14-3-3 — białko z rodziny BAP-1; ABL — kinaza tyrozynowa; ALL — ostra białaczka limfoblastyczna; AML — ostra białaczka szpikowa; ATM — mutacja genu AT (ang. ataxia-teleangiectasia)\ BAD, BAK, BAX — inhibitory apoptozy; Bap-1 — białko towarzyszące BCR; BCL-2, BCLXL, BCL-W — promotory apoptozy; BCR — region złamań chromosomu 22; CML — przewlekła białaczka szpikowa; CLL — przewlekła białaczka limfocytama; CRKL, CRK, CBL, GRB-2, SHC — białka adaptorowe; DNA-PK — zależna od DNA kinaza białkowa; Doc-1 — białko przewodzące sygnał z receptora czynnika wzrostu KIT; GAP — białko akty­wujące GTPazę; GEF — czynnik regulujący wymianę GDP/GTP; ICSBP — bjałka wiążące interferon; IFN -a — inter- feron-a; JAK — kinazy cytoplazmatyczne z rodziny Janus; Kit — międzybłonowy receptor kinaz tyfozynowych; MAP — białka stowarzyszone z mikrotubulami; M-bcr — główny region złamań chromosomu 22; m -bcr— mniejszy region złamań chro­mosomu 22; MDR — oporność wielolekowa; NLS — sekwen­cje lokalizacji jądrowej; OTK — onkogenna kinaza tyrozyno­wa; Ph — chromosom Filadelfia; PI3K — kinaza fosfatydylo- inozytolowa; RAC, RHO — białka o aktywności GTPazy;

'Dr, 2prof. dr hab., Katedra Genetyki Molekularnej Uniwersyte­tu Łódzkiego, ul. Banacha 12/16, 90-237 Łódź, e-mail: januszb@biol.uni.lodz.pl

RAD51 — białko biorące udział w naprawie przez rekombina­cję homologiczną; RAD52/RAD5 l/RPA — kompleks rekombi- nacyjny; RAF-1, AKT, MEK1/MEK2, ERK — kinazy seryno- wo-treoninowe; SH — domena homologiczna z SRC (ang. Src Homology); SRC, MYC, RAS —- protoonkogeny komórkowe; STAT1.5 — czynniki transkrypcyjne; VDAC — napięciowo za­leżne kanały anionowe.

I. Wprowadzenie

Białaczkom towarzyszy na ogół niestabilność ge- nomowa, będąca skutkiem zaburzeń funkcjonowania układów endokrynologicznego i immunologicznego oraz oddziaływania czynników chemicznych i fi­zycznych, a także wirusów. U chorych na białaczki obserwuje się aberracje chromosomalne oraz re- aranżacje protoonkogenów, genów supresorowych i genów białek naprawy DNA [1-6]. Zmiany w proto- onkogenach, będące wynikiem mutacji punktowych, integracji wirusowego DNA, amplifikacji oraz trans- lokacji, m ogą prowadzić do ich aktywacji. Mutacje punktowe w protoonkogemie N -RA S wykrywane są u chorych w stanach ostrych białaczek, a także u cho­rych ze stanami przedbiałaczkowymi [7, 8]. W białaczkach i chłoniakach obserwuje się także akty­

156 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

wację protoonkogenów C-M YC i BC L-2 [9-13]. Za udziałem czynników genetycznych w powstawaniu białaczek przemawia także wysoka częstość poja­wiania się ostrej białaczki mieloblastycznej u cho­rych z zespołem Downa (trisomia chromosomu 21) oraz z genetycznie uwarunkowanym i syndromami towarzyszącymi niestabilności genomowej — niedo­krwistości Fanconiego i zespole Blooma [14-16]. W komórkach białaczkowych wykryw a się różne nie­prawidłowości chromosomalne, z których najczę­stszą określa się mianem chromosomu Filadelfia, po­wstającego na skutek translokacji z udziałem chro­mosomów 9 i 22 [17-19].

II. Klonalny charakter białaczek

Białaczki są nowotworami krwi i charakteryzują się akumulacją nieprawidłowych krwinek białych w szpiku. Komórki te przedostają się często do krwi obwodowej i naciekają narządy. Białaczki są choro­bami klonalnymi, wyw odzą się zazwyczaj z jednej komórki, która uległa transformacji nowotworowej. W niektórych białaczkach kom órką przechodzącą transformację jes t w ielopotencjalna komórka m a­cierzysta, która może dać początek wszystkim li­niom komórkowym krwi. W innych przypadkach białaczka jes t związana z transformacją bardziej zróżnicowanej komórki, która może zapoczątkować tylko jedną linię. Zmieniona kom órka daje początek klonowi potomnych kom órek nowotworowych. W białaczkach ostrych klon nowotworowy charakte­ryzuje się wysoką zdolnością do progresji, a w białaczkach przewlekłych — niską [20].

Podstawą klinicznego podziału białaczek jes t sto­pień dojrzałości komórek dominującego typu w szpi­ku i we krwi. Cztery najczęściej występujące odm ia­ny białaczek, to: ostra białaczka limfoblastyczna (ALL), ostra białaczka szpikowa (AML), przewlekła białaczka szpikowa (CML) i przewlekła białaczka limfocytarna (CLL) [21-24].

III. Chromosom Filadelfia

W 1960 roku N o v e l l i H u n g e r f o r d opisali pierwszą specyficzną nieprawidłowość chromoso- m alną nowotworów krwi, nazw aną od miasta doko­nania odkrycia chromosomem Filadelfia (Ph). Został on zidentyfikowany w komórkach szpiku pobranego od pacjentów z CML. W 1973 roku wykazano, że Ph jes t wynikiem translokacji fragmentu chromosomu 22 do chromosomu 9 ( t(9q+ ;22q-)(q34;q l 1)) [25]. Translokacja jest zapoczątkowana pęknięciami w dłuższych ramionach chromosomu 9 (9q34) i 22

(22q 11) i powoduje przeniesienie fragmentu genu BCR z chromosomu 22 do locus protoonkogenu C-ABL w chromosomie 9 [26-28]. W rezultacie zo­staje utworzony gen fuzyjny BCR/ABL, kodujący cy- tozolowe białko charakteryzujące się aktywnością onkogennej kinazy tyrozynowej [29-31].

Chromosom Filadelfia występuje w 95% CML oraz w około 5% ALL u dzieci i 15-25% ALL u do­rosłych; jes t także w ykryw any w AML [32, 33]. W CML translokacja ma miejsce w wielopotencjalnych macierzystych komórkach mieloidalnych i limfo- idalnych, a w ALL — prekursorowych komórkach B lub T, niekiedy także w wielopotencjalnych kom ór­kach pnia [33]. Translokacje BCR-ABL w CML i ALL różnią się punktem pęknięcia w BCR, a po­wstałe geny fuzyjne kodują białka różnych wielkości (190 kDa i 210 kDa) [33, 34]. Z klinicznego punktu widzenia identyfikacja Ph u dzieci z CML jest bardzo ważna, gdyż są one kwalifikowane do leczenia typo­wego dla CM L u dorosłych i rokowanie jes t u nich lepsze niż w postaci bez Ph [29, 30]. W ALL w ystę­powanie Ph związane jes t z niekorzystnym rokow a­niem i kwalifikuje chorych do przeszczepu szpiku. Szczególnie źle rokujące dla pacjentów z ALL jes t występowanie Ph łącznie z monosom ią chromosomu 7 [32, 33, 35].

Ostrej fazie choroby w CML towarzyszą wtórne zmiany chromosomalne: dodatkowy Ph, trisomia chromosomu 19, brak chromosomu Y [36]. W tym stadium w około połowie komórek wykrywa się w ię­cej niż jeden chromosom Filadelfia, powstający prawdopodobnie w wyniku duplikacji lub triplikacji pierwotnego Ph, a nie w wyniku nowych, niezale­żnych translokacji [36-39]. Zmiany chromosomalne pojawiają się dużo wcześniej przed wystąpieniem klinicznych objawów tej fazy. Opisano także złożone translokacje Ph, w których oprócz chromosomów 9 i 22 biorą udział dodatkowe chromosomy, na przykład chromosom 20 [31].

III-l. Obszar pęknięć chromosomu 22 (BCR)

Pęknięcie w chromosomie 22, zapoczątkowujące translokację Ph, ma miejsce w genie BCR [40]. Gen ten liczy 130 kpz, zawiera 25 eksonów i koduje białko o masie 160 kDa, P160BCR [41-43] (Ryc. 1). Ekson pierwszy genu BCR koduje A-końcowy region białka charakteryzujący się aktywnością kinazy se- rynowo-treoninowej [44, 45]. Eksony 3-10 m ają se­kwencje homologiczne z onkogenem DBL, który ko­duje białko z rodziny białek GEF (czynnik wymiany GDP/GTP). Białko GEF pełni razem z białkiem wspomagającym GAP (białko aktywujące GTPazy)

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 157http://rcin.org.pl

P145 c-ABLP210/185

BP P203 BP

SH3 SH2 SH1 (kinaza)

COOH

DNA BD AKTYNA BD

P160 c-BCR

NH

P210/203 P230

COOH

Oligomeryzacja 14-3-3/BAP-1 Rho-GEF Ca**-Lipidy Rac-GAPBD BD

Aktywność kinazy SERYNOWO/TREONINOWEJ

Ryc. 1. Struktura białek c-ABL (P145) i c-BCR (P160). NLS — sekwencje lokalizacji jądrowej, PPPP — sekwencje bogate w prolinę, BD — domeny wiążące, BP — punkty pęknięć w A-końcowym obszarze c-BCR i C-końcowym obszarze c-ABL prowadzące do translokacji, powodującej po­wstawanie chromosomu Filadelfia z genem fuzyjnym BCRJABL, którego ekspresja prowadzi do powstania białek P I 85, P203 i P210 BCR/ABL występujących w białaczkach człowieka (na podstawie [1, 18])

rolę regulatora enzymów charakteryzujących się ak­tywnością GTPazy [46], Białko BCR zbudowane jest w sposób domenowy — zawiera domenę oligomery- zacji, zależne od wapnia miejsce wiązania lipidów, miejsce wiązania czynnika 14-3-3 z rodziny BAP-1 (białka stowarzyszone z BCR), domenę hom olo­giczną z RHO-GEF oraz C-końcow ą domenę RAC-GAP, wykazującą aktywność GTPazy [47-49]. M echanizm działania BCR w hematopoezie nie został jeszcze dokładnie poznany, jednak wyniki badań na myszach z wyłączonym genem BCR suge­rują związek pomiędzy P160BCR i regulacją w ytw a­rzania rodników tlenowych przez układ oksydazy NADPH w komórkach m ieloidalnych i B-limfoidal- nych [50]. Myszy BCR~'~ w ykazują normalne czyn­ności życiowe, podobnie ich system hematopoetycz- ny funkcjonuje bez zaburzeń, jednak w obecności en- dotoksyn rozwija się u nich szok septyczny. W neu- trofilach tych zwierząt następuje nadmierne w ytw a­rzanie rodników tlenowych, które zaburzają kontrolę nad białkiem P 2 1rac2 aktywującym neutrofilowy w y ­buch oddechowy [51].

III-2. Protoonkogen c-ABL

c-ABL występuje u wszystkich zwierząt kręgo­wych oraz bezkręgowców i charakteryzuje się filo­genetyczną konserwatywnością [52]. Ludzki c-ABL zawiera 12 eksonów z sekwencjami hom ologiczny­

158

mi z sekwencją onkogenu v-ABL rozłożonymi nie­ciągłe w obszarze 300 kpz [41, 53, 54]. Dwa pierw­sze eksony c-ABL, a l i b l , są transkrybowane alter­natywnie, co prowadzi do syntezy dwóch cząsteczek mRNA o długości 6 kpz i 7 kpz, ulegających transla­cji na białka liczące 1122 i 1142 am inokwasów [54]. Ludzki c-ABL koduje kinazę tyrozynow ą o masie 145 kDa, (P 145c ABL) (Ryc. 1). P145C'ABL jest jedną z niereceptorowych kinaz tyrozynowych spokrewnio­nych z białkiem SRC, pierw szą scharakteryzowaną onkogenną kinazą tyrozynową (OTK) [17, 55]. Białko c-ABL zawiera domeny homologiczne z SRC: SH1, SH2 i SH3. Domena SH1 wykazuje ak ­tywność kinazową, SH2 wiąże ufosforylowaną tyro­zynę a SH3 wykazuje powinowactwo do sekwencji bogatych w prolinę i bierze udział w regulacji aktyw ­ności SH1 [56-58]. P145°'ab l zawiera C-końcowy fragment z domenami sekwencji lokalizacji jądrowej (NLS) i sekwencji bogatych w prolinę, domenę wiążącą DNA, miejsce wiązania P53 i domenę wiążącą aktynę. Lokalizacja kom órkow a P145c ABL umożliwia jego udział w procesach zachodzących zarówno w jądrze jak i cytoplazmie [56].

IV. Gen fuzyjny BCR/ABL

Translokacja fragmentu genu BCR z chromosomu 22 do locus protoonkogenu c-ABL w chromosomie 9 (t(9q+;22q-)(q34:ql 1)) prowadzi do powstania genu

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

fuzyjnego BC R/ABL (Ryc. 2), którego ekspresja sprzyja proliferacji i stwarza przewagę komórek Ph+ nad otaczającymi je prawidłowymi komórkami szpi­ku [17, 48, 59]. W komórkach Ph+ ekspresji ulegają zarówno gen fuzyjny BC R/ABL jak i c-BCR oraz c-Abl [60-61].

m-bcr < ►

t

W chromosomie 22 pęknięcia następują wewnątrz intronów genu BCR, głównie w trzech regionach: M-bcr, m-bcr i p-bcr [66-68]. W regionie M-bcr pęk­nięcia m ają miejsce w obszarze o długości 5,8 kpz, obejmującym 5 eksonów e 12-e 16 (b l-b5 ) i wystę­pują zazwyczaj pomiędzy eksonami e l3 (b2) i e 14

Chromosom 22M-bcr u-bcr

< ►

t t t tc-BCR

Chromosom 9

Hl— HIt It

a3—a11 C-ABL

a2-a11 P230 BCR/ABL

P210 BCR/ABL

P203 BCR/ABL

P185-190 BCR/ABL

a3-a11 P180 BCR/ABL

EKSONY

INTRONY

tt

punkty złam ań w ALL

punkty złam ań w CML

Ryc. 2. Molekularne konsekwencje translokacji t(9q+;22q-) prowadzącej do powstania chromosomu Filadelfia. Lokalizacja punktów pęknięć w chro­mosomach 22 i 9 oraz główne mRNA białek fuzyjnych występujących w białaczkach człowieka (na podstawie [8, 15, 17, 18, 19])

Region chromosom u 9, w którym następują pęk­nięcia prowadzące do powstania chromosomu Fila­delfia obejmuje obszar ponad 200 kpz. Najczęściej pęknięcia w ystępują w pierwszym eksonie od końca 5 ’ genu c-ABL, co powoduje, że translokacji do chro­mosomu 22 ulega prawie cały ten gen (eksony a2-al 1), a wycięciu ulegają eksony la i lb [59, 62]. Ekson 2 odgryw a k luczow ą rolę w składaniu BCR/ABL [63]. Pęknięcia pomiędzy eksonami b l i a l pow odują translokację dłuższego fragmentu ABL (a 1-a 11), a w ycięciu ulega tylko wewnętrzny ekson b l [62]. W chromosom ie 9 stwierdza się również zw iększoną częstość pęknięć w intronie przedzie­lającym eksony a2 i a3. W ówczas translokacji ulega krótszy region a 3 - a l l [64, 65].

(b3) lub e l4 (b3) i e l5 (b4) [59, 64]. Gdy fragmenty BCR u legają fuzji z eksonami a 2 -a l l ABL, podczas transkrypcji powstaje hybrydowy mRNA b2a2/b3a2, zawierający 8,5 kz z sekwencją pochodzącą z BCR na końcu 5 ’ i sekwencją z ABL na końcu 3 ’ [31, 62]. Białko BCR/ABL o masie 210 kDa, (P210), zawiera 902 lub 927 aminokwasów kodowanych przez gen BCR oraz 426 aminokwasów kodowanych przez gen ABL [59, 69]. Ekspresję P210 stwierdza się u więk­szości pacjentów z CM L oraz u około połowy ALL z Ph [31 ]. W kilku przypadkach ALL Ph+ i CML obser­wowano ekspresję białka 203 kDa (P203) z tran- skryptu b2a3/b3a3 B C R/ABL [64, 65].

W ponad 75% przypadków ALL i nielicznych przypadkach CML Ph+, ekspresja genu fuzyjnego

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 159http://rcin.org.pl

BCR/ABL prowadzi do syntezy mniejszego białka o masie 185-190 kDa, P185-190 [17, 48]. W genie BCR miejsca pęknięć znajdują się w regionie m-bcr, pomiędzy dwoma pierwszymi eksonami e l i e2 [62, 64]. W wyniku połączenia eksonów a 2 - a l l genu ABL z eksonem e l genu BCR powstaje mRNA BCR/ABL liczący 7,5 kz [62]. Ze względu na alterna­tywne składanie białko P I 85-190 może występować razem z białkiem P210 [70]. W ALL Ph+ można ob­serwować także ekspresję białka o masie 180 kDa, będącego produktem translacji e la3 mRNA, po­wstającego w wyniku połączenia eksonu e l BCR i eksonów a 3 - a l l ABL [64, 65]. Geny fuzyjne BCR/ABL z miejscem pęknięcia w obszarze p-bcr pomiędzy eksonami e 19 i e20 genu BCR rzadko to­warzyszą CML. Połączenie eksonów e 1-e 19 BCR z obszarem a 2 - a l l ABL prowadzi do powstania tran- skryptu c3a2 mRNA, ulegającego translacji na białko o masie 230 kDa [65, 71, 72],

tywność przypisuje się b iałku P I 85 B C R /A B L [32 ,73 ] .0 ile białko c-ABL występuje zarów no w jąd rze jak1 cytoplazmie, to białka fuzyjne B C R /A B L w ykry ­wane sąn iem al wyłącznie w cy toplazm ie [25]. Taka lokalizacja BCR/ABL m oże mieć udział w onko- gennej aktywności genu B C R /A B L , na k tórą wpływać także m ogą zw iększona aktyw ność kodo­wanego przez niego enzym u i zdolność BCR/ABL do fosforylacji substratów nie rozpoznaw anych przez c-Abl [74-76].

V. Rola BCR/ABL w procesach komórkowych

BCR/ABL uczestniczy w aktywacji wew nątrzko­mórkowych kaskad przesyłania sygnałów w szla­kach: RAS [77-79], JAK/STAT [80-83] oraz kinazy PI3K [84-85] (Ryc. 3). Proliferacja komórek B C R /A B L+ wymaga aktywności k inazy fosfatydylo- inozytolu PI3K [86, 87], jednakże to B CR/ABL two-

Ryc. 3. Niektóre formy aktywności BCR/ABL w komórce. Kolorem czarnym zaznaczono białka w postaci nieaktywnej, kolorem białym - aptorowe. Szczegółowy opis procesów przedstawionych na rycinie umieszczono w tekście (na podstawie [84])

białka ad-

Tak więc ekspresja genu fuzyjnego BC R/ABL, w zależności od miejsca pęknięc ia w BCR i ABL, p o ­woduje syntezę kilku białek: P I 80, P I 85-190, P203, P210 lub P230, zw iązanych z różnymi pos ta­ciami białaczek u ludzi. W szystkie b iałka fuzyjne w ykazują k ilkakrotnie w yższą aktyw ność kinaz ty-rozynowych niż białko P I 45 c -A B L N ajw yższą ak-

rzy multimeryczny kom pleks z białkami adaptoro- wymi CBL, CRK oraz CRKL, uczestniczącymi w ak­tywacji kinazy PI3K [88]. Przekaźnikiem w kaska­dzie PI3K jes t kinaza serynowo-treoninowa AKT, której substratem jes t białko proapoptotyczne BAD — stwarza to możliwość udziału BC R/ABL w regula­cji apoptozy [89-92].

160 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

Wzrost komórek hematopoetycznych kontrolują cytokiny, których receptory przekazują sygnał po­przez aktywację kinaz cytoplazmatycznych JAK, fosforylujących i aktywujących czynniki transkryp- cyjne z rodziny STAT. W komórkach BC R /AB L+ ma miejsce stała aktywacja szlaku JAK/STAT. Może być ona spowodowana nieza leżną od JAK fosforylacją STAT5, wykazującego aktywność antyapoptotyczną w obecności B CR/A BL [48, 81, 93, 94], W odróż­nieniu do naturalnych m echanizm ów aktywacji szla­ku JAK/STAT, B C R /A B L może bezpośrednio wpływać na czynniki STAT1 i STAT5, bez uprzed­niej fosforylacji kinaz JAK. W konsekwencji, eks­presja genu BC R/ABL uniezależnia komórki od czyn­ników wzrostu. Proces ten może być także zależny od białka RAS, będącego produktem protoonkogenu R A S [95, 96]. W aktywacji RAS biorą udział białka adaptorowe GRB-2, SHC i CRKL. GRB-2 razem z białkami SOS stabilizuje RAS w jego formie aktyw­nej, co pozwala na przyłączenie GTP. Białka GRB-2, SHC oraz CRK L są substratami BCR/ABL biorącego udział w aktywacji RAS [48]. Współdziałanie B CR /A B L i RAS może prowadzić do aktywacji kinazy RAF-1, inicjującej kaskadę sy­gnałów regulujących transkrypcję i apoptozę [84].

Nadekspresja onkogenu M YC towarzyszy wielu nowotworom u ludzi, także białaczkom. BCR/ABL może aktywować protoonkogen c-M YC, jednakże mechanizm tego procesu nie został jeszcze poznany [99-101], Białko M YC pochodzi z rodziny czynni­ków transkrypcyjnych, do której należą również białka JUN i FOS, a heterodimer JUN/FOS ma właściwości plejotropowego aktywatora transkryp­cji. BCR/ABL m oże fosforylować JUN, przyczy­niając się do ekspresji M Y C [102].

BCR/ABL m oże stym ulow ać proliferację kom ó­rek, jednakże aktywność ta może być hamowana przez białko P27. Białko to jes t inhibitorem zale­żnych od cyklin kinaz i odgrywa kluczową rolę w re­gulacji wzrostu kom órek hematopoetycznych. Taki charakter działania BCR /A B L może wynikać z j e d ­noczesnej aktywacji cyklu komórkowego i zale­żnych od cyklin kinaz przez oddziaływanie z czynni­kami hamującymi cykl kom órkow y [103]. S tymula­cja proliferacji kom órek przez BCR/ABL może się odbywać z wykorzystaniem szlaków działania czyn­ników wzrostu: B C R /A B L może oddziaływać z pod- jednostką Bc receptora interleukiny-3 (IL-3) oraz m iędzybłonowym receptorem kinaz tyrozynowych, KIT. Fosfoproteina Dok-1 (P26DOK2), biorąca udział w przesyłaniu sygnału z receptora KIT, może tw o­rzyć kompleks z CRKL, RAS-G A P i BCR/ABL [84]. BCR/A BL może także fosforylować i aktywować

fosfolipazę Cy (PLCa), fosfatazę inozytolową SHIP-2, białka VAV i FAK, kinazy ERK i SRC [104-110] (Tabela 1).

Komórki BC R /A B L+ charakteryzują się obniżoną zdolnością adhezji. Ponieważ adhezja hamuje proli­ferację, to ta właściwość komórek BC R/ABL+ może mieć znaczenie dla ich zwiększonej aktywności pro- liferacyjnej, mającej kluczowe znaczenie w progresji nowotworów [111, 112]. Zdolności adhezyjne kom ó­rek BC R/A B L+ m ogą zostać zwiększone przez inter- fe ron-a (IFN-a), który jes t stosowany w terapii CML[113].

V -l. Stymulowana przez BCR/ABL naprawa DNA

Kluczow ą rolę u człowieka w procesie naprawy rekombinacyjnej odgrywa białko RAD51, biorące także udział w innych systemach naprawy DNA [114-120]. RAD51 może oddziaływać z produktami genów supresorowych P53, BRCA1 i BRCA2 [120, 122]. Białka rodziny R A D 5 1 m ogą także bezpośred­nio kontrolować wzrost komórek [123].

Uszkodzenia DNA w komórce mogą powodować aktywację białka c-ABL, które może fosforylowć Tyr54 białka RAD51 [84, 124, 125], Fosforylacja RAD51 stymuluje jego wiązanie z RAD52 i tworze­nie kompleksu rekombinacyjnego RAD52/RAD51/ RPA [126]. RAD51 może być także fosforylowany przez zależną od DNA kinazę białkową, DNA-PK, b iorącą udział w naprawie przez rekombinację nie- hom ologiczną [127]. BCR/ABL może bezpośrednio aktywować RAD51 [23, 57, 128] (Ryc. 4). Wzrost aktywności RAD51 w komórkach BC R/ABL+ może być wynikiem stymulowanej przez BCR/ABL trans- aktywacji promotora genu RAD51 przy udziale czyn­nika transkrypcyjnego STAT5 [58].

N apraw a przez rekom binację hom ologiczną z udziałem R A D 5 1 odgryw a główna rolę w usuwaniu dw uniciowych pęknięć DNA, które, gdy nie są na­prawiane, m ogą prowadzić do śmierci komórki. BCR/ABL, poprzez oddziaływ anie z RAD51, może pow odow ać zw iększenie efektywności naprawy pęknięć dw uniciow ych DNA. Takie uszkodzenia są w yw oływ ane przez wiele leków przeciw now otw o- rowych oraz prom ieniow anie jon izu jące stosowane w celach terapeutycznych, a ich efektywniejsza n a ­prawa w kom órkach B C R /A B L + może indukować oporność tych kom órek na prom ieniow anie i cy to ­statyki [129]. BC R/A B L m oże s tym ulow ać naprawę DN A w kom órkach poddanych działaniu leków przeciw now otworow ych: cisplatyny, mitom ycyny C oraz prom ieniow ania y; w kom órkach tych nastę­pować może wyraźny wzrost poziom u ekspresji

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 161http://rcin.org.pl

RAD51 [128, 130]. Dane te sugerują, że zależna od RAD51 napraw a przez rekom binację hom olo­giczną, je s t jednym z m echanizm ów biorących udział w indukcji oporności kom órek B C R /A B L + na leki i prom ieniow anie [128]. B CR /A B L może także indukować lekooporność poprzez inne m echan i­zmy: blokow anie cyklu kom órkow ego w fazie G2/M czy prow adzące do b lokow ania apoptozy sty-

Tabela 1

Substraty BCR/ABL3

S u bstra t Funkcja

CBL Białko adaptorowe

Grb-2 Białko adaptorowe

CRKL Białko adaptorowe

CRK Białko adaptorowe

SHC Białko adaptorowe

Ras-GAP GTPaza aktywująca białko RAS

Paksylina Białko strukturalne (cytoszkielet/błona komórkowa)

Talina Białko strukturalne (cytoszkielet/błona komórkowa)

FAK Białko strukturalne (cytoszkielet/błona komórkowa)

PLC-( Fosfolipaza fosfatydyloinozytolowa

P13K podjcdnostka p85 Kinaza serynowo-treoninowa

VAV Różnicowanie komórek hematopoetycznych

FES Różnicowanie komórek mieloidalnych

STAT1/STAT5 Czynnik transkrypcyjny

P62DOK Białko adaptorowe

3 na podstawie [84]

mogą mieć związek z powstawaniem chromosomu Filadelfia, będącego jednym z wyznaczników CML[139].

BCR/ABL może brać udział w regulacji ekspresji P53, wpływając na procesy związane z indukcją apo­ptozy oraz przejściowym blokowaniem cyklu ko­mórkowego przed wyjściem z fazy G1 (Ryc. 4). Eks­presji BCR/ABL może towarzyszyć obniżenie

mulowanie ham owania aktywności kaspazy 3 przez białka z rodziny BCL-2 (Ryc. 4) [111, 128, 131, 132]. Do oporności kom órek B C R /A B L + na p rom ie­niowanie i cytostatyki może też przyczyniać się zwiększona efektywność naprawy uszkodzeń DNA przez rekom binację niehom ologiczną. Zachodzi ona w skutek bezpośredniego oddziaływ ania BCR/ ABL z k inazą D NA -PK, m ającą k luczow e znacze­nie dla tego rodzaju napraw y [133].

V-2. Oddziaływanie BCR/ABL z genem supresoro- wym P53

Mutacje P53 tow arzyszą wielu nowotworom złośliwym, jednakże w białaczkach ich częstość jest stosunkowo niska w porównaniu z innymi now otw o­rami [134, 135]. Wyjątkiem jes t CML, gdzie mutacje wykrywa się u około 30% pacjentów w fazie ostrej choroby [136-138]. Sugeruje to, że mutacje P53

wewnątrzkomórkowego poziomu P53, co sugeruje udział BCR/ABL w hamowaniu aktywności P53[140], M echanizm tego procesu nie jest znany, je d ­nak w odpowiedzi na uszkodzenia DNA prawidłowe białko c-ABL może być aktywowane przez białko ATM. Jest ono produktem zmutowanego genu A T (ang. ataxia teleangiectasia ) i tworzy kompleks z P53. Wiązanie P53 poprzedza fosforylacja Ser465 c-ABL przez ATM [100]. Być może podobny proces zachodzi także w odniesieniu do domeny ABL białka BCR/ABL. Na hamowanie aktywności P53 przez BCR/ABL wskazują także wyniki doświadczeń prze­prowadzonych na myszach z wyłączonym genem P53, u których stwierdzono podwyższoną zdolność do proliferacji i zmniejszoną podatność na apoptozę komórek B C R/ABL+ [141-143]. Zatem hamowanie aktywności P53 przez BCR/ABL może być elem en­tem transformacji komórek BC R /A B L+ do stanu cha­rakterystycznego dla ostrej fazy białaczek.

162 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

Ryc. 4. Udział RAD51 i P53 w procesach komórkowych stymulowanych przez BCR/ABL. L ligand, R błonowy receptor komórkowy, BCL-2/BCLXl białka hamujące apoptozą, BAD/BAX białka proapoptotyczne. Grubość strzałek odzwierciedla stopień aktywacji lub hamowania

VI. Rola BCR/ABL w regulacji apoptozy

Jak już wspominano, ekspresji genu BCR/ABL może towarzyszyć hamowanie apoptozy [144-151] (Ryc. 4). Uszkodzenia DNA w komórkach BCR/ABL+ wywołują aktywację szlaku RAS pro­wadzącego do zwiększenia tempa proliferacji i b lo­kowania apoptozy [111, 129], BCR/ABL może ha­mować apoptozę poprzez blokowanie uwalniania cy- tochromu C z mitochondriów; cytochrom może się łączyć z białkiem APAF-1 oraz proenzymem kaspa- zy-9 [131, 132]. Utworzenie takiego kompleksu pro­wadzi do aktywacji kaspazy-9, uruchomienia kaska­dy innych kaspaz i apoptozy. Białka z rodziny BCL, w tym inhibitory apoptozy: BCL-2, BCL X l , BCL-W oraz promotory apoptozy: BAD, BAK, BAX mogą funkcjonować jako integratory na drodze przekazy­wania sygnału apoptozy [152, 153]. Białka BAX i BAK wraz z białkami VDAC (białka napięciowo-za- leżnych kanałów anionowych) tworzą duże kanały błonowe, przez które przedostają się cząsteczki cyto- chromu C z mitochondrium do cytoplazmy. BCR/ABL może także hamować apoptozę przez

zmianę aktywności genów należących do rodziny BCL: B CL X l i BCL-2 [89, 154-157]. Oddziaływa­niu BCR/ABL z BCL-2 towarzyszyć może aktywa­cja szlaków RAS lub kinazy PI3K [158]. BCR/ABL może hamować apoptozę również przez fosforylację proapoptotycznego białka BAD przy udziale RAS [159-162]. Fosforylowane białko BAD tworzy kom ­pleks z białkami frakcji cytoplazmatycznej z rodziny 14-3-3 i w takim stanie jes t nieaktywne [92], BCR/ABL może blokować uwalnianie cytochromu C z mitochondriów i aktywację kaspazy 3, hamując proapoptotyczną aktywność BAD [132, 154,155, 163].

VII. Uwagi końcowe

Odkrycie chromosomu Filadelfia i poznanie m echanizmów translokacji t(9q+;22q-) stworzyło nowe perspektywy molekularnej analizy białaczek. Identyfikacja sekwencji regionów pęknięć w chro­mosomach biorących udział w powstawaniu Ph otwiera nowe możliwości prowadzenia badań nad jego znaczeniem biologicznym i rozwojem nowych

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 163http://rcin.org.pl

strategii diagnozowania oraz terapii. Określono rolę Ph i genu fuzyjnego BC R/ABL w patogenezie białaczek. BCR/ABL może brać udział w transfor­macji nowotworowej kom órek hematopoetycznych przez zwiększenie tempa proliferacji, zaburzenie ad­hezji, hamowanie apoptozy, aktywację białek MAP, aktywację protoonkogenów C-M YC i BC L-2, od­działywanie z genami supresorowymi i aktywację genów, których produkty uczestniczą w naprawie DNA.

Znajomość molekularnych podstaw translokacji Ph stwarza nowe perspektywy w leczeniu białaczek. Ekspresja BCR/ABL może być ham owana na etapie transkrypcji przez użycie antysensowych cDNA lub RNA. Zastosowanie specyficznych inhibitorów ki­naz tyrozynowych pozwala na hamowanie aktywno­ści BCR/ABL, w szczególności jego działania anty- apoptycznego, wynikającego ze zdolności do fosfo­rylacji białek regulujących apoptozę. Pomimo obie­cujących efektów terapii genowej z zastosowaniem strategii antysensowej, inhibitory kinaz tyrozyno­wych wzbudzają największe nadzieje. W 1998 roku wprowadzono do zastosowania klinicznego związek o nazwie STI571, hamujący aktywność BCR/ABL, poprzez blokowanie jego domeny ATP, niezbędnej dla aktywności kinazy BCR/A BL [164], STI571 jest obecnie stosowany w leczeniu ALL i CML, w których stwierdza się translokacje Ph [165].

Artykuł otrzymano 13 września 2001 Zaakceptowano do druku 11 kwietnia 2002

Piśmiennictwo

1. F e r r a r a F, V i c a r i L , F e s t a B , Di N o t o R, P a n e F, S e b a s t i o L, C i m i n o R (1995) Haematologica 80: 434-436

2. S e b a s t i o L, F e r r a r a F , V i c a r i L, di N o t o R, d e l V e c c h i o L, P a n e F, F a s a n a r o A, C i m i n o R, S a - l v a t o r e F , V e n t r u t o V (1995) Am J Hematol 50: 49-52

3. G u i n B , P a d u a R A (1995) Cancer J 8: 195-2004. S h e e r D , S q u i r e J (1996) Cancer Biology 7: 1-325. D e A n g e l i C, G a n d i n i D, C u n e o A, M o r e t t i S, B i -

g o n i R, R o b e r t i M G, B a r d i A, C a s t o l d i G L, d e l S e n n o L (2000) Haematologica 85: 913-921

6. l i d a S, H a n a m u r a I , S u z u k i T , K a m i y a T, K a t o M, H a y a m i Y, M i u r a K, H a r a d a S, T s u b o i K, W a - k i t a A, A k a n o Y, T a n i w a k i M, N i t t a M, U e d a R (2000) Int J Hematol 72: 85-91

7. S c h a i c h M, R i t t e r M, I l l m e r T , L i s s k e P , T h i e d e C, S c h ä k e l U, M o h r B, E h n i n g e r G, N e u b a u e r A (2001 )B rJ H a em a to l 112: 300-307

8. S c h e e l e J S, R i p p l e D, L u b b e r t M (2000) Celi Mol Life Sei 57: 1950-1963

9. B o t t i A C, V e r m a R S (1990) Anticancer Res 10: 519-5261 0 . B r u c k e r t P , K a p p l e r R , S c h e r t h a n H, L i n k H,

H a g m a n n F, Z a n k l H (2000) Cancer Genet Cytogenet 120: 73-79

1 1 . B a r t o v a E , K o z u b e k S, K o z u b e k M, J i r s o v a P, L u k a s o v a E, S k a l n i k o v a M, C a f o u r k o v a A, K o - u t n a I (2000) Gene 244: 1-11

12. W u Y, M e h e w J W, H e c k m a n C A, A r c i n a s M, B o x e r L M (2000) Haematologica 85: 913-921

1 3 . S t a m a t o u l l a s A, B u c h o n n e t G, L e p r e t r e S, L e n a - i n P, L e n o r m a n d B, D u v a l C, C a l l a t M P , G a u i a r d P, B a s t a r d C, T i l l y H (2000) Leukemia 14: 1960-1966

14. Perera F P (1996) J Natl Cancer Inst 88: 469-5091 5 . G r i g n a n i F , F a g i o l i M, A l c o y M (1994) Blood 83:

10-2516. P a s t e r n a k G, H o c h h a u s A, S c h u l t h e i s B, H e h l ­

m a n n R (1998) J Cancer Res Clin Oncol 124: 643-6601 7 . K o l i b a b a K S, D r u k e r B J (1997) Biochim Biophys Acta

1333: 217-24818. C l a r k S S, M c L a u g h l i n J , T i m m o n s M, P e n d e r -

g a s t A M, B e n - N e r i a h Y, D o w L W, C r i s t W, R o v e r a G, S m i t h S D, W i t t e O N (1988) Science 1: 775-777

19. S h t i v e l m a n E, L i f s h i t z B, G a l e R P, R o e B A, C a ­n a a n i E (1986) Cell 2: 277-284

20. F i n c h S C, L i n e t M S (1992) Clin Haematol 5: 27-562 1 . B e n n e t t J M, C a t o v s k y D, D a n i e l M T, F l a n d r i n

G, G a l t o n D A G , G r a l n i c k H R, S u l t a n C (1976) Br Haematol 33: 451-459

22. B e n n e t t J M, C a t o v s k y D, D a n i e l M T, F l a n d r i n G, G a l t o n D A G, G r a l n i c k H R, S u l t a n C (1980)B rJ Haematol 44: 169-170

2 3 . C o p l e a n A E, M c G u i r e E A (1995) Blood 85: 1151-116824. D a m e s h e c W (1967) Blood 29: 566-58425. R o w l e y J D (1973) Nature 243: 290-29326. R o w l e y J D (1990) Cancer 65: 2178-21842 7 . B a r t r a m C R, d e K l e i n A, H a g e m e i j e r A, v a n

A g t h o v e n T , G e u r t s v a n K e s s e l A, B o o t s m a D, G r o s v e l d G, F e r g u s o n - S m i t h M A, D a v i e s T, S t o n e M (1983) Nature 306: 227-280

28. H e i s t e r k a m p N, S t e p h e n s o n J R, G r o f f e n J , H a n ­s e n P F, d e K l e i n A, B a r t r a m C R, G r o s v e l d G (1983) Nature 306: 239-242

29. H a r b o t t J , R i t t e r b a c h J , J a n k a - S c h a u b G, L u ­d w i g W D, R e i t e r A, R i e h m H, L a m p e r t F (1990) Hamatol Bluttransfus 33: 451-458

30. K a l w i n s k y D K, R a i m o n d i S C, S c h e l l M J , M i r r o J J r , S a n t a n a V M, B e h m F, D a h l G V, W i l l i a m s D (1990) J Clin Onkol 8: 75-83

3 1 . M o r r i s C, K e n n e d y M, H e i s t e r k a m p N, C o l u m - b a n o - G r e e n L, R o m e r i l K, G r o f f e n J , F i t z g e r a l d P (1991) Genes Chromosomes Cancer 3: 263-271

32. L a m p e r t F, H a r b o t t J , R i t t e r b a c h J (1991) Klin P a d i a t r 2 0 3 : 3 1 1 - 3 1 8

3 3 . P u i C H, C r i s t W M, L o o k A T (1990) Blood 76: 1449-1463

34. R o w l e y J D (1990) Semin Hematol 27: 122-1363 5 . F l e t c h e r J A K i m b a l l V M, L y n c h E, D o n n e l l y M,

P a v e l k a K, G e l b e r R D, T a n t r a v a h i R, S a l l a n S E(1989) Blood 74: 2130-2135

3 6 . R a i K R, S a w i t s k y A, C r o n k i t e E P, C h a n a n a A D, L e v y R N, P a s t e r n a k B S (1975) Blood 46: 219-234

3 7 . S o k o l J E, B a c c a r i n i M, R u s s o D, T u r a S (1988)Se­min Hematol 25: 49-61

38. C o l l i n s S J (1991) W: Deisseroth AB, Arlinghaus RB (red) Chronic myelogenous leukemia. Dekker, NY, str. 3-72

39. Collins S J (1986) J Clin Invest 78: 1392-139640. G r o f f e n J , S t e p h e n s o n J R, H e i s t e r k a m p N, d e

K l e i n A, B a r t r a m C R, G r o s v e l d G (1984) Cell 36: 93-99

4 1 . C h i s s o e S L , B o d e n t e i c h A, W a n g Y F, W a n g Y P, B u r i a n D, C l i f t o n S W, C r a b t r e e J , F r e e m a n A, I y e r K , J i a n L (1995) Genomics 27: 67-82

42. Heisterkamp N, Stam K, Groffen J, de Klein A, Grosveld G (1985) Nature 315: 758-761

43. M e l o J V (1996) Leukemia 10: 751-75644. M a r u Y W i t t e O N (1991) Cell 67: 459-46845. M u l l e r A J , Y o u n g J C , P e n d e r g a s t A M, P o n d e l

M, L a n d a u N R, L i t t m a n D R, W i t t e O N (1991)M ol Cell Biol 11: 1785-1792

164 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

46. E v a A , A a r o n s o n S A (1985b) Nature 316: 273-27547. P e t e r s K L, S m i t h g a l l T E (1999) CellSignal 11: 507-5144 8 . R a i t a n o A B, W h a n g Y E (1997) Biochim Biophys Acta

1333:210-21649. S k o r s k i T , W ł o d a r s k i P, D a h e r o n L, S a l o m o n i

P, N i e b o r o w s k a - S k o r s k a M, M a j e w s k i M, W ą ­s i k M, C a l a b r e t t a B (1998) Proc Natl Acid Sci USA 29: 11858-11862

50. V o n e k e n J W , v a n S c h a i c k H, K a a r t i n e n V, D e - e m e r K, C o a t e s T, L a n d i n g B, P a t t e n g a l e P , D o r - s e u i l O, B o k o c h G M, G r o f f e n J (1995) Cell 80: 719-728

51. G r o f f e n J (1997) W: Abstracts J M ol Med 75: B 15052. P e n d e r g a s t A M, T r a u g h J A, W i t t e O N (1987) Mol

Cell Biol 7: 4280-428953. A b e I s o n H T, R a b s t e i n L S (1970) Cancer Res 30:

2213-222254. H e i s t e r k a m p N , S t a m K, G r o f f e n J , d e K l e i n A,

G r o s v e l d G (1985a) J Mol Appl Genet 2: 57-6855. K o n o p k a J B, W i t t e O N (1985) M ol CellB iolS: 3116-312356. W a n g J Y J (1993) Curr Opin Gen Rev 3: 35-4357. S k o r s k i T, N i e b o r o w s k a - S k o r s k a M, W ł o d a r s k i

P, W a s i k P, T r o t t a R, K a n a k a r a j P, S a l o m o n i P, A n t o n y a k M, M a r t i n e z R, M a j e w s k i M, W o n g A, P e r u s s i a B, C a l a b r e t t a B (1998) Blood 15: 406-418

58. N i e b o r o w s k a - S k o r s k a M, W a s i k M A, S l u p i a - n e k A, S a l o m o n i P, K i t a m u r a T, C a l a b r e t t a B, S k o r s k i T (1999) J Exp M ed 19: 1229-1242

59. Z a m e c n i k o v a A (2000) Neoplasma 47: 269-27360. M e 1 o J V , G o r d o n D E, C r o s s N C , G o l d m a n J M

(1993) Blood 81: 158-165ó l . I s s a a d C, A h m e d M, N o v a u l t S, B o n n e t M L,

B e n n a r d o T, V a r e t B, V a i n c h e n e r W, T u r h a n A G (2000) Leukemia 14: 662-610

62. B e r n a r d s A, R u b i n C M, W e a t b r o o k C A, P a - s k i n d M, B a l t i m o r e D (1987) M ol Cell B io l l \ 3231-3236

63. L i c h t y B D, K a m e l - R e i d S (2000) Biochem J 15: 63-6964. I w a t a S, M i z u t a n i S, N a k a z a w a S, Y a t a J (1994)

Leukemia 8: 1696-170265. M a r t i n e l l i G, A m a b i l e M, T e r r a g a n a C, T e s t o n i

N, O t t a v i a n i E, M o n t e f u s e c o V, d e V i v o A, B a c - c a r a n i M, R i c c i P , S a g i l o G, T u r a S (1999) Leukemia 13: 1463-1472

66. H e r m a n s A, H e i s t e r k a m p N , v o n L i d e n M, v a n B a a a l S, M e i j e r D, v a n d e r P l a s D, W i e d e m a n n L M G r o f f e n J , B o o t s m a D, G r o s v e l d G (1987) Cell 51: 33-40

67. S h t i v e l m a n E, L i f s h i t z B, G a l e R P, C a n a a n i E (1985) Nature 315: 550-554

68. S a g l i o G, G u e r r a s i n o A, R o s s o C, Z a c c a r i a A, T a s s i n a r i A, S e r r a A, R e g e - C a m b r i G, M a z z a U, G a v o s t o F (1990) Blood 76: 1819-1824

69. G u o J Q, L i a n J Y, X i a n Y M, L e e M S, D e i s s e - r o t h A B, S t a s s S A, C h a m p l i n R E, T a l p a z M, W a n g J Y, A r l i n g h a u s R B (1994) Blood 83: 3629-3637

70. W i n t e r S S, G r e e n e J M, M c C o n n e l l T S, W i l l - m a n C L (1999) Leucemia 13: 2007-2011

71. P a n e F, F r i g e r i F, S i n d o m a M, L u c i a n o L, F e r r a ­r a F , C i m i n o R, M e l o n i G, S a g l i o G, S a l v a t o r e F, R o t o l i B (1996) Blood 88: 2410-2414

72. R o t o l i B , P a n e F, S a l v a t o r e F , S a g l i o G (2000)B r J Haematol 110: 493-649

73. L u g o T G, P e n d e r g a s t A M, M u l l e r A J , W i t e O N(1990) Science 247: 1041 -1044

74. R e y n o l d s C H, W i l l s o n M G, G r o f f e n J , H e i s t e r ­k a m p N , P e a k m a n T C , P a g e M J (1993) Biochim Biophys Acta 1181: 122-130

75. D e i n i n g c r M W, V i e r a S, M e n d i o l a R, S c h u l t h e - i s B, G o l d m a n J M (2000) Cancer Res 1: 2049-2055

76. T a k e d a N, S h i b u y a M, M a r u Y (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96: 203-207

77. M a n d a n a s R A, L e i b o w i t z D S, G h a r e h b a g h i K, T a u c h i T , B u r g e s s G S, M i y a z a w a K, J a y a r a m H N , B o s w e l l H S (1993) Blood 82: 1838-1847

78. M a t s u g u c h i T, S a l g i a R, H a l l e k M, E d e r M, D r u - k e r B, E r n s t T J , G r i f f i n J D (1994) J Biol Chem 7: 5016-5021

79. P u i l L, L i u J , G i s h G, M b a m a l u G, B o w t e l l D, P e - l i c c i P G, A r l i n g h a u s R, P a w s o n T (1994)EM BOJ13: 764-773

80. C a r l e s s o N, F r a n k D A, G r i f f i n J D (1996) J Exp Med 183: 811-820

8 1 .1 1 a r i a R L J , V a n E t t e n R A (1996) J Biol Chem 271: 31704-31710

82. S h u a i K, H a l p e r n J , t e n H o e v e J , R a o X, S a w y e r s C L (1996) Oncogene 13: 247-254

83 . C o r t e z D, R e u t h e r G W, P e n d e r g a s t A M (1997) Oncogene 15: 2333-2342

84. D e i n i n g e r M W N , G o l d m a n J M, M e l o J V (2000) Blood 96: 3343-3356

8 5 . V a r t i c o v s k i L, D a l e y G Q, J a c k s o n P, B a l t i m o r e D, C a n t l e y L C (1991) M ol Cell B iol 11: 1107-1113

86. M a r a i s R, L i g h t Y, P a t e r s o n H F, M a r s h a l l C J (1995) EMBO J 14: 3136-3145

87. S k o r s k i T, K a n a k a r a j P , N i e b o r o w s k a - S k o r s k a M (1995) Blood 86: 726-736

88. S a t t l e r M, S a l g i a R, O k u d a K, U e m u r a N , D u r - s t i n M A, P i s i c k E, X u G, Li J L, P r a s a d K V, G r i f f i n J D (1996) Oncogene 12: 839-846

89. S k o r s k i T , B e l l a c o s a A, N i e b o r o w s k a - S k o r s k a M, M a j e w s k i M, M a r t i n e z R, C h o i J K, T r o t t a R, W l o d a r s k i P, P e r r o t t i D, C h a n T O , W a s i k M A, T s i c h l i s P N , C a l a b r e t t a B (1997) EMBO J 16: 6151-6161

90. S l u p i a n e k A, N i e b o r o w s k a - S k o r s k a M, H o s e r G, M o r r i o n e A, M a j e w s k i M, X u e L, M o r r i s S W, W a s i k M A, S k o r s k i T (2001) Cancer Res 61: 2194-2199

91. C o n s t a n t i n o R S S, L a c r o n i q u e V, B o u c h a r e t I, M o n n i R, B e r n a r d O, G i s s e l b r e c h t S, G o u i l l e u x F (2001) Oncogene 20: 2080-2090

92. d e l P e s o L, G o n z a l e s - G a r c i a M, P a g e C , H e r r e r a R, N u n e z G (1998) Science 278: 687-689

9 3 . H o r i t a M, A n d r e u E J , B e n i t o A A r b o n a C, S a n zC, B e n e t I , P r o s p e r F, F e r n a n d e z - L u n a J L (2000) J Exp Med 191: 977-984

94. S i l l a b e r C, G e s b e r t F, F r a n k D A, S a t t l e r M, G r i f f i n J D (2000) Blood 95: 2118-2125

95. K a b a r o w s k i J H, A l l e n P B, W i e d e m a n n L M (1994) EMBO J 13: 5887-5889

96. A l e y G Q , B a l t i m o r e D (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85: 9312-9316

97. O d a T , H e a n e y C, H a g o p i a n J R, O k u d a K, G r i f - f i n J D, D r u k e r B J (1994) J Biol Chem 269: 22925-22928

98. P e l i c c i G, L a n f r a n c o n e L, S a l c i n i A E, R o m a n o A, M e i e S, G r a z i a B o r r e l l o M, S e g a t t o O, Di F i o ­r e P P, P e l i c c i P G (1995) Oncogene 11: 899-907

99. S a w y e r s C L , C a l l a h a n W, W i t t e O N (1992) Cell 70: 901-910

100. B i s s o n n e t t e R P, E c h e v e r r i F , M a h b o u b i A, G r e e n D R (1992) Nature 359: 552-554

101. E v a n G I , W y l l i e A H, G i l b e r t C S, L i t t l e w o o d T D, L a n d H, B r o o k s M, W a t e r s C M, P e n n L Z, H a n c o c k D C (1992) Cell 69: 119-128

102. R a t i n o A B, H a l p e r n J R, H a m b u c h T M, S a w y ­e r s C L (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92: 11746-11750

1 0 3 . J o n u l e i t T , K u i p v a n d e r H, M i e t h i n g C, M i ­c h e l s H , H a l l e k M, D u y s t e r J , A u l i t z k y W E(2000) Blood 96: 1933-1939

104. G o t o h A , M i y a z a w a K, O h y a s h i k i K, T o y a m a K(1994) Leukemia 8: 115-120

105. T a u c h i T , F e n g G S, S h e n R, S o n g H Y , D o n n e rD, P a w s o n T , B r o x m e y e r H E (1994) J Biol Chem 269: 15381-15387

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 165http://rcin.org.pl

106. M a t s u g u c h i T , I n h o r n R C, C a r l e s s o N , X u G, D r u k e r B, G r i f f i n J D (1995) EMBO J 14: 257-265

107. S a l g i a R, B r u n k h o r s t B, P i s i c k E, Li J L, L o SH, C h e n L B, G r i f f i n J D (1995)Oncogene 11: 1149-1155

108. S a l g i a R, Li J L, L o S H, B r u n k h o r s t B , K a n s a s G S, S o b h a n y E S, S u n Y, P i s i c k E, H a l l e k M, E r n s t T (1995) J Biol Chem 270: 5039-5047

109. D a n h a u s e r - R i e d l S, W a r m u t h M, D r u k e r B J, E m m e r i c h B, H a l l e k M (1996) Cancer Res 56: 3589-3596

1 1 0 . W a r m u t h M, B e r g m a n n M, P r i e s s A, H ä u s l m a n n K, E m m e r i c h B, H a l l e k M (19979JB io l Chem 272: 33260-33270

111. B e d i A, Z e h n b a u e r B A, B a r b e r J P, S h a r k i s S J, J o n e s R J (1994) Blood 83: 2038-2044

112. V e r f a i l l i e C M, H u r l e y R, L u n d e l l B I , Z h a o C, B h a t i a R (1997) Acta Haematol 97: 40-52

113. B h a t i a R, W a y n e r E A, M c G l a v e P B, V e r f a i l l i e C M (1994) J Clin Invest 94: 384-391

114. T r z e c i a k A, B ł a s i a k J (1999) Post Biol Kom 26: 707-729115. N e w J H, S u g i y a m a T, Z a i t s e v a E, K o w a l c z y -

k o w s k i S C (1998) Nature 391: 407-410116. Y u Z, C h e n J , F o r d B N B r a c k l e y M E, G l i c k m a n

B W (1999) Environ Mol Mutagen 33: 3-20117. D y c k v a n E, S t a s i a k A Z, S t a s i a k A, W e s t S C

(1999) Nature 398: 728-731118. S c h i l d D, L i o Y C, C o l l i n s D W, T o s o m o n d o T,

C h e n D J (2000) J B io l Chem 275: 16443-16449119. S o n g B, S u n g P (2000) J Biol Chem 275: 15895-15904120. S h a r a n S K, M o t i m a s u M, A l b r e c h t U, L i m D - S ,

R e g e l E, D i n h C, S a n d s A, E i c h e l e G, H a s t y P, B r a d l e y A (1997) Nature 386: 804-810

121. S t u r z b e c h e r H - W , D o n z e l m a n n B, H e n n i g W, K n i p p s c h i l d U, B u n c h l o p S (1996) EMBO J 15: 1992-2002

122. S c u l l y R, C h e n j , P l u g A, X i a o Y, W e a v e r D, F e u n t e u n J , A s h l e y T, L i v i n g s t o n D M (1997) Celi 88: 265-275

123. H a v r e P A, R i c e M C, N o e M, K m i e ć E B (1998) Cancer Res 58: 4733-4739

124. T a k a o N, M o r i R, K a t o H, S h i n o h a r a A, Y a m a ­m o t o Ki (2000) J B io l Chem 275: 725-728

125. Y u a n Z M, H u a n g Y, I s h i k o T, N a k a d a S, U t s u - g i s a w a T, K h a r b a n d a S, W a n g R, S u n g P, S h i n o ­h a r a A, W e i c h s e l b a u m R, K u f e D (1998) J Biol Chem 273: 3799-802

126. C h e n G, Y u a n S S, L i u W, X u Y, T r u j i l l o K, S o n g B, C o n g F , G o f f S P, W u Y, A r l i n g h a u s R, B a l t i m o r e D, G a s s e r P J , P a r k M S, S u n g P, L e c E Y (1999) J Biol Chem 274: 12748-12752

127. K h a r b a n d a S, Y u a n Z M, W e i c h s e l b a u m R, K u f e D (1998) O ncogenell: 3309-3318

128. S l u p i a n e k A, H o s e r G , M a j s t e r e k I , B r o n i s z A, M a ł e c k i M, F i s h e l R , B l a s i a k J , S k o r s k i T (2002) M ol Celi Biol 22: 4189-4201

129. B e d i A, B a r b e r J P , B e d i G C, e l - D e i r y W S, S i - d r a n s k y D, V a l a M S, A k h t a r A J , H i l t o n J , J o ­n e s R J (1995) Blood 1: 1148-1158

130. B ł a s i a k J , T r z e c i a k A, K a c z y ń s k i K, M a j s t e r e kI, H o s e r G, G l o c E, M ł y n a r s k i W, S k o r s k i T(2001) Leukemia 15: 483

131. A m a r a n t e - M e n d e s G P, N a e k y u n g K C, L i u L, H u a n g Y, P e r k i n s C L, G r e e n D R, B h a l l a K (1998) Blood 91: 1700-1705

132. D u b r e z L, E y m i n B M, S o r d e t O, D r o i n N, T u r - h a n A G, S o l a r y E (1998) Blood 91: 2415

133. D e u t s c h , E, D u g r a y A, A b d u l K a r i m B, M a r a n - g o n i E, M a g g i o r e l l a L, V a g a n a y S, M ’ K a c h e r R, R a s y S D, E s c h w e g e F, V a i n c h e n k e r W, T u r - h a n A G, B o u r h i s J (2001) Blood 97: 2084

134. B e a c h D, S t i l l m a n B, W a t s o n J D (1991) 96: Cold Spring Harbor Press, New York, 1991

135. S k u z e G R, L u d l o w J W (1995) Lancet 345: 902-9061 3 6 . R o v i r a A, U r b a n o - 1 s p i z u a A, C e r v a n t e s F,

R o z m a n M, V i v e s - C o r r o n s J L , M o n t s e r r a t E, R o z m a n C (1995) Ann Hematol 70: 129-133

1 3 7 . 0 k a b e M, K u n i e d a Y, N a k a n e S, K u r o s a w a M, I t a y a T, V o g l e r W R, S h o j i M, M i y a z a k i T (1995) Leuk Lymphoma 16: 493-503

138. N e u b a u e r A, H e M, S c h m i d t C A, H u h n D, L i u E T (1993) Leukemia 7: 593-600

139. G u e r r a s i o A, S e r r a A, G o t t a r d i E, C i l l o n i D, V i s c h i a F, P a r v i s G, C i l l i V, S a g i l o G (1997) Leu­kemia 11 (Suppl 3): 519-521

140. P i e r c e A, S p o o n c e r E, W o o l e y S, D i v e C, F r a n ­c i s J M, M i y a n J, O w e n - L y n c h P J, D e x t e r T M, W h e t t o n A D (2000) Oncogene 19: 5487-5497

141. S k o r s k i T, N i c b o r o w s k a - S k o r s k a M, W l o d a r - s k i P, P e r r o t t i D, M a r t i n e z R, W a s i k M A, C a 1 a - b r e t t a B (1996) Proc Natl Acad Sei USA 93: 13137-13142

142. H o n d a H, H i r a i H (2001) Blood Cells Mol Dis 27: 265-278143. H o n d a H, U s h i j i a m a T, W a k a z o n o K, O d a Y,

A i z a w a S, I s h i k a w a T, Y a z a k i Y, H i r a i H (2000) Blood 95: 1144-1150

144. A l d e e r m a n E M, F u d e n b e r g H H, L o v i n s R E (1980) Blood 55: 817-822.

145. A l n e m r i E S, L i v i n g s t o n D, N i c h o l s o n D, S a - l v e s e n G, T h o r n b e r r y N, W o n g W, Y u J (1996) Cell 8 7 :171

146. A l l s o p p T E, W y a t t S, P e t e r s o n H F, D a v i e s A M(1993) Cell 73: 295-307

147. A l n e m r i E S, R o b e r t s o n N M, F e r n a n d e s T F, C r o c e C M, L i t w a c k G (1992,) Proc Natl Acad Sei USA 89: 7295-7299

148. C o t t e r T G (1995) Leukemia lymphoma 18: 231-236149. W a n g J Y (2000) Oncogene 2019: 5643-5650150. D a l e y G Q, B a l t i m o r e D (1992) Proc Natl Acad Sei U SA

85: 9312-9316151. S i r a r d C, L a n e u v i l l e P, D i c k J E (1994) Blood 83:

1575-1585152. A d a m s J M, C o r y S (1998) Science 281: 1322-1226153. M a k i n G, H i c k m a n J A (2000) Cell Tissue Res 301:

143-152154. A m a r a n t e - M c n d e s G P, M c G a h o n A J, N i s h i o k a

W K, A f a r D E, W i t t e O N, G r e e n D R (1998) Oncoge­ne 16: 1383-1390

1 5 5 . S a l o m o n i P, C o n d o r l l i F, S w e e n e y S M, C a l a - b r e t t a B (2000) Blood 96: 676-684

156. G r o s s A, M c D o n n e l l J M, K o r s m e y e r S J (1999) Gens Dev 13: 1899-1911

157. K a r n i R, J o v e R, L e v i t z k i A (1999) Oncogene 18: 4654-4662

158. S a n c h e z - G a r c i a I , M a r t i n - Z a n c a D (1997) J M ol Biol 267: 225-228

159. W a n g H G, R a p p U R, R e e d J C (1996) Cell 87: 629-638160. Z h a J , H a r a d a H, Y a n g E, J o c k e l J , K o r s m e y e r

S J (1996) Cell 87: 619-628161. N e s h a t M S, R a i t a n o A B, W a n g H G, R e e d J C,

S a w y e r s C L (2000) Mol Cell Biol 20: 1179-1186162. M a j e w s k i M, N i e b o r o w s k a - S k o r s k a M, S a l o -

m o n i P , S l u p i a n e k A, R e i s s K, T r o t t a R, C a l a - b r e t t a B, S k o r s k i T (1999) Cancer Res 59: 2815-2819

163. J o h n s o n B W, C e p e r o E, B o i s e L H (2000) J Biol Chem 275: 31546-31553

164. B u c h d u n g e r E, Z i m m e r m a n n J, M e t t H (1995)Proc Natl Acid Sei USA 92: 2558-2562

165. L e C o u n t r e P, M o l o g o n i L, C l e r i s L (1999) J Natl Cancer Inst 91: 163-168

166 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

Zagadka histonu HI

The histone HI mystery

ANDRZEJ T. WIERZBICKI

Spis treści:

I. W stępII. Chromatyna uczestniczy w regulacji ekspresji genówIII. Powszechność w ystępow ania i rola strukturalna suge­

rują istotną rolę histonu HIIII-I.H iston HI w ystępuje u wszystkich grzybów, roślin

i zwierzątIII-2. Histon HI ulokow any jest w krytycznym miejscu

na nukleosom ieIV. Brak histonu H I nie w pływ a na żyw otność organizm ów

\\- \.T e tra h ym en a therm ophilaIV -2. K om órki kręgow ców in vitro IV-3. GrzybyIV-4. Zwierzęta IV-5. Rośliny

V. Sprzeczność m iędzy danym i strukturalnym i a funkcjo­nalnymi

VI. Pierwszym kluczem do zagadki histonu H I jest redun­dancjaVI-1. Redundancja jest pow szechną cechą układów bio­

logicznychVI-2. M echanizm y działające na poziom ie chrom atyny

tworzą sieć w zajem nych powiązańVI-3. Histon HI jest elem entem sieci m echanizm ów

chrom atynowychVI-4. Zasada redundancji tłum aczy sprzeczność danych

strukturalnych i funkcjonalnychVII. Drugim kluczem do zagadki histonu HI jest jego dyna­

miczne zachow anie w chrom atynieVII-1. Procesów biologicznych nie należy rozumieć

m echanistycznieVII-2. Chrom atyna jest układem dynam icznymVII-3. Histon HI m oże m odyfikow ać w łaściwości

dynam iczne chrom atynyVII-4. Dynam ika tłum aczy sprzeczność danych

strukturalnych i funkcjonalnychVIII. Jak rozwikłać paradoks histonu H I?

VIII-1. R edundancja VIII-2. Dynam ika

IX. Podsum owanie

Contents:

I. IntroductionII. Chrom atin participates in the regulation o f gene

expressionIII. Com m on occurrence and structural function suggest a

significant role for histone HIIII-l. H istone HI is found in all fungi, plants and

anim alsIII-2. H istone HI occupies a critical position on the

nucleosom eIV. The absence o f histone H I does not influence viability o f

organism sIV-1. Tetrahymena thermophila IV-2. Vertebrate cell lines in vitro IV-3. FungiIV-4. Anim alsIV-5. Plants

V. C ontradiction between structural and functional dataVI. The first key to the histone HI m ystery is redundancy

VI-1. Redundancy is a com m on feature o f biologicalsystem s

VI-2. Chrom atin processes constitute a network of interactions

VI-3. H istone HI is an elem ent o f the chromatin networkVI-4. Redundancy explains the contradiction between

structural and functional dataVII. The second key to the histone HI m ystery is its dynamic

behaviour in chrom atinVII-1. B iological processes should not be explained

m echanisticallyVII-2. Chrom atin is a dynam ic systemVII-3. H istone HI may m odify the dynam ic properties o f

chrom atinVII-4. D ynam ics explains the contradiction between

structural and functional dataVIII. How to solve the histone H I paradox?

V III-1. RedundancyVIII-2. Dynam ics

IX. C onclusion

I. Wstęp

Histon HI jes t białkiem w ystępującym w dużej ilości w jądrach komórkowych praktycznie wszyst-

Mgr, Uniwersytet Warszawski, Pracownia Biologii Molekular­nej Roślin, ul. Pawińskiego 5a, 02-106 Warszawa, e-mail: andw@ibb.waw.pl

kich organizmów eukariotycznych. Dlatego pytanie o jego funkcję od wielu lat przyciąga uwagę badaczy. Pomimo to rola histonu H I pozostaje do dzisiaj za­gadkowa. W artykule tym przedstawiam aktualny stan wiedzy na temat funkcji histonu HI ukazujący głęboką sprzeczność między danymi pochodzącymi z różnych podejść badawczych oraz proponuję dwa hipotetyczne wyjaśnienia roli histonu HI wraz ze sposobami ich weryfikacji.

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 167http://rcin.org.pl

II. Chromatyna uczestniczy w regulacji eks­presji genów

DNA w jądrach komórkowych organizmów euka­riotycznych pozostaje stale związany z białkami, tworząc chromatynę. Odkrycie niespełna 30 lat temu podstawowej, nukleosomowej struktury chromatyny zapoczątkowało intensywne badania nad ro lą organi- zacji strukturalnej materiału genetycznego. Początkowo przypuszczano, że połączenie DNA z białkami jes t statyczne i m a znaczenie wyłącznie strukturalne. Z czasem okazało się, że pogląd ten był błędny [1]. Organizacja chromatyny ma istotne zna­czenie dla regulacji procesów takich jak replikacja [2], rekombinacja [3], naprawa DNA [4], a przede wszystkim transkrypcja. Wydaje się, że struktura chromatyny jest ważnym czynnikiem w regulacji ekspresji genów, a przez to w regulacji różnicowania i rozwoju oraz odpowiedzi organizmów na warunki środowiska [5-9].

DNA nawinięty jes t na rdzenie utworzone z ośmiu cząsteczek histonów, po dwie cząsteczki każdego ro­dzaju: H2A, H2B, H3 i H4. Są to tak zwane histony rdzeniowe. Podjednostka zbudow ana z rdzenia histo- nowego wraz z niemal dwukrotnie owiniętym wokół niego odcinkiem DNA o długości około 150 par za­sad została nazwana nukleosomem. Sąsiadujące nu- kleosomy połączone są odcinkiem DNA (tak zw a­nym łącznikiem) o długości kilkudziesięciu par za­sad [1] (Ryc. 1).

Ryc. 1. Struktura nukleosomowa chromatyny.

Uważa się, że struktura nukleosom owa w swoim podstawowym stanie stanowi zawadę steryczną, k tó­ra uniemożliwia lub silnie utrudnia wiązanie innych białek z DNA. Tam gdzie niemożliwy jes t dostęp białek do DNA, niemożliwe staje się zachodzenie procesów związanych z DNA, przede wszystkim transkrypcji. Wykazano, że struktura chromatyny ulega zmianom oraz opisano m echanizmy j ą m odyfi­kujące, regulujące przez to procesy zależne od DNA [1]. Najistotniejsze z nich to: aktywne, zależne od

hydrolizy ATP, przesuwanie nukleosomów i zmiany oddziaływań histony-DNA [6, 10, 11], acetylacja, metylacja i inne modyfikacje histonów rdzeniowych [7, 12], a także metylacja DNA [13].

III. Powszechność występowania i rola strukturalna sugerują istotną rolę histonu HI

III-l. Histon HI występuje u wszystkich grzybów, roślin i zwierząt

Histon H I , zwany również histonem łączniko­wym, występuje u praktycznie wszystkich grzybów, roślin oraz zwierząt [14, 15] i pozostaje zw iązany z większością nukleosomów w jądrze kom órkowym[1], U roślin i zwierząt z reguły występują liczne nie- alleliczne warianty histonu HI różniące się n ie­znacznie sekwencją am inokw asow ą [14, 16].

Histon HI jes t białkiem silnie zasadowym, boga­tym w aminokwasy lizynę i argininę. Ma budowę trójczęściową. Składa się z centralnej domeny globu- larnej oraz krótkiej domeny N-końcowej i dłuższej C-końcowej (Ryc. 2). Domeny końcowe są słabo

N-końcowa Globularna C-końcowa

50 aa

Ryc. 2. Histon H 1 składa się z trzech domen: N-końcowej, globulamej i C-końcowej.

ustrukturalizowane i słabo konserwowane ew olucyj­nie. Domena globularna jest za to silnie konserw o­wana ewolucyjnie i przyjmuje dobrze określoną strukturę trzeciorzędową [14, 17] (Ryc. 3).

III-2. Histon HI ulokowany jest w krytycznym miejscu na nukleosomie

Histon HI zajmuje w strukturze nukleosomowej miejsce odmienne niż histony rdzeniowe, przyłącza się bowiem do nukleosomu od zewnątrz [ 1 ]. Podczas gdy szczegółowa budowa samego nukleosomu zo­stała poznana dzięki zastosowaniu metod krystalo­graficznych [18] (Ryc. 4a), lokalizacja histonu HI pozostaje przedmiotem kontrowersji. Za najbardziej prawdopodobne uważa się ułożenie domeny globu- larnej w miejscu, gdzie DNA wchodzi i schodzi z nu­kleosomu pomiędzy nicią w chodzącą a przebie-

168 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

Ryc. 3. Struktura krystalograficzna domeny globulamej histonu HI według [17].

gającą przez środek nukleosomu [14, 19, 20] (Ryc. 4b). Domena C-końcowa może wtedy od­działywać z DNA łączącym nukleosomy. Taka loka­lizacja histonu HI sugeruje jego bardzo istotną funk­cję. Spina on bowiem i stabilizuje strukturę nukle­osomu od zewnątrz.

Wykazano, że funkcja strukturalna histonu HI nie ogranicza się do budowania nukleosomu. Bierze on

(a)

histonowy

udział w organizowaniu wyższego rzędu struktur chromatyny, czyli tak zwanego włókna 30 nm [14, 21-23]. Wyraźnie w idoczną strukturę ponadnukle- osom ową przyjm ują obszary chromatyny nieaktyw­nej transkrypcyjnie [23]. A zatem histon HI może utrudniać dostęp do DNA co najmniej na dwa sposo­by: stabilizując strukturę nukleosomu oraz biorąc udział w organizacji struktury ponadnukleosomowej chromatyny. To właśnie dlatego uznano histon HI za białko o kluczowym znaczeniu dla hamowania eks­presji genów, najprawdopodobniej niezbędne do ży­cia komórek i organizmów.

IV. Brak histonu HI nie wpływa na żywotność organizmów

IV-1. Tetrahymena termophila

Równolegle do badań nad ro lą histonu H 1 w struk­turze nukleosomowej, w miarę pojawiających się no­wych możliwości metodycznych prowadzono bada­nia funkcjonalne. Pierwsze doświadczenia przepro­wadzono na orzęsku Tetrahymena therm ophila. Ku wielkiemu zaskoczeniu szczep T. therm ophila po ­zbawiony całkowicie białka uznanego za histon HI nie wykazywał żadnych istotnych zaburzeń [24], Z a­obserwowano co prawda niewielkie zmiany w struk­turze jądra komórkowego oraz drobne zmiany w eks­presji genów, jednak wzrost komórek był całkowicie normalny. Również ogólna ekspresja genów nie była zaburzona [24, 25]. Wyniki te pozwoliły po raz pierwszy zakwestionować tezę, jakoby histon HI był niezbędny do funkcjonowania organizmów. Badania te miały jednak pewien słaby punkt. Otóż białko

Rdzeńhistonowy

Ryc. 4. Struktura krystalograficzna nukleosomu według [18] (a), umiejscowienie histonu HI na nukleosomie według [19] (b).

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 169http://rcin.org.pl

uznane przez autorów za histon H I jes t w rzeczywi­stości podobne jedynie do C-końcowej domeny kla­sycznych histonów HI wyższych eukariontów, przy czym podobieństwo to dotyczy wyłącznie składu aminokwasowego. Brak domeny globularnej pozw a­la wątpić, czy białko to jes t w rzeczywistości histo- nem HI i czy T. therm ophila i pozostałe orzęski w ogóle mają histon H I.

IV-2. Komórki kręgowców in vitro

Następny cykl badań funkcjonalnych pośw ięco­nych roli histonu HI przeprowadzono na hodow a­nych in vitro komórkach kręgowców. Otrzymano li­nie komórkowe z podwyższonym [26] lub obniżo­nym [27, 28] poziomem wybranych wariantów histo­nu H I. Wyniki były podobne do opisanych wyżej: drobne zmiany nie wpływające na żywotność kom ó­rek. Za pom ocą elektroforezy dwuwymiarowej w y­kazano pewne zmiany w ekspresji genów. W kom ór­kach pozbawionych w ybranych wariantów histonu HI zaburzenia w ekspresji genów były obecne, doty­czyły jednak tylko bardzo niewielkiej liczby genów [27]. Ugruntowało to tezę, że histon H 1 nie pełni k lu­czowej roli w podstawowych procesach życiowych, a co najwyżej jakąś funkcję ograniczoną i specy­ficzną. Niestety również te badania miały swój słaby punkt. Nadekspresji lub wyłączeniu określonego w a­riantu histonu HI towarzyszył efekt kompensacyjny czyli zawartość pozostałych wariantów odpowiednio spadała lub wzrastała. Sumaryczna zawartość histo­nu HI zmieniała się najwyżej o 50 procent.

IV-3. Grzyby

Aby ominąć problem kompensacji sięgnięto po organizmy mające tylko jeden gen histonu H 1 - grzy­by. Trzem niezależnym grupom badawczym udało się uzyskać szczepy trzech różnych gatunków grzy­bów pozbawione histonu H I . Pomimo wnikliwych analiz fenotypowych nie znaleziono żadnych niepra­widłowości w drożdżach Saccharom yces cerevisiae [29] ani w Aspergillus n idulans [30]. W A scobolus imm ersus zaobserwowano pewne nieprawidłowości, podstawowy wzrost nie był jednak zakłócony [31]. Wydaje się zatem, że histon HI nie jes t niezbędny do zachodzenia podstawowych procesów życiowych na poziomie komórkowym. Funkcja jego może być bar­dziej subtelna niż sądzono i może dotyczyć raczej funkcjonowania organizmu jako całości. Kwestię tę rozstrzygnąć mogły tylko badania na organizmach wielokomórkowych.

IV-4. Zwierzęta

Podjęto próby zbadania funkcji histonu HI u zwierząt. Pierwszą było pokazanie, że w początko­wym etapie rozwoju w zarodku Drosophila nie ma hi­stonu HI [32]. Później rozpoczęto serię eksperymen­tów na myszach, mających na celu wyłączenie kolej­nych wariantów histonu H I. Opublikowane dotych­czas dane potwierdzają brak jakichkolwiek zaburzeń spowodowanych przez usunięcie części wariantów hi­stonu HI [33]. Udało się za to znaleźć interesującą, choć bardzo specyficzną funkcję histonu HI we wcze­snym rozwoju zarodkowym płaza Xenopus laevis. Wykazano, że wymiana wariantów histonu H 1 powo­duje istotną w rozwoju utratę zdolności komórek do różnicowania w tkankę mezodermalną [34],

IV-5. Rośliny

Do badania funkcji histonu HI wykorzystano rów­nież rośliny. Pierwszym znaczącym rezultatem było uzyskanie roślin tytoniu z silnie podwyższoną za­wartością histonu H I [35]. Nadm iar tego białka nie upośledzał żywotności roślin, obserwowane zabu­rzenia były niewielkie. Podobnie jak u zwierząt, rów­nież w przypadku roślin żadna z dotychczas przepro­wadzonych prób wyłączenia histonu HI nie przełamała mechanizmu kompensacji. Zmiany pro­porcji wariantów histonu HI w tytoniu nie zaburzyły żywotności roślin, a obserwowane defekty były ograniczone i specyficzne [36, 37]. Dotychczas do­stępne dane z eksperymentów na organizmach wielo­komórkowych potwierdzają zatem wcześniej w ysnu­te wnioski. Histon HI nie jes t niezbędny dla przeży­cia. Jego rola jest raczej ograniczona i dotyczy tylko wybranych procesów [14].

V. Sprzeczność między danymi strukturalny­mi a funkcjonalnymi

Jak zatem pogodzić wnioski płynące z różnych podejść eksperymentalnych? Z jednej strony po­wszechność występowania, istotne miejsce w struk­turze nukleosomowej i rola w tworzeniu wyższego rzędu struktur chromatyny. Z drugiej, brak pow a­żniejszych defektów w organizmach pozbawionych histonu H I lub z zaburzonymi proporcjami warian­tów bądź nadekspresjąh is tonu H I. Czy to możliwe, by białko tak silnie konserwowane ewolucyjnie było jednocześnie zbędne dla przeżycia? Czy białko w y­stępujące na powierzchni każdego nukleosomu może nie pełnić żadnej istotnej funkcji?

170 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

VI. Pierwszym kluczem do zagadki histonu HI jest redundancja

VI-1. Redundancja jest powszechną cechą układów biologicznych

Wydaje się, że pierwszym kluczem do rozwiąza­nia zagadki histonu H I jes t redundancja m echani­zmów biologicznych, czyli istnienie więcej niż j e d ­nego mechanizmu odpowiedzialnego za konkretną funkcję. W razie uszkodzenia jednego mechanizmu pozostałe przejm ują jego rolę. Redundancja jes t jed n ą z podstawowych cech układów biologicznych, a jej najlepszym przykładem jes t istnienie dwóch kopii wszystkich genów w większości organizmów eukariotycznych.

VI-2. Mechanizmy działające na poziomie chroma­tyny tworzą sieć wzajemnych powiązań

Różne procesy regulujące funkcjonowanie chro­matyny są ze sobą silnie powiązane a jednocześnie ich funkcje w dużym stopniu pokryw ają się. Wykaza­no, że acetylacja histonów rdzeniowych i przesuwa­nie nukleosomów, mechanizmy uważane za k luczo­we dla aktywacji ekspresji genów, są od siebie zale­żne [38]. Jednoczesne usunięcie acetylazy histono- wej oraz czynnika przesuwającego nukleosomy wywołuje efekt letalny, podczas gdy usunięcie tylko jednego z nich nie zaburza żywotności [38, 39], Oznacza to, że ich funkcje m uszą przynajmniej czę­ściowo się pokrywać.

Podobnie, trzy najistotniejsze mechanizmy odpo­wiedzialne za hamowanie transkrypcji na poziomie struktury chromatyny: metylacja lizyny 9 histonu H3, deacetylacja histonów rdzeniowych i metylacja DNA są od siebie nawzajem zależne [12, 13, 40, 41]. Jednocześnie istnieją organizmy pozbawione jed n e­go lub nawet dwóch z nich [13,41]. Pozostające m e­chanizmy przejm ują funkcje brakujących, co świad­czy o ich przynajmniej częściowej redundancji.

Istnienie sieci m echanizmów zależnych od siebie i również częściowo się pokrywających zapewnia nie­zawodność regulacji ekspresji genów. Jednocześnie uszkodzenie jednego mechanizmu nie uniemożliwia działania całego układu.

VI-3. Histon HI jest elementem sieci mechanizmów chromatynowych

Skoro struktury i m echanizm y chromatynowe tworzą sieć wzajemnych powiązań, czy histon HI może być elementem tej sieci? Liczne dane w ska­

zują, że tak. Wykazano, że obecność histonu HI sil­nie hamuje acetylację histonów rdzeniowych [42]. Wydaje się, że histon HI ma podobny wpływ na działanie czynników przesuwających nukleosomy [43]. Oba te procesy są uważane za bardzo ważne dla aktywacji ekspresji genów. Zaobserwowano również związek histonu HI z m etylacją DNA. Z jednej stro­ny jego obecność zapobiega nadmiernej metylacji DNA [31], z drugiej zaś histon H I jest odpowiedzial­ny za kondensację chromatyny w odpowiedzi na me- tylację DNA [22]. Nie bez znaczenia wydaje się rów­nież zdolność do oddziaływania histonu HI z białkami strukturalnymi odpowiedzialnymi za inak- tyw ację transkrypcyjną obszarów chromatyny [44].

VI-4. Zasada redundancji tłumaczy sprzeczność danych strukturalnych i funkcjonalnych

Wydaje się zatem, że histon HI rzeczywiście jes t elementem sieci m echanizmów chromatynowych. Dostępne dane wskazują, że powiązany jes t raczej z hamowaniem transkrypcji. Jest to zgodne z w nioska­mi z badań strukturalnych, które sugerują, że histon HI hamuje dostęp do DNA przez stabilizowanie struktury nukleosomu i skondensowanych struktur chromatyny wyższego rzędu. Jednocześnie jego funkcja pokrywa się w dużej mierze z innymi m echa­nizmami, które m ogą kompensować brak histonu HI (Ryc. 5). Jest to zgodne z wynikami badań funkcjo-

Otwarty stan chromatyny

Zamknięty stan chromatyny

Ryc. 5. Redundancja mechanizmów chromatynowych odpowiedzial­nych za hamowanie transkrypcji. Brak jednego mechanizmu może zostać skompensowany przez pozostałe.

nalnych, które pokazują, że jego brak nie zaburza podstawowych procesów życiowych. Tak więc spoj­rzenie na rolę histonu HI uwzględniające redundan­cję procesów biologicznych zdaje się wyjaśniać pa­radoksalną sprzeczność między danymi struktural­nymi a funkcjonalnymi.

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 171http://rcin.org.pl

VII. Drugim kluczem do zagadki histonu HI jest jego dynamiczne zachowanie w chromatynie

VII-1. Procesów biologicznych nie należy rozumieć mechanistycznie

Drugim kluczem do rozwiązania zagadki histonu HI może być bardziej realistyczne rozumienie pro­cesów biochemicznych. Istnieje tendencja, aby pro­cesy te rozpatrywać w kategoriach mechanistycz- nych. Cząsteczki chemiczne często traktuje się jak tryby w maszynie, ich oddziaływanie jako popycha­nie, a modyfikacje strukturalne jako przestawianie elementów. Tymczasem na poziomie molekularnym rządzi dynamika i prawa statystyczne. Aktualny stan każdego układu sprowadza się zawsze do równowagi dynamicznej różnych stanów przejściowych.

VII-2. Chromatyna jest układem dynamicznym

Klasyczne badania nad strukturą i funkcją chro­matyny interpretowane były w kategoriach mechani- stycznych. Wraz ze wzrostem wiedzy na ten temat, podejście to okazuje się coraz mniej użyteczne. D o­brze ilustrują to wyniki doświadczeń, w których dwukrotnie zmniejszono gęstość nukleosomów w chromatynie drożdży, a następnie analizowano eks­presję wszystkich genów [45]. Ponieważ organizacja nukleosomowa postrzegana jes t jako kluczowy czyn-

0&'ETCLayto

CLt/i

Eo

Li_

|t

It

W obecności histonu H1

Bez histonu H1

Ryc. 6. Przyłączanie histonu HI może zmieniać równowagę dyna­miczną między różnymi stanami konformacyjnymi nukleoso­mów przez stabilizowanie jednego stanu (po lewej). Bez histo­nu H 1 mogą spontanicznie powstawać stany o zmienionej kon­formacji (po prawej).

nik hamujący transkrypcję, spodziewano się ogólne­go wzrostu ekspresji genów. Wynik był jednak za­skakujący. Ekspresja trzech czwartych ogólnej licz­by genów wcale się nie zmieniła, a spośród pozo­stałej jednej czwartej ekspresja połowy genów była podwyższona, a połowy obniżona [45]. Okazuje się więc, że znaczenia struktury nukleosomowej dla eks­presji genów i ogólnie dla zachodzenia procesów w chromatynie nie można wytłumaczyć w kategoriach czysto mechanistycznych.

Ostatnio zaproponowano, aby otwarty lub za­mknięty (w odniesieniu do ekspresji genów) stan chromatyny rozpatrywać jako układ w równowadze dynamicznej. W takim rozumieniu nukleosom może przyjmować stany konformacyjne różniące się do­stępnością do DNA (Ryc. 6). Stany te różnią się ener­gią swobodną, a przejście między nimi może wym a­gać osiągnięcia stanu pośredniego o wysokiej energii swobodnej [10, 46].

VII-3. Histon HI może modyfikować właściwości dynamiczne chromatyny

Rolę histonu HI również trudno jest wyjaśnić w kategoriach mechanistycznych. Nie dość, że lokali­zacja w krytycznym miejscu na nukleosomie nie pociąga za sobą niezbędności dla zachodzenia pod­stawowych procesów życiowych, to ostatnie badania wskazują, że histon HI jes t białkiem bardzo ruchli­wym. Wykazano, że cząsteczki histonu HI wystę­pują w jądrze komórkowym w stanie dynamicznej równowagi między formą w olną a przyłączoną do nukleosomu [47]. Bardzo możliwe zatem, że histon HI nie jes t statycznym elementem żadnej struktury. Można spekulować, że jes t on niezbędny dla utrzy­mywania określonej równowagi między różnymi sta­nami konformacyjnymi nukleosomów. Może on sta­bilizować pewien stan i tym samym przesuwać rów ­nowagę na jego korzyść (Ryc. 6). Może również przez przyłączanie się do nukleosomów zwiększać energię swobodną stanu przejściowego między sta­nem otwartym a zamkniętym chromatyny.

VII-4. Dynamika tłumaczy sprzeczność danych strukturalnych i funkcjonalnych

Przedstawiona wyżej interpretacja roli histonu HI mogłaby wskazywać na jego niezwykle istotne zna­czenie dla funkcjonowania organizmu. Stabilizując jeden z możliwych stanów konformacyjnych nukle­osomów, histon HI zapobiegałby nieuprawnionemu samoistnemu przechodzeniu nukleosomów w inny stan (Ryc. 6). To z kolei redukowałoby nieupraw­

172 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

nioną ekspresję genów i tym samym zmniejszałoby straty energetyczne wywołane niedoskonałością pro­cesów regulacyjnych oraz dawałoby przewagę se­lekcyjną organizmom posiadającym histon H I. W ten sposób zbędność histonu HI dla przeżycia orga­nizmów staje się możliwa do wyjaśnienia. Być może histon H 1 nie jest potrzebny dla procesów elementar­nych, jes t za to niezbędny dla uzyskania odpowied­nio precyzyjnej regulacji ekspresji genów. Defekt wywołany brakiem histonu H 1 jes t przez to niewielki i może ujawniać się tylko w szczególnych warunkach lub po długim okresie czasu.

Przyjęcie, że histon H I pełni rolę czynnika m ody­fikującego właściwości dynamiczne chromatyny, pozwala więc wyjaśnić sprzeczność między danymi strukturalnymi a funkcjonalnymi.

VIII. Jak rozwikłać paradoks histonu HI?

VIII-1. Redundancja

Jeśli paradoks histonu HI wynika z pokrywania się jego funkcji z funkcjami innych białek chromaty- nowych, kluczem do jego rozszyfrowania będą w ni­kliwe badania funkcjonalne. Po pierwsze, konieczne jest zbadanie wpływu całkowitego usunięcia histonu H 1 na funkcjonowanie organizmów roślin i zwierząt. Przypuszczalnie efekt całkowitej eliminacji histonu H 1 może się ujawnić dopiero w skomplikowanym or­ganizmie eukariotycznym [48], Po drugie, konieczne jes t sprawdzenie, czy w organizmach pozbawionych histonu HI nie są zaburzone procesy chromatynowe potencjalnie powiązane z histonem H I. Na uwagę w pierwszej kolejności zasługują acetylacja i metylacja histonów rdzeniowych oraz metylacja DNA. Po trze­cie wreszcie, należałoby sprawdzić efekty jednocze­snego wyłączenia histonu HI oraz białek odpowie­dzialnych za istotne procesy chromatynowe. Defekt obserwowany w organizmie z podwójnym wyłącze­niem histonu HI oraz wybranego innego białka może być dużo silniejszy niż suma defektów wynikających z pojedynczych wyłączeń. Gdyby tak było, sugero­wałoby to, że obecność histonu H 1 jes t istotna dla za­chodzenia określonego procesu. W tym wypadku, oprócz białek odpowiedzialnych za modyfikacje hi­stonów rdzeniowych i metylację DNA, na uwagę zasługują też czynniki przebudowujące chromatynę oraz białka strukturalne chromatyny.

VIII-2. Dynamika

Wyjaśnienie paradoksu histonu H I w kategoriach dynamiki chromatyny będzie trudniejsze. Tutaj rów ­

nież kluczowe jest uzyskanie rośliny lub zwierzęcia całkowicie pozbawionego histonu H I, a następnie ich wnikliwa analiza. Szczególnie istotne może być sprawdzenie zachowania takich organizmów w w a­runkach stresowych, a także zbadanie koordynacji ekspresji genów w różnych tkankach i różnych w a­runkach środowiska. Rozstrzygające znaczenie miałyby bezpośrednie badania dynamiki struktur chromatynowych przy braku histonu H I. Obecnie możliwe jes t to wyłącznie in vitro [46], jednak nie­wykluczone, że wkrótce pow staną techniki pozw a­lające badać to zjawisko bezpośrednio w żywych or­ganizmach.

IX. Podsumowanie

Od czasu poznania struktury nukleosomowej, wiedza na temat mechanizmów rządzących chroma- tyną ogromnie posunęła się naprzód. Histon HI p o ­został ostatnim z głównych składników chromatyny, którego funkcja jes t nieznana. Pojawiające się obec­nie nowe hipotezy na temat jego funkcji stwarzają nadzieję, że już wkrótce zagadka histonu HI zostanie rozwiązana.

Podziękowania

Dziękuję prof. Andrzejowi Jerzmanowskiemu za cenne uwagi w czasie redagowania pracy.

Artykuł otrzymano 14 marca 2002 Zaakceptowano do druku 27 maja 2002

Piśmiennictwo

1. K o r n b e r g R D , L o r c h Y (1999) Celi 98: 285-2942. M e l e n d y T, Li R (2001) Front Biosci 6: 1048-10533. R o t h D B , R o t h S Y (2000) Celi 103: 699-7024. M o d e s t i M, K a n a a r R (2001) Curr Biol 11: R229-R2325. F a r k a s G , L e i b o v i t c h B A , E l g i n S C (2000) Gene 253:

117-1366. S u d a r s a n a m P, W i n s t o n F (2000) Trends Genet 16:

345-3507. C h e u n g P, A l l i s C D , S a s s o n e - C o r s i P (2000) Cell

103: 263-2718. V e r b s k y M L , R i c h a r d s E J (2001) Curr Opin Plant Biol 4:

494-5009. M i i l l e r C , L e u t z A (2001) Curr Opin Genet Dev 11: 167-17410. K i n g s t o n R E , N a r l i k a r G J (1999) Genes Dev 13:

2339-235211. C a l i k o w s k i TT (2001) Post Bioch 47: 129-13712. Z h a n g Y, R e i n b e r g D (2001) Genes Dev 15: 2343-236013. B i rd A (2002) Genes Dev 16: 6-2114. J e r z m a n o w s k i A (2002) W: Z 1 a t a n o v a J , L e u b a S H

(red) New Comprehensive Biochemistry, Elsevier, Holland (w dru­ku)

15. K a s i n s k y H E , L e w i s J D , D a c k s J B , A u s i o J (2001) F A SE B J 15: 34-41

16. K h o c h b i n S (2001) Gene: 271: 1-12

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 173http://rcin.org.pl

17. R a m a k r i s h n a n V , F i n c h J T , G r a z i a n o V , L e e P L , S w e e t R M (1993) Nature 362: 219-223

18. L u g e r K , M a d e r A W , R i c h m o n d R K , S a r g e n t D F , R i c h m o n d T J (1997) Nature 389: 251-260

1 9 . Z h o u Y B , G e r c h m a n S E , R a m a k r i s h n a n V, T r a v e r s A, M u y l d e r m a n s S (1998) Nature 395: 402-405

20. T h o m a s J O (1999) Curr Opin Cell Biol 11:312-3172 1 . B e d n a r J , H o r o w i t z R A , G r i g o r y e v S A , C a r r u -

t h e r s L M , H a n s e n J C , K o s t e r A J , W o o d o c k C L (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95: 14173-14178

22. K a r y m o v M A , T o m s c h i k M, L e u b a S H , C a i a f a P, Z l a t a n o v a J (2001) FASEB J. 15: 2631-2641

2 3 . W o o d c o c k C L , D i m i t r o v S (2001) Curr Opin Genet Dev 11: 130-135

24. S h e n X, Y u L, W e i r J W , G o r o v s k y M A (1995) Cell 82: 46-56

25. S h e n X, G o r o v s k y M A (1996) Cell 86: 475-48326. B r o w n D T , A l e x a n d e r B T , S i t t m a n D B (1996)Nuleic

Acid Res 24: 486-49327. T a k a m i Y, N i s h i R , N a k a y a m a T (2000) Biochem

Biophys Res Commun 268: 501-50828. T a k a m i Y, N a k a y a m a T (1997) Genes Cells 2: 711-72329. P a t t e r t o n H G , L a n d e l C C , L a n d s m a n D, P e t e r ­

s o n C L , S i m p s o n R T (1998) J Biol Chem 273:7268-727630. R a m o n A, M u r o - P a s t o r M I , S c a z z o c c h i o C, G o n ­

z a l e z R (2000) M ol Microbiol 35: 223-23331. B a r r a J L , R h o u n i m L , R o s s i g n o l J L , F a u g e r o n G

(2000) M ol Cell Biol 20: 61 -6932. N e r S S , T r a v e r s A A (1994) EMBO J 13: 1817-18223 3 .F a n Y, S i r o t k i n A, R u s s e l l R G , A y a l a J , S k o u l -

t c h i AI (2001) M ol Cell Biol 21: 7933-7943

3 4 . S t e i n b a c h O C , W o l f f e A P , R u p p R A W (1997)Nature 389: 395-399

35. P r y m a k o w s k a - B o s a k M, P r z e w l o k ą M R , I w k i e - w i c z J , E g i e r s z d o r f f S , K u r a s M, C h a u b e t N , G i - g o t C, S p i k e r S, J e r z m a n o w s k i A (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93: 10250-10255

36. P r y m a k o w s k a - B o s a k M, P r z e w l o k ą M R , Ś l u s a r ­c z y k J , K u r a s M, L i c h o t a J , K i l i a n c z y k B, J e r z ­m a n o w s k i A (1999) Plant Cell 11: 2317-2329

37. P r z e w ł o k a M R , W i e r z b i c k i A T , Ś l u s a r c z y k J, K u r a ś M, G r a s s e r K D , S t e m m e r C, J e r z m a n o w ­s k i A (2002) Planta 215: 371-379

38. N a r l i k a r G J , F a n H Y , K i n g s t o n R E (2002) Cell 108: 457-487

39. R o b e r t s S M , W i n s t o n F (1997) Genetics 147: 451-46540. T a m a r u H, S e l k e r E U (2001) Nature 414: 277-28341. R i c h a r d s E J , E l g i n S C R (2002) Cell 108: 489-50042. H e r r e r a J E , W e s t K L , S c h i l t z R L , N a k a t a n i Y,

B u s t i n M (2000) M ol Cell Biol 20: 523-52943. H i l l D A , I m b a l z a n o A N (2000) Biochemistry 39:

11649-1165644. N i e l s e n A L , O u l a d - A b d e l g h a n i M, O r t i z J A ,

R e m b o u t s i k a E, C h a m b o n P, L o s s o n R (2001) Mol Cell 7: 729-739

45. W y r i c k J J , H o l s t e g e F C P , J e n n i n g s E G , C a u s t o n H C , S h o r e D, G r u n s t e i n M, L a n d e r E S , Y o u n g R A (1999) Nature 402: 418-421

46. N a r l i k a r G J , P h e l a n M L , K i n g s t o n R E (2001) Mol Cell 8: 1219-1230

47. Mi s t e l i T , G u n j a n A, H o c k R, B u s t i n M, B r o w n D T (2000) Nature 408: 877-881

48. A u s i o J (2000) Bioessays 22: 873-877

174 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

Prion ffiSY] i jego wpływ na terminację translacji u drożdży Saccharomyces cerevisiae

Prion [P5Y] and its effect on termination of translation inthe yeast Saccharomyces cerevisiae

MAŁGORZATA JAKUBIEC1, MAGDALENA BOGUTA2

Spis treści:

I. WstępII. Odkrycie prionu [PSY]III. Wpływ [PSI] na fizjologię komórkiIV. Indukcja prionu [PSY]

IV-1. Rola domen Sup35 w indukcji [PSY]IV-2. Inne priony wpływające na indukcję [PS1/]IV-3. Białka opiekuńcze a [PS1/]

V. Podsumowanie

Wykaz stosowanych skrótów: Cox2 — białko podjednostki oksydazy cytochromu c drożdży S. cerevisiae; H spl04, Hsp70, Hsp40 — białka opiekuńcze, wpływające na tworzenie i propa­gację prionu [PS1/] u drożdży S. cerevisiae; Nam9 — białko ry­bosomów mitochondrialnych u drożdży S. cerevisiae; N ew l, Rnql — białka, które tworzą priony u drożdży; Pde2 — fosfo- diesteraza cAMP u drożdży S. cerevisiae; [PIN] — prion dro- żdżowy, wpływający na indukcję [AST]; PrP — białko komórko­we ssaków, które ulega przemianie konformacyjnej tworząc prion; [PSI] — prion drożdżowy, zagregowana forma białka Sup35; Sup35 — czynnik terminacji translacji (eRF3) u drożdży S. cerevisiae; Sup45 — czynnik terminacji translacji (eRFl) u drożdży S. cerevisiae\ Ure2 - represor katabolizmu związków azotu u drożdży S. cerevisiae\ [URE3] — prion drożdżowy, za­gregowana forma białka Ure2.

I. Wstęp

Prion ssaczy był początkowo opisany jako pato­genne białko, które powoduje neurodegenerację i śmierć komórki [1]. Obecnie terminem prion określa się niekonwencjonalny, zakaźny czynnik powstający w wyniku zmiany konformacji białka komórkowego PrP, które atakuje mózg ssaków. Zmiana konformacji PrP uważana jes t za proces autokatalityczny, gdyż

’Mgr, 2doc. dr hab, Zakład Genetyki, Instytut Biochemii i Biofi­zyki PAN, ul. Pawińskiego 5a, 02-106 Warszawa, tel. 659 7072 w. 1312, email: magda@ibbrain.ibb.waw.pl

Contents:

I. IntroductionII. [ASY] discoveryIII. The effects of [PSY] on cell physiologyIV. [PSY] induction

IV-1. The role of Sup35 domainsIV-2. Other prions effect the induction of [AST]IV-3. Chaperones and [PSY]

V. Summary

prion jes t zdolny do przekazania swojej konformacji na natywne cząsteczki białka. Jest to reakcja łańcu­chowa, która rozprzestrzenia się w mózgu i pow odu­je degenerację neuronów. Choroby wywołane przez prion u ssaków to: encefalopatia gąbczasta krów (choroba szalonych krów, BSE), scrapie u owiec i muflonów, a u człowieka — zespół Creutzfelda-Ja- coba (CDJ), kuru, choroba Gertsmanna-Straussle- ra-Scheinkera oraz śmiertelna rodzinna bezsenność

[2].Priony, w szerszym sensie oznaczają białka ist­

niejące przynajmniej w dwóch różnych alternatyw­nych, stabilnych konformacjach. Priony zidentyfiko­wano również u grzybów, a ich istnienie objawia się jako cechy fenotypowe, które dziedziczą się nie­zgodnie z prawami Mendla. Priony u grzybów nie prowadzą do śmierci komórki, ale są elementem dziedzicznym, w ażnym w regulacji procesów ko­mórkowych i potencjalnie w ażnym w ewolucji. N a j­lepiej scharakteryzowano priony [PSI] i [URE3] u drożdży Saccharom yces cerevisiae [3]. [URE3] jest formą konform acyjną białka Ure2 — negatywnego regulatora w metabolizmie azotu. [PSI] jes t alterna­tywną form ą konform acyjną białka Sup35 — czynni­ka terminacji translacji. Priony [PÓ7] i [URE3] m o­żna wyeliminować z komórek drożdży w wyniku traktowania chlorowodorkiem guanidyny (GuHCl) dodanym do pożywki w niskim stężeniu. Po przenie­sieniu takich komórek na pożyw kę bez GuHCl, agre­

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 175http://rcin.org.pl

gaty prionu tworzą się ponownie w wyniku nadpro­dukcji odpowiednio Sup35 i Ure2. Białka opiekuń­cze, szczególnie H sp l04 , b iorą udział w tworzeniu prionu. Wiadomości ogólne o prionach u drożdży S. cerevisiae zostały zamieszczone poprzednio na łamach „Postępów Biochem ii” w artykule pt. „Prio- ny u drożdży i grzybów nitkowatych” [4].

Mechanizm dziedziczenia [PST] i [URE3] polega prawdopodobnie na propagacji określonej konfor­macji białka komórkowego. Zarówno drożdżowe jak i ssacze priony to nierozpuszczalne, oporne na prote- azy agregaty, przyjmujące strukturę (3-kartki. Spon­tanicznemu przejściu aktywnych białek do formy prionu zachodzącemu z niską częstotliwością (10"5- 10‘7), tow arzyszą zmiany fenotypowe. Zapro­ponowano różne modele tworzenia prionu. Najbar­dziej zgodny z wynikami doświadczalnymi model zakłada, że priony są regularnymi polimerami służącymi jako „zarodki” do polimeryzacji [5]. Agregaty prionów służą jako „zarodki” do rozm na­żania, czyli propagacji prionów i są dziedziczone przez cytoplazmę. „Zarodki” powodują przemianę nowo zsyntetyzowanych białek Sup35 i Ure2 w prion. Analogiczny m echanizm zaproponowano dla przemiany komórkowego PrP do prionu u ssaków. Natura i specyfika „zarodków” jes t obecnie tematem dyskusji na łamach wiodących czasopism nauko­wych [6, 7].

Tworzenie agregatów prionu zależy od domen białkowych bogatych w glutaminę i asparaginę, zw a­nych domenami prionowymi [8]. Przyłączenie do­meny prionu może nadawać innemu białku zdolność do agregacji [9].

Przemiany konformacyjne Sup35 i Ure2 zaobser­wowano także in vitro. Białka Sup35 i Ure2 syntety­zowane w E. coli i przetrzym ywane w roztworze tworzą bardzo regularne agregaty w postaci włókien amyloidowych. Szybkość powstawania włókien dra­stycznie wzrasta po dodaniu wcześniej utworzonych agregatów [3, 10].

II. Odkrycie [P*S7]

Supresja mutacji nonsens jes t m ożliwa w szcze­pach drożdżowych ze zm utowanym tRNA, zdolnym do odczytania kodonów stop: UAA, UAG czy UGA. [P57] był odkryty przez B r i a n a C o x a w 1965 r., jako czynnik dziedziczenia nie związany z chromo- somalnym DNA drożdży, który zwiększa wydajność odczytywania kodonów stop przez supresorowe tRNA. [Pis'/] um ożliwia również słabą supresję non­sens w szczepie pozbawionym supresorowego tRNA[11]. Forma [PSI] dziedziczy się w sposób dom i­

nujący i niezgodny z prawami Mendla, tj. segreguje w potomstwie m ejotycznym 4:0. Próby powiązania czynnika [-P5Y] z pozachrom osom alnym DNA były nieudane [12].

Oprócz zmutowanego tRNA, również mutacje w genach kodujących białka rybosomalne i czynniki translacyjne są odpowiedzialne za wierność procesu translacji [13]. W latach 60-tych wyizolowano i scharakteryzowano recesywne mutanty supresorowe sup35 i sup45 [14]. Geny SU P35 i SU P45 były na­stępnie klonowane i wykazano, że są one niezbędne do życia komórki. W ostatnim czasie stwierdzono, że białka Sup35 i Sup45 są czynnikami terminacji trans­lacji [15]. Sup45 (eR F l) jes t odpowiedzialny za roz­poznawanie kodonu stop w m RNA i za uwalnianie peptydów z rybosomu po zakończeniu jego syntezy. Sup35 jes t drożdżowym homologiem czynnika euka­riotycznego eRF3, który jes t G TP-azą i funkcjonuje razem z Sup45 [16].

Niezależne eksperymenty wykazały, że mutacja P N M zlokalizowana w genie SU P35, eliminuje zdol­ność do tworzenia [PSI] [17, 18]. Wyjaśnienie tego zjawiska było możliwe dzięki skojarzeniu przez R e ­e d a W i c k n e r a prionu PrP i czynnika [PSI] [19]. Zgodnie ze sformułowaną przez niego hipotezą, [PSI] jes t formą konformacją Sup35. Do utworzenia prionu [T\S7] konieczne jes t natywne, niezmutowane białko Sup35. Występowanie Sup35 w formie zagre­gowanej jako prion [PSY], powoduje defekt w termi­nacji translacji i supresję kodonów stop. Tak więc, [PSI] pozwala na regulację terminacji.

III. Wpływ [P57] na fizjologię komórki

[PST] obniżając wierność terminacji translacji, może mieć wpływ na morfologię, jak również m ody­fikuje metabolizm komórki [20]. Tworzenie nowych fenotypów związanych z indukcją prionu stanowi nowy, ewolucyjnie ważny mechanizm dziedziczenia, który może ułatwić adaptację komórek drożdży do wzrostu i rozwoju w zmieniających się warunkach środowiska. W szczególnych przypadkach obniżenie wydajności terminacji zależne od [PÓ7] może posłużyć do tworzenia polipeptydów wydłużonych od C-końca, co prowadzi do zmiany funkcji i lokali­zacji powstałych białek. Obecność wydłużonego białka lub zmniejszenie poziomu produktu białka „normalnego” może w istotny sposób wpłynąć na funkcję komórki. Poniżej przedstawione zostaną konkretne przykłady takich efektów.

Głównym parametrem wpływającym na wydajną terminację jes t lokalna sekwencja otaczająca kodon stop. Analiza statystyczna genów z różnych organi­

176 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

zmów wskazuje, że sekwencje otaczające kodonu stop nie są przypadkowe [21]. Określony kontekst nukleotydów wokół kodonu stop może umożliwić odczyt takiego kodonu jako sensowny [22, 23]. Po­ziom błędności odczytu kodonu stop jest dodatkowo zwiększony w obecności prionu [PS/]. Ostatnio stwierdzono, że w szczepach zawierających prion [PS/] rzeczywiście pewne białka są syntetyzowane w formie wydłużonej od C-końca. Przykładem jest białko Pde2, które jes t fosfodiesterazą cAMP, działającą globalnie na fizjologię komórki [24]. W komórkach zawierających [PS/] zaobserwowano dwudziestokrotny wzrost poziomu odczytu kodonu stop w mRNA PD E2 jako sensowny. Mylny odczyt wpłynął na syntezę dłuższej formy białka Pde2 o zmienionej funkcji wskutek dodatkowej sekwencji na C-końcu [24]. Ekspresję dłuższej formy Pde2 stwierdzono w 25% komórek w szczepie zawie­rającym [PSI] (Ryc. 1). Dłuższa forma Pde2 nie jest

Zaobserwowano, że prion [PS/] wpływa na funk­cje mitochondrialnych białek rybosomalnych. Przykładem jest Nam9, białko małej podjednostki rybosomu mitochondrialego [26]. M utacja punktowa w genie N AM 9 nazywana n a m 9 -l, powoduje zakłócenia w translacji genów kodowanych w mito- chondriach, a w następstwie defekt oddechowy dro­żdży. Zastosowanie metod biochemicznych pozw o­liło na sprecyzowanie przyczyny defektu oddecho­wego n a m 9 -l jako zależnej od [AST] niestabilności białek syntetyzowanych przez rybosomy mitochon- drialne, posiadające zmienione białko Nam9. Poka­zano to bezpośrednio na przykładzie białka Cox2, podjednostki oksydazy cytochromu c. Obniżona sta­bilność prowadziła do degradacji Cox2 i znacznego obniżenia poziomu innych białek syntetyzowanych w mitochondriach. Analiza genetyczna szczepu z m utacją n a m 9 -l potwierdziła rolę prionu [PS/] jako czynnika odpowiedzialnego za n iekom petencję od-

75%

25%nieaktywne białko Pde2

idegradacja w cytoplazm ie

R yc.l. Wpływ [PS/] na ekspresję genu PDE2

aktywna w hydrolizie cAMP i ulega degradacji w cy­toplazmie. W konsekwencji w komórkach zawie­rających [PS/] hydroliza cAMP jest ograniczona, co powoduje dwukrotny wzrost poziom u cAMP. cAMP reguluje wiele funkcji w komórce, stąd tak znaczna zmiana jego poziomu może mieć związek z różnymi fenotypami powodowanymi przez [PS/] [25].

dechową i niestabilność Cox2. Jest to pierwszy, po ­znany dotychczas przykład wpływu [PS/] na funk­cjonowanie mitochondriów [27] (Ryc. 2).

Opisane zależności kompetencji oddechowej ko ­mórki drożdży od prionu [PS/] sugerują istnienie specyficznych powiązań pomiędzy translacją cyto- p lazm atyczną i translacją m itochondrialną lub/i wy-

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 177http://rcin.org.pl

prion [PS/] luzpuszczdiiidforma Sup35

aktywne białko X ***

lîmitochondria

Ryc. 2. Hipotetyczny model wpływu [PSI] na funkcję mitochondriów. Zagregowane białko Sup35 (prion [PS/]) umożliwia kontynuację translacji mimo kodonu stop w mRNA białka X. Białko X, którego ekspresja zależałaby od [PS/] importowane do mitochondriów, mogłoby stanowić przekaźnik między prionem a funkcją oddechową komórki.

darzeniami post-translacyjnymi, prowadzącymi do włączenia Cox2 w w ew nętrzną błonę mitochon- drialną i kompleks oksydazy cytochromowej [27].

IV. Indukcja [P57j

IV-1. Rola domen Sup35

Sup35 jes t drożdżowym homologiem czynnika terminacji translacji eRF3. Białko to ma budowę do­menową [28]. Domena C Sup35 (od 254 do 685-ami- nokwasu białka Sup35) jes t odpowiedzialna za ter- minację translacji i warunkuje wzrost. Sekwencja domeny C konserwowanej w ewolucji, jes t hom olo­giczna do czynnika elongacji translacji ( E F l - a ) i za­wiera cztery miejsca wiążące GTP [29]. W odróżnie­niu, domena N a także środkowa domena białka (N i M, do 253 aminokwasu) nie jes t ważna z punktu w i­dzenia wzrostu i ewolucji [30]. Domena M o niezna­nej funkcji, jest łącznikiem domeny N i C. Domena N, złożona z 113 am inokwasów jest odpowiedzialna za tworzenie [PS/] [18]. Co więcej, nadekspresja do­meny N jes t wystarczająca do indukcji [PS/] [31]. Zaobserwowano wzajemne oddziaływania między domenami. Delecja określonego fragmentu domeny C białka Sup35 powoduje wzrost wydajności tworze­nia prionu przez domenę N [32]. N-terminalna dom e­na jes t bogata w glutaminę i asparaginę i zawiera czterokrotnie powtarzający się układ dziewięciu aminokwasów PQ G GY QQYN. Delecja tych se­kwencji powodowała zmniejszenie częstości po­wstawania komórek [PSY], zaś wprowadzenie dodat­kowych traktów zwiększenie tej częstości, połączo­ne ze zwiększeniem szybkości tworzenia agregatów prionu [33]. Fuzja domeny N z GFP (białko fluory­

zujące zielonym światłem) powodowała agregację hybrydu Sup35-GFP, co było m onitorowane z uży ­ciem mikroskopu fluorescencyjnego. Domena N od­grywa także k luczow ą rolę w konwersj i białka Sup3 5 do formy prionu [PSY] w warunkach in vitro [31]. Tak więc, domena N białka Sup35 jes t decydująca w regulacji wydajności terminacji translacji zależnej od [PSY] [30].

IV-2. Inne priony wpływające na indukcję [PSI]

[PS/] może być indukowane w określonych, lecz nie wszystkich szczepach drożdżowych. Wykazano, że kolejny prion, nazwany [PIN] dziedziczący się niezgodnie z prawami Mendla, jes t potrzebny do in­dukcji prionu [PS/] [34]. [PIN] jest konieczny do spontanicznej indukcji [PS/], jak również do induk­cji [PS/] przez nadmiar białka Sup35, ale nie jes t po ­trzebny w propagacji [PS/] (Ryc. 3). [PS/] może być przekazywany wraz z cytoplazmą do komórki p o ­tomnej w obecności i nieobecności [PIN] [35], [PIN] scharakteryzowano jako prion, ponieważ znika wskutek traktowania komórek GuHCl i może poja­wiać się de novo po usunięciu GuHCl [35]. Nie zaob­serwowano bezpośredniego związku [PIN] z białkiem Sup35. W wyniku klonowania [PPV] otrzy­mano różne geny z prionow ą domeną, co sugeruje, że więcej niż jeden prion wpływa na fenotyp [PIN] [7]. Niezależnie, stosując metody komputerowe, ziden­tyfikowano białka drożdżowe, które zawierają do­meny bogate w glutaminę i asparaginę, a także w yka­zują podobieństwo do domeny N białka Sup35. Jed­nak tylko niektóre agregaty bogate w glutaminę i asparaginę powodują cechę [PIN] czyli są zdolne do indukcji [PS/]. Wykazano, że fenotyp [PIN] wiąże

178 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

♦ ♦

Sup35-N domena [P/A]-Newl, R nql, Ure2 Hsp70-Ssal

indukcja [PSI]

^Hsp70-Ssal

H spl04 propagacja [PSI]

,zarodki” piionu

rozpuszczalna forma Sup35 prion [PS/]

Hsp 104 T GuHCl H sp 7 0 -S sb l t

eliminacja [PSI]

Ryc. 3. Udział białek opiekuńczych w tworzeniu i degradacji prionu [T\S7]

się z agregacją białek: R n q l , Ure2 i N e w l. N ato­miast analogiczna domena białka P an i , bogata w glutaminę i asparaginę, nie powodowała indukcji [PSI] [6].

Dziewięć innych genów niosących domeny prio­nu jest także potencjalnie odpowiedzialna za fenotyp [PIN]. Takie obserwacje wskazują na powszechnie istniejący mechanizm kaskadowej indukcji prionu [T\SY] przez inne priony [7].

Funkcje komórkowe białek R nql i N ew l są nie­znane, ponieważ inaktywacja genów RNQ J i NEW1 nie daje widocznego efektu fenotypowego. Obydwa białka mają domeny prionu bogate w glutaminę i asparaginę. W wyniku fuzji domeny N białek N ew l i R nql z dom enąC białka Sup35 obserwowano induk­cje [PSY] [36]. Białko R nql spełnia in vivo wszystkie kryteria prionu [37], Fuzja domeny C prionu R nql z GFP powoduje zależną od Hsp 104 agregację hybry­du R nq l-G F P [37], Agregaty R nql dziedziczą się w sposób niezgodny z prawami M endla i korelują z in­dukcją fenotypu [P/A7] [7]. Ponadto, obecność białka R nql w szczepie biorcy jes t konieczna do powstania [PIN].

IV-3. Białka opiekuńcze a [PSI]

Zastosowanie metod genetycznych umożliwiło wykrycie białek opiekuńczych, które kontrolują zw i­jan ie białek. Udział białek opiekuńczych w pow sta­waniu [PS/] jest zrozumiały, gdyż właśnie proces zwijania białka towarzyszy tworzeniu prionu. Propa­gacja [PS/] jest możliwa dzięki białkom: Hsp 104,

Hsp70 i Hsp40 [38]. H sp l0 4 pełni k luczową rolę w dziedziczeniu [PS/]. W utrzymaniu stabilnej konfor­macji prionu wymagana jest określona ilość tego białka. Białko Hsp 104 jes t także odpowiedzialne za przenoszenie prionów [URE3], [PIN] i R nql do ko­mórek potomnych [34,37,39]. Wśród znanych prio­nów drożdżowych tylko nowo wykryty prion [ISP] wydaje się być niezależny od H sp l0 4 [40]. H sp l0 4 nie jes t konieczne do normalnego wzrostu, ale jes t potrzebne do reaktywacji komórek po stresie [41]. Nadekspresja, jak również brak białka Hsp 104, pro­wadzi do eliminacji prionu [PS/] z drożdży.

Zaproponowano dwa alternatywne modele inter­pretujące udział Hsp 104 w powstawaniu prionu. Według modelu wcześniejszego, Hsp 104 oddziałuje bezpośrednio z Sup35 tworząc konformację przejś­ciową, która służy jako substrat do formowania prio­nu [42], Drugi model zakłada, że Hsp 104 jes t nie­zbędny w propagacji prionu i tworzeniu „zarodków” prionu [30]. Model ten był potwierdzony przez szczegółową analizę eksperymentalną wyników roz­padu prionu po inaktywacji Hsp 104. Obniżenie po­ziomu lub aktywności Hsp 104 i wzrost rozmiaru agregatu prionu prowadzi do akumulacji dużych aglomeratów, które w nieobecności Hsp 104 nie są przekazywane do kom órek potomnych i w ten spo­sób eliminowane z populacji. Hsp 104 wydaje się więc być niezbędny do rozpadu agregatów i tworze­nia „zarodków ”, które są przenoszone do komórki potomnej i zapoczątkowują w niej propagację prionu [43]. Wynik ten wskazuje na zasadniczą funkcję Hsp 104 w propagacji prionu.

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 179http://rcin.org.pl

W przemianach konformacyjnych prionu [PS/] u drożdży oprócz H sp l04 , uczestniczą białka z rodzi­ny Hsp70: H sp70-Ssal i H sp 7 0 -S sb l . Ssał jes t indu­kowane w warunkach stresowych, podczas gdy Ssbl jes t związane z rybosomami, a jego ekspresja jest ha­mowana w warunkach stresowych. Wpływ Hsp70-Ssal na propagację [PSI] jes t przeciwny do efektu H sp l04 . Zgodnie z aktualnym stanem wiedzy, Ssał sprzyja gromadzeniu nowych agregatów i pro­pagacji [PSr\ [43]. N admiar Ssał zapobiega elimina­cji [PSi\ przez nadekspresję H sp l0 4 [44]. Mutacja w genie SSA1 prowadzi do obniżenia stabilności [PS/] [45]. Przeciwnie, nadprodukcja H sp70-Ssbl sprzyja eliminacji [PS/] [46] i powoduje zwiększenie sku­teczności eliminacji prionu przez nadmiar H sp l0 4 [47]. Inaktywacja H sp70-Ssbl prowadzi do wzrostu indukcji [PS/]. Prawdopodobnie Ssbl wpływa na [PS/], jako białko kontrolujące konformację, które przeciwdziała n iewłaściwemu zwijaniu Sup35 [47].

Dotychczasowe badania pozw alają na identyfika­cję H sp l0 4 i Hsp70-Ssbl jako białek zdolnych do eliminacji prionu [PS/]. Dokładna analiza eliminacji prionu z komórek drożdży jes t szczególnie przydatna do badań prionów ssaczych, które m ogą być aktyw­nie leczone w podobnych warunkach. Jednak nie stwierdzono istnienia hom ołogów H sp l0 4 u takich organizmów wyższych jak nicienie i muszka owoco­wa. Wiadomo natomiast, że białko Hsp70-Ssbl jes t homologiczne w 61% do białka obecnego w kom ór­kach ludzkich.

V. Podsumowanie

Obecność prionu [PS/] modyfikuje terminację translacji powodując zmianę funkcji wybranych białek i określonych cech fenotypowych. Ponieważ zmiany te są dziedziczne, [PS/] może być traktowany jako nowy epigenetyczny m echanizm dziedziczenia. Mechanizm ten jest kontrolowany na różnych pozio­mach. Zdolność tworzenia [PS/] jes t zależna od obecności i udziału komórkowej domeny prio- nu-Sup35. Indukcja [PS/] jes t również modulowana przez inne czynniki komórkowe: kodowane chromo- somalnie białka opiekuńcze oraz kolejny prion ko­mórkowy zwany [PIN]. Prawdopodobnie w regula­cję indukcji [PS/] są zaangażowane także inne proce­sy, jednak zrozumienie tego zagadnienia wydaje się być odległe.

Podziękowania

Dziękujemy Pani doc. Teresie Żołądek za krytyczne uwagi pomocne przy pisaniu pracy.

Praca została zrealizowana w ramach grantu KBN 3 P 0 4 A 03922 oraz grantu Polsko-Francuskiego Centrum Biotechnologii Roślin.

A rty ku ł o trzym ano 25 lutego 2002 Z aakcep tow ano do druku 13 czerw ca 2002

Piśmiennictwo

1. P r u s i n e r S B , S c o t t M R , D e A r m o n d S J , C o h e n F E (1998) Celi 93: 337-348

2. H o r w i c h A L , W e i s s m a n J S (1997) Celi 89: 499-5103. W i c k n e r R B , T a y l o r K L , E d s k e s H K , M a d d e l e i n

M L , M o r i y a m a H , Roberts B T (1999) Microbiol Mol Biol Rev 63: 844-861

4. B o g u t a (2000) Postępy Biochemii 46(2): 108-1155. S e r i o T R , C a s h i k a r A G , K o w a l A S , S a w i c k i G J ,

M o s l e h i J J , S e r p e l l L, A r n s d o r f M F , L i n d q u i s t SL(2000) Science 289: 1317-1321

6. O s h e r o v i c h L Z , W e i s s m a n J S (2001) Celi 106: 183-1947. D e r k a t c h I L , B r a d l e y M E , H o n g J Y , L i e b m a n S W

(2001) Celi 106: 171-1828. D e P a c e A H , S a n t o s o A, H i l l n e r P , W e i s s m a n J S

(1998) Celi 93:1241-12529. T u i t e M F (2000) Celi 100: 289-29210. G l o v e r J R , K o w a l A S , S c h i r m e r E C , P a t i n o M M ,

L i u J J , L i n d q u i s t S L (1997) Cell 89: 811-81911. C o x B S , T u i t e M F , M c L a u g h i n C S (1988) Yeast 4:

159-17812. W i c k n e r R B , M a s i s o n D C , E d s k e s H K (1995) Yeast 11:

1671-168513. L i e b m a n S W , C h e r n o f f Y O , L i u R (1995) Blochem Celi

Biol 73: 1141-114914. I n g e - V e c h t o m o v S G , A d r i a n o v a M V (1970) Genetika

6:103-11515. S t a n s f i e l d I, J o n e s K M , K u s h n i r o v W , D a g k e s a m

a n s k a y a A R , P o z n y a k o v s k i A l , P a u s k h i n S V, N i e r a s C R , C o x B S , T e r - A v a n e s y a n M D , T u i t e MF(1995) E M B O J 14: 4365-4373

16. Z h o u r a v l e v a G, F r o l o v a L, G o f f X L , G u e l l e c R L , I n g e - V e c h t o m o v S G , K i s e l e v L, P h i l i p p e M (1995) E M B O J U : 4065-4072

17. D o e l S M , M c C r e a d y S J , N i e r a s C R , C o x B S (1994) Genetics 137: 659-670

18. T e r - A v a n e s y a n M D , D a g k e s a m a n s k a y a A R , K u s h ­n i r o v V V , S m i r n o v V N (1994) Genetics 137: 671-676

19. W i c k n e r R B (1994) Science 264: 566-56920. T r u e H L , L i n d q u i s t S L (2000) Nature 407: 477-4832 1 . B r o w n C M , D a l p h i n M E , S t o c k w e l l P A , T a t e W P

(1993) Nucleic Acids Res 21: 3119-31232 2 . B o n e t t i B , F u L, M o o n J , B e d w e l l D M (1995) JM o l

Biol 251: 334-3452 3 . M o t t a g u - T a b a r S, T u i t e M F , I s a k s s o n L A (1998)E ur

J Blochem 257: 249-25424. N a m y O , H a t i n I , R o u s s e t J P (2001) EMBO Rep 2:

787-7932 5 . N a m y O, D u c h a t e a u - N g u y e n G M , R o u s s e J P (2002)

M ol Microbiol, in press.26. B o g u t a M, D m o c h o w s k a A, B o r s u k P, W r ó b e l K,

G a r g o u r i A, Ł a z o w s k a J , S ł o n i m s k i P P , S z c z ę ś ­n i a k B, K r u s z e w s k a A (1992J Mol Celi Biol 12(1): 402-412

27. C h a c i ń s k a A , B o g u t a M, K r z e w s k a J , R o s p e r t S(2000) M ol Celi Biol 20: 7220-7229

28. T e r - A v a n e s y a n M D , K u s h n i r o v W , D a g k e s a m a n s k a y a A R , D I d l c h e n k o S A , C h e r n o f f Y O , I n g e - V e c h t o m o v S G , S m i r n o v V N (1993) M ol Microbiol 7: 683-6929

29. K u s h n i r o v V V , T e r - A v a n e s y a n M D , T e l c k o v M V , S u r g u c h o v A P , S m i r n o v V N , I n g e - V e c h t o m o v S G (1988) Gene 66: 45-54

180 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

30. K u s h n i r o v VV, T e r - A v a n e s y a n M D (1998) Cell 94: 13-16

3 1 . P a u s h k i n S V , K u s h n i r o v V V , S m i r n o v V N , T e r - A v a n e s y a n M D (1997) M ol Cell Biol 17: 2798-2805

32. K o c h n e v a - P e r v u k h o v a N V , P o z n y a k o v s k i A I , S m i r n o v V N , T e r - A v a n e s y a n M D (1998) Curr Genet 34: 146-151

33. L i u J J , L i n d q u i s t S (1999) Nature 400: 573-57634. D e r k a t c h I L , B r a d l e y M E , Z h o u P, C h e r n o f f Y O ,

L i e b m a n S W (1997) Genetics 147: 507-51935. D e r k a t c h I L , B r a d l e y M E , M a s s e S V , Z a d o r s k y

SP, P o l o z k o v G V , I n g e - V e c h t o m o v S G , L i e b m a n S W (2000) EMBO J 19: 1942-1952

36. M i c h e l i t s c h M D , W e i s s m a n J S (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97: 11910-11915

37. S o n d h e i m e r N , L i n d q u i s t S (2000) M ol Cell 5: 163-17238. K u s h n i r o v V V , K r y n d u s h k i n D S , B o g u t a M, S m i r ­

n o v V N , T e r - A v a n e s y a n M D (2000) Curr Biol 10: 1443-1446

39. M o r i y a m a H, E d s k e s H K , W i c k n e r R B (2000) M ol Cell Biol 20: 8916-8922

40. V o l k o v K V , A k s e n o v a A Y , S o o m M J , O s i p o v K V , S v i t i n A V , K u r i s c h k o C, S h k u n d i n e I S , T e r - A v a n ­e s y a n M D , I n g e - V e c h t o m o v S G , M i r o n o v a L N(2002) Genetics 160(1): 25-36

41. P a r s e 11 D A , K o w a l A S , S i n g e r M A , L i n d q u i s t S(1994) Nature 372: 475-478

42. C h e r n o f f Y O , L i n d q u i s t S L , O n o B, I n g e - V e c h t o ­m o v S G , L i e b m a n S W (1995) Science 268: 880-884

43. W ę g r z y n R D , B a p a t K, N e w n a m G P , Z i n k A D , C h e ­r n o f f Y O (2001) M ol Cell Biol 21: 4656-4669

44. N e w n a m G P , W ę g r z y n R D , L i n d q u i s t S L , C h e r n o f f Y O (1999) M ol Cell B iol 19: 1325-1333

45. J u n g G, J o n e s G, W ę g r z y n R D , M a s i s o n D C (2000) Genetics 156: 559-570

46. C h a c i ń s k a A, S z c z ę ś n i a k B, K o c h n e v a - P e r u k o v a N, K u s h n i r o v V, T e r - A v a n e s y a n M D , B o g u t a M(2001) Curr Genet 39: 62-67

47. C h e r n o f f Y O , N e w n a m G P , K u m a r J , A l l e n K, Z i n k A D (1999) M ol Cell Biol 19: 8103-9112

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 181http://rcin.org.pl

Wyciszanie ekspresji genów i nowe narzędzia biologii molekularnej roślin

Gene silencing and new tools in plant molecular biology

MAREK KOTER1, JACEK HENNIG2

Spis treści:

I. W stępII. Kosupresja

III-l.P otranskrypcyjne w yciszanie genów (ang. Post- Transcriptional Gene Silencing)

III-2. Przykłady praktycznego zastosowania w yciszania genów indukow anego przez infekcję w irusa (ang. Virus Induced Gene Silencing)

IV. W irusowe supresory potranskrypcyjnego wyciszania genów

V. Am plikonyV -l. Am plikony, a wysoce w ydajna ekspresja transge-

nów w roślinachVI. Uwagi końcowe

W ykaz stosowanych skrótów: CaMV (ang. cauliflower mosaic virus); chs — syntaza chalkonowa (ang. chalcone syntase); CP — wirusowe białko płaszcza (ang. coat protein); GFP — zielone białko fluoryzujące (ang. Green Fluorescent Protein); GUS — P-glukuronidaza; Hc-Pro — proteaza (ang. Helper compo- nent-Protease); LAS — miejscowe wyciszenie ekspresji genu (ang. Localised Acquired Silencing); Nia — gen reduktazy azo­tanowej; PDS — desaturaza fitoenowa (ang. phytoene desatu- rase); PTGS — potranskrypcyjne wyciszanie ekspresji genów (ang. Post-Transcriptional Gene Silencing); PVX (ang. potato virus X); PVY (ang. potato virus F); RYMV (ang. rice yellow mottle sobemovirus); SAS — systemowe wyciszenie ekspresji genu (ang. Systemie Acquired Silencing); TBRV (ang. tomato black ring nepovirus); TBSV (ang. tomato bushy stunt tombu- svirus); TEV (ang. tobacco etch potyyirus); TEV (ang. tobacco etch virus); TGS — transkrypcyjne wyciszanie ekspresji genów (ang. Transcriptional Gene Silencing); TMV (ang. tobacco mosaic tobamovirus); TRSV (ang. tomato ringspot nepovirus); TRV (ang. tobacco rattle virus); uidA — gen (3-glukuronidazy; UTR — region nie ulegający transkrypcji (ang. untranscribed region); VIGS — indukowane przez wirus wyciszanie ekspresji genowej (ang. Virus 1nduced Gene Silencing).

'D r ,2 Doc. dr hab., Zakład Biochemii Roślin, Instytut Bioche­mii i Biofizyki PAN, ul. A. Pawińskiego 5A, 02-106 Warszawa, e-mail: 1 koterm@ megapolis.pl,2 jacekh@ibb.waw.pl

Contents:

I. IntroductionII. Cosuppression

III-l. Post-Transcriptional Gene Silencing III-2. Practical applications o f Virus Induced Gene Si­

lencingIV. Viral Suppressors o f Post-Transcriptional Gene

SilencingV. A m plicons

V -l. Am plicons and high level transgene expression in plants

VI. Final remarks

I. Wstęp

Opracowanie technik transformacji genetycznej roślin umożliwiło nowe podejście do genetyki, fizjo­logii a także biotechnologii tej grupy organizmów. W Stanach Zjednoczonych w 1999 roku ponad 40% ku­kurydzy, 50% bawełny i 45% soi pochodziło z od­mian transgenicznych, charakteryzujących się w ię­kszą odpornością na choroby łub ulepszoną w arto­ścią odżyw czą niż odmiany otrzymane w wyniku tra­dycyjnych krzyżówek [1]. Postuluje się, że zm odyfi­kowane genetycznie rośliny m ogą również stać się wygodnymi i tanimi bioreaktorami do syntezy sub­stancji mających zastosowanie w różnych dziedzi­nach życia. Chociaż z metodycznego punktu w idze­nia transformacja roślin jes t dobrze opracowana, często poziom ekspresji transgenu jes t zmienny w różnych liniach roślin transgenicznych [2]. Nie jest też łatwo uzyskać wydajne i stabilne wyrażanie w prowadzonych do roślin genów ze względu na czę­ste wyciszanie ich ekspresji (ang. gene silencing ). Proces ten można podzielić na dwie grupy: wycisza­nie na etapie transkrypcyjnym oraz potranskrypcyj- nym (ang. PTGS). W ostatnich latach potranskryp­cyjne wyciszanie genów w ykorzystano dla o trzym a­nia roślin odpornych na infekcje wirusowe oraz dla badania funkcji nieznanych genów roślinnych. W

182 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

tym artykule ze względu na obszerność tematu ogra­niczymy się do opisania zjawisk związanych z PTGS. Om ówione zostaną również amplikony, nowe obiecujące narzędzie biologii molekularnej roślin, pozwalające na identyfikację funkcji genów oraz na tworzenie wysoce wydajnego systemu do nadpro­dukcji białek w roślinach.

II. Kosupresja

H omologiczne wyciszanie ekspresji genów zaob­serwowano po raz pierwszy podczas doświadczeń, mających na celu zwiększenie intensywności barwy kwiatów petunii Petunia hybrida [3, 4]. Ekspery­menty te polegały na transformacji roślin dodatko­wymi kopiami genu syntazy chalkonowej (chs), en­zymu ze szlaku syntezy antocyjanów odpowiedzial­nego za zabarwienie kwiatów. Przeciwnie jednak do założeń doświadczenia, otrzymane rośliny charakte­ryzowały się kwiatami biało nakrapianymi lub j e d ­nolicie białymi, a oznaczenia poziomu mRNA synta­zy chalkonowej w transformantach wykazały niski poziom w porównaniu do m RNA uzyskanego z ro ­ślin kontrolnych. Tak więc wprowadzenie transgenu przyczyniło się do redukcji jego ekspresji oraz endo­gennej syntazy chalkonowej w transformowanych roślinach. Zjawisko to nazwano kosupresją [5]. Nasunęło się w związku z tym pytanie, czy niski po­ziom transkryptu jes t rezultatem zmniejszonej synte­zy czy zwiększonej degradacji mRNA.

Dalsze badania pozwalające na odróżnienie ak­tywności syntetyzowanego de novo mRNA na m atry­cy DNA od całkowitego poziomu mRNA w komórce (ang. , ,ru n -o n ” experim ents) wykazały identyczną aktywność syntezy m RNA w obydwu obszarach kwiatów. A więc niski poziom lub brak mRNA synta­zy chalkonowej w białych sektorach kwiatów jest wynikiem specyficznej degradacji [6, 7].

III-l. Potranskrypcyjne wyciszanie genów(ang. Post-Transcriptional Gene Silencing)

Interesujące obserwacje przeprowadzono podczas badań linii transgenicznego tytoniu N icotiana taba- cum wyrażającego gen białka płaszcza wirusa TEV (ang. tobacco etch virus) [8, 9]. Po zainfekowaniu ro­ślin wirusem TEV początkowo obserwowano wszystkie typowe objawy zakażenia, jednakże w miarę wzrostu roślin pojawiały się młode zdrowe liś­cie, które w ykazywały odporność na ponow ną infek­cję przez TEV. Proces ten nazwano ,,ozdrowieniem” (ang. recovery). Hybrydyzacyjna analiza poziomu m RNA dla białka płaszcza TEV w liściach przed za­

każeniem i po zaniku objawów infekcji, wykazała ni­ski poziom transkryptu w młodych liściach, na któ­rych nie zaobserwowano objawów infekcji w iruso­wej. Ponieważ brak m RN A może świadczyć o jego degradacji lub też braku transkrypcji, wykonano do­świadczenia „ run-on” [8] pozwalające stwierdzić, czy na matrycy DNA następuje synteza mRNA de novo. W ykazały one, że zarówno w liściach z ob­jaw am i infekcji wirusowej jak też w młodych liś­ciach roślin, u których zanikły objawy porażenia, gen białka płaszcza wirusa TEV ulegał transkrypcji, a wydajność syntezy jego m RNA była w obydwu przypadkach identyczna. Tak więc wyniki ekspery­mentów świadczą o tym, że w roślinach z fenotypem „recovery” nastąpiła specyficzna degradacja w iruso­wego RNA. Jednak, pomimo że rośliny uzyskały od­porność na TEV, były nadal wrażliwe na infekcje po­krewnym wirusem ziemniaka Y (PVY). Świadczy to o dużej specyficzności zjawiska, które nazwano po- transkrypcyjnym wyciszaniem genów (ang. Post Transcriptional Gene Silencing, PTGS).

Obecność transgenu nie jes t warunkiem niezbęd­nym dla wyciszenia ekspresji genu [9]. Infekcja tyto­niu N icotiana clevelandii szczepu W22 wirusem TBRV (ang. tom ato black ring nepovirus) pow odo­wała silne objawy porażenia na liściach. Jednakże liście, które rozwinęły się po inokulacji były wolne od jakichkolwiek objawów porażenia oraz w ykazy­wały odporność na powtórne zakażenie tym wirusem na skutek degradacji w irusowego RNA [9]. Ponadto roślin tych nie infekował specjalnie zmodyfikowany wirus PVX, jednak pod warunkiem, że do jego geno­mu włączono odcinek RNA wirusa TBRV szczepu W 22 [9]. Otrzymana w ten sposób odporność jest wysoce specyficzna wobec zakażającego wirusa: ro ­śliny inokulowane spokrewnionym wirusem TRSV (ang. tomato ringspot nepovirus) lub PVX w ykazy­wały silne objawy porażenia. Na podstawie tego typu doświadczeń wysunięto hipotezę, że infekcja w iru­sem może indukować naturalną odporność roślin po­legającą na wysoce specyficznym degradowaniu ob­cego RNA [9].

Do indukcji odporności roślin przeciwko wirusom m ogą służyć nie tylko geny pochodzenia w irusow e­go. Transgeniczny tytoń N. tabacum , w którym nastąpiło wyciszenie genu uidA kodującego po­chodzący z bakterii enzym (3-glukuronidazę (GUS) infekowano zm odyfikowanym wirusem mozaiki ty­toniu TMV, do genomu którego dołączono gen uidA. Po kilkunastu dniach po infekcji rośliny kontrolne wykazały wszystkie objawy charakterystyczne dla porażenia przez TMV, podczas gdy rośliny transge- niczne pozostały odporne na infekcję [10]. Tak więc

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 183http://rcin.org.pl

można domniemywać, że warunkiem niezbędnym do wystąpienia odporności na infekcje w irusowe jest homologia sekwencji występującej w czynniku in­fekcyjnym do sekwencji znajdującej się w genomie gospodarza, a źródło jej pochodzenia nie odgrywa żadnej roli.

Sygnał indukujący PTGS rozchodzi się w roślinie systemowo. Liście transgenicznego tytoniu N icotia- na bentham iana wyrażającego gen białka GFP (ang. Green F luorescent P rotein ), infiltrowano zawiesiną bakterii A grobacterium tum efaciens wyrażających gen reportero wy GFP. Tkanki, w których ma miejsce ekspresja tego genu charakteryzują się z ieloną flu- orescencją po naświetleniu ich UV. Już po dwóch dniach od infiltracji można było obserwować inten-

je s t szczególnie użyteczny w tego typu ekspe ry ­mentach, gdyż brak jego ekspresji m anifestu je się występowaniem charakterystycznej ch lorozy liści. Tak więc gdy zaszczepiono zraz pochodzący z roś li­ny z funkcjonalnym genem reduktazy azotanowej na podkładce z w yciszonym genem N ia, po trzech tygodniach również w zrazie obserw ow ano p o ja ­wienie się chlorozy. N atom iast zaszczepien ie chlo- ro tycznego zrazu na podkładce z genem aktywnym nie wywoływało w yciszenia genu reduk tazy azo ta­nowej w podkładce. Św iadczy to jednoznaczn ie , że transport sygnału w yciszania odbyw a się w k ierun­ku od korzeni do m erystem u w ierzcho łkow ego ro ­śliny [12]. Schemat opisanych pow yżej badań przedstawia rycina 1.

Ryc. 1. Schemat przedstawiający kierunkowe rozchodzenie się sygnału dla wyciszenia ekspresji genu Nia. A — roślina z wyciszonym genem Nia, B - roślina z aktywnym genem Nia. ★Ekspresja genu Nia uległa wyciszeniu.

sywną fluorescencję w okolicy liścia, gdzie w prow a­dzono Agrobacterium . Sygnał ten, pochodzący z bakterii był znacznie intensywniejszy niż fluore- scencja będąca wynikiem ekspresji transgenu roślin­nego. Jednak na granicy strefy infiltrowanej liścia fluorescencja zanikła świadcząc o zachodzącym tam wyciszeniu ekspresji GFP.

Strefa lokalnego w yciszenia (ang. L o ca l A cq u ­ired S ilencing) rozszerzała się, by po 18 dniach osiągnąć górne liście infiltrowanej rośliny [11]. Efekt ten nazwano w yciszeniem system ow ym (ang. System ie A cqu ired S ilencing) [12]. Dośw iadczenia z w ykorzystaniem transgenicznych roślin tytoniu charakteryzujących się w yciszeniem genu reduk ta­zy azotanowej N ia w ykazały k ierunek rozprzestrze­niania się sygnału PTGS w roślinie [12]. Gen Nia

Jak pokazują wyniki przedstawionych doświad­czeń, w roślinach może istnieć system obrony zabez­pieczający przed infekcjami w irusowym i polegający na specyficznej degradacji w irusowego RN A zdolny do szybkiej odpowiedzi w przypadku ponownej in­fekcji.

III-2. Przykłady praktycznego zastosowania wyciszania genów indukowanego przez infekcję wirusa (ang. Virus Induced Gene Silencing)

Potranskrypcyjne wyciszanie ekspresji genów (PTGS) może być wykorzystane do wywoływania wyciszania ekspresji genów gospodarza. Rośliny ty­toniu A. benthamiana, do których wprow adzono gen

184 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

GFP po infekcji rekombinowanym wirusem PVX-GFP wykazywały normalne objawy porażenia. Jednakże proces namnażania się wirusa prowadził do włączenia się mechanizmu potranskrypcyjnego w y ­ciszania, który dotyczył zarówno ekspresji transge- nu, jak i ekstrachromosomalnie replikującego się w i­rusa, co w rezultacie doprowadziło do całkowitej eliminacji PVX z rośliny [13]. Zjawisko to nazwano wyciszaniem ekspresji genów indukowanym przez wirus (ang. Virus Induced Gene Silencing, VIGS). Może być ono również wywoływane przez wirusy zawierające w swoim genomie odcinki DNA hom o­logiczne do genów rośliny [14, 15]. Ma to duże za­stosowanie praktyczne: dysponując wektorem w iru­sowym z wklonowanym genem roślinnym można za­każając podatne rośliny wywołać wyciszenie ekspre­sji homologicznego genu roślinnego. Otrzymuje się w ten sposób efekt fenotypowy mutacji (fenokopie) tego genu w roślinie.

Jednym z najbardziej spektakularnych przykła­dów wykorzystania zjawiska VIGS jes t całkowite za­blokowanie ekspresji desaturazy fitoenowej (PDS) [13, 16], manifestujące się w tytoniu całkowitym w y­bieleniem górnych liści. W zakażonych zrekombino- wanym wirusem PVX-PDS roślinach tytoniu proces ten spowodował obniżenie poziomu mRNA tran- skrybowanego z chromosomalnej kopii genu desatu­razy, co w konsekwencji doprowadziło do zabloko­wania produkcji karotenoidów, niezbędnych do ochrony przed niszczącym w pływem światła [17].

Metoda ta ma duże perspektywy zastosowań przy analizie funkcjonalnej genów roślinnych. Znając choćby część sekwencji badanego genu sprawdzać można zmiany fenotypowe pojawiające się po upływie kilkunastu dni, to jes t po okresie, gdy na górnych liściach pojaw ią się pierwsze symptomy VIGS. Tak więc zależność miedzy sekwencją n iezna­nego genu a odpowiadającym mu fenotypem można ustalić w ciągu zaledwie kilku tygodni [17]. Z pew nością łatwiejsza będzie teraz analiza funkcjo­nalna genów wielokopijnych oraz takich, których mutacje są letalne już we wczesnych stadiach rozw o­jow ych roślin.

Technika ta może służyć również do ustalenia od­wrotnej relacji: od fenotypu do odpowiadającego mu genu. W tym celu należałoby skonstruować bibliote­ki cDNA badanej rośliny z wykorzystaniem PVX jako wektora i analizować dużą liczbę infekowanych roślin [17].

Jednakże pomimo wielu zalet, technologia oparta na VIGS jes t zjawiskiem zależnym od liczby i orga­nizacji transgenów, oraz od regionu chromatyny, gdzie nastąpiło ich wbudowanie do chromosomu.

IV. W irusowe supresory potranskrypcyjnego wyciszania genów

Obserwacja przebiegu infekcji u roślin zaka­żonych dwom a gatunkami wirusów dała podstawy do przypuszczeń, że niektóre wirusy mogą kodować czynniki będące naturalnymi supresorami w ycisza­nia genów. Taka podwójna infekcja w wielu przypad­kach prowadzi do synergizmu symptomów chorobo­wych i do akumulacji jedynie jednego z infekujących w irusów [18, 19]. Zaobserwowano również, że wiele z takich przypadków dotyczy wirusów z rodziny Po- tyviridae, a infekowane rośliny transgeniczne, w yra­żające geny zlokalizowane w rejonie 5 ’ genomu w i­rusa TEV należącego do tej rodziny, w ykazują znacznie ostrzejsze objawy chorobowe niż rośliny nie transgeniczne [19, 20]. Doświadczenia te sugero­wały, że kompleks białkowy P l/H C -P ro kodowany przez tę cześć genomu wirusa inhibuje system ochro­ny antywirusowej u roślin. Istniało przypuszczenie, że systemem tym może być potranskrypcyjne w yci­szanie genów PTGS [19],

Dla weryfikacji doświadczalnej tej hipotezy p rze­prowadzono dwa typy doświadczeń. W pierwszym eksperymencie skrzyżowano transgeniczne rośliny wyrażające P l/H C -P ro z roślinami transgenicznymi, u których gen reportero wy kodujący GUS uległ po- transkrypcyjnemu wyciszeniu. U roślin potomnych tej krzyżówki gen ten ulegał wydajnej ekspre­sji [21, 22]. W wyniku dalszych doświadczeń w yka­zano, że genem odpowiedzialnym u potywirusów za inhibicję PTGS jes t wielofunkcyjne białko HC-Pro, odpowiedzialne również za przemieszczanie się w i­rusa w roślinie, przenoszenie wirusa przez mszyce i m odyfikow anie białek [23, 24].

Drugim typem doświadczeń były eksperymenty, w których udowodniono, że wektor wirusowy PVX w yrażający gen reporterowy GFP nie wywołuje zja­wiska VIGS w roślinach transgenicznych w yra­żających GFP w obecności P l /H C -P ro [21].

W laboratorium profesora D a v i d a B a u l - c o m b a opracowano test umożliwiający poszuki­wanie supresorów PTGS z wykorzystaniem transge­nicznych roślin tytoniu N. bentham iana w yra­żających GFP [23, 24]. W roślinach tych wyciszanie ekspresji transgenu indukowane było poprzez infil­trację liści zawiesiną bakterii A. tumefaciens n iosącą plazm id z GFP [23]. Następnie rośliny takie zaka­żane są różnymi wirusami i monitorowane pod względem ekspresji GFP. Dzięki tej metodzie odkry­to kilka kolejnych białek, mających zdolność do su- presji roślinnego systemu ochrony przed infekcjami wirusowymi, jak im jes t PTGS. Przykładem może tu

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 185http://rcin.org.pl

być białko P I 9 wirusa TBSV, A C2 gem iniwirusa czy PI z RYM V [24]. W szystkie te białka uniem ożli­wiają skuteczną obronę przed infekcjami w irusow y­mi.

Aby nie pozostać bezbronnymi, rośliny zastoso­wały inną strategię obrony przed w irusami mającymi zdolności do inaktywacji systemu chroniącego przed patogenami: supresory PTGS są często tak zwanymi białkami awirulencji (avr), z którym i oddziałują p ro ­dukty roślinnych genów odporności R [25, 26]. In te­rakcja dwu białek, produktów genów avr i R, p row a­dzi do uaktywnienia całego łańcucha reakcji p ro ­wadzących do zwalczania infekcji [27].

V. Amplikony

Przeprowadzane dośw iadczenia nad ekspresją transgenów w roślinach doprow adziły do skonstru­owania amplikonów. Są to samoreplikujące się w ko­mórkach roślinnych zm odyfikow ane cząsteczki w i­rusowego RNA [28]. Schemat ekspresji amplikonów w transgenicznych roślinach przedstawia rycina 2. Pierwszy etap ich cyklu replikacyjnego polega na transkrypcji przez roślinną polim erazę RNA cDNA amplikonu, znajdującego się pom iędzy prom otorem 35S wirusa mozaikowatości kalafiora (CaMV), a sekwencją 3 ’ UTR nos odpow iedzia lną za poliadeny- lację cząsteczek mRNA. Taka konstrukcja transgenu zapewnia stabilne namnażanie replikujących się w roślinach cząsteczek amplikonów (etap 1). Tran- skrypt, po przejściu z jądra kom órkow ego do cyto- plazmy (etap 2), ulega translacji i powstaje wirusowa RNA-zależna polimeraza RN A odpowiedzialna za replikację wirusa (etap 3). Synte tyzow ana przez nią ujemna nić RNA (etap 4) pełni rolę m atrycy do synte­zy potomnych (dodatnich) nici RNA obejmujących cały genom wirusa (etap 5), jak rów nież do syntezy tak zwanego subgenomowego RNA, z którego u le ­gają translacji geny w irusowe (etap 6). Do konstruk­cji amplikonów wykorzystano dobrze poznany wirus ziemniaka X (PVX), gospodarzem którego jes t m ię­dzy innymi tytoń N. tabacum. Is to tną dla p rzeprow a­dzanych doświadczeń cechą tego w irusa jest m ożli­wość zastąpienia przez obcy gen wirusowego genu białka płaszcza bez jakiegokolw iek w pływ u na rep li­kację. Pierwotnie amplikony m iały służyć jako w y ­dajny system do ekspresji genów i produkcji obcych białek w roślinie [28], N ieoczekiw anie dośw iadcze­nia wykazały, że są one bardzo dobrym narzędziem do wyciszania ekspresji genów roślinnych. Przykładem może być eksperyment, w którym rośli­ny tytoniu transformowano am plikonam i zaw ie­rającymi pełen genom PVX, bądź też zm odyfikow a­

ny w ten sposób, że gen reporterowy GUS wklono- wany był zamiast białka płaszcza wirusa (PVX-GUS) lub jako gen przylegający do genu białka płaszcza (PVX-GUS-CP). Rośliny w yra­żające amplikony z PVX pomimo obecności w pełni infekcyjnych wirionów nie w ykazywały objawów porażenia tym wirusem i były także odporne na w tór­ne infekcje tym samym szczepem wirusa. Obecność genu GUS w amplikonach powodowała wysoce spe­cyficzne jego wyciszanie [28]. Zastosowanie am pli­konów charakteryzuje specyficzność i pow tarzal­ność wyników, jakiej nie osiągnięto w dośw iadcze­niach z żadnym innym układem roślinnym, w którym zachodziło wyciszanie ekspresji genów. Każda z ro­ślin wyrażających pojedynczy transgen wykazywała podobny, wysoki poziom odporności na infekcje w i­rusowe [9].

Do tej pory nie wyjaśniono zjawiska wysokiej w y­dajności indukowanego przez amplikony wyciszania ekspresji genów. Pewnym pozostaje tylko fakt, że odpornością na wirusy charakteryzowały się jedynie rośliny, w których zachodzi wydajna replikacja tran- skrybowanych z transgenu amplikonów. Rośliny za­wierające konstrukty amplikonów ze zm utow aną re- plikazą nie były odporne na zakażenie wirusowe. Najprawdopodobniej w tym przypadku homologia sekwencji pomiędzy transgenem a RNA infe­kującego wirusa PVX wydaje się być nie wystar­czająca do indukcji PTGS. Być może aktywacja w y­ciszania genów przez amplikony zachodzi jedynie w pewnym okresie rozwojowym roślin [9]. A utor pio­nierskich prac dotyczących amplikonów D a v i d B a u l c o m b e sugeruje, że zjawisko ustępowania objawów chorobowych (ang. recovery) występujące tylko w młodych liściach może być związane z bez­pośrednim oddziaływaniem wirusowego RNA z jądrow ym DNA. A sytuacja taka może mieć właśnie miejsce w dzielących się komórkach bez otoczki jądrowej w młodych pędach roślin [9].

V-1. Amplikony, a wysoce wydajna ekspresja transgenów w roślinach

Amplikony stworzono poszukując narzędzia do wydajnej ekspresji obcych genów w roślinach. By wykorzystać je w tym celu, niezbędne jes t równocze­sne stosowanie amplikonów z wirusowymi supreso- rami potranskrypcyjnego wyciszania genów. Po­twierdzają to doświadczenia z roślinami zawie­rającymi gen reporterowy GUS w amplikonie, w któ­rych potranskrypcyjne wyciszanie tego genu zostało zniesione w obecności białek P l/H C -P ro będących supresorami PTGS. Rośliny te charakteryzowały się

186 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

Ryc. 2. Schemat ekspresji amplikonów w roślinach transgenicznych.

wysokim poziomem ekspresji GUS, w których białko to stanowiło do 3 % wszystkich białek kom ór­kowych [26].

VI. Uwagi końcowe

W pracy tej przedstawiono jedynie zarys bardzo obszernego zagadnienia, jakim jes t wyciszanie eks­presji genów. Ostatnia dekada przyniosła w tej dzie­dzinie wiele nowych odkryć: wykazano, że w ycisza­nie ekspresji genów może zachodzić na dwóch jej etapach (transkrypcyjnym i potranskrypcyjnym), udowodniono, że kosupresja jes t formą potranskryp- cyjnego wyciszania ekspresji genów a także odkryto wirusowe supresory potranskrypcyjnego wyciszania ekspresji genów [24], Wykazano również doświad­czalnie, że infekcja wirusowa może być przezwycię­żana w roślinie na skutek specyficznej degradacji w i­rusowego RNA [8]. Zwłaszcza te dwa odkrycia do­starczają dowodów, że PTGS jes t najprawdopodob­niej naturalnym systemem obrony roślin przed infek­

cjami wirusowymi. Jednakże odkrycia związane z wyciszaniem genow ym m ają nie tylko znaczenie czysto poznawcze.

Infekcja roślin wirusami niosącymi sekwencje ho­mologiczne z genami gospodarza prowadzić może do wyciszenia ich ekspresji w roślinie. Jest to proces wyciszania genów indukowany przez wirusy (VIGS). Stanowi on nowe narzędzie, pozwalające biologom roślin na wyciszanie ekspresji genów na żądanie, manifestujące się fenotypowymi efektami mutacji.

Wadą tej metody jes t konieczność przebadania du­żej liczby roślin w celu znalezienia stabilnie w yci­szanego genu. Problem ten można ominąć stosując amplikony dające 100% pewność wyciszania ekspre­sji genów [9, 28].

Nadchodzące lata przyniosą z pew nością w iado­mości o odkryciu wielu nowych genów u roślin, do czego przyczyni się zastosowanie amplikonów.

Artykuł otrzymano 25 marca 2002 Zaakceptowano do druku 15 kwietnia 2002

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 187http://rcin.org.pl

Piśmiennictwo

1. S t e c W J (2000) Biotechnologia 48: 15-302. H o b b s S L A, K p o d a r P , D e l o n g C M O ( l 990) Plant Mol

Biol 15: 851-8643. N a p o l i C, L e m i e u x C, J o r g e n s e n R (1990) Plant Celi 2:

279-2894. V a n d e r K r o i AR, M u r LA, B e l d M , M o l J N M ( 1 990)

Plant Celi 2: 291-2995. M a t z k e M , M a t z k e A i M (\9 9 3 )A n n u Rev Plant Physiol Plant

M ol Biol 44: 53-766. V a n B l o k l a n d R , v a n d e r G e e s t N , M o l J N M , K o o t e r

J M (1994) Plant J fi. 861-8777. M e t z l a f f M , O ’ D e l l M, C l u s t e r PD, F l a v e l l R B (1997)

Celi 88: 845-8548. L i n d b o JA, D o u g h e r t y W G (1992) Virology 189: 725-7339. v a n K a m m e n A (1997) Trands Plant Sci 2: 409-41110. E n g l i s h JJ, M u e l l e r E, B a u l c o m b e D C (1996) Plant Celi

179-1881 1 . V o i n n e t O, B a u l c o m b e D C (1997) Nature 389: 55312. P a 1 a u q u i J-C, E l m a y a n T, P o l l i e n J-M, V a u c h e r e t FI

(1997) EMBO J 16: 4738-474513. R u i z M T , V o i n n e t O, B a u l c o m b e D C (1998) Plant Celi

10: 937-94614. K u m a g a i MH, D o n s o n J, D e l l a-C i o p a G, H a r v e y D,

H a n l e y K , G r i l l L K (1995) Proc Natl Acad Sci 92: 1679-1683

15. K j e m t r u p S, S a m p s o n K S . P e e l e CG, C o n k l i n g MA, T h o m p s o n W F , R o b e r t s o n D (1998)PlantJXA: 91-100

16. K u m a g a i M H , T u r p e n T H , W e i n z e t t l N, D e l l a-C i o p p a G, T u r p e n A M, D o n s o n J, H i l f M R , G r a n t h a m GL, D a w s o n WO , C h o w TP, P i a t a k Mj , G r i l l L K (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90: 427-430

17. B a u l c o m b e D C (1999) Curr Opin Plan Biol 2: 109-11318. R o c h o w WF , R o s s A F (1955) Virology 1: 10-2719. P r u s s G, G e X, S h i X M, C a r r i n g t o n J C, V a n c e V B

(1997) Plant Cell 9: 859-86820. V a n c e V B (1991) Virology 182: 486-49421. A n a n d a l a k s h m i R, P r u s s GJ , G e X, M a r a t h e R,

M a 11 o r y AC, S m i t h T H, V a n c e V B ( 1 998) Proc Natl Acad Sci USA 95: 13079-13084

22. K a s s c h a u K D , C a r r i n g t o n J C (1998) C ell95: 461-47023. B r i g n e t i G, V o i n n e t O, W a n-X i a n g L, L i a n g H u i J,

D i n g S - W , B a u l c o m b e D C (1 9 9 8 )£ 'M 5 0 J1 7 : 6739-674624. V o i n n e t O, P i n t o YM, B a u l c o m b e D C (1 999) Proc Natl

Acad Sci USA 96: 14147-1415225. L i H-W, L u c y AP , G u o H-S, L i W-X, J i L-H, W o n g SM,

D i n g S-W (1999) EMBO J 18: 2683-269126. M a r a t h e R, A n a n d a l a k s h m i R, S m i t h TH, P r u s s GJ,

V a n c e V B (2000) Plant M ol Biol 43: 295-30627. F 1 o r H H (1971) Annu Rev Phytopatol 9: 275-29628. A n g e l l S M , B a u l c o m b e D C (1997)E M B O J16: 3675-3684

188 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

Udział syntetaz aminoacylo-tRNA w procesach komórkowych

Participation of aminoacyl-tRNA synthetases in cellularprocesses

MONIKA KAMIŃSKA1, ADRIANA ZAKRZEWSKA2, MARIA MADAJKA2. JAN BARCISZEWSKI3

Spis treści:

I. W stępII. W łaściwości syntetaz am inoacylo-tRN AIII. Procesy kom órkowe kierowane przez syntetazy am ino­

acylo-tRNAIV. Udział syntetaz am inoacylo-tRN A w powstawaniu cho­

rób autoim m unologicznychV. Poszukiwanie antybiotyków skierowanych przeciwko

bakteryjnym syntetazom am inoacylo-tRN AVI. Perspektywy

Contents:

I. IntroductionII. Properties o f am inoacyl-tRN A synthetasesIII. Cellular processes o f am inoacyl-tRNA synthetasesIV. Role o f am inoacyl-tRNA synthetases in autoim m unolo-

gical diseases etiologyV. Searching for antibiotics for bacterial am inoacyl-tRNA

synthetasesVI. Perspectives

W ykaz stosowanych skrótów: aa — aminokwas; aa-AMP- aminoacyloadenylan; aaRS — syntetaza aminoacylo-tRNA; Adt — amidotransferaza; AlaRS — syntetaza alanylo-tRNA; ArgRS — syntetaza arginylo-tRNA; AsnRS — syntetaza aspa- raginylo-tRNA; AspRS — syntetaza aspartylo-tRNA; ATP-ade- nozynotrifosforan; CysRS — syntetaza cysteinylo-tRNA; GlnRS — syntetaza glutaminylo-tRNA; GluProRS — syntetaza gluprolilo-tRNA; GluRS — syntetaza glutamylo-tRNA; GlyRS— syntetaza glicylo-tRNA; IleRS- syntetaza izoleucylo-tRNA; HisRS — syntetaza histydylo-tRNA; LeuRS — syntetaza leucy- lo-tRNA; LysRS — syntetaza lizylo-tRNA; MDa-mega Dalton; MetRS — syntetaza metionylo-tRNA; mRNA — informacyjny kwas rybonukleinowy; mtDNA — mitochondrialny kwas deok- syrybonukleinowy; PheRS — syntetaza fenylo-tRNA; PPi — pirofosforan; ProCysRS — syntetaza procysteinylo-tRNA; ProRS — syntetaza prolilo-tRNA; SerRS — syntetaza sery- lo-tRNA, tRNA — transferowy kwas rybonukleinowy; TrpRS— syntetaza tryptofanylo-tRNA; TyrRS — syntetaza tyrozy- lo-tRNA.

'M gr inż., 2mgr, 3prof. dr hab., 'Akademia Rolnicza, ul. Wojska Polskiego 28, 60-637 Poznań; e-mail: gregor@ibch.poznan.pl; 2,3Instytut Chemii Bioorganicznej PAN, ul. Noskowskiego 12, 61-704 Poznań; e-mail: jbarcisz@ibch.poznan.pl, ada-zak@go2.pl

I. W stęp

Proces translacji informacji genetycznej zawartej w DNA polega na przepisaniu „języka kwasów nu­kleinowych” (4 nukleotydy) na „język białka” (21 aminokwasów). Głównym „tłum aczem ” w tym pro­cesie są syntetazy aminoacylo-tRNA, które rozpo­znają tRNA i katalizują jego reakcję aminoacylacji. W pierwszym etapie następuje aktywacja aminokwa­su w obecności adenozynotrifosforanu oraz utworze­nie aminoacyloadenylanu z jednoczesnym uwolnie­niem pirofosforanu. Reakcja ta przebiega zasadniczo bez udziału tRNA, choć w przypadku syntetaz: argi­nylo-tRNA, glutaminylo-tRNA, glutamylo-tRNA jego obecność jes t niezbędna. W drugim etapie na­stępuje przeniesienie zaktywowanego aminokwasu z aminoacylo-AM P na grupę 2 ’- lub 3 ’-hydroksylową adenozyny przy końcu 3 ’ tRNA i utworzenie am ino­acylo-tRNA.

Olbrzymie zróżnicowanie strukturalne aaRS tłumaczy szerokie spektrum ich działania. Enzymy te obok podstawowej funkcji acylacji tRNA, uczest­niczą w procesach dojrzewania RN A, regulacji eks­presji genów na poziomie transkrypcji i translacji, syntezie chlorofilu, alarmonów Ap4A oraz biosynte­zie aminokwasów (histydyny). Widoczny jes t udział

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 189http://rcin.org.pl

aaRS w apoptozie i embriogenezie. W ydaje się, że wielofunkcyjność aaRS wraz z dostępnością nowych informacji strukturalnych stwarzają możliwości ich wykorzystania w medycynie molekularnej.

Celem niniejszego artykułu jes t przedstawienie udziału syntetaz am inoacylo-tRNA w różnych pro­cesach komórkowych oraz powstawaniu niektórych chorób autoimmunologicznych. W skażem y również na możliwości wykorzystania syntetaz aminoacy- lo-tRNA w poszukiwaniu nowych antybiotyków.

II. Właściwości syntetaz aminoacylo-tRNA

Główną funkcją syntetaz am inoacylo-tRNA jest swoiste rozpoznanie a następnie dwuetapow a reak­cja estryfikacji tRNA. Enzymy te w ykazują o lbrzy­mie zróżnicowanie strukturalne. Dotyczy to zarówno wielkości polipeptydów, sekwencji aminokwaso- w ych jak i budowy czwartorzędowej [1]. aaRS mogą występować jako: m onomery (a ) , hom odim ery i ho- motetramery ( a 2, a 4) lub heterotetramery (CI2P2), je d ­nak analiza struktury kryształów PheRS Thermus therm ophilus wskazuje, że ten enzym jes t dimerem zbudowanym z dwóch podjednostek ( a P )2 [2, 3], aaRS dzieli się na dwie klasy (Tabela 1). Każda z

Tabela 1

Reakcja aminoacylacji tRNA i klasyfikacja syntetaz aminoacylo-tRNA

nich charakteryzuje się odmiennym m otywem struk­turalnym [4], W klasie pierwszej aaRS miejsce kata­lityczne enzymu tworzy struktura Rossmanna pięciu na przemian ułożonych helis a (ang. Rossm ann fo ld ). W jej obszarze znajdują się dwie znacznikowe se­kwencje peptydowe: His-Leu-Gly-His (HIGH) i Lys-Met- Ser-Lys-Ser (KMSKS). Am inokwasy te są zaangażowane w syntezę aminoacylo-adenylanu [5], Dwie reszty lizynowe w sekwencji KM SKS wiążą i aktywują aminokwas. Ten pentapeptyd, oprócz wiązania ATP rozpoznaje koniec 3 ’ cząsteczki tRNA. Dwie reszty histydynowe tetrapeptydu HIGH wiążą reszty fosforanowe ATP. Należy podkreślić, że podobne motywy sekwencyjne w ystępują również w wielu innych białkach wiążących mono- i dinukle- otydy np. w dehydrogenazach [6]. aaRS klasy I spe­cyficznie rozpoznają określone fragmenty tRNA wiążąc się z mniejszą bruzdą helisy RN A i katalizują estryfikację grupy 2 ’OH końcowej 3 ’ rybozy specy­ficznym aminokwasem [7]. Centrum aktywne synte­taz klasy II tworzy głównie siedem antyrównolegle ułożonych struktur [J-daszkowych oraz trzy helisy ot [8, 9]. W ystępują w nim trzy zdegenerowane m oty­wy sekwencyjne [10, 11], Syntetazy klasy II (z wyjątkiem PheRS) w iążą się z tRNA w jego większej

A. aa + ATP < aaR-— > aa-AMP + PP|

aa-AMP + tRNA < aaRS -» aa-tRNA + AMP

B.I II

K lasa aaRS

(1) ®Goxx0xxP00

Charakterystyczna

sekwencja aminokwasowaHIGH, KMSKS

(2) ®00X0xxx(F/Y/H)RxE

(R/H)xxxFxxx(D/E)

(3) x0G0G0G0ERo0000

Centrum

katalitycznestruktura Rossmanna

antyrównoległa

struktura [3

Miejsce wiązania

syntetazy do tRNAmniejsza bruzda tRNA

większa bruzda tRNA

Miejsce aminoacylacji

przy końcowej rybozie tRNA2 ’OH 3 ’OH (z wyjątkiem PheRS)

Podklasy aaRS:

a

b

c

d

Arg, Cys, Ile, Leu, Met, Val

Tyr, Trp

Gin, Glu

His, Thr, Pro, Ser

Asp, Asn, Lys

Ala, Gly

Phe

(A) W pierw szym etapie am inoacylacji tRNA, aaRS aktyw uje specyficzny aminokwas z w ytw orzeniem am inoacylo-adenylanu (aa-AM P) i jednoczesnym uwolnieniem pirofosforanu (PPi). W drugim etapie następuje przeniesienie grupy am inoacylow ej am inoacylo-AM P na cząsteczkę tRNA z utworzeniem am inoacylo-tR N A [1], (B) C harakterystyczne sekwencje am inokwasow e aaRS przedstaw iono w kodzie je d ­noliterowym (© — am inokwasy obdarzone ładunkiem dodatnim , 0 — aminokwas hydrofobowy, x — am inokw as dowolny), podklasy w ko­dzie trójliterowym . W szystkie AARS z w yjątkiem LysRS (niektórych Archea, Bacteria ) i ProCysRS podlegają powyższej klasyfikacji i są przydzielone do jednej z dwóch klas [2-11].

190 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

bruździe i katalizują przyłączanie aminokwasu do grupy 3 ’OH końcowej 3 ’ rybozy [11].

aaRS Prokaryota w porównaniu z syntetazami Eu- karyota zbudowane są z mniejszych podjednostek. Łańcuchy polipeptydowe syntetazy tryptofany- lo-tRNA i walino-tRNA E. coli zawierają od 344 do 951 aminokwasów. U Eukaryota ich długość wynosi odpowiednio 481 i 1265 aminoakwasów [12, 13]. Jest to konsekwencją występowania dodatkowych peptydów przy końcu aminowym lub karboksylo­wym [14]. W syntetazie gluprolilo-tRNA o podwój­nej specyficzności dodatkowa sekwencja aminokwa- sowa znajduje się pom iędzy sekwencjami swoistymi dla syntetaz glutamylo-tRNA i prolilo-tRNA [15]. Struktura i funkcja dodatkowych peptydów jest mało poznana. Dotychczas wykazano, że biorą one udział w tworzeniu wielocząsteczkowych kompleksów en­zymatycznych [16, 17]. Syntetaza metionylo-tRNA Saccharom yces cerevisiae występuje w kompleksie z białkiem A rc łp (ang. am inoacyl-tRNA synthetase cofactor), w tworzeniu którego uczestniczy dodatko­wy polipeptyd 185 aminokwasowy przy końcu am i­nowym. Taki kompleks nie występuje u Prokaryota. Białko A rc lp przy końcu aminowym wiąże GluRS i MetRS, a przy końcu karboksylowym tRNA Glu lub tR N A Met [18]. Obecność A rc lp w kompleksie z M et­RS i GluRS zwiększa wydajność aminoacylacji kata­lizowanej przez obie syntetazy. Domena karboksylo­wa białka A rc lp oddziałuje niespecyficznie z tRN A phe, tR N A Lys i tR N A Arg [19]. Przyłączenie tej domeny do centrum katalitycznego GlnRS E. coli umożliwia aminoacylację tR N A Gln drożdży [20].

Syntetazy aminoacylo-tRNA występują w kom ór­kach ssaków na ogół w postaci wielocząsteczkowego kompleksu o m. cz. 1,4 MDa. Składa się on z 11 białek, z których dziewięć to aaRS a pozostałe to białka nieenzymatyczne: p 18, p38 i p43 [21]. Białko p38 wiąże się z ArgRS, GlnRS, AspRS, LysRS i Glu- ProRS stabilizując strukturę kompleksu [21]. Białko p43 uważane jes t za prekursor cytokiny EMAPII (ang. Endothelia l M onocite A ctiva ting Polipeptyde) (proEMAPII), która uczestniczy w ostrej odpowiedzi zapalnej i zaangażowana jes t w proces apoptozy. Domena przy końcu karboksylowym p43 wykazuje właściwości chemotaktyczne wobec leukocytów (monocytów, granulocytów), powodując ich grom a­dzenie się w ogniskach apoptycznych [22-25]. P43 wiąże ponadto niespecyficznie tRNA, a jego proteo- liza powoduje utratę tych właściwości, co prowadzi do zaburzeń biosyntezy białka i jest przyczyną w ejś­cia komórki w apoptozę. Udział białka p43 jednocze­śnie w dwóch procesach komórkowych — translacji i apoptozie, wskazuje na wzajemne powiązanie tych

procesów. Z analizy sekwencji aminokwasowej białka p 18 wynika, że jes t to homolog przedłużenia syntetazy walilo-tRNA przy końcu aminowym, która to sekwencja bierze udział w wiązaniu podjednostek czynnika elongacyjnego EF-1H [26]. Pomimo tych obserwacji, funkcja multisyntetazowego kompleksu jes t wciąż słabo poznana. Kompleksy te występują nie tylko w cytoplaźmie, ale także w jądrze kom órko­wym ssaków, gdzie m ogą tworzyć inne połączenia transportujące tRNA z jądra komórkowego do cyto- plazmy [27]. Obecność dodatkowych domen poza rdzeniem katalitycznym aaRS nie jes t jednak w arun­kiem tworzenia wieloskładnikowych kompleksów. Dodatkowe aminokwasy przy końcu karboksylo­wym SerRS S. cerevisiae, nie wpływają na tworzenie m akrokom pleksów, ale zw iększają powinowactwo seryny i tR N A Ser do syntetazy w reakcji aminoacyla­cji [28]. Istnieją dane doświadczalne wskazujące, że dodatkowe polipeptydy występujące przy końcu am inowym lub karboksylowym, są zaangażowane w oddziaływania z tRNA [29, 30]. Łańcuch 200 am ino­kwasów przy końcu karboksylowym roślinnej M et­RS tworzy strukturę niespecyficznie w iążącą tRNA [31]. Przykład ten potwierdza wcześniejsze obser­wacje według których C-końcowa domena MetRS może brać udział w początkowym procesie rozpo­znania i przyłączania tRNA przez syntetazę. Pełniąc funkcję swoistego „m agnesu” specyficznych i nie­specyficznych tRNA w komórce, może zapobiegać ich dyfuzji w cytoplaźmie przyczyniając się do zw ię­kszenia efektywności aparatu translacyjnego. Bar­dziej szczegółowe badania wykazały, że dodatkowa domena wiąże i aminoacyluje ramię akceptorowe tR N A Met [31, 32].

Ponad 40 lat temu, tuż po odkryciu syntetaz am i­noacylo-tRNA, F.H.C. C r i c k postulował istnienie dwudziestu aaRS w komórkach wszystkich organi­zmów żywych, gdzie jedna syntetaza rozpoznaje po­jedynczy aminokwas [33]. Szybko jednak stwierdzo­no przypadki będące odstępstwem od tego dogmatu. Ostatnie zaś wyniki sekwencjonowania genomów bakteryjnych potwierdziły, że nie we wszystkich or­ganizmach występuje pełen zestaw aaRS. Genom M ethanococcus ja n a sh ii zawiera geny kodujące tyl­ko 16 z 20 aaRS [34]. Nie zidentyfikowano w nim ge­nów strukturalnych GlnRS, AsnRS, LysRS oraz CysRS, pom imo obserwowanej aktywności katali­tycznej tych enzymów [34, 35]. Nasunęło to przy­puszczenie, iż w komórkach znajdują się inne białka o podobnych właściwościach, których obecność umożliwia prawidłowy przebieg translacji.

M ethanococcus ja n a sh ii zalicza się do królestwa A rchaea is tniejącego obok B acteria i Eukarya.

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 191http://rcin.org.pl

W każdym królestwie funkcjonuje praw dopodobnie inny m echanizm syntezy g lu tam iny lo-tR N A Gln (Gin- tR N A Gln). W cytoplaźm ie kom órek E ukaryota oraz w niektórych bakteriach (np. E. co li) synteza Gin- tR N A Gln zachodzi przy udziale syntetazy glu- tam inylo-tRNA [36]. Jednak u większości bakterii gram-dodatnich, n iektórych gram -ujem nych, cyja- nobakterii, w organellach kom órkow ych oraz u wszystkich znanych A rchaea proces ten odbywa się pośrednio poprzez etapy am inoacylacji n iespecy­ficznej i transamidacji [37,38]. U M. ja n a sh ii, M. therm oautotrophicum i B. sub tilis proces glutami- nylacji przebiega w dw óch etapach.

Glu + tR N A Gin + ATP < GluRS > G \u-tR N A GIn + AM P + PPi

G lu -tRN AGln + Gin + ATP < GluAdT > G ln-tRN AGln + G lu + Adp + PPi

W pierwszym etapie GluRS katalizuje n iespecy­ficzne przyłączanie glutaminianu (Glu) do tRNA n tworząc Glu-tRNAcln. Tak błędnie zacylowany tRNA jest następnie przekształcany do Gln-tRNA cln przez amidotransferazę glutamylo-tRNA (GluAdt). W liniach współczesnych organizmów Bacteria i A r­chaea proces transamidacji przebiega przy udziale dwóch strukturalnie różnych amidotransferaz g lu­tamylo-tRNA. W bakteriach oraz w chloroplastach ten heterodimeryczny enzym jest kodowany przez geny ga tA , gatB i gatC a w królestwie Archaea en­zym o tej samej specyficzności kodowany jes t dodat­kowo przez geny gatD i gatE [39]. W podobnym szlaku transamidacyjnym przy udziale syntetazy aspartylo-tRNA i amidotransferazy aspartylo-tRNA powstaje A sn-tRNA Asn [40]. Analiza kryształu GluRS Thermus therm ophilus wskazuje, że arginina w pozycji 358 swoiście rozpoznaje tR N A Glu w yklu­czając acylację tRNA Gln [41].

Poznanie sekwencji nowych genom ów uwidacz­nia kolejne przykłady odstępstw od dotychczaso­wych reguł podziału aaRS. Syntetazy lizylo-tRNA mają swoich przedstawicieli zarówno w klasie I (A r­chaea i niektóre bakterię) jak i drugiej (pozostałe or­ganizmy). Centrum katalityczne LysRS M ethano- coccus m anipaludis zawiera oba motywy sekwencyj­ne HIGH i KMSKS charakterystyczne tylko dla syn- tetaz klasy I [42]. LysRS klasy I i II pomimo braku podobieństw w budowie przestrzennej, rozpoznają te same fragmenty struktury tR N A Lys : ramię akcepto­rowe i pętlę antykodonową. Jednak sposób wiązania ramienia akceptorowego przez LysRS obu klas jest odmienny. LysRS klasy I (Borelia burgdorferi) w iążą się z mniejszą bruzdą helisy tRNA, podczas gdy enzymy klasy II (np. E. co li) oddziałują z dużą

bruzdą tRNA. [43, 44], Jest to jedyny przykład synte­tazy o tej samej specyficzności należących do dwóch klas.

Brak genu kodującego CysRS w sekwencji geno- mowej M. ja n a sh ii i M. theroautotrophicum jes t ko­lejnym przykładem odstępstw od reguł kodu gene­tycznego. Wykazano, że acylacja cysteiną u n iektó­rych Archaea zachodzi przy udziale dwuspecyficz- nej ProCysRS. Jego sekwencja aminokwasowa od­powiada sekwencji ProRS. ProCysRS może syntety­zować in vitro i in vivo zarówno Pro-tRNAPro jak i Cys-tRNACys [45]. Nie zaobserwowano błędnego tworzenia się kompleksów Pro-tRNACys jak i Cys- tR N A Pr0. Mutageneza ProCysRS wykazała, że m iej­sca wiązania proliny i cysteiny są wspólne dla obu aminokwasów [46]. Etapy tworzenia cysteinylo-ade- nylanu i prolilo-adenylanu przez ProCysRS są je d ­nak odmienne. Aktywacja cysteiny przez ProCysRS jes t możliwa tylko w obecności tRNACys. Z kolei tworzenie prolilo-adenylanu wobec ProCysRS za­chodzi bez udziału tR N A Pro. Przypuszcza się, że od­działywanie tRNACys z ProCysRS indukuje zmiany konformacyjne miejsca aktywnego syntetazy, um o­żliwiając wiązanie tylko specyficznego aminokwasu [47],

III. Procesy komórkowe kierowane przez syntetazy aminoacylo-tRNA

aaRS obok swej zasadniczej funkcji katalizy am i­noacylacji tRNA biorą udział w wielu procesach nie związanych bezpośrednio z rozpoznawaniem tRNA i wiązaniem aminokwasu (Ryc. 1). Enzymy te regu-

dojrzewanieRNA

aminoacylacja tRNA

rozwójembrionalny

biosyntezachlorofilu

aktywnośćcytokin

aminoacylacja wirusowych RNA

podobnych do tRNA

regulacjatranskrypcji

biosynteza alarm onów

regulacjatranslacji

Ryc. 1. Funkcje syntetaz aminoacylo-tRNA. aaRS katalizują reakcję aminoacylacji tRNA a także wykazują inne funkcje nie związane bezpośrednio z biosyntezą białka. Nie uwzględniono tutaj udziału aaRS w mechaniźmie naprawczym [67-69],

lują ekspresję własnych genów, zarówno na pozio­mie transkrypcji jak i translacji [48]. Syntetaza tre- onylo-tRNA (ThrRS) E. coli wiąże się z dwoma do­

192 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

menami odcinka liderowego mRNA przypom i­nającymi strukturę spinki do włosów. Każda z nich imituje kształtem ramię antykodonu tRN AThr. ThrRS tworząc kompleks z własnym mRNA uniemożliwia jego wiązanie do rybosomu [49, 50]. W podobny sposób ekspresję własnego genu autoreguluje AlaRS. Enzym ten hamuje syntezę AlaRS poprzez wiązanie się z sekwencją palindromową, otaczającą miejsce startu transkrypcji własnego genu [51]. Mi- tochondrialne aaRS zaangażowane są w proces doj­rzewania mitochondrialnego RNA. W wycinaniu in- tronów grupy I (ang. splicing) udział biorą: TyrRS N. crassa [52], P. anserina [53], LeuRS S. cerevisiae , S. douglasii [54], Domena M tTyrRS N. crassa zawiera dodatkową sekwencję przy końcu aminowym istotną dla tego procesu. Syntetaza rozpoznaje introny grupy I dzięki ich strukturalnej homologii do tRNA [55]. Bakteryjne LeuRS i ludzkie MtLeuRS nie uczest­niczą w procesie składania własnych genów, gdyż nie zawierają intronów. M ogą natomiast wykazywać tę aktywność w procesie składania sekwencji ko­dującej MtLeuRS S. cerevisiae [56].

LysRS, PheRS i SerRS odpowiedzialne są za syn­tezę alarmonów — oligofosforanów dinukleotydo- wych, odgrywających w ażną rolę w odpowiedzi ko­mórek bakteryjnych i eukariotycznych na różne w a­runki stresowe. Zalicza się do nich: Ap4A, A p3Gpp, Ap4G, A p3G, A p3A w których jedna z reszt fosfora­nowych cząsteczki ATP (pppA) jes t zastąpiona przez ADP, AMP, ppGpp, GTP oraz GDP [57,58], Alarmo- ny stanowią swoiste „czujniki” sygnalizujące ko­mórce o zmianie warunków otoczenia.

U roślin wyższych, glonów, Eubacteria i Archeo- bacteria syntetaza glutamylo-tRNA zaangażowana jes t w proces biosyntezy porfiryny. Utworzony przez nią g lutam ylo-tRNAGlu jest substratem wyjściowym szlaku prowadzącego do powstania kwasu 5-aminol- ewulinowego, będącego prekursorem związków te- trapirolowych, do których należą chlorofil i hem [59],

W bakteryjnych genomach Bacillus subtilis, Lac- tococcus lactis, Synechocystic sp. odkryto białko uczestniczące w biosyntezie histydyny i wykazujące podobieństwo do HisRS. Otwarta ramka odczytu se­kwencji kodującej to białko zawiera gen hisZ, które­go produkt jes t homologiem domeny katalitycznej HisRS. Produkt ekspresji genu hisZ nie jes t jednak zdolny zarówno do hydrolizy ATP jak i katalizy reak­cji aminoacylacji tR N A Hls. W komórkach bakteryj­nych białko HisZ pełni funkcje podjednostki białka HisG o aktywności ATP fosforybotransferazy, który jes t pierwszym enzymem uczestniczącym w szlaku biosyntezy histydyny. U bakterii w których genomie

brak sekwencji hisZ produkt genu hisG jest o 100 aminokwasów dłuższy i funkcjonuje bez białka HisZ. Przypuszcza się więc, że HisZ jest brakującym elementem niekompletnej ATP fosforybozylotrans- ferazy [60].

aaRS katalizują przyłączanie aminokwasów nie tylko do tRNA ale także do genomowych RNA w iru­sów. RNA Tymowirusów, Tobamowirusów i Bromo- wirusów sąam inoacylow ane na jego końcu 3 ’ ponie­waż ta część kwasu nukleinowego przybiera struktu­rę podobną odpowiednio do tRNA Tyr, tR N A Val, tR N A Hls. Przebieg tej reakcji uwarunkowany jest obecnością struktury tRNA przypominającej kształtem literę L oraz sekwencji CCA na końcu 3 ’. Utworzenie tej sekwencji przez nukleotydylotransfe- razę tRNA i przyłączenie aminokwasu przez odpo­wiednią aaRS chroni wirusowy genom przed działa­niem nukleaz gospodarza. Aminoacylowane wiruso­we RNA mogą też wiązać się z komórkowymi czyn­nikami elongacyjnymi i uczestniczyć w translacji białek wirusa [61].

Niektóre aaRS oraz białka z nimi oddziałujące wykazują aktywność cytokin. Ludzka TyrRS zbudo­wana jest z dwóch fragmentów wykazujących ak­tywność cytokin [62]. Domena przy końcu karboksy­lowym jest strukturalnie podobna do EMAPII-pepty- du biorącego udział w prostej odpowiedzi zapalnej i zaangażowanego w proces apaptozy [63]. Powoduje ona chemotaksję leukocytów, monocytów i stymulu­je syntezę mieloperoksydazy, czynnika nekrozy no­wotworów T N F -a (ang. tum or necrosis fa c to r -a ) oraz czynnika tkankowego MP (ang. tissue fa c to r produced by m ononuclear phagocytes-M P s). D om e­na katalityczna TyrRS wiąże się natomiast z recepto­rem interleukiny 8A [62]. Za prekursor EMAPII uważany jes t również peptyd p43 wchodzący w skład kompleksów wielosyntetazowych (rozdz. II). A k­tywność TrpRS będącej bliskim homologiem TyrRS ma związek z regulacją procesu angiogenezy [64],

Aktywność aaRS może być szczególnie istotna we wczesnym etapie rozwoju organizmów. U Arabi- dopsis thaliana stwierdzono obecność mutanta e d d l . Jego sekwencja jest homologiczna (70%) do sekwen­cji GlyRS E. coli. Efektem mutacji jest ograniczony wzrost zarodkowy rzodkiewnika, wywołany niepra­w idłowym wykształceniem plastydów. Uważa się, że GlyRS odpowiedzialna jes t za tworzenie i przekazy­wanie sygnału z jądra komórkowego do plastydów warunkujący prawidłowy ich rozwój [65].

Niedawno zauważono związek między niektóry­mi aaRS a rozwojem embrionalnym zwierząt. W ba­daniach nad rozwojem gruczołów ślinowych w yka­zano zwiększony poziom ekspresji TrpRS, TyrRS,

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 193http://rcin.org.pl

SerRS i AlaRS. Sekwencja TrpRS D rosophila mela- nogaster jes t wysoce hom ologiczna do sekwencji TyrRS ssaków. W kulturach ludzkich kom órek stwierdzono zdolność czynnika przeciwwirusowego IFN-y do aktywacji TrpRS. Ludzka TrpRS posiada przed miejscem startu transkrypcji własnego genu elementy odpowiedzi na ten czynnik (ang. interferon gam m a-stim ulating response elem ents). Poziom eks­presji TrpRS w komórce może być regulowany przez czynniki transkrypcyjne aktywowane przez IFN-y. Możliwe jes t więc, że podwyższona ekspresja TrpRS muszki owocowej stanowi barierę dla rozwoju w iru­sów oraz innych wew nątrzkom órkowych pasożytów [66].

IV . U d zia ł syn tetaz a m in o a cy lo -tR N A w p ow staw an iu ch orób a u to im m u n o lo - giczn ych

W ostatnich latach badania nad niektórymi choro­bami autoimmunologicznymi udowodniły ich związek z obecnością w osoczu pacjentów przeciw ­ciał skierowanych przeciw określonym aaRS. Celem prac badawczych jest znalezienie przyczyn po jaw ia­nia się tego rodzaju przeciwciał.

Jak wiadomo, układ immunologiczny dojrzałego organizmu rozpoznaje i eliminuje tylko nieswoiste antygeny, a nie reaguje z własnymi. Jednakże zasada tolerancji nie jest absolutna. W pewnych warunkach może pojawić się tzw. reakcja autoimmunologiczna, w której własne antygeny m ogą być nieprawidłowo rozpoznawane, co prowadzi do powstawania choro­botwórczych autoprzeciwciał. Proces ten nie został dotychczas całkowicie wyjaśniony. Rozważa się kil­ka możliwości ich tworzenia: 1) utrata zdolności układu immunologicznego do rozpoznawania sw o­istych substancji we własnym organizmie, 2) wywoływanie niewłaściwych reakcji im m unologicz­nych w wyniku zmian w tkankach pod w pływem en­zymów bakteryjnych i toksyn, 3) zaburzenia m etabo­liczne, genetyczne, mechaniczne podczas produkcji przeciwciał. Zatem powstawanie przeciwciał może mieć podłoże immunologiczne, genetyczne, infek­cyjne lub hormonalne. Limfocyty T rozpoznają auto- antygen jako egzogenny, jeśli nie oddziałuje on z ko ­mórkami układu immunologicznego. Zjawisko to nosi nazwę sekwestracji autoantygenu, w efekcie której nie wytwarza się tolerancja na ten autoanty- gen. Może on zostać rozpoznany również jako obcy, jeśli na skutek różnych przyczyn dojdzie do zmian w jego strukturze, co zachodzi w przypadku uszkodze­nia tkanek, procesu zapalnego czy wpływu leków [70], Dostępne są dowody potwierdzające wpływ in­

fekcji wirusowych na indukcję i rozwój procesu im­munologicznego. M ożna j ą tłumaczyć m akrom ole­kularną mimikrą, to jes t podobieństwem w struktu­rze antygenów bakteryjnych i fragmentów struktur komórkowych. Przykładem jest syntetaza tryptofa- nylo-tRNA, której fragment aminokwasowy 130/HFLPR jest homologiczny do sekwencji białek wirusowych np. H FVRD H erpes sim plex, HFVKU Epsteina-Barra. W irusowe peptydy w ywołują mo- nonukleazę zakaźną w zespole Sjögrena [71].

Choroby autoimmunologiczne związane są z w y­stępowaniem przeciwciał przeciw wielu składnikom komórkowym, takim jak: polimeraza I [72], topoizo- meraza I [73], dehydrogenaza [74] czy histony [75]. Powstające przeciwciała wywołuje wiele chorób tkanki łącznej jak: toczeń rumieniowaty (SLE, ang. System ie Lupus E rythem atosus), zespół Sjörgena (SS, ang. Sjörgen Syndrom e), reumatoidalne zapale­nie stawów (RA, ang. R heum atoid A rthritis), zapale­nie mięśni (M, ang. M yositis), zapalenie wielomię- śniowe (PM, ang. P olym yositis), zapalenie skórno- mięśniowe (DM, ang. D erm atom yositis), czy sklero- dermę (SSc, ang. System ie Sclerosis) [76]. U pacjen­tów z tymi chorobami stwierdzono występowanie przeciwciał wobec aaRS. U osób cierpiących na za­palenie mięśni i zapalenie skórno-mięśniowe wykry­to przeciwciała anty-Jo-1 (A-Jo-1) reagujące z Hi- sRS [77]. Chorobom tym towarzyszy także śród­miąższowe zapalenie płuc, a niekiedy reumatoidalne zapalenie stawów [78]. Powstawanie określonego rodzaju przeciwciał jes t charakterystyczne wyłącznie dla danego antygenu, co oznacza, że nie ma to wpływu na powstawanie innych przeciwciał. Przeciwciało anty-Jo-1 rozpoznaje wyłącznie synte- tazę HisRS. Jest ono specyficzne dla danego pacjenta i nie reaguje z innymi aaRS. Z analizy reakcji wiąza­nia AsnRS z anty-HisRS, anty- AsnRS i anty-AlaRS wynika, że tylko anty-AsnRS ham ują aminoacylację w 98%. Pozostałe przeciwciała wpływają na reakcję w nieznacznym stopniu [79]. Antygen Jo-1 w ystępu­je prawie wyłącznie we frakcji cytoplazmatycznej, co oznacza, że np. MtHisRS nie ma właściwości im- munogennych. U chorych cierpiących na zapalenie skórno-mięśniowe wykryto przeciwciała reagujące z: ThrRS [80], AlaRS i tR N A Ala [81], IleRS [82] i GlyRS [83], dla których stwierdzono występowanie antygenów, odpowiednio: PL7, PL12, OJ i EJ (Tabe­la 2). Wymienione wyżej aaRS (oprócz IleRS), prze­ciw którym może być skierowana odpowiedź immu­nologiczna, występują w komórce w postaci poje­dynczych peptydów [17, 18]. Przeciwciała mogą ta­kże powodować inhibicję takich aaRS, które w chodzą w skład wieloenzymatycznych komplek­

194 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

sów. IleRS w wyniku reakcji z anty-OJ traci prawie całkowicie aktywność enzymatyczną, a kompleks syntetaz ulega wytrąceniu [82].

Metody biochemiczne i immunologiczne obecnie pozwalają na scharakteryzowanie autoantygenu. Określa się miejsca wiązania przeciwciał lub limfo­cytów T (epitopy) oraz bada się immunogenność określonego autoantygenu. Z analizy sekwencji aaRS wynika, że w ludzkiej HisRS 60 aminokwaso- wy peptyd przy końcu aminowym jest głównym epi- topem rozpoznawanym przez przeciwciała u chorych

Tabela 2

nak może mieć miejsce i zachodzi dwoma drogami: potranslacyjnie poprzez acylację reszt lizynowych białka lub translacyjnie poprzez włączanie S-ni- tro-Hcy do rosnącego łańcucha polipeptydowego białka. Efektem tego jes t obniżenie aktywności bio­logicznej komórki oraz indukcja patogenezy i arte- riosklerozy [89, 90].

W 1997 roku wykazano, że LysRS może mieć związek z chorobami ośrodkowego układu nerw o­wego np. w stwardnieniu rozsianym (ALS ang. A m y­otrophic Lateral Sclerosis). Rozwój tej choroby na-

Przeciwciała wzglądem aaRS uczestniczące w powstawaniu chorób autoimmunologicznych

Przeciwciało Antygen C horoby autoim m unologiczne Piśm iennictwo

Anty-Jo-1 HisRS PM rzadziej DM 76, 77

Anty-PL-7 ThrRS PM, DM 76, 80

Anty-PL-12 AlaRS+ tRNA Ala PM, DM, ILD 76, 81

Anty-OJ IleRS PM, DM, ILD 76, 82

Anty-EJ GlyRS DM, rzadziej PM 76, 83

Anty-Jo-1 (anty-H isRS); anty-PL-7 (anty-ThrRS); anty-PL-12 ( anty-A laRS i tRNA Ala); anty-OJ (anty-IlcR S); anty-EJ (anty-G ly), DM — za­palenie skórno-m iąśniow e, PM — zapalenie w ielom ięśniow e, ILD — śródm iąższow e zapalenie pluc.

na zapalenie mięśniowe i skórno-mięśniowe. Region ten tworzą głównie helikalne struktury białkowe [84, 85]. Homologiczny region został zidentyfikowany w dwuspecyficznej GluProRS H. sapiens. Obie synte­tazy połączone są 3-krotnie powtarzającymi się b lo­kami aminokwasowymi (ang. tandem repeat motif). Każdy segment o długości 57 aminokwasów jest od­powiednikiem końca aminowego HisRS. Podobny motyw występuje również przy końcu aminowym TrpRS i GlyRS, które podobnie jak HisRS mogą pełnić rolę autoantygenów w procesie autoimmuni- zacji [86],

Okazało się, że aaRS wyjaśnić może etiologię ar- teriosklerozy (tworzenie płytek miażdżycowych), która charakteryzuje się udziałem homocysteiny (Hcy) i syntetazy m etionylo-tRNA w uszkodzeniach naczyń krwionośnych. Homocysteina jest produk­tem pośrednim w biosyntezie metioniny. Różni się od metioniny brakiem tylko jednej grupy metylowej, w wyniku czego może być niespecyficznie rozpozna­wana przez MetRS. Aktywność korekcyjna MetRS zapobiega jednak przeniesieniu zaktywowanej Hcy na tRN A Met, prowadząc w obecności ATP do powsta­nia tiolaktonu homocysteiny. Proces ten odbywa się w komórkach wszystkich organizmów i zapobiega błędnemu wbudowaniu niebiałkowego aminokwasu w łańcuch polipeptydowy [87, 88]. Sytuacja ta jed-

stępuje w wyniku mutacji genu kodującego dysmuta- zę nadtlenkową. Zmutowane białko SOD1 tworzy kompleks z dwoma białkami, w tym z LysRS, pod­czas gdy natywna forma SOD1 nie wykazuje takiej właściwości. Ma to szczególne znaczenie w kom ór­kach mózgowych, gdzie poziom ekspresji LysRS i białka SOD1 jest bardzo wysoki [91].

V. Poszukiwanie antybiotyków skierowanych przeciwko bakteryjnym syntetazom ami­noacylo-tRNA

Antybiotyki s tanow ią grupę m etabolitów w tór­nych w ytw arzanych przez bakterie (E ubacteria les) , prom ieniow ce (A ctin o m yceta les ), grzyby (F ungi), rzadziej przez podstaw czaki (B asid iom ycetes), po ­rosty (L ich en es ) a także rośliny zielone i zwierzęta w yższe [92]. W spólną cechą w szystkich an tybio ty­ków je s t ich w ybiórcza zdolność ham ow ania aktyw ­ności określonych układów enzym atycznych drob­noustro jów a przez to w pływ ania na ich podstaw o­we procesy życiowe. aaRS katalizujące podsta­w ow ą reakcję am inoacylacji tRNA stanowią dosko­nałe narzędzie do syntezy tych inhibitorów. Duże zróżnicowanie strukturalne aaRS Prokaryota i Eu- karyota świadczy o wysokiej selektywności tych enzymów, dzięki której m ogą ograniczać aktyw ­

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 195http://rcin.org.pl

ność patogena nie zaburzając funkcji enzymu ludz­kiego. Leki będące substratami (np. am inokwasy) lub produktami pośrednim i (np. am inoacyloadeny- lan) w reakcji am inoacylacji tRNA z udziałem aaRS m ogąprow adzić do silnych zaburzeń syntezy białka [93]. Jednym z lepiej poznanych antybiotyków, k tó ­ry specyficznie oddziałuje z syntetazą am inoacy­lo-tRNA jes t m upirocyna (kwas pseudom onowy), wytwarzana przez bakterie P seudom onic flu o re - scens [94]. M upirocyna została po raz p ierwszy w y­izolowana w 1971 roku, a w krótce potem określono

Tabela 3

tworzenia izoleucylo-adenylanu. Posiada on szkie­let węglowy L-izoleucyny zawierający grupę epok­sydową. W ydaje się, że antybiotyk ten będący ana­logiem L-izoleucyny w spółzaw odniczy o miejsce wiązania przez IleRS. Ponadto antybiotyk ten przyłącza się do m iejsca aktywnego IleRS poprzez zachow aw czą sekw encję 602K M SK S606, blokując miejsce wiązania ATP [ 102], Zastosowanie mupiro- cyny w leczeniu chorób zakaźnych ma jednak pew ­ne ograniczenia. Jest to związek mało stabilny i we krwi ulega hydrolizie do kwasu monowego. Obec-

Struktury chemiczne inhibitorów (antybiotyków) niektórych bakteryjnych syntetaz aminoacylo-tRNA

L.p.Nazwa

antybiotykuWzór

strukturalny AARS Piśmiennictwo

I. mupirocyna

onw, Y i T r 0' 1

en , o IleRS 97

II- indolmycynaCHj

--- ¡T— C H -C H -C = 0

C X 7 vH 1

NHCHj

TrpRS 103

III. borelidyna

OH

h3CV N / V >HjC J CH, CHj C=0

JL X COOHho y ^ --- rCN

ThrRS 104

IV. furanomycynaNHj

HaC O ¿-COOHW H

IleRS 105

V. granatycynaO

LeuRS 106

Antybiotyki te były projektow ane w oparciu o strukturę substratów lub produktów pośrednich reakcji am inoacylacji.

jej strukturę (Tabela 3) [95-97]. Jest to inhibitor IleRS patogenów g ram -doda tn ich jak: S taphylo ­coccus epiderm i, S taphylococcus aureus, S taphylo ­coccus saphrophyticus oraz gram-ujem nych: H a­em ophilus influenzae, N eisseria gonorrhoeae i N e­isseria m eningitid is [98-100]. Infekcje w yw oływ a­ne przez S. aureus p row adzą do zaburzeń układu od­dechowego [100]. S. aureus charakteryzuje się w y­soką opornością na w iększość stosowanych anty­biotyków (np. ß-laktamy). M upirocyna charak tery­zuje się znaczną selektywnością . Inhibuje ona ak­tywność bakteryjnej IleRS z w yda jnośc ią 10000- -krotnie w iększą niż IleRS ssaków [101]. Kwas pseudom onow y blokuje aktyw ność IleRS na etapie

nie projektuje się antybiotyki syntetyczne, będące analogami m upirocyny o korzystniejszych w łaś­ciwościach terapeutycznych jak: wyższa stabilność i selektywność. Jednym z nich jes t inhibitor CB432, który hamuje aktywność bakteryjnej IleRS z w yda j­nością 60-11000 krotnie w iększą aniżeli IleRS człowieka. Stężenie 0,1; 0,5 i 10 pg/ml jes t w ystar­czające aby zaham ować wzrost bakterii odpow ied­nio: S. aureus, S. pyogenes i E. coli [93].

Innym antybiotykiem, inhibitorem syntetaz am i­noacylo-tRNA jest indolmycyna, opisywana początkowo jako antybiotyk PA -155A. Jest to po ­chodna tryptofanu (Tabela 3). Hamuje ona wzrost bakterii gram-dodatnich i gram-ujemnych. Indolmy-

196 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

cyna blokuje aktywację tryptofanu na etapie tworze­nia tryptofanylo-adenylanu [103].

Odmienny mechanizm działania antybiotyków na aaRS wykazuje borelidyna, która jes t inhibitorem ThrRS, produkowanym przez Streptom yces species (Tabela 3) [104], Przypuszcza się, że w tym przypad­ku blokowany jest etap aminoacylacji tRNA. Innymi naturalnymi inhibitorami bakteryjnymi aaRS są: fu- ranomycyna (ang . fu ranom ic in ) [105], granatycyna (ang. granaticin ) [106], ochratoksyna (ang. ochra- toxin) i cyspentacyna (ang. cispentacin ), które ha­mują działanie odpowiednio: IleRS [107], LeuRS [108] PheRS [108,109] i ProRS [110] (Tabela 3). Znane są także inhibitory GlnRS [111], GluRS [112] oraz MetRS [113, 114]. Są to analogi odpowiednio glutaminyloadenylanu, glutaminianu, metionyloade- nylanu i metioniny.

Podstawowym problemem, który nie tylko ograni­cza skuteczność antybiotyków, ale także zmusza do poszukiwania nowych, jes t antybiotykooporność, polegająca na uodparnianiu się drobnoustrojów na ich działanie. Jak dotąd nie wydaje się, aby antybio­tyki hamujące działanie aaRS mogły całkowicie roz­wiązać ten problem. Składa się na to kilka czynni­ków. Częstość spontanicznych mutacji w komórkach bakteryjnych waha się w granicach 10'5-10 '9. Punk­towe mutacje bakteryjnych IleRS wywołują natych­miastowe obniżenie wrażliwości patogena na mupi- rocynę. W ostatnich latach wzrosła oporność szcze­pu S. aureus na ten antybiotyk. Przyczyną tego jest pojawienie się drugiego genu IleRS, który występuje w plazmidzie bakterii. Produkt tego genu wykazuje tylko 34% identyczności aminokwasowej z IleRS kodowanej przez chromosomalny DNA [115]. Jak wiadomo plazmidowy rodzaj oporności charaktery­zuje się ogrom ną łatwością przenoszenia, nie tylko wśród szczepów tego samego gatunku, ale także roz­przestrzeniania się na inne gatunki. Zadaniem współczesnej m edycyny jes t poszukiwanie antybio­tyków o zmienionych strukturach chemicznych, w odpowiedzi na nowo pojawiające się drobnoustroje. Wydaje się, że w najbliższej przyszłości poszukiwa­nie antybiotyków realizowane będzie w oparciu o ge- nomikę. W genomach H elicobacterpyro li, M ethano- coccus ja n a sh i czy Borelia burgdorferi nie znalezio­no genów syntetazy Gln-tRNAGln oraz A sn-tRNAAsn. Pośrednia glutaminylacja zachodzi przy udziale syntetazy glutamylo-tRNA i amido- transferazy glutamylo-tRNA. Amidotransferaza, której obecność jes t konieczna dla prawidłowego funkcjonowana aparatu translacyjnego Archea może stanowić interesujące narzędzie w projektowaniu an­tybiotyków [116]. Szczególnym przykładem wśród

syntetaz aminoacylo-tRNA jest LysRS, która według kanonicznego podziału syntetaz przynależy do klasy II, a wśród niektórych patogennych bakterii zidenty­fikowano LysRS o strukturze typowej dla klasy I-ej syntetaz. Ta cecha LysRS może być wykorzystana w projektowaniu antybiotyków, które specyficznie blokowałby aktywność tylko LysRS patogena.

VI. Perspektywy

Z przedstawionej charakterystyki wynika, że aaRS należą do jednej z najstarszych i najlepiej po­znanych rodziny białek. Również z tego powodu sta­now ią one dobre narzędzie badawcze do poszukiwa­nia odpowiedzi na pytania dotyczące ewolucji. Wia­domo, że enzymy te zawierają klasyczne motywy wiążące dinukleotydy występujące także w wielu in­nych białkach jak oksydazy czy dehydrogenazy. N a­suwa się natychmiast pytanie o relacje między tymi enzymami a także o wspólnego przodka.

Podstawowa rola kom órkowa aaRS związana z acylacją tRNA specyficznym aminokwasem daje szanse wykorzystania tych enzymów do celów dia­gnostycznych. Na przykład inhibitory projektowane w oparciu o substraty lub produkty pośrednie tej re­akcji s tanowią now ą alternatywę dla farmakologii. Podejmowane są również próby rozszerzenia kodu genetycznego w celu włączenia nienaturalnych am i­nokwasów do dowolnego białka. Ich celem jes t skon­struowanie nowych par syntetaza-tRNA, które byłyby specyficzne wobec nowych aminokwasów i włączanie ich do powstającego peptydu. Rozwiąza­nie tego i podobnych zagadnień z udziałem nowych aa-tRNA umożliwi syntezę dowolnych białek o właściwościach i zastosowaniach terapeutycznych.

A rtyku ł o trzym ano 23 kw ietn ia 2002 Z aakceptow ano do druku 7 m aja 2002

Piśmiennictwo:

1. A r n e z J G , M o r a s D ( 1 9 9 7 ) Trends Biochem Sci 22:211-2162. G o l d g u r Y, M o s y a k L, R e s h e t n i k o v a L, A n k i -

l o v a V, L a v r i k K , K h o d y r e v a S, S a f r o M (1997) Structure 15: 59-68

3. S i a t e c k a M, B a r c i s z e w s k i J (1995) Post Biochem 41: 266-275

4. I b b a M, C u r n o w A W , S o l i D (1997) Trends Biochem Sci 22: 39-42

5. J G A r n e z a n d D M o r a s (1994) Oxford University Press, New York, wyd. przez: K Nagai I IW Mattaj

6. B u r b a u m J , S c h i m m e l P (1991) J Biol Chem 266: 16965-16968

7. D e l a r u e M, M o r a s D (1993) Bioessays 15: 675-6868. M o r a s D (1990) Nature 344: 195-1979. Moras D (1992) Trends Biochem Sci 17: 159-16410. C u s a c k S (1997) Curr Opin Struct Biol 7:881-88911. C u s a k S (1999) Curr Opin Struct Biol 9: 66-73

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 197http://rcin.org.pl

12. C u s a c k S (1995) Nat Struct Biol 2: 824-83113. M i r a n d ę M, L a z a r d M, K e r j a n P, B e e G, A g o u F,

Q u e v i l l o n S , W a l l e r J - P (1993): w: K. H. NicrhausThe Translational Apparatus, wyd. Plenu Press, New York str. 657-668

14. I b b a M , S ö l l D (2000) Annu Rev Biochem 69: 617-65015. R h o S B , L e e J S , J e o n g E J , K i m Y G , K i m S (1998)7

Biol Chem 273: 11267-1127316. Y a n g D C H (1996) Curr Top Cell Regul 34: 101-13617. Berbeć H (1990) Post Biochem 3-4: 41-5018. D e i n e r t K, F a s i o l o F, H u r t E C , S i m o s G (2001)7

Biol Chem 276: 6000-600819. S i m o s G, S a u e r A, F a s i o l o F, H u r t E C (1998) Mol

Cell 1: 235-24220. W a n g C C , S h i m m e l P ( 1 9 9 9 ) 7 B i o l C h e m 2 7 4 :

1 65 08 - 1 6 5 1 22 1 . Q u e v i l l o n S, R o b i n s o n J C , B e r t h o n n e a u E, S i a -

t e c k a M, M i r a n d ę M (1999) 7 Mol Biol 285: 183-19522. M u r r a y J C , T a s J (1996) Int 7 Biochem Cell Biol 28: 837-84123. Q u e v i l l o n S, A g o u F, R o b i n s o n J C , M i r a n d ę M

(1997) 7 Biol Chem 272:32573-3257924. Shalak V, Kamińska M, Mitnacht-Kraus R, Vandenabeele P, Clauss

M, Mirandę (2001) 7 Biol Chem 276: 23769-2377625. K im Y , S h i n J , Li R, C h e o n g C, K i m K, K i m S

(2000)7 Biol Chem 275: 27062-2706826. Q u e v i l l o n S, M i r a n d ę M (1996) FEBS Lett 395: 63-67.27. N a t h a n s o n L, D e u t s c h e r M P (2000) 7 Biol Chem

275:31559-3156228. W e y g a n d - D u r a s e v i ć I , L e n h a r d B, F i l i p i e S,

S ö l l D (1 9 9 6 )7 Biol Chem 271:2455-246129. F r u g i e r M, M o u l i n i e r L, G i e g e R (2000) EMBO J 19:

2371-238030. S c h i m m e l P, R i b a s d e P o p u p l a n a L (2000) Trends

Biochem Sei 25: 207-2093 1 . K a m i ń s k a M, D e n i z i a k M, K e r j a n P, B a r c i s z e w -

s k i J , M i r a n d ę M A (2000) EMBO 7 19: 6908-691732. S t a p u l i o n i s R, D e u t s c h e r M P (1995) Proc Natl Acad Sei

USA 92: 7158-716133. W i l c o x M, N i r e n b e r g M (1968) Proc Natl Acad Sei USA

61:229-23634. B u l t C J , W h i t e O, O l s e n G J , Z h o u L, F l e -

i s c h m a n n R D , S u t t o n G G , B l a k e J A , F i t z G e r a l d L M , C l a y t o n R A , G o c a y n e J D , K e r l a v a g e A R , D o u g h e r t y B A , T o m b J F , A d a m s M D , R e i c h C l , O v e r b e e k R, K i r k n e s s E F , W e i n s t o c k K G , M e r ­r i c k J M , G l o d e k A, S c o t t J L , G e o g h a g e n N S , W e - i d m a n J F , F u h r m a n n J L , N g u y e n D, U t t e r b a c k T R , K e l l e y J M , P e t e r s o n J D , S a d o w P W , H a n n a M C , C o t t o n M D , R o b e r t s K M , H u r s t M A , K a i n e B P , B o r o d o v s k y M, K l e n k H - P , F r a s e r C M , S m i ­t h H O , W o e s e C R , V e n t e r J C (1996) Science 273: 1058-1073

35. I b b a M, S ö l l D (2001) EM BO reports 2: 382-38736. A r n e z J G , M o r a s D (1998) Cold Spring Harbor Laboratory

Press3 7 . I b b a M, C u r n o w A W , S ö l l D (1997) Trends Biochem Sei

22: 39-4238. K o o n i n E V , A r a v i n d L (1998) Curr Biol 8: R266-R26939. I b b a M, B e c k e r H D , S t a t h o p o u l o s C , T u m b u l a

D L , S ö l l D (2000) Trends Biochem Sei 25:311-31640. C u r n o w A W , I b b a M, S ö l l D (1996) Afo/nre 382: 589-59041. S e k i n e S, N u r e k i O, S h i m a d a A, V a s s y l y e v D G ,

Y o k o y a m a S (2001) Nat Struct Biol 8: 203-20642. I b b a M, M o r g a n S, C u r n o w A W , P r i d m o r e D R ,

V o t h k n e c h t U C , G a r d e n W, L i n W, W o e s e C R , S ö l l D (1997) Science 278: 1119-1122

43. S ö l l D, B e c k e r H D , P l a t e a u P, B l a n q u a t S, I b b a M (2000) Proc Natl Acad Sei USA 97: 14224-14228

44. I b b a M, L o s e y H C , K a w a r a b a y a s i Y, K i k u c h i H, B o n j u n S, S ö l l D (1999) Proc Natl Acad Sei USA 96:418-423

45. S t a t h o p o u l o s C, Li T , L o n g m a n R, V o t h k n e c h t U C , B e c k e r H D , I b b a M, S ö l l M (2000) Science 287: 479-482

46. S t a t h o p o u l u s C, J a c q u i n - B e c k e r C , B e c k e r D H , Li T , A m b r o g e l l y A, L o n g m a n R, S ö l l D (2001)Bio­chemistry 40: 46-52

47. Y a r u s M (2000) Science 287: 440-44148. Putzer H, Grunbcrg-Manago M, Springer M (1995) w: tRNA Struc­

ture, Biosynthesis and Function, ASM Press, Washington DC, 293-333.

49. Sacerdot C, Caillet J, Graffe M, Eyermann F, Ehresmann B, Ehres- mann C, Springer M, Romby P (1998) Mol Microbiol 29: 1077-1090

50. Sankaranarayanan R, Dock-Bregeon AC, Romby P, Caillet J, Sprin­ger M, Rees B, Ehresmann C, Ehresmann B, Moras D (1999) Cell 97: 371-381

5 1 . P u t n e y S D , S c h i m m e l P (1981) Nature 291: 632-6355 2 . C a p r a r a M G , L e h n e r t V, L a m b o w i t z A M , W e -

s t h o f E (1996) Cell 87: 1 135-1145.5 3 . K a m p e r U, K u c k U, C h e r n i a c k A D , L a m b o w i t z

A M (1992) M ol Cell Biol 12: 499-5115 4 . H e r b e r t C J , L a b o u e s s e M, D u j a r d i n G, S ł o n i m ­

s k i P P (1988) EMBO 7 7: 473-483.55 . L a m b o w i t z A M , P e r l m a n P S (1990) Trends Biochem Sei

15; 440-444.56. H o u m a n F, R h o S B , Z h a n g J , S h e n X, W a n g C C ,

S c h i m m e l P, M a r t i n i s S A (2000) Proc Natl Acad Sei USA 97: 13743-13748

57. N i s h i m u r a A (1998) Trends Biochem Sei 23: 157-1595 8 . K i s s e l e v L L , J u s t e s e n J, W o l f s o n A D , F r o l o v a

L Y (1998) FEBS Lett. A ll'. 157-16359. K u m a r A M , S c h a u b U, S ö l l D, U j w a l M L (1996)

7755 1: 371-37560. S i s s l e r M, D e l o r m e C, B o n d J, E h r l i c h S D , R e ­

n a u l t P, F r a n c k l y n C ( 1 9 9 9 ) Proc Natl Acad SciUSA 96: 8985-8990

ó l . H a e n n i A - L , C h a p e v i l l e F (1997) Acta Biochim Pol 44: 827-837

62. W a k a s u g i K, S c h i m m e l P (1999) Science 284: 147-1516 3 . T a s s M P R . i M u r r a y J C (1996) Int. 7. Biochem. Cell Biol.

28: 837-84164. W a k a s u g i K, S l i k e B M , H o o d J , O t a n i A, E w a l t

K L, F r i e d l a n d e r M, C h e r e s h D A, S c h i m m e l P(2002) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8: 173-177

65. U w e r U, W i l l m i t z e r L, A l t m a n n T (1998) Plant Cell 10: 1277-1294

66. S e s h a i a h P, A n d r e w D J : (1999) Mol Biol Cell 10:1595-1608

67. F e r s h t A R (1997) Enzyme Structure and Mechanism , 263pp., Freeman, San Francisco

68. N u r e k i O, V a s s y l y e v D G , T e t e n o M, S h i m a d a A, N a k a m a T , F u k a i S, K o n n o M, H e n d r i c k s o n T L , S c h i m m e l P, Y o k o y a m a S (1998) Science 280: 578-582

69. J a k u b o w s k i H (1999) Biochemistry 38: 8088-809370. J a k ó b i s i a k M (1995) Immunologia, wyd. PWN, Warszawa71. P a 1 e y E L , A l e x a n d r o v a N, S m e l a n s k y L (1995) Im­

munol Lett 48: 201-20772. R e i m e r G , R o s e K M , S c h e e r U , T a n E M (1987) 7 Clin

Invest 79: 65-727 3 . S a m u e l s D S , T o j o T , H o m m a M, S h i m i z u N (1986)

FEBS Lett 209: 231-23474. U i b o R, M a c k a y I R , R o w l e y M, H u m p h r i e s P,

A m s t r o n g J M , M c N e i l a g e J (1990) Clin Exp Immunol 80: 19-24

75. T h o r e n - T o l l i n g K, R y d e n L (1991) Acta Vet Scand 32: 15-26

76. T a r g o f f I N (1992) Rheum Dis Clin North Am 18: 445-48277. B i s w a s T , M i l l e r F W , T a k a g a k i Y, P l o t z P H

(1987) J Immunol Methods 98: 243-24878. T a r g o f f I N , T r i e u E P , P l o t z P H , M i l l e r F W (1992)

Arthritis Rheum 35: 821-8307 9 . B e a u l a n d e M, T a r b o u r i e c h N, H a r t l e i n M (1998)

Nucleic Acid Res 26: 521-52480. T a r g o f f I N , A r n e t t F C , R e i c h l i n M (1988) Arthr

Rheum 31: 515-52481 . T a r g o f f I N , A r n e t t F C (1990) Am J Med 88: 241-251

198 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

82. T a r g o f f I N , T r i e u E P , M i l l e r F W (1993) J Clin Invest 91: 2556-64

83. G e Q, T r i e u E P , T a r g o f f I N (1994) J Biol Chem 269: 28790-28797

84. R a b e n N, N i c h o l a s R, D o h l m a n J , M c P h i e P, S r i d h a r V , H y d e C, L e f f R , P l o t z P (1994) J Biol Chem 269: 24277-24283

85. B 1 e c h y n d e n L M , L a w s o n C M , G a r l e p p M J (1996)Gene 178: 151-156

86. B c r t h o n n e a u E, M i r a n d ę M (2000) FEBS Lett 470:300-304

87. J a k u b o w s k i H (1995) J Biol Chem 270: 17672-1767388. J a k u b o w s k i H (1991) EMBO J 10: 593-59889. J a k u b o w s k i H, Z h a n g L, B a r d e g u e z A, A v i v A (

2000) Circ Res 87: 45-5190. J a k u b o w s k i H (2001) J Nutr 131: 2983S-7S91 . K u n s t C B , M e z e y E, B r o w n s t e i n M J , P a t t e r s o n

D (1997) Nat Genet 15: 91-949 2 . Z e j c A, G o r c z y c a M (1998) Chemia leków, wyd. PZWL,

Warszawa93. S c h i m m e l P, T a o J , H i l l J ( \9 9 8 )F A S E B J 12: 1599-160994. B r o o m N J P , C a s s e l s R, C h e n g H Y , E l d e r J S ,

H a n n a n P C , M a s s o n N , O ’ H a n l o n P J , P o p e A, W i l s o n J M (1996) J M e d Chem 39: 3596-3600

95. B a i n e s P J , J a c k s o n D, M e l l o w s G, S w a i s l a n dA J , T a s k e r T C G (1984) W i 1 k i n s o n D S , P r i c e J D (eds), Royal Society o f Medicine, London, UK: 13-22

96. S i l v i a n L, W a n g J , S t e i t z T A (1999) Science 285:1074-1077

97. Z e j c a A, G o r c z y c a M (1998) Chemia leków wyd.: PZWLWarszawa

98. P o p e A J , L a p o i n t e J , M e n s a h L, B e n s o n N,B r o w n M J , M o o r e K J (1998) J Biol Chem 273: 31680-31690

99. P o p e A J , M o o r e K J , M c V e y M, M e n s a h L, B e n ­s o n N, O s b o u r n e N , B r o o m N , B r o w n M J , O ’ H a n l o n P (1998) J Biol Chem 273: 31691-31701

100. P o p e A J , M c V e y M, F a n t o m K, M o o r e K J (1998)7 Biol Chem 273: 31702-31706

101. H u g h e s J , M e l l o w s G (1980) Biochem J 191: 209-219102. Y a n a g i s a w a T , L e e J L , W u H C , K a w a k a m i M

(1994) J Biol Chem 269: 24304-24309103.W e r n e r R G , T h o r p e L F , R e u t e r W, N i e r h a u s K H

(1976) Eur J Biochem 68: 1-3104. F r e i s t W , G a u s s D H (1995) Biol Cchem Hoppe Syler 376:

213-224105. N e g w e r M (1978) Organic-chemical drugs and their synonyms

vol 1, Akademie Verlang, Berlin106. K o r z y b o w s k i T , K o w s z y k - G i n d i f e r Z,

K u r y ł o w i c z W (1997) Antybiotyki: pochodne, rodzaje i właściwości PZWL Warszawa

107. Tanara K, Tamaki M, Watanabe S (1996) Biochem Biophys Acta 195: 244-245

108. Konrad I, Röschenthaler R (1977) FEBS Lett 83: 341-348109. R o t h A, E r i a n i G, D i r h e i m e r G, G a n g l o f f J

(1993) FEBS Lett 326: 87-91110. H e a c o c k D H , F o r s y t h C J , S h i b a K, M u s i e r - F o r -

s y t h K (1996) Bioorg Chem 24: 273-289111. B e r n i e r S, D u b o i s D Y , T h e r r i e n M, L a p o i n t e J,

C h q n e v e r t R (2000) Bioorg M ed Chem Lett 10: 2441-2444112. D e s j a r d i n s M, D e s g a g n e s J , L a c o s t e L, Y a n g F,

M o r i n M P , L a p o i n t e J (1997) Bioorg Med Chem Lett 1 : 2363-2366

113. L e e J, K a n g S U , K a n g M K , C h u n M M , J o Y J , K w a k J H , K i m S (1999) Bioorg M ed Chem Lett 9: 1365-1370

114. L e e J , K a n g M K , C h u n M M , J o Y J , K w a k J H , K i m S (1998) Bioorg M ed Chem Lett 8: 3511-3514,

115 B r o w n J R , Z h a n g J , H o d g s o n J E (1998) Curr Biol 8: R365-R367

116. D e c i c c o C P , N e l s o n D J , L u o Y, S h e n L, H o r i u - c h i K Y , A m s l e r K M , F o s t e r L A , S p i t z S M , M e r r l i l l J J , S i z c m o n e C h , G o g e r s K C , C o p e ­l a n d R A , H a r p e l M R (2001) Bioorg M ed Chem Lett 11: 2561-2564

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 199http://rcin.org.pl

Niedobór cholesterolu sygnałem dla transdukcji informacji z endoplazmatycznego retikulum do jądra komórkowego — procesy proteolitycznego odszczepienia czynników transkrypcyjnych z błon ER

Depletion of cholesterol in signal transduction from endoplasmic reticulum to the cell nucleus — the proteolytic cleavage of transcription factors from the ER membranes

BOŻENA WIECZOREK1, JADWIGA GNIOT-SZULŻYCKA2

Spis treści:

I. W stępII. Sterolowe elem enty regulatorowe SRE i białka SREBPIII. Budowa białek SREBPIV. M echanizm dw uetapowego procesu proteolizy białka

SREBPIV -1.SC A P — białko aktyw ujące proteolityczne rozsz­

czepienie SREBP z udziałem proteaz S1P i S2PIV-2. Proces proteolizy białka SR EBP błon ER i uwol­

nienie czynnika transkrypcyjnego SREBP-68

Contents:

I. IntroductionII. SRE-steroł regulatory elem ents and SREBP-steroł regu­

latory elem ent binding proteinsIII. Structure of the SREBP proteinsIV. M echanism of the proteolytic cleavage and release of

SREBPIV-1. SCAP, the SREBP cleavage activating proteinIV-2. The proteolytic cleavage process and release of the

transcription factor SREBP-68

Wykaz stosowanych skrótów: ACAT — acylotransferaza acy-lo-CoA:cholesterol; AG — aparat Golgiego; bHLH-Zip — mo­tyw suwaka leucynowego (ang. b a sic -h e lix -lo o p -h e lix -leu c i- ne-zipper)\ HDL — lipoproteiny o dużej gęstości; LDL — lipo- proteiny o małej gęstości; SCAP — białko aktywujące proteoli­tyczne rozszczepienie SREBP (ang. SREBP c lea va g e a c tiva tin g protein)', SIP — proteaza miejsca 1 (ang. s ite - \ p ro te a se ); S2P— proteaza miejsca 2 (ang. s ite -2 p ro tea se )\ SRE — sterolowy element regulatorowy (ang. ste ro l reg u la to ry e lem en t); SREBP— białka błon o m.cz. 125 kDa podlegające proteolizie z uwol­nieniem SREBP-68; SREBP-68 — białka wiążące się ze stero­lowym elementem regulatorowym (ang. s te ro l reg u la to ry e le ­m ent b in d in g protein)', VLDL — lipoproteiny o bardzo małej gę­stości.

'Mgr, 2prof. dr hab., Zakład Biochemii, Instytut Biologii (Ogól­nej i Molekularnej), Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, Uniwer­sytet Mikołaja Kopernika, ul. Gagarina 7/9, 87-100 Toruń; e-mail: jgsz@biol.uni.torun.pl

I. Wstęp

Cholesterol jest związkiem nieodzownym dla pra­widłowego przebiegu wielu procesów m etabolicz­nych zachodzących w komórkach i tkankach organi­zmów wyższych. Jako składnik błon biologicznych uczestniczy w regulacji ich struktury i funkcji. Cho­lesterol jest także wyjściowym substratem do bio­syntezy wszystkich hormonów steroidowych, w ita­miny D3, kwasów żółciowych i oksysteroli [1-8].

W komórkach eukariotycznych cholesterol po­chodzi z wewnątrzkomórkowej syntezy de novo oraz cholesterolu dostarczanego z zewnątrz. Rozprowa­dzanie cholesterolu zachodzi z udziałem jego szybko wymienialnej puli, którą stanowią lipoproteiny oso­cza (VLDL, LDL, HDL), a wychwytywany jest przez tkanki głównie poprzez receptorozależną endocyto- zę. U ssaków głównym miejscem biosyntezy chole­

200 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

sterolu są wątroba, jelito cienkie, mięśnie szkieleto­we i skóra [1, 5, 8-10].

Synteza de novo w komórce zachodząca w błonach retikulum endoplazmatycznego (ER) podle­ga precyzyjnej regulacji na poziomie transkrypcji, translacji i bezpośredniej regulacji aktywności k lu­czowych enzymów szlaku biosyntezy cholesterolu. Nieprawidłowości metaboliczne wynikające z nad­miernej podaży cholesterolu ukierunkowały badania ostatnich trzydziestu lat głównie na poznanie m echa­nizmów ograniczających biosyntezę i zaangażowa­nych w utrzymaniu jego prawidłowego stężenia [ 1 , 11-21],

Modulacja aktywności kluczowych enzymów szlaku biosyntezy cholesterolu jes t procesem stosun­kowo dobrze poznanym i polega na modyfikacji ko­walencyjnej przez fosforylację i defosforylację, zmianie konformacji niektórych enzymów przez cholesterol i metabolity pośrednie oraz inhibitory kompetycyjne. Stwierdzono ponadto, iż enzymy szlaku biosyntezy cholesterolu pozostają pod kon­trolą statusu oksydacyjno-redukcyjnego komórki i aktywności enzymów proteolitycznych [ 1 , 11-15].

Konstytutywna regulacja procesów transkrypcji enzymów biosyntezy cholesterolu, przemian mewa- lonianu i metabolizmu kwasów tłuszczowych polega na oddziaływaniu szeregu sygnałowych związków z czynnikami transkrypcyjnymi uczestniczącymi w re­gulacji odczytu promotorów z ramką E (CANNTG- 3 ') .Takimi związkami sygnałowymi są np. choleste­rol, oksysterole, malonylo-CoA, kwasy tłuszczowe i kwasy żółciowe [16-19]. Transkrypcyjna regulacja syntezy enzymów szlaku biosyntezy przemian me- walonianu przez końcowy produkt cholesterol, była przedmiotem szczególnie intensywnych badań. W y­mogiem strukturalnym, koniecznym dla wywarcia hamującego efektu przez cholesterol jes t obecność niezestryfikowanej grupy hydroksylowej w pozycji 3 pierścienia steroidowego, a obecność grupy keto­nowej lub hydroksylowej w pozycji 6 , 7 lub 25 znacznie zwiększa efekt inhibitorowy. Wykazano również, że naturalne oksysterole, występujące w śladowych ilościach są skuteczniejszymi od chole­sterolu inhibitorami transkrypcji [10, 17, 20, 21].

Oprócz m echanizm ów regulujących homeostazę cholesterolu przy prawidłowej i nadmiernej jego po­daży, istnieją również m echanizm y odbioru sygnału o jego niedoborze i konieczności uaktywnienia pro­cesów biosyntezy. M echanizm y te polegają na akty­wacji genów z promotorami ze sterolowym elemen­tem regulatorowym (SRE).

Przedmiotem niniejszego artykułu będzie om ó­wienie poznanych w ostatnich latach mechanizmów

proteolitycznego odszczepienia czynników tran- skrypcyjnych z integralnych białek SREBP. Białka te zlokalizowane są głównie w błonach ER.

II. Sterolowe elementy regulatorowe SRE i białka SREBP

Za zależną od obniżonego poziomu steroli regula­cję transkrypcji odpowiedzialne są regiony prom oto­rów ekspresji genów dla enzymów szlaku biosyntezy cholesterolu, receptora LDL i lipogenezy. Zawierają one jed n ą lub wiele kopii jednego z wariantów10-nukleotydowej sekwencji: 3 ’-CATGAGATCA- C C C C A C T G C A A -5’. Regiony te określane są m ia­nem sterolowy element regulatorowy (SRE). Ich ak­tywacja jest niezbędna dla inicjacji transkrypcji w kom órkach sygnalizujących zapotrzebowanie na cholesterol (Tabela 1) [17, 21, 22]. Aktywacja SRE nie zachodzi w warunkach konstytutywnej (podsta­wowej) ekspresji, gdy komórka nie sygnalizuje zapo­trzebowania na cholesterol.

Obniżenie się stężenia cholesterolu w komórce inicjuje proteolityczne procesy prowadzące do uwol­nienia z integralnych białek błonowych, SREBP, re­t ikulum endoplazmatycznego, rozpuszczalnych fragmentów SERB P-68 . Uwolnione białka SRE- B P -68 transportowane są do jądra komórkowego, gdzie uczestniczą w aktywacji genów z promotorami SRE.

Białka SREBP zostały wykryte w 1993 roku [25, 26] przez dwie odrębne grupy badaczy: H u a , Y o k o y a m a , W u , B r i g g s , B r o w n , G o l d ­s t e i n i W a n g z University o f Texas (Dallas), zaj­mujących się metabolizmem cholesterolu oraz T o n - t o n o z , K i m , G r a v e s i S p i e g e l m a n z Harvard Medical School (Boston), prowadzących badania nad metabolizmem cholesterolu i jego w pływ em na procesy różnicowania [16-18, 21-23, 27, 28].

Białka SREBP są składnikiem błony retikulum endoplazmatycznego (ER). Ich obecność stwierdzo­no również w błonie jądrowej i błonach Aparatu Gol- giego (AG).

Aktualnie znane są trzy izoformy białka SREBP: S R E B P -la , S R E B P -lc i SREBP-2. Białka te kodo­wane są przez dwa geny. Gen SR E B P-1 z dwoma promotorami koduje białka S R E B P -la i lc , różniące się tylko d ługośc iąN - końcowej domeny, S R E B P -la zawiera dodatkowo w tej domenie 29 kwaśnych am i­nokwasów. Gen SREBP-2 koduje pojedyncze białko (Ryc. 1) [17,18, 28-30].

N adekspresja S R E B P -la wywołuje intensywną biosyntezę cholesterolu i kwasów tłuszczowych, na-

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 201http://rcin.org.pl

dekspresja S R E B P-lc um iarkowany wzrost b iosyn­tezy cholesterolu i kwasów tłuszczowych. Według najnowszych badań S R E B P -lc , najpraw dopodob­niej reguluje głównie syntezę kwasów tłuszczowych i w mniejszym stopniu cholesterolu.

SRE B P-lc uczestniczy również w regulacji meta­bolizmu węglowodanów. Białko SREBP-2 wpływa głównie na biosyntezę cholesterolu i w pewnym stopniu również na biosyntezę kwasów tłuszczo­wych. Ekspresja białek SREBP jes t kontrolowana na wielu poziomach i zachodzi w odpowiedzi na zmiany stężenia cholesterolu, oksysteroli, wielonienasyco- nych kwasów tłuszczowych, glukagonu, cAMP oraz stosunku insulina/glukoza (Tabela 2) [17, 28, 31].

mRNA pozostaje w korelacji z ilością odpowiednich białek SREBP [28],

III. Budowa białek SREBP

SREBP to trójdomenowe białka (~ 1150 am ino­kwasów) o masie 125 kDa, o orientacji szpilki do włosów, związane z błonami ER (Ryc. 2); ich N-ter- minalne domeny (~ 480 aminokwasów) i C-terminal- ne domeny (~ 590 aminokwasów) znajdują się w cy- tosolu. Białka SREBP zakotwiczone są w błonie do­m eną centralną (~ 80 aminokwasów). Ta unikalna domena odróżniająca SREBP od innych białek błonowych, zawiera dwa hydrofobowe 2 2 -amino-

Tabela 1

Nukleotydowe sekwencje dla sterolowych elementów regulatorowych SRE [na podstawie 17]

Geny odpowiedzialne za syntezę Sekwencja SRE

OU Receptora LDL ATCACCCCACt/5 Syntazy HMG-CoA CTCACCCCACO-Co GCCACCCTACoNO Reduktazy HMG-CoA ACCGCACCATa CTCTCACCACtS)CJ Syntazy farnezylo-PP CTCACACGAG

'c Syntazy skwalenu ATCACGCCAG.a CGATGCTGAGoQh SREBP-2 ATCACCCCAC

Karboksylazy acetylo-CoA

Syntazy kwasów tłuszczowych

Desaturazy 1 stearylo-CoA

Desaturazy 2 stearylo-CoA

Acylotransferazy glicerylo-3-fosforanu

GGAGGACCAT

CTCACGTCGC

ATCACCCCAC

AGCAGATTGC

AGCAGATTGT

CTCAGCCTAG

InneLiaza ATP-cytrynian

TCAGGCTAG

Stężenie poszczególnych form SREBP jes t odm ien­ne w różnych tkankach. Dla przykładu w wątrobie i adopocytach ilość mRNA dla S R E B P -1 c przewyższa odpowiednio 9- i 3-krotnie zawartość m RNA dla SREBP-la. Natomiast śledziona zawiera 10-krotnie więcej SREB P-la , aniżeli lc. W większości tkanek przeważa ekspresja białka SR E B P-la . Zawartość

kwasowe segmenty transmembranowe połączone krótką 31 -am inokwasową pętlą zwróconą do światła błon ER. N-końcowe partie białek SREBP zawierają sekwencje bogate w aminokwasy kwaśne. Sekwen­cje te są stosunkowo długie w S R E B P-1 a (42 am ino­kwasy) i SREBP-2 (48 aminokwasów), natomiast w SR E B P -lc ten odcinek jes t krótszy i zawiera 24 am i­

202 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

Ryc. 1. Domeny i homologia struktury białek SREBP-la I SREBP-2 wg [18]).

nokwasy. Po odcinkach bogatych w aminokwasy kwaśne występują sekwencje bogate w prolinę, sery- nę, glicynę i glutaminę, z następującą po nich kla­syczną sekwencją bHLH-Zip. Kolejne odcinki białek SREBP to dwa hydrofobowe segmenty transbłonowe przedzielone krótką sekwencją łącznikową oraz re­gulatorowa domena C-końca (Ryc. 1). Stopień ho- mologii między S R E B P -la i SREBP-2 jest nastę­pujący, procent identyczności dla sekwencji zawie­rających kwaśne aminokwasy wynosi — 33 %, dla sekwencji bHLH-Zip — 71 % i dla C-końcowej do­meny regulatorowej wynosi — 49 % ( Ryc. 1) [ 18].

Domena N-końcowa SREBP po proteolitycznym odszczepieniu jes t transkrypcyjnym czynnikiem ro­dziny suwaka leucynowego — basic-helix-loop-he- lix-leucine-zipper (bHLH-Zip) [17-19, 21-23, 27-29, 32-36],

Motyw bHLH-Zip pośredniczy w dimeryzacji i translokacji dimeru do jąd ra komórkowego oraz wiązaniu go z regionami SRE.

IV. Mechanizm dwuetapowego procesu proteolizy białka SREBP

IV-1. SCAP — białko aktywujące proteolityczne rozszczepienie SREBP z udziałem proteaz SIP i S2P

Proces proteolizy białek SREBP zachodzi z udziałem dwóch proteaz S IP i S2P (dane o specy­ficzności w dalszej części artykułu) oraz przy współudziale białka SCAP(ang. cleavage activating protein). Białko SCAP uczestniczy również w trans­

porcie białka SREBP o masie cząsteczkowej 125 kDa z błon ER do aparatu błon aparatu Golgiego.

SCAP jest integralnym N-glikozylowanym białkiem błonowym, zbudowanym z około 1276 aminokwasów, recyklizującym między ER i AG (Ryc. 2) [18, 21]. Po N-terminalnej, zlokalizowanej w cytosolu domenie SCAP, w ystępują na przemian hydrofobowe i hydrofilne odcinki, które tworzą osiem transmembranowych fragmentów rozdzielo­nych krótkimi hydrofilnymi pętlami. Hydrofilna C-końcowa domena SCAP, zlokalizowana również w cytosolu (546 aminokwasów), zawiera pięć powta­rzających się sekwencji WD, które pośredniczą w in­terakcjach białko-białko. Odcinek obejmujący pięć z ośmiu transmembranowych sekwencji białka SCAP (domeny transbłonowe 2 -6 , pomiędzy aminokwasa­mi 280-446) jest dom eną sensorow ą dla steroli. D o­meny o podobnej strukturze w ystępują również w ta­kich białkach jak reduktaza HM G-CoA (pomiędzy aminokwasami 57-224 białka zbudowanego z 887 aminokwasów), białka NPC-1 (Nieman-PicK typ 1, pomiędzy aminokwasami 617-691 białka zbudow a­nego z 1278 aminokwasów) oraz receptorze morfo- genezy Patched (pomiędzy aminokwasami 420-589 białka zawierającego 1434 aminokwasy). Wymie­nione odcinki sensorowe pozostają pod kontrolą ste­roidów, choć w reduktazie HM G-CoA nie wykazuje wrażliwości na sterole [17, 18,21 -23,27-29, 32, 37].

Zamiana jednego aminokwasu asparaginy na argi- ninę w obrębie domeny sensorowej SCAP unieczyn- nia jej rolę jako sensora steroli w komórce [2 2 ],

W spomniana już zmiana asparaginy na argininę w SCAP znosi jego aktywujący wpływ na proteazę

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 203http://rcin.org.pl

Ryc. 2. Topologia struktury białka SREBP i SCAP w obrębie błon retikulum edoplazmatycznego (wg [21], zmodyfikowane).

S1P, a w konsekwencji tej zmiany aktywność S1P utrzymuje się na stałym poziomie.

Lipidy niesterolowe jak sfingomielina [38] oraz androgeny [39], oksysterole i nienasycone kwasy tłuszczowe [40] w pływ ają zarówno na proces tran­skrypcji białek SREBP jak i na aktywność proteazy S1P.

Szczególnie ciekawe choć nie w pełni wyjaśnione są efekty wywołane przez sfingomielinazę w wyniku działania której następuje translokacja cholesterolu z błon plazmatycznych do ER. W odpowiedzi na po­traktowanie komórek sfingom ielinazą(w warunkach hodowli tkankowych) zaobserwowano podw yższe­nie stężenia estrów cholesterolu z powodu aktywacji ACAT oraz zahamowanie syntezy cholesterolu w wyniku zmniejszenia aktywności reduktazy HMG-CoA; oprócz tego stwierdzono obniżenie się ilości dojrzałych form SREB P -68 w jądrach kom ór­kowych, co jest rezultatem ham owania proteazy S1P(38). Oksysterole w szczególności w obecności nienasyconych kwasów tłuszczowych są również sil­nymi inhibitorami procesu konwersji SREBP w czynniki transkrypcyjne SREB P -68 [40], Z badań nad wpływem stopnia nienasycenia kwasów tłusz­czowych na proces uwalniania białek SREB P -68 w y­nika, iż bardzo skutecznym inhibitorem jest kwas oleinowy C l 8:1 (A9) [40]. Według innych autorów [4 3 ] najefektywniejsze w hamowaniu uwalniania białek SREBP-68- l c są wielonienasycone kwasu

tłuszczowe, jak np. kwas arachidonowy C20:4 (A5,8’n ’i4) [4 1 ]. Efekty nienasyconych kwasówtłuszczowych dotyczą również regulacji tkankowo specyficznej ekspresji białek SREBP. W hepatocy- tach wywierają wpływ na ekspresję, natomiast w adi- pocytach pozostają bez wpływu.

Przypuszcza się również, iż proces proteolizy białek S R E B C -lc pozostaje wyłącznie pod kontrolą nienasyconych kwasów tłuszowych i jest niezależny od steroli. Proces aktywacji białek S E R B P-lc regu­lowany jes t także poprzez proces modyfikacji kow a­lencyjnej z udziałem kinazy MAP [41].

S R E B P -1 i SREBP-2 w komórkach apoptotycz- nych m ogą również ulegać proteolizie nieregulowa- nej przez sterole z udziałem proteaz cysteinowych CPP-32 i Mch-3 [16]. Znaczenie tych procesów nie zostało jeszcze wyjaśnione.

IV-2. Proces proteolizy białka SREBP błon ER I uwolnienie czynnika transkrypcyjnego SREBP-68

W warunkach niedoboru steroli w komórce białko SREBP błon ER wchodzi w interakcję z SCAP. Inte­rakcja zachodzi pomiędzy C-końcową dom eną regu­latorową SREBP i dom eną WD białka SCAP (Ryc. 3). Wytworzony kompleks SREBP-SCAP, według najnowszych doniesień [17] zostaje prze­transportowany do błon AG, gdzie w dwuetapowym

204 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

1 SREBP 3 S1P 5 SREBP-68 7 DNA

2 SCAP 4 S2P 6 SRE-1 8 mRNA

Ryc. 3. Model mechanizmu proteolizy membranowego białka SREBP. Proteaza S 1P rozpoznająca kompleks SREBP-SCAP rozcina pętlę SREBP w lu- minamej części ER na dwa fragmenty. Druga proteaza S2P odcina N-terminalną partię SREBP z domeną bHLH (SREBP-68). Kolejnym eta­pem jest transport uwolnionego czynnika transkrypcyjnego SREBP-68 do jądra komórkowego. Dimer białka SREBP-68 aktywuje promotory SRE.

procesie proteolizy następuje uwolnienie transkryp- cyjnie aktywnego N-końcowego fragmentu o masie 68 kDa (SREBP-68). Pierwsze rozszczepienie nastę­puje w środku pętli białka SREBP w obrębie sekwen­cji: Arg-Ser-Yal-L eu -S e r (RSYLS) (Ryc. 3) pom ię­dzy leucyną522 i seryną523, katalizowane jest przez proteazę S 1P, aktyw ow aną przez SCAP. Na tym eta­pie SREBP rozdzielone zostaje na dwie części, pozo­staje jednak nadal związane z błoną Aparatu Golgie- go (Ryc. 3). Według niektórych autorów proces ten zachodzi również w ER [17, 18, 21, 28, 42], W kolej­nym etapie, w błonach AG, druga proteaza - S2P uwalnia z połączenia z błoną N-końcowy fragment białka SREBP, tzn. właściwy, transkrypcyjnie czyn­ny czynnik — SREBP -68 (Ryc. 3). Cięcie następuje w segmencie trans-membranowym, w obrębie se­kwencji: A sp-A rg-Ser-Arg-Ile-Leu-L eu-C vs (DR- SRILLC) pomiędzy leucyną i cysteiną.

S2P jes t hydrofobową, cynkow ą metaloproteazą, natomiast S IP jes t proteazą typu subtylizyn o struk­turze i właściwościach podobnych do subtylizyn bakteryjnych. Obecność S1P stwierdzono również w regionie pre-Golgi i jest ona proteazą odmienną od konwertaz prehormonów, które występują w obrębie AG i post-AG. Stąd możliwe jest, że pierwszy i drugi etap proteolizy zachodzi w regionie pre-Golgi. W/g B r o w n a i G o l d s t e i n a [21] proteaza S1P wy­stępuje w formie nieaktywnej w ER i ulega aktywacji w regionie pre-Golgi (mechanizm aktywacji nieznany).

Uwolniona, transkrypcyjnie aktywna N-końcowa domena o masie 68 kDa (SREBP-68) zostaje prze­niesiona do cytosolu, skąd migruje do jądra, gdzie jako dimer wiąże się z regionami SRE (Ryc. 3) i akty­wuje szereg genów enzymów szlaku biosyntezy cho­lesterolu, lipogenezy, receptora LDL i metabolizmu węglowodanów, geny syntazy HM G-CoA (pierwszy

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 205http://rcin.org.pl

Tabela 2

Zmiany ekspresji i uczynniania białek SREBP pod wpływem metabolitów i hormonów [na podstawie 17, 28, 31].

SREBP Czynnik mRNA Uczynnienie

SREBP-la, lc, 2 cholesterol 4 4

SREBP-la, lc, 2 oksystcrole bz 4

SREBP-2 insulina/glukoza bz bz

SREBP-lc insulina/glukoza T T

SREBP-lc glukagon, cAMP 4 4

SREBP-2 hipolipidemiczne leki T T

SREBP-1 hipolipidemiczne leki bz 4

SREBP-1wielonienasycone kwasy

tłuszczowebz 4

SREBP-2wielonienasycone kwasy

tłuszczowebz bz

T — wzrost, -i — obniżenie, bz — bez zmian

wykryty), receptora LDL, reduktazy HM G-CoA, syntazy skwalenu, syntazy farnezylodifosforanu, syntazy kwasów tłuszczowych, karboksylazy-CoA, glicerylo-3-fosfoacylotransferazy, lipazy lipoprote- inowej, kaweolin i leptyny [17, 24].

Aktywacja w/w genów wym aga jednak dodatko­wo współdziałania SREBP -68 z innymi czynnikami transkrypcyjnymi [17, 21-23, 28], takimi jak N F-Y (ang. nuclear fa c to r Y), Spl lub CREB (ang. cAMP response elem ent binding protein). Dodatkowymi białkowymi koaktywatorami w ym aganymi do akty­wacji transkrypcji są CBP (ang. CREB binding p ro ­tein), P-300 oraz ARC (ang. activa ted recruited f a c ­tor) lub DRIP (ang. vitam in D receptor in teracting protein) przy czym izoformy S R E B P -la i lc oraz SREBP-2 wchodzą w interakcję z odrębnymi czynni­kami transkrypcyjnymi [28], co daje możliwość spe­cyficznych tkankowo modulacji ekspesji genów i precyzyjnej kontroli ich ekspresji przez czynniki wewnątrzkomórkowe.

Transkrypcyjne czynniki z sekwencją suwaka le- ucynowego (bHLH-Zip), takie jak: Myc, Max i USP (ang. upstream stim ula tory fa c to r) zawierają argini- nę w konserwatywnym regionie i w iążą się z ram ką E D N A (5 ’-CANNTG -3 ’) [43]. SREBP -68 są szcze­gólnymi białkami typu bHLH-Zip, ponieważ w m iej­scu argininy występuje tyrozyna [43] i w związku z tym w iążą się efektywnie tylko z SRE-1. In teresują­cym jest fakt, że choć SREB P -68 w warunkach in vivo w iążą się również z ram ką E i w ykazują wysokie powinowactwo do niej, jednak wszystkie promotory do tej pory opisane, wrażliwe na poziom steroli regu­lowane są tylko poprzez promotory zawierające

SRE. Wynika to prawdopodobnie z faktu, iż interak­cja z promotorami z ram ką E, nie wywołuje dosta­tecznej zmiany konformacji wytworzonego kom ­pleksu białko-DNA, dla uczynnienia transkrypcji [23, 24]. Najnowsze poglądy o oddziaływaniu czyn­ników transkrypcyjnych SREBP- 68 z promotorami z sekwencją typu SRE i ramką E przedstawione zo­stały w pracach szeregu pracach [22-24].

Wydaje się, iż ramka E-box jes t rozpoznawana przez białka zawierające motyw suwaka leucynowe- go i uczynnia promotory odpowiedzialne za konsty­tutywną ekspresję genów szlaków biosyntezy nieza­leżną od omawianych procesów regulowanych przez sterole z udziałem SREBP, SCAP, S1P i S2P.

Czynniki transkrypcyjne — SREBP -68 praw do­podobnie koewoluowały dla optymalizacji i uprecy- zyjnienia regulacji metabolizmu przemian choleste­rolu, kwasów tłuszczowych i węglowodanów.

W artykule przedstawiono niedawno poznane podstawowe mechanizmy odbioru sygnałów o n iedo­borze cholesterolu oraz konwersji integralnych białek błon retikulum endoplazmatycznego SREBP w czynniki transkrypcyje SREBP -68 uczestniczące w aktywacji genów z promotorami SRE.

Artykuł otrzymano 12 grudnia 2001 Zaakceptowano do druku 20 maja 2002

Piśmiennictwo:

1. R u s s e l l D (1992) Cardiovasc Drugs Ther 6: 103-1102. H i n s o n D D, C h a m b l i s K L, T o t h M J , T a n a k a R

D, G i b s o n K M (1997) J Lipid Res 38: 2216-22233. L a u f s U, L a F a t a V, L i a o J K (1997) J Biol Chem 272:

31725-31729

206 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

4. B e l l o s t a S, B e r n i n i F , F e r r i N, Q u a r a n t o P, C a - n a v a e s i M, A r n a b o l d i L, F u m a g a l l i R, P o a l e t t i R, C o r s i n i A (1998) Artherosclerosis 137: S I01- S I09

5. F a r c s e R V, H e r z J (1998) Trends in Genetics 14: 115-1206. F u Q , G o o d r u m J F, H a y e s C, H o s t e t t l e r J D, T o -

e w s A D, M o r e l i P (1998) J Neurochem 71: 549-5557. M a n n R K, B c a c h y P A (2000) Biochim Biophys Acta 1529:

188-2028. Y o k o y a m a S (2000) Biochim Biophys Acta 1529: 231 -2449. L o i r d i g h i N, M e n a r d D, D e l v i n E, L e v y E (1997)

Am J Physiol 273: G62-G6710. A c c a d M, F a r e s e R V (1998) Current Biology 8: R 601-R60411. B r o w n M S, G o l d s t e i n J L (1986) Science 232: 43-4712. F i e l d i n g C h J , F i e l d i n g P E (1997) J Lipid Res 38:

1503-152113. L o p e z D, C h a m b e r s C h M, N e s s G C (1997) Arch Bio-

chem Biophys 343: 118-12214. G r i f f i n M, F r a z e r A, J o h n s o n A, C o l l i n s P,

O w e n s D, T o m k i n G H (1998) Artherosclerosis 138: 313-318

15. W i e c z o r e k B, G n i o t - S z u l ż y c k a J (2000) Kosmos 49: 191-206

16. S c h o o n j a n s K , B r e n d e l C, M a n g e l s d o r f D, A u w e r x J (2000) Biochim Biophys Acta 1529: 114-125

17. E d w a r d s P A , T a b o r D, K a s t H R, V e n k a t e s w a r a n A (2000) Biochim Biophys Acta 1529: 103-113

18. B r o w n M S, G o l d s t e i n J L (1997) Cell 89: 331-34019. N o g a l s k a A, Ś w i e r c z y ń s k i J (2001) Postępy Biochemii

47: 160-16820. C h r i s t e n s o n L K, M c A l l i s t e r J M, M a r t i n K O

J a v i t N B, O s b o r n e T F, S t r a u s s I I I J F (1998)J B io l Chem 273, 30727-30735

21. B r o w n M S , G o l d s t e i n J L (1999) Proc Natl Acad Sci 96: 11041-11048

22. E d w a r d s P A, E r i c s s o n J (1999) Annu Rev Biochem 68: 157-185

2 3 . A t h a n i k a r J N , O s b o r n e T F (1998) Proc Natl Acad Sci 95:4935-4940

24. P a h 1 H L (1999) Physiological Reviews 79: 683-701

2 5 . H u a X, Y o k o y a m a C, W u J, B r i g g s M R, B r o w n M S, G o l d s t e i n J L, W a n g X (1993) Proc Natl Acad Sci 90: 11603-11607

26. T o n t o n o z P, K i m J B, G r a v e s R A, S p i e g e l m a n B M (1993) M ol Cell Biol 13: 4753-4759

27. R a w s o n R B, D e B o s e - B o y d R, G o l d s t e i n J L, B r o w n M S (1999) J Biol Chem 274: 28549-28556

28. O s b o r n e T F (2000) J Biol Chem 275: 32379-3238229. P a i J , G u r y e v O, B r o w n M S, G o l d s t e i n J L (1998)J

Biol Chem 273: 26138-2614830. M a g a n a M M, K o o S - H , T o w l e H C, O s b o r n e T F

(2000) J Biol Chem 275: 4726-47333 1 . H a n n a h V C, O u J , L u o n g A , G o l d s t e i n J L,

B r o w n M S (2001) J Biol Chem 276: 4365-437232. Hua X, Sakai J, Brown M S, Goldstein J L (1996)J B io l Chem 271:

10379-1038433. H u a X , S a k a i J , H o Y K, G o l d s t e i n J L, B r o w n M

S (1995) J Biol Chem 270: 29422-2942734. C h e n g D, E s p e n s h a d e P J , S l a u g h t e r C A, J a e n J

C, B r o w n M S, G o l d s t e i n J L (1999) J Biol Chem 274: 22805-22812

35. Y a n g T , G o l d s t e i n J L, B r o w n M S (2000) J Biol Chem 275: 29881-29886

36. S t u r l e y S L (2000) Biochim Biophys Acta 1529: 155-16337. N o h t u r f f t A, D e B o s e - B o y d R A, S c h e e k S, G o l d ­

s t e i n J L , B r o w n M S (1999) Proc Natl Acad Sci 96: 11235-11240

38. S c h e e k S, B r o w n M S, G o l d s t e i n J L (1997) Proc Natl Acad Sci 94: 11179-11183

3 9 . S w i n n e n J V, U l r i x W, H e y n s W, V e r h o e v e n G (1997) Proc Natl Acad Sci 94: 12975-12980

40. T h e w k e D P, P a n i n i S R, S i n e n s k y M (1998) J Biol Chem 273: 21402-21407

4 1 . M a t e r M K . , T h e l e n A P, P a n D A, J u m p D B (1999) J.Bio.Chem 274: 32725-32732

42. D u n c a n E A, B r o w n M S, G o l d s t e i n J L, S a k a i J (1997) J Biol Chem 272: 12778-12785

4 3 . P a r r a g a A, B e l l s o l e l l L, F e r r e - D ’ A m a r e A R, B u r l e y S K (1998) Structure 4 6: 661-672

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 207http://rcin.org.pl

Rola lipidów błony komórkowej w zjawisku oporności wielolekowej i jego modulacji

The role of cell membrane lipids in multidrug resistance and its modulation

KRYSTYNA MICHALAK1, ANDRZEJ B. HENDRICH2

Spis treści:

I. Oporność w ielolekowa pow stająca w w yniku działania transporterów usuwających leki z kom órki

II. Cechy budowy transporterów zw iązanych z opornością wielolekową i ich lokalizacja w błonie kom órkowej

III. Hipoteza „odkurzacza m olekularnego”IV. Rola fizycznego stanu błony w m odulacji aktyw ności

transportowej glikoproteiny PIV-1. Błona jako środowisko dla dyfuzji lekówIV-2. W pływ stanu fazow ego lipidów błonowych na pro­

ces transportu lekówIV-3. Fenotiazyny jako przykład m odulatorów oporno­

ści wielolekowejV. Zmiany w m etabolizm ie lipidów w kom órkach opor­

nych i wpływ m odulatorów na ten m etabolizmV -l. Skład lipidowy błon kom órek nowotworowych

w ykazujących oporność w ielolekowąV-2. W pływ m odulatorów oporności w ielolekowej na

transport i m etabolizm lipidów w kom órkachVI. Proces chem ouczulania a m odyfikacja w łaściw ości fazy

lipidowej błony kom órkowejV II.Uwagi końcowe

W ykaz stosowanych skrótów: CDR1, CDR2 — transportery wielolekowe grzybów C andida albicans', CPZ — chlorproma- zyna; DPPC — dipalmitylofosfatydylocholina; DPPE — dipal- mitylofosfatydyloetanoloamina; DMPC — dimirystylofosfaty- dylocholina; DMPE — dimirystylofosfatydyloetanoloamina; LmrA — transporter wielolekowy bakterii L a c to co cu s lactis, bakteryjny homolog ludzkiej glikoproteiny P; MDR — opor­ność wielolekowa (ang. m u ltid ru g r e s is ta n c e ); MRP- białko związane z opornością wielolekową (ang. m u ltid ru g resis ta n ­ce-a sso c ia ted p ro te in ), PA — kwas fosfatydowy; P-gp — gliko- proteina P; Pdr5 — transporter z drożdży S a cch a ro m yces cerevi- sia e związany z plejotropową lekoopomością tych komórek; PS — fosfatydyloseryna; SDS — siarczan dodecylu sodu.

’Prof. dr hab., 2dr, Katedra i Zakład Biofizyki, Akademia Me­dyczna we Wrocławiu, ul. Chałubińskiego 10, 50-368 Wrocław, e-mail: michalak@biofiz.am.wroc.pl

Contents:

I. M ultidrug resistance generated as a result o f activity o f transporters that extrude drugs out o f cell

II. Features o f structure o f m ultidrug resistance related transporters and their localization in cell m em brane

III. “Vacuum cleaner” hypothesisIV. Role of m em brane physical state in m odulation o f P gly­

coprotein transport activityIV-1. M em brane as a drug diffusion mediumIV-2. Influence o f phase state o f m em brane lipids on

process o f drug transportIV-3. Phenotiazines as an exam ple o f m ultidrug resi­

stance m odulatorsV. Alterations in lipid m etabolism in resistant cells and in­

fluence of m odulators on that m etabolismV -l. M em brane lipid com position o f cell m em branes o f

m ultidrug resistant cancer cellsV-2. Influence o f drug resistance m odulators on cellu­

lar lipid transport and lipid m etabolismVI. Relation between chem osensitization and modification

o f properties o f cell m em brane lipid phaseV II.F inal remarks

I. Oporność wielolekowa powstająca w wyni­ku działania transporterów usuwających leki z komórki

Istnieje wiele różnorodnych m olekularnych m e­chanizmów powstawania oporności na leki w kom ór­kach bakterii, pasożytów, grzybów i nowotworów. Cechą charakterystyczną komórek przejawiających tzw. oporność wielo lekow ą (ang. m ultidrug resistan- ce, w skrócie — MDR) jes t brak wrażliwości na bar­dzo wiele leków, różniących się znacznie strukturą chemiczną. Jedną z głównych przyczyn oporności wielolekowej w przypadku nowotworów, a także p a ­togennych grzybów, bakterii i pasożytów, jes t aktyw­ny transport chemoterapeutyków z wnętrza komórki przez błonę kom órkow ą do środowiska zewnątrzko- mórkowego. Za ten proces odpowiadają białka nazy­wane wielolekowymi transporterami (ang. m ultidrug transporters). Ekspresja transporterów, zaliczanych

208 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

do nadrodziny białek ABC (ang. A TP -binding cas­sette), w błonie komórek opornych jest znacznie zwiększona. Głównymi tego typu transporterami zi­dentyfikowanymi w komórkach nowotworowych człowieka są glikoproteina P oraz białka typu MRP (białko związane z opornością wielolekową, ang. m ultidrug resistance-associa ted pro tein ). Z kolei transportery CDR1 i CDR2 obecne w błonach pato­gennych drożdży Candida albicans przyczyniają się do ich oporności na leki przeciwgrzybicze. Trans­porter Pdr5p z drożdży piekarskich Saccharom yces cerevisiae wykazuje w swojej budowie 56% iden­tyczności sekwencji z białkiem CDR1 z Candida a l­bicans. Oba białka (Pdr5p i CDR1) posiadają wiele substratów wspólnych z glikoproteiną P, co świad­czy o ich funkcjonalnym podobieństwie. Transporte­ry usuwające leki z różnych komórek, pomimo róż­nic w sekwencji aminokwasowej a także w topologii, często nie tylko transportują te same substraty, ale również są podatne na działanie tych samych inhibi­torów. Może to wskazywać na zbliżony mechanizm transportu i identyfikacji substratów przez różne transportery.

Transportery usuwające leki z komórek, ich sub­straty i inhibitory (modulatory oporności) oraz lipidy błonowe powiązane są wieloma wzajemnymi zale­żnościami funkcjonalnymi. Najwięcej prac na ten te­mat pochodzi z badań nad glikoproteiną P [ 1 ], odpo­wiadającą za najlepiej poznany typ oporności kom ó­rek nowotworowych (MDR1). W wielu z nich poka­zano, że transportowane leki i modulatory oporności (chemouczulacze) m ogą oddziaływać bezpośrednio z glikoproteiną P [2], wpływając na jej aktywność ATPazową. Przypuszcza się, że niektóre modulatory, takie jak werapamil lub cyklosporyna A są transpor­towane przez glikoproteinę P [3]. Z innych badań wynika jednak, że lipidowa faza błony ma kluczowe znaczenie zarówno dla oporności M DR wynikającej z działania glikoproteiny P, jak i dla modulacji tej oporności przez odpowiednie inhibitory [4]. Działa­nie chemouczulaczy może być związane zarówno z ich specyficznym wiązaniem z transporterami b łono­wymi, jak i z n iespecyficzną adsorpcją do lipidowej części błony. Jednak rola lipidów w regulacji funkcji transporterów i procesie chemouczulania jes t z łożo­na i słabo poznana. Ponieważ substraty transporte­rów oraz modulatory oporności są na ogół hydrofo­bowe, a leki prawdopodobnie są przenoszone przez białko transportujące z dwuwarstwy lipidowej, a nie z fazy wodnej [5, 6], lipidowe otoczenie musi mieć ważny wpływ na oddziaływanie leków z glikoprote­iną P. Określenie roli fazy lipidowej jes t ważne dla zrozumienia mechanizmu działania i funkcji trans­

porterów związanych z MDR. Należy rozpatrzyć od­działywania glikoproteina P-lipidy błonowe oraz li- pidy-leki (substraty i modulatory). Dotychczas naj­więcej prac na temat możliwej roli fazy lipidowej błony komórkowej oraz poszczególnych rodzajów li­pidów w zjawisku oporności wielolekowej przepro­wadzono w układach modelowych: liposomach i proteoliposomach, w których rekonstytuowano gli­koproteinę P [7-9]. Chociaż układy takie są uprosz­czonym modelem błony biologicznej, to jednak ba­dania nad dobrze zdefiniowanymi strukturami lipi­dowymi zawierającymi oczyszczoną glikoproteinę P, w noszą ważne informacje na temat oddziaływań tego białka z lipidami. Lipidy o różnej strukturze i właściwościach m ogą modulować działanie gliko­proteiny P, a także mogą wpływać na wiązanie trans­portowanego leku z białkiem. Zróżnicowany skład lipidowy błon komórkowych w różnych typach ko­mórek może powodować zależność aktywności gli­koproteiny P od rodzaju tkanki. Odrębnym cieka­wym zagadnieniem jest przypuszczalna rola gliko­proteiny P w transporcie lipidów w komórce [10]. Taka funkcja glikoproteiny P wiązałaby to białko z wieloma procesami komórkowymi, z uwagi na udział lipidów i ich metabolitów w przekazywaniu sygnałów w komórce (np. szlak poprzez pochodne fosfatydyloinozytolu lub sfingolipidów).

II. Cechy budowy transporterów związanych z opornością wielolekową i ich lokalizacja w błonie komórkowej

Pewne fragmenty sekwencji aminokwasowej róż­nych białek błonowych korzystających z energii ATP przy usuwaniu leków z komórek wykazują znaczne podobieństwo strukturalne i najprawdopodobniej funkcjonalne. Ze względu na te podobieństwa om a­wiane tranportery zaliczane są (razem z kilkuset in­nymi białkami) do jednej wspólnej nadrodziny białek ABC [11]. Cechami wspólnymi białek z tej nadrodziny jes t występowanie w ich strukturze do­men wiążących nukleotydy (ang. nucleotide binding domain — NBD) oraz obecność domen transbłono- wych. Domeny takie posiada także w swojej struktu­rze glikoproteina P. Jak pokazano na rycinie 1, gliko­proteina P zawiera dwie domeny wiążące ATP uloko­wane w pętlach znajdujących się po cytoplazmatycz- nej stronie błony oraz dwie domeny transbłonowe, z których każda składa się z sześciu segmentów [ 1 2 , 13]. Obecność domen transbłonowych wskazuje, że glikoproteina P (podobnie jak inne transportery) jest integralnym białkiem błonowym, a co za tym idzie

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 209http://rcin.org.pl

Miejsca glikozylacji Domeny transbłonowe

Cytoplazma Domenawiążącanukleotydy

Miejscafosforylacji

Ryc. 1. Schemat struktury glikoproteiny P jako przykład budowy wielolekowego transportera.

stan fizyczny otoczenia lipidowego może wpływać na jego zdolność do transportowania leków.

W transporterach usuwających leki z komórki, d o ­meny zaangażowane w wiązanie leków są przypusz­czalnie zlokalizowane w segmentach transbłono- wych tych białek integralnych, jak to wykazano w przypadku glikoproteiny P [14]. W związku z tym jest bardzo prawdopodobne, że oddziaływanie leku z fazą lipidową będzie wpływać na oddziaływanie gli- koproteina P-lek, co z kolei będzie mieć istotne zna­czenie dla transportu leku przez to białko.

Prosta rola lipidów błonowych, jak ą jes t tworze­nie amfipatycznej dwuwarstwy otaczającej komórki i organelle oraz blokującej przepływ hydrofitowych związków, nie wym agałaby tak dużej różnorodności lipidów, jaka występuje w błonach biologicznych. Badania prowadzone w ostatnich latach zaczynają wyjaśniać niektóre konsekwencje funkcjonalne hete- rogenności lipidów. Jedną z nich jes t możliwość n ie­przypadkowego mieszania się lipidów w dwuwar- stwie i tworzenie lipidowych m ikrodom en [15], w y ­raźnie różniących się składem od swojego otoczenia i odpornych na rozpuszczanie detergentami. Istnie­nie takich mikrodomen, zawierających dużą ilość cholesterolu i glikosfingolipidów [16] wykazano w błonach komórek wielu typów — np. erytrocytów [17], komórek nabłonka [18], kom órek mięśniowych [19] czy neuronów [20]. M ikrodom eny m ogą tw o­rzyć w błonie tzw. „tratwy lipidowe” (ang. lip id ra- f t s ) oraz silnie zakrzywione wgłębienia zwane kawe- olami [21]. Trwałość tych wgłębień jes t stabilizow a­na m.in. przez integralne białko błonowe zwane ka- weoliną, które wiąże cholesterol i oddziałuje z inny­mi białkami obecnymi w kaweolach [22]. Schemat błony zawierającej zarówno „tratwy lipidow e” , jak i kaweole przedstawiony jes t na rycinie 2. Przypusz­cza się, że struktury tego typu m ogą uczestniczyć za­równo w procesach przekazywania sygnałów, jak i w

gospodarce lipidowej [23, 24]. M ikrodomeny mogą być miejscem skupiania się białek zaangażowanych w określony proces [25, 26]. Istnieją też przesłanki by sądzić, iż glikoproteina P jes t tego typu białkiem i znaczna jej część jes t ulokowana w błonie właśnie w strukturach typu caveolae [27, 28].

III. Hipoteza „odkurzacza molekularnego”

Wiadomo, że glikoproteina P jest białkiem o sze­rokiej substratowej specyficzności [29]. Wydaje się, że jedyną wspólną cechą transportowanych substan­cji, jak też chemouczulaczy, jest ich stosunkowo duża hydrofobowość. Leki przeciwnowotworowe oraz leki stosowane do zwalczania chorób infekcyj­nych, a także inhibitory transporterów związanych z MDR, należą najczęściej do związków o znacznej hydrofobowości i przem ieszczają się przez błonę z zewnątrzkomórkowego do wewnątrzkomórkowego środowiska w wyniku biernej dyfuzji (na skutek ist­nienia gradientu ich potencjału chemicznego lub elektrochemicznego przez błonę) [30, 31].

Wiele dowodów eksperymentalnych wskazuje na to, że glikoproteina P rozpoznaje swoje substraty, gdy znajdują się one w błonie komórkowej. D ow o­dzi tego między innymi eksperyment, w którym p o ­kazano przeniesienie energii z daunorubicyny (flu­oryzujący substrat glikoproteiny P), na światłoczułą pochodną azydkow ą (azydek jodonaftalenu), którym znakowane było to białko transportujące [6], O od ­działywaniu substratów z transporterem we wnętrzu błony świadczą również wyniki badań nad transpor­tem znaczników fluorescencyjnych przez błony, w których występowały takie transportery jak gliko­proteina P lub transporter LmrA bakterii Lactococ- cus lactis. Wykazano, że estry acetoksymetylowe niektórych znaczników fluorescencyjnych będące substratami badanych transporterów są usuwane z

210 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

Tratwa lipidowa

Kaweolina

Tratwa lipidowa

g Sfingolipid o Cholesterol

KaweolaRyc. 2. Domeny lipidowe typu tratwa lipidowa oraz kaweola.

błon zanim osiągną cytoplazmę, w której byłyby hy- drolizowane przez wewnątrzkomórkowe esterazy [32, 33]. Ostatnio wykryto ciekawe cechy struktury białka oporności wielolekowej w komórkach Bacil- lus subtillis, w trakcie badań nad czynnikiem tran- skrypcyjnym BmrR, który po związaniu leku induku­je ekspresję transportera Bmr. Stwierdzono, że cechą charakterystyczną struktury Bmr jest obecność dużej hydrofobowej kieszeni [34], co prawdopodobnie jest bardzo istotne dla możliwości rozpoznawania wielu strukturalnie różnych związków przez jedno białko.

Hydrofobowa natura substratów i eksperymental­ne dowody, że rozpoznawanie substratu ma miejsce na poziomie transbłonowych segmentów glikoprote- iny P prowadzi do hipotezy działania tego białka jako hydrofobowego „odkurzacza m olekularnego” . Zgodnie z tą koncepcją, glikoproteina P (oraz naj­prawdopodobniej również inne transportery odpo­wiedzialne za MDR) „w yciąga” leki bezpośrednio z błony i transportuje je aktywnie na zewnątrz komórki [6]. Pomimo, że istnieje jeszcze kilka innych hipotez dotyczących sposobu działania glikoproteiny P, hi­potezę odkurzacza molekularnego potwierdzają w y­niki licznych najnowszych prac eksperymentalnych [35].

Na rycinie 3 przedstawiony jes t schemat działania wielolekowego transportera oraz przypuszczalna rola, jaką mogą pełnić związki przyczyniające się do modulacji jego zdolności transportowej. Zgodnie z tym modelem cząsteczki leku, biernie przenikające przez błonę w kierunku cytoplazmy, są wiązane przez białko w obrębie hydrofobowej części dwu- warstwy lipidowej i następnie dzięki energii po­chodzącej z hydrolizy ATP są transportowane z p o ­wrotem na zewnątrz komórki. Zdolność transporto­wa białka może zostać zmniejszona hipotetycznie na kilka sposobów:

— wszelkie zmiany właściwości fazy lipidowej błony, traktowanej jako środowisko, w którym za­chodzi dyfuzja leku, m ogą zmieniać praw dopodo­bieństwo kontaktu lek-białko,

— zmiany właściwości środowiska lipidowego, w którym zanurzone jes t białko mogą wpływać na jego zdolności transportowe,

— miejsca wiążące leki m ogą zostać bezpośrednio zablokowane cząsteczkami związków działa­jących jako chemouczulacze,

— cząsteczki chemouczulaczy mogą oddziaływać z białkiem transportującym i indukować zmiany konformacji białka, zmieniając jednocześnie jego zdolność do wiązania leków.Hipoteza „molekularnego odkurzacza” pozwala

na wyjaśnienie roli, jak ą w modulacji oporności w ie­lolekowej oraz w regulacji różnych funkcji wielole- kowych transporterów pełni faza lipidowa błon. Jak pokazano poniżej, istnieje wiele faktów doświad­czalnych bezpośrednio lub pośrednio potwier­dzających słuszność tego modelu.

IV. Rola fizycznego stanu błony wmodulacji aktywności transportowej glikoproteiny P

IV-1. Błona jako środowisko dla dyfuzji leków

Zarówno substraty glikoproteiny P jak i chem o­uczulacze mają bardzo często charakter lipofilowych słabych zasad. Przenikanie tego typu hydrofobo­wych cząsteczek przez błonę zależy od błonowego współczynnika podziału pom iędzy fazą w odną i lipi­dową. Dyfuzja i lokalizacja w błonie zależą od wielu parametrów, takich jak właściwości struktury lipido­wej (typ główki polarnej, struktura łańcuchów kw a­sów tłuszczowych, stan fizyczny dwuwarstwy) i

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 211http://rcin.org.pl

Chemouczulacz©

Cząsteczka leku związana z miejscem wiążącym

Chemouczulacz blokujący miejsce wiążące

CytoplazmaMiejsce wiążące zmodyfikowane przez chemouczulacz

Ryc. 3. Schemat działania „odkurzacza molekularnego”.

skład wodnego roztworu otaczającego dwuwarstwę. Zasadowe leki m ogą ponadto występować w dwóch różnych formach — neutralnej i dodatnio naładow a­nej (protonowanej). Te dwie postacie cząsteczek prawdopodobnie m ają różne współczynniki podziału i różną lokalizację w lipidowej dwuwarstwie. S tęże­nie każdej z form przy powierzchni błony zależy nie tylko od pH i jonow ego składu fazy wodnej, ale rów ­nież od właściwości biofizycznych granicy faz (in­terfazy), takich jak lokalna stała dielektryczna czy potencjał błonowy. W formie nienaładowanej związki te łatwo przenikają przez błonę lipidową, forma protonowana w niewielkim stopniu wnika do błony. Natomiast trwale naładowane leki kationowe mają często taką strukturę, że ładunek jes t zdelokali- zowany lub osłonięty lipofilowymi resztami, co ułatwia ich dyfuzję przez błony.

Obserwowana w ypadkowa szybkość transportu przez błonę zawierającą glikoproteinę P jes t w yni­kiem dwóch procesów: aktywnego transportu do śro­dowiska zewnętrznego oraz biernej dyfuzji zgodnie z gradientem stężenia. Rolę biernej dyfuzji leków w błonach komórek z opornością M DR potwierdza za­leżność pomiędzy lipofilnością cząsteczek a ich efektywnością w charakterze chemouczulaczy, co wykazano na przykładzie homologicznej serii p ro ­stych, aromatycznych związków [36]. W cytowanej pracy pokazano, że istnieje granica lipofilności, po ­niżej której komórki nie reagują na cząsteczki che- mouczulacza.

Oddziaływanie chemouczulaczy z dwuwarstwami lipidowymi badano między innymi w przypadku fe- notiazyn, leków należących do środków psychotro­powych, będących równocześnie efektywnymi m o­

dulatorami MDR. Pokazano, że chloropromazyna (CPZ), amfipatyczny kationowy lek z tej grupy związków wbudowuje się w lipidową dwuwarstwę liposomów ze współczynnikiem podziału zależnym od długości acylowego łańcucha lipidu i zab u rza ją w sposób zależny od fosfolipidowej grupy polarnej [37]. Wykazano również, że powierzchnia przypa­dająca w błonie na cząsteczkę fosfatydyloseryny (PS) ulega podwojeniu, gdy chloropromazyna w bu­dowuje się do liposomów. Wpływ chloropromazyny na błony utworzone z mieszaniny lipidów DPPC/DM PC, które nie niosą ładunku elektryczne­go netto jes t niewielki i wskazuje na słabe od­działywanie chloropromazyny z nienaładowanymi cząsteczkami fosfolipidów [37],

Rola protonowania w oddziaływaniach modulato­rów M DR z błonami badana była w przypadku inne­go reprezentanta fenotiazyn — trifluoperazyny. W y­kazano, że postać neutralna tego leku, jako bardziej hydrofobowa, lepiej wbudowuje się w błony erytro­cytów [38].

Chemouczulacze mogą wpływać na wiązanie sub­stratów glikoproteiny P z błoną oraz na ich dyfuzję przez błonę. Wykazano to na przykładzie werapamilu (inhibitor glikoproteiny P), który zwiększa szybkość dyfuzji doksorubicyny (substrat glikoproteiny P) przez błony liposomów [30]. Chemouczulacze mogą zatem zwiększać szybkość wpływu substratów gliko­proteiny P do komórki na drodze biernej dyfuzji, co dzięki skróceniu czasu pobytu leku w błonie pozwala tym ostatnim na „ucieczkę” przed wypompowaniem przez ten transporter. Dzięki temu stężenie leku wewnątrz komórki staje się większe. Stwierdzono, że niektóre modulatory — kationowe leki lipofilne —

212 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

mają zdolność do indukowania przepływu barwnika (,Sulphan blue) poprzez błony jednowarstwowych pę­cherzyków formowanych z ujemnie naładowanych li­pidów [39]. Indukowanie tego przepływu pod wpływem poszczególnych związków zwiększało się znacznie ze wzrostem współczynnika podziału okta- nol/bufor. Zmianę przepuszczalności liposomów pod wpływem kilku chemouczulaczy (rezerpiny, werapa- milu, chininy i kolchicyny) wykazano również ba­dając wpływ tych substancji na bierny transport znacznika fluorescencyjnego — karboksyfluoresce- iny [40]. Modulatory mogą indukować w błonach mo­delowych powstawanie lipidowej nie dwuwarstwo­wej fazy heksagonalnej Hn [41]. Wśród znanych wcześniej czynników, które wpływają na przejścia dwuwarstwa — struktury nie dwuwarstwowe są: tem­peratura, skład lipidowy, lokalne anestetyki i kationy dwuwartościowe. Wykazano, że chloropromazyna, chemouczulacz z grupy fenotiazyn, może indukować powstawanie fazy Hu w błonach modelowych zawie­rających kwas fosfatydowy (PA) [41].

Rozpatrując związek pomiędzy strukturą leków a ich zdolnością do wiązania się z białkami błonowy­mi, trzeba wziąć pod uwagę lokalne otoczenie lipido­we, w którym wiązanie takie zachodzi. Przy wyzna­czaniu stałej dysocjacji K d lek-białko transportujące należy rozważyć stężenie leku w dwuwarstwie lipi­dowej błony [42], Obserwując wiązanie leków z oczyszczoną glikoproteiną P w obecności różnych fosfolipidów, stwierdzono, że w przypadku winbla- styny stała dysocjacji Kd lek-białko transportujące zmienia się znacznie w zależności od otoczenia lipi­dowego [43]. Zmiany stałej K d m ogą odzwierciedlać różnice w zdolności leków do wbudowyw ania się do fazy lipidowej. Powinowactwo wiązania winblasty- ny z glikoproteiną P jes t odwrotnie proporcjonalne do współczynnika podziału tego leku pomiędzy fazą wodną a lipidową. Glikoproteiną P w rzeczywistości „widzi” swoje substraty umieszczone w lipidowej dwuwarstwie. Białko to może mieć stosunkowo ni­skie powinowactwo do swoich substratów, ale jes t to kompensowane przez lipidową dwuwarstwę, która koncentruje leki, „prezentując” je białku.

W przypadku oddziaływań lek-błona małe m ody­fikacje w strukturze związków (substratów P gliko- proteiny) należących do tej samej rodziny chemicz­nej mogą prowadzić do istotnej zmiany oddziaływań z lipidową dwuwarstwą, co zaobserwowano na przykład w przypadku antracyklin [44], Różna loka­lizacja i współczynnik podziału w błonie mogą z ko­lei zmieniać dostęp leku do miejsca wiązania z białkiem lub spowodować związanie się leku z in­nym fragmentem białka.

IV-2. W pływ stanu fazowego lipidów błonowych na proces transportu leków

Z uwagi na zanurzenie wielolekowych transporte­rów w środowisku lipidowym błony, oraz ze względu na hydrofobowość ich substratów, wydaje się oczy­wiste, że fosfolipidy m uszą odgrywać ważną rolę w modulowaniu zarówno ATPazowej aktywności, jak i transportowych właściwości glikoproteiny P.

Integralne białka błonowe w ym agają zwykle dla swojej funkcjonalnej aktywności minimalnej liczby zasocjowanych z nimi fosfolipidów. ATPazowa ak­tywność glikoproteiny P zostaje zniesiona przy całkowitym usunięciu jej lipidowego otoczenia za pom ocą Tritonu X-100 lub deoksycholanu [45]. Po­nowne umieszczenie uprzednio wyizolowanej gliko­proteiny P w otoczeniu różnych fosfolipidów przy­wraca aktywność tego białka w różnym stopniu, np. azolektyna — mieszanina fosfolipidów z ziaren soi przywraca 84% pierwotnej aktywności, fosfatydylo- cholina z żółtek ja ja kurzego — 95%, a stosunkowo płynny w pokojowej temperaturze, syntetyczny lipid — dimirystylofosfatydylocholina (DMPC) — 62%. W przeciwieństwie do tego lipidy o wysokiej tem pe­raturze topnienia takie jak: dipalmitylofosfatydylo- cholina (DPPC), dimirystylofosfatydyloetanoloami- na (DMPE) czy dipalmitylofosfatydyloetanoloamina (DPPE) nie przywracają glikoproteinie P jej aktyw­ności. W temperaturze pokojowej, a więc takiej w j a ­kiej prowadzono powyższe eksperymenty, lipidy te znajdują się w stanie żelu i cechują się stosunkowo małą płynnością. Dane te wskazują, że glikoproteiną P dla swojej aktywności ATPazowej potrzebuje w najbliższym otoczeniu obecności fosfolipidów cha­rakteryzujących się dużą płynnością.

Wiadomo, że na płynność dwuwarstwy lipidowej duży wpływ m ogą wywierać nawet sublityczne ilości działających na nią detergentów. Już w latach sie­demdziesiątych stwierdzono, że Tween 80 może uczulać na leki komórki oporne [46]. Kilka niejono­wych detergentów, w szczególności z grupy poliok- syetylenów moduluje cytotoksyczność i/lub akum u­lację związków przeciwnowotworowych w opor­nych komórkach nowotworowych. Przyjmuje się, że w odwracaniu oporności M DR przez detergenty ma znaczenie ich wpływ na fazę lipidową błony, chociaż możliwe jes t również specyficzne oddziaływanie z glikoproteiną P.

W innych badaniach [47] wykazano, że lipidy są zdolne nie tylko do przywracania katalitycznej ak­tywności po uprzedniej delipidacji detergentem, ale również do ochrony glikoproteiny P przed termiczną inaktywacją. Pokazano, że przed inaktywacją najle­

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 213http://rcin.org.pl

piej chronią fosfatydyloetanoloaminy (PE) z nasyco­nymi łańcuchami — dimirystylofosfatydyloetanolo- amina (DMPE) i dipalmitylofosfatydyloetanoloami- na (DPPE).

Aktywność glikoproteiny P wydaje się szczegól­nie wrażliwa na rodzaj i stan fizyczny dwuwarstwy lipidowej w całej objętości błony (nie tylko w naj­bliższym otoczeniu białka). Egzogenne fosfolipidy m odulują ATPazową aktywność glikoproteiny P. O b­serwowano inhibicję jej ATPazowej aktywności przy wzroście płynności lipidowej dwuwarstwy. Zale­żność ATPazowej aktywności glikoproteiny P od składu lipidowego w całej objętości błony może od­zwierciedlać zmiany konformacyjne indukowane w transbłonowej części glikoproteiny P w danym śro­dowisku lipidowym, przenoszone następnie do miejsc wiązania ATP. Wrażliwość ATPazowych do­men glikoproteiny P na stan fazowy dwuwarstwy, w którą białko jes t wbudowane [45] pozwala sądzić, że domeny te m ogą być ściśle zasocjowane z dwu- warstwą lipidową. Zależność aktywności glikoprote­iny P od płynności otaczającej j ą dwuwarstwy lipido­wej odbiega od zwykle obserwowanej dla innych transporterów. W przypadku wielu pomp i enzymów energia aktywacji jes t mniejsza, gdy dwuwarstwa li­pidowa, w której są zanurzone, znajduje się w fazie ciekłokrystalicznej. Glikoproteina P natomiast efek­tywniej hydrolizuje ATP, gdy jes t wbudowana w dwuwarstwę będącą w stanie żelu. Stan fazowy wpływa również na szybkość pom powania leków i jest ona większa w stanie żelu [45]. Wykazano, że dodanie związku upłynniającego dwuwarstwę (alko­hol benzylowy) powoduje 2-4 krotne zmniejszenie zdolności glikoproteiny P do transportu daunorubi- cyny i winblastyny [48]. Wzrost zdolności transpor­towych glikoproteiny P w obecności mniej płynnych lipidów jest cechą zadziwiającą. Większość b łono­wych białek transportujących efektywniej działa w otoczeniu lipidów w fazie płynnej, a kilka z nich tra­ci zdolność transportową, gdy lipidowa matryca jes t w stanie żelu. Glikoproteina P jes t zatem nie­zwykłym transporterem, którego funkcja jes t m odu­lowana przez lipidy w nieznany dotąd sposób. M odu­lujący wpływ na aktywność glikoproteiny P może wywierać cholesterol. Lipid ten może wpływać na funkcję białka błonowego przez zmianę fizycznych właściwości lipidowej dwuwarstwy (w całej jej obję­tości) lub przez działanie przy interfazie li- pid-białko. Inne transportery ABC zaangażowane w M DR np. w Candida albicans i Saccharom yces ce- rivisiae są również wrażliwe na skład lipidowego otoczenia, a w szczególności na zawartość choleste­rolu [49,50].

IV-3. Fenotiazyny jako przykład modulatorów oporności wielolekowej

Fenotiazyny oddzia łu ją z receptorami komórek układu nerwowego, m.in. z receptorami dopamino- wymi i receptorami serotoniny. Ostatnio wykazano również, że chloroprom azyna silnie hamuje prądy postsynaptyczne w yw ołane w iązaniem kwasu y-aminom asłowego (GA BA ) z jego receptorem [51]. Fenotiazyny oddziału ją również z białkami tworzącymi kanały jonow e w błonach, na przykład z kanałami potasowym i i sodowymi. Oprócz tego jednak fenotiazyny, tioksanteny i związki podobne do nich strukturalnie są szczególnie silnymi m odu­latorami MDR, co w ykazano w kilku opornych li­niach kom órek now otw orow ych [52-54], Istotny wpływ na zdolność ham ow ania przez nie transpor­towej aktywności g likoproteiny P m ają następujące właściwości strukturalne: hydrofobowy trójcy- kliczny pierścień, dodatnio naładow ana trzeciorzę­dowa amina oraz wprow adzenie reszty aminowej do formy cyklicznej [55, 56]. Analiza zdolności do re ­dukcji oporności w ielolekowej przez 232 fenotiazy­ny w opornych mysich kom órkach białaczkowych P388/DOX potw ierdziła istotność wymienionych cech strukturalnych [57]. Wykazano, że jedna z fe- notiazyn — trifluoperazyna — oprócz tego, że ha­muje aktywność pom pow ania leków przez gliko- proteinę P w kom órkach nowotworow ych, jes t rów ­nież inhibitorem transportu rodaminy 6G (substrat glikoproteiny P) przez białko Pdr5p — funkcjonal­ny hom olog glikoproteiny P z drożdży piekarskich Saccharom yces cerevisiae [58], Okazało się, że wiele zw iązków mających zdolność odwracania oporności w ielolekowej w kom órkach now otw oro­wych, a także wiele leków przeciwnowotworo- wych, jes t silnymi inhibitorami transportu rodam i­ny 6G przez Pdr5p. W skazuje to na funkcjonalne podobieństw o pom iędzy glikoproteiną P a Pdr5p [58].

W przypadku modulowania oporności wieloleko­wej przez fenotiazyny i ich pochodne, a także inne chemouczulacze, ich wpływ na właściwości lipido­wej fazy błony może mieć istotny wkład do moleku­larnych m echanizmów redukcji oporności wielole­kowej. Fenotiazyny wywierają istotny wpływ na dwuwarstwę lipidową, jak wykazano to między inny­mi w badaniach własnych autorów pracy. W pływają one na płynność lipidów błonowych w błonach m o­delowych i naturalnych [59], obniżają temperaturę i entalpię przejścia fazowego żel-ciekły kryształ oraz m ogą indukować separację faz w układach lipido­wych [60].

214 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

V. Zmiany w metabolizmie lipidów w komórkach opornych i wpływ modulatorów na ten metabolizm

V -l. Skład lipidowy błon komórek nowotworo­wych wykazujących oporność wielolekową

W komórkach linii wyselekcjonowanych poprzez ekspozycję na leki cytotoksyczne obserwuje się zmiany w składzie lipidowym błon plazmatycznych. M ogą to być zmiany w zawartości neutralnych lipi­dów, fosfolipidów lub kwasów tłuszczowych [61-63]. Trudno jednoznacznie określić, czy obser­wowane modyfikacje struktury lipidów błonowych są związane z nadekspresją glikoproteiny P, czy też są niezależną konsekw encją procedury selekcyjnej poprzez ekspozycję komórek na leki [64], M etabo­lizm lipidów w komórkach nowotworów różnych ty­pów jest na ogół zaburzony, a rozwój oporności może pogłębiać te zaburzenia [65].

Zmiany w składzie lipidowym błon towarzyszące pojawieniu się oporności na leki są różne w różnych komórkach. Na przykład w komórkach P388 mysiej białaczki, wyselekcjonowanych za pom ocą adriamy- cyny, stwierdzono zwiększone ilości fosfatydylo- choliny oraz sfingomieliny [66], Użycie dipiridamo- lu zamiast adriamycyny prowadziło do zwiększenia ilości fosfatydyloseryny i zmniejszenia ilości fosfa- tydyloetanoloaminy w komórkach P388. W tym sa­mym rodzaju komórek selekcjonowanych za pom ocą daunomycyny stwierdzono natomiast zmniejszoną ilość fosfatydyloseryny [67].

Przy zastosowaniu jądrow ego rezonansu m agne­tycznego 'H N M R zaobserwow ano różnice pom ię­dzy fragmentami widma pochodzącymi od lipidów w przypadku komórek K562 wrażliwych i opornych na działanie adriamycyny [64]. Natężenie sygnału p o ­chodzącego od kwasów tłuszczowych było znacznie wyższe w komórkach wrażliwych niż w opornych. W komórkach opornych stwierdzono wzrost natężenia sygnałów pochodzących od fosfatydyloinozytolu i cholesterolu. Wzrost zawartości zarówno choleste­rolu, jak i fosfolipidów wykryto także w lekoopor- nych białaczkowych limfoblastach T, wyselekcjono­wanych za pom ocą winblastyny [68].

W nowotworow ych komórkach opornych na leki obserwuje się również znacznie zmieniony m etabo­lizm ceramidów i glikolipidów (przede wszystkim glikosfingolipidów) w porównaniu z komórkami nie wykazującymi oporności [21,77], co również wpływa na występowanie różnic w składzie lipido­wym błon komórek wrażliwych i opornych.

V-2. W pływ modulatorów lekooporności natransport i metabolizm lipidów w komórkach

Chemouczulanie komórek opornych może prow a­dzić do zmian w ilości niektórych fosfolipidów w ko­mórkach, jak to stwierdzono w komórkach P388 [66]. W reakcji na działanie leków odwracających oporność komórek, takich jak: werapamil, tamoksy- fen i dipirydamol stwierdzono wzrost syntezy fosfa- tydylocholiny w komórkach opornych i brak takich zmian w komórkach wrażliwych na leki.

Niektóre modulatory oporności wielolekowej wpływają na szlaki metaboliczne lipidów; przykładem takim m ogą być tamoksyfen, werapamil i cyklosporyna A, które ham ują glikozylację cerami- du. Zmiany w biosyntezie lipidów pod wpływem m o­dulatorów dotyczą na ogół właśnie glikolipidów i sfingolipidów. PCS833, silny chemouczulacz będący pochodną cyklosporyny, aktywuje syntezę ceramidu i zwiększa jednocześnie wrażliwość kom ó­rek nowotworowych (KBV1) na winblastynę [69]. Chloropromazyna działając na komórki wywiera wpływ na enzymatyczne przemiany kwaśnych fosfo­lipidów. Jednak nie da się wytłumaczyć wszystkich obserwowanych zmian jedynie poprzez bezpośred­nie oddziaływanie modulatora z enzymami katali­zującymi poszczególne etapy przemian. Jest bardziej prawdopodobne, że chloropromazyna wpływa na fi­zyczne rozmieszczenie substratów w stosunku do en­zymów w błonie, przy czym zjawisko to określane jes t jako prezentacja substratu [37].

Na kolejne istotne powiązania pomiędzy w ystępo­waniem oporności z nadekspresją w błonie kom órko­wej glikoproteiny P a lipidami wskazuje zdolność glikoproteiny P do transportu lipidów [70], Nie w ia­domo, czy lipidy z długimi łańcuchami reszt kwasów tłuszczowych są transportowane przez glikoproteinę P, wykazano natomiast, że glikoproteina P transpor­tuje krótkołańcuchowe analogi fosfolipidów, akumu- lując je w zewnętrznej warstewce dwuwarstwy lipi­dowej [71]. Glikoproteina P transportuje również krótkołańcuchowe analogi sfingomieliny i glukozy- loceramidu [77]. Podobne obserwacje poczyniono również w przypadku innych transporterów odpo­wiadających za oporność w ielolekową np. w kom ór­kach drożdży — w transport lipidów są praw dopo­dobnie zaangażowane transportery Pdr5, Yorlp, CDR1 [72],

Niektóre badania wskazują, że glikoproteina P może brać także udział w transporcie steroli z błony plazmatycznej do retikulum endoplazmatycznego, kontrolując estryfikację cholesterolu i jego biosynte­

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 215http://rcin.org.pl

zę [73, 74]. Sterole często są substratami glikoprote­iny P bądź modulatorami MDR. W ykazano, że okre­ślone mutacje w strukturze glikoproteiny P prow adzą do utraty jej zdolności do rozpoznaw ania steroli i ich transportu [75, 76],

VI. Proces chemouczulania a modyfikacja właściwości fazy lipidowej błony komórkowej

M odulatory M D R dzia ła ją często poprzez specy ­ficzne ham ow anie g likoproteiny P [3, 56]. L ip id o ­wa faza błony nie może jednakże być pom inię ta w badaniach nad m echanizm em dzia łan ia m odu la to ­rów. Chinidyna i ira^s-f lupen tik so l są bardziej ak ­tywne jako modulatory M D R niż ich odpowiednie stereoizomery. Taką stereospecyficzność związków chiralnych przypisuje się zw ykle specyficzności wiązania s tereoizom erów z określonym i miejscam i w łańcuchach peptydow ych białek. Jednakże ob y ­dwa stereoizomery f lupentiksolu ( tra n s - i cis-) w równym stopniu ham ują przy łączanie azydopiny do glikoproteiny P, co przem aw ia p rzeciw ko różnym m iejscom wiązania tych izom erów w cząsteczce transportera. Za pom ocą jąd row ego rezonansu m a­gnetycznego i skaningowej kalorym etrii różn ico­wej w ykazano natomiast, że trans- i c /s-f lupenti- ksol m ogą oddziaływać z lipidami, fosfa tydylocho- liną i fosfa tydyloseryną w sposób zależny od ich stereoizomerii [78]. Fakt ten p rzem aw ia za ko n iecz­nością uwzględnienia roli oddzia ływ ania m odu la to ­rów M DR z lipidami w procesie chem ouczulan ia komórek.

Modulatory oporności wielolekowej ze względu na swoją hydrofobowość w nikają do lipidowej dwu- warstwy błony i oddziałują z jej składnikami. N ie ­zbędne jest dokładne poznanie lokalizacji m odulato­rów w błonie oraz dyfuzyjnych charakterystyk w ba­danym układzie. Łatwość wnikania do błony jest istotnym warunkiem rozpoznania substratów, czy też przypominających je inhibitorów, przez transportery związane z opornością w ielo lekow ą MDR. W ykaza­no na przykład korelację pom iędzy hydrofobow ością modulatorów transportera Pdr5p a ich stężeniem ha­mującym do połowy aktywność tej pompy [58]. Wiele danych doświadczalnych wskazuje na związek pomiędzy hydrofobow ością m odulatorów z ich zdolnością do odwracania oporności w ielo leko­wej komórek nowotworow ych [79].

Nadekspresja glikoproteiny P wraz ze wszystkimi jej skutkami, jak na przykład zaburzenia w strukturze i funkcji błony, jes t jedynie jednym z elementów ple- jotropowych zmian obserwowanych w opornych ko­

mórkach nowotworowych. Opracowanie strategii postępowania mającej na celu zwiększenie skutecz­ności chemioterapii w ym aga zrozumienia m oleku­larnych podstaw tych plejotropowych zmian w błonach komórek opornych. N ależą tu m.in. zmiany przepuszczalności, składu lipidowego lub stanu fa­zowego lipidów błon komórkowych.

Rekonstytucja oczyszczonej glikoproteiny P w pęcherzykach lipidowych o określonym składzie wpływa na przejścia fazowe w znacznej liczbie ota­czających j ą lipidów, co pokazano m etodą skaningo­wej kalorymetrii różnicowej [43]. Ze wzrostem za­wartości glikoproteiny P w błonie, następuje przesu­nięcie temperatury przejścia fazowego lipidów w stronę niższych temperatur oraz znaczne obniżenie kooperatywności topnienia lipidu, czyli zm niejsze­nie tej frakcji cząsteczek lipidowych, które jednocze­śnie podlegają przejściu fazowemu. Pokazano, że wbudowaniu P-gp do liposomów towarzyszy wzrost płynności błony i zwiększenie jej przepuszczalności Efekty te są częściowo zmniejszane przez obecność w błonie cholesterolu — zwiększanie jego zawarto­ści w błonie do 30% wagowych wywołuje zm niejsze­nie płynności dwuwarstwy lipidowej oraz jej p rze­puszczalności [80],

W przypadku silnie opornych komórek, w których glikoproteina P stanowi ponad 20% białka b łonow e­go, zaburzenie fazy lipidowej wywołane jej obecno­ścią wpływa silnie na biofizyczne właściwości lipi­dowej dwuwarstwy, co z kolei może zmieniać trans­portowe funkcje glikoproteiny P [43],

Stosując znaczniki fluorescencyjne, wykazano [82], że gęstość upakowania zewnętrznej monowar- stwy lipidowej błony plazmatycznej jes t znacznie większa w komórkach opornych niż w komórkach wrażliwych. Obecność glikoproteiny P prowadzi wprawdzie do zmiany upakowania lipidów błono­wych, lecz nie zaobserwowano zmian całkowitej mi- krolepkości błony.

Niektóre chemouczulacze zwiększają cytotok- syczność i akumulację czynników przeciwnowotwo- rowych w określonych liniach komórkowych nie w y­kazujących oporności lub w komórkach z M D R nie wykazujących ekspresji glikoproteiny P. Takie działanie m odulatorów można, przynajmniej czę­ściowo, wiązać ze zmianami metabolizmu lipidowe­go lub/i niezależnymi zmianami właściwości błon np: płynności czy przepuszczalności. Wykazano, że zdolność niektórych związków do modulowania M DR jest skorelowana z ich zdolnością do induko­wania wypływu rodaminy 6G z liposomów oraz ha­mowania wiązania tego znacznika z błoną, a także z ich zdolnością do oddziaływania z anionowym deter­

216 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

gentem SDS [83], W wielu badaniach wykazano, że chemouczulacz mogą albo zwiększać albo zm niej­szać uporządkowanie lipidów w błonach komórek z opornością M DR łub w izolowanych frakcjach błonowych.

Modyfikacja składu lipidowego błony może uczu­lać komórki oporne bez specyficznej inhibicji gliko- proteiny P. Udowodniono, że związki lub warunki hodowli komórek, które modyfikują właściwości li­pidowej dwuwarstwy, uczulają komórki oporne, przywracając akumulację przez nie leków [84], W y­kazano, że liposomy m ogą przywracać akumulację winblastyny w kom órkach opornych i przyjmuje się, że efekt ten pochodzi z modyfikacji lipidowego składu błony komórkowej w wyniku fuzji z liposo- mami.

Rolę stanu fizycznego lipidów błonowych w re­dukcji oporności wielolekowej w liniach komórek nowotworowych wykazano przy wykorzystaniu w a­żnej klinicznie klasy nietoksycznych surfaktantów, takich jak: Solutol HS-15, Tween 40 lub Cremophor EL. Surfaktanty te obniżają płynność lipidów błono­wych i może to być ważny mechanizm niwelowania oporności przez te polioksyetylenowe związki [85].

Zaobserwowano, że zdolność do zmiany biofi- zycznych właściwości błony przez niektóre substan­cje wiąże się często z inhibicją wzrostu komórek opornych w ich obecności [86], Określone warunki hodowli i niektóre substancje są bardziej toksyczne dla komórek z opornością w ielo lekow ą niż dla w ra­żliwych linii rodzimych. Zjawisko to, nazwane hy- per- lub kolateralną wrażliwością, wykryto w kom ór­kach opornych w obecności werapamilu, lokalnych anestetyków, detergentów i długołańcuchowych n ie­nasyconych kwasów tłuszczowych [81]. Ponieważ stwierdzono, że wśród tych związków są też takie, które nie oddziałują bezpośrednio z glikoproteiną P, można sądzić, że kolateralna wrażliwość może być spowodowana przez ich wpływ na przykład na prze­puszczalność błony.

VI. Uwagi końcowe

Podsumowując, można stwierdzić, że istotna rola lipidowej fazy błony plazmatycznej w zjawisku oporności wielolekowej i jego modulacji wynika z kilku przyczyn:— związki transportowane przez glikoproteinę P

oraz modulatory oporności są substancjami o znacznej hydrofobowości, a ich transport do ko­mórki zachodzi drogą biernej dyfuzji poprzez dwuwarstwę lipidową, zgodnie z gradientem p o ­

tencjału chemicznego lub elektrochemicznego [3 0 ,3 1 ] ,

— zgodnie z h ipotezą „molekularnego odkurzacza” leki usuwane są z komórki bezpośrednio z dw u­warstwy lipidowej błony plazmatycznej [5, 6],

— otoczenie lipidowe glikoproteiny P (i innych transporterów usuwających leki z komórki) jest czynnikiem regulującym aktywność ATPazową i transportow ą tego białka [87],

— oporność wielolekową komórek nowotworowych wiąże się często ze zmienionym metabolizmem li­pidów w komórce, co w pływa na zmianę składu lipidowego błon komórek opornych w porów na­niu z komórkami wrażliwymi [64, 68].

— glikoproteiną P bierze prawdopodobnie udział w transporcie lipidów, w tym cholesterolu, w ko­mórce [75, 76].

— nadekspresja transporterów błonowych pow o­dujących lekooporność może zmieniać biofizycz- ne właściwości błony, takie jak przepuszczalność lub płynność lipidów błonowych [88],

— istnieje związek pomiędzy rozmieszczeniem gli­koproteiny P w błonie, a niedawno odkrytą struk­turą dom enow ą błon komórkowych, w której w ażną rolę odgryw ają m.in. glikosfingolipidy [21].

— modulatory oporności wielolekowej modyfikują biofizyczne właściwości błony komórkowej, ta­kie jak przepuszczalność błon, płynność lipidów błonowych, właściwości przejść fazowych lipi­dów błonowych, co może być jednym z m echani­zmów m odulowania oporności wielolekowej [41].

— niektóre modulatory, takie jak werapamil czy chloropromazyna, wyw ierają wpływ na m etabo­lizm lipidów komórkowych, co znajduje odzwier­ciedlenie w składzie błon plazmatycznych kom ó­rek opornych [89].Badania dyfuzji w błonach m odelowych oraz od­

działywania substratów glikoproteiny P i chemo- uczulaczy z lipidami, a także badania zależności p o ­m iędzy funkcjonowaniem transportera leków a jego oddziaływaniem z fazą lipidow ą błony komórkowej, powinny przyczynić się do odkrycia sposobów re­dukcji oporności wielolekowej w różnych typach ko­mórek, umożliwiając w przyszłości skuteczniejszą chemioterapię. Zagadnienia te są również istotne w przypadku oporności wielolekowej wywołanej nad- ekspresją w błonach komórek nowotworowych in­nych transporterów, na przykład typu MRP.

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 217http://rcin.org.pl

Podziękowanie

Niniejsza praca została sfinansowana z funduszy grantu KBN No. 6 P05A 01221.

Artykuł otrzymano 12 lutego 2001 Zaakceptowano do druku 20 maja 2002

Piśmiennictwo

1. G o t t e s m a n M M , A m b u d k a r S V, C o r n w e l l M M , P a s t a n I, G e r m a n U A (1996) W : S c h u l t z S G (red) M o­lecular Biology o f Membrane Transport Disorders, Plenum Press, New York, 243-257

2. S t e i n W (1997) Physiol Rev 77: 545-5903. S p o e l s t r a E C , W e s t e r h o f f H V , P i n e d o H M , D e k -

k e r H, L a n k e l m a J (1994) Eur J Biochem 221: 363-3734. F e r t e J (2000) Eur J Biochem 267: 277-2945. A l t e n b e r g G A , V a n o y e C G , H o r t o n J K , R e u s s L

(1994) Proc Nat Acad Sci USA 91: 4564-46576. Raviv Y, Pollard HB, Bruggemann EP, Pastan I, Gottesman MM

(1990) J Biol Chem 265: 3975-39807. A w a s t h i S, S h a r m a R, A w a s t h i Y C , B e l l i J A ,

F r e n k e l P (1992) Cancer Lett 63: 109-1168. U r b a t s c h I L , S e n i o r A E (1995) Arch Bioch Biophys 316:

135-1409. R o m s i c k i Y, S h a r o m F J (1998) Eur J Biochem 256:

170-1781 0 . B e v e r s E M , C o m f u r i s P, D e k k e r s D W C , Z w a a l

R F A (1999) Biochim Biophys Acta 1439: 317-33011. B a r t o s z G (1998) Post Bioch 44: 136-14912. B o s c h I, C r o o p J (1996) Biochim Biophys Acta 1288:

F37-F5413. L o o T W , C l a r k e D M (1999) Biochim Biophys Acta 1461:

315-32514. L o o T W , C l a r k e D M (1999) J Biol Chem 274:35388-3539215. F i e l d i n g C h J , F i e l d i n g P E (2000) Biochim Biophys Acta

1529: 210-22216. B r o w n D A , L o n d o n E (1997) Biochem Biophys Res Com-

mun 240: 1-717. Y u J, F i s c h m a n D A , S t e c k T L (1973)7 Supramol Struct

3: 233-24818. F i e d l e r K, K o b a y a s h i T , K u r z c h a l i a T V , S i m o n s

K (1993) Biochemistry 32: 6365-637319. C h a n g W - J , Y i n g Y - S , R o t h b e r g K G , H o o p e r

N M , T u r n e r A J , G a m b l i e l H A , D e G r u n z b u r g J, M u m b y S M , G i l m a n A G , A n d e r s o n R G W (1 9 9 4 )7 Cell Biol 126: 127-138

20. M o s s D J , W h i t e C A (1992) Eur J Cell Biol 57: 59-6521. L a v i e Y , F i u c c i G, L i s c o v i t c h M (1998) 7 Biol Chem

273: 32380-3238322. L i s c o v i t c h M , L a v i e Y (2000) Trends Biochem Sci 25:

530-53423. H a r d e r T, S i m o n s K (1997) Curr Opinion Cell Biol 9:

534-54224. W a n g T Y , S i l v i u s J R (2000) Biophys J 79: 1478-148925. B r o w n D A , L o n d o n E (1998) J Membrane Biol 164:

103-1142 6 . K u r z c h a l i a T V , P a r t o n R G (1999) Curr Opinion Cell Biol

11: 424-43127. L a v i e Y, F i u c c i G, C z a r n y M, L i s c o v i t c h M (1999)

Lipids 34: S57-S6328. D e m e u l e M, J o d o i n J, G i n g r a s D, B e l i v e a u R

(2000) FEBS Lett 466: 219-22429. P a w a g i A B , W a n g J , S i l v e r m a n M, R e i t h m e i e r

R A F , D e b e r C M (1994) 7 Molec Biol 235: 554-56430. S p e e l m a n s G, S t a f f h o r s t R W H M , d e W o l f F A , d e

K r u i j f f B (1995) Biochim Biophys Acta 1238: 137-146

3 1 . E y t a n G D , R e g e v R, O r e n G, A s s a r a f Y G (1996)7 Biol Chem 271: 12897-12902

32. H o m o l y a L, H o l l o Z, G e r m a n n U A , P a s t a n I, G o t t e s m a n M M , S a r k a d i B (1993) 7 Biol Chem 268: 21493-21496

3 3 . B o l h u i s H, v a n V e e n H W , M o l e n a a r D, P o o l m a n B, D r i e s s e n A J M , K o n i n g s W N (1996) EMBO 7 15: 4239-4245

34. Z h e l e z n o v a E E , M a r k h a m P N , N e y f a k h A A , B r e n n a n R G (1999) Cell 96: 353-362

35. L u P , L iu R , S h a r o m F J (2001) Eur J Biochem 268: 1687-1697

36. D e l l i n g e r M, P r e s s m a n B C , C a l d e r o n - H i g g i n - s o n C, S a v a r a j N , T a p i e r o H, K o l o n i a s D, L a m - p i d i s T J (1992) Cancer Res 52: 6385-6389

37. N e r d a l S A , G u n d e r s e n V, T h o r s e n H, H o i l a n d H, H o 1 m s e n H (2000) Biochim Biophys Acta 1464: 165-175.

3 8 . M a l h e i r o s S V, d e P a u l a E , M e i r e l l e s N C (1998) Biochim Biophys Acta 1373: 332-340

39. C a s t a i n g M, B r o u a n t P, L o i s e a u A, S a n t e l - l i - R o u v i e r C h , S a n t e l l i M, A 1 b e r t - F r a n c o S, M a h a m o u d A, B a r b e J (2000) 7 Pharm Pharmacol 52: 289-296

40. D r o r i S, E y t a n G D , A s s a r a f Y G (1995) Eur 7 Biochem 228: 1020-1029

4 1 . V e r k l e i j A J , d e M a a g d R, L e u n i s s e n - B i j v e 11 J, d e K r u i j f f B (1982) Biochim Biophys Acta 684: 255-262

42. M a s o n R P , R h o d e s D G , H e r b e t t e L G (1991) 7 Med C h e m 3 4 : 8 6 9 - 8 7 7

4 3 . S h a r o m F J , L i u R, R o m s i c k i Y (1998) Biochem Cell Biol 76: 695-708

44. L a m p i d i s T J , K o l o n i a s D, P o d o n a T, I s r a e l M, S a f a A R , L o t h s t e i n L, S a v a r a j N N , T a p i e r o H, P r i e b e W (1997) Biochemistry 36: 2679-2685

45. S h a r o m FJ (1997) Biochem Soc Trans 25: 1088-109646. R i e h m J , B i e d l e r L (1972) Cancer Res 32: 1195-120047. D o i g e C A , Y u X, S h a r o m FJ (1993) Biochim Biophys

Acta 1146: 65-724 8 . S i n i c r o p e F A , D u d e j a P K , B i s s o n n e t t e B M ,

S a f a A R , B r a s i t u s T A (1992) 7 Biol Chem 267: 24995- 25002

49. K r i s h n a m u r t h y S S , P r a s a d R (1999) FEMS Microbiol Lett 173: 475-481

50. K a u r R, B a c k h a w a t A K (1999) Microbiol 145: 809-81851. M o z r z y m a s J W , B a r b e r i s A, M i c h a l a k K, C h e r u ­

bi n i E (1999) J Neuroscience 19: 2474-24885 2 . M o l n a r J , H e v e r A, F a k l a I , F i s c h e r J, O c s o v s k i

I , A s z a l o s A (1997) Anticancer Res 17: 481-48653. M o l n a r J , S z a b o D, M a n d i Y, M u c s i I, F i s c h e r J,

V a r g a A, K ö n i g S, M o t o h a s h i N (1998) Anticancer Res 18: 3033-3038

54. M o t o h a s h i N , K u r i h a r a T, K a w a s e M, H e v e r A, T a n a k a M, S z a b o D, N a c s a J, Y a m a n a k a W, K e ­r i m A, M o l n a r J (1997) Anticancer Res 17: 3537-3543.

55 . F o r d J M , P r o z i a l e c k W C , H a i t W N (1988) Molec Pharmacol 35: 105-115

56. F o r d J M , H a i t W N (1990) Pharmacol Rev 42: 155-19957. R a m u N, R a m u A (1992) Cancer Chemother Pharmacol 30:

165-17358. K o 1 a c z k o w s k i M, C y b u 1 a r z - K o ł a c z k o w s k a A,

Ł u c z y ń s k i J , W i t e k S, G o f f e a u A (1998) Microbiol Drug Resistance 4: 143-158

59. M i c h a l a k K, B o b r o w s k a - H a g e r s t r a n d M, H a g e r ­s t r a n d H, P o ł a A, M o l n a r J (1999) W \ 6th International Conference on Methods and Applications o f Fluorescence Spectro­scopy, 12-15 September 1999, Paris

60. H e n d r i c h A B , W e s o ł o w s k a O, M i c h a l a k K (2001) Biochim Biophys Acta 1510: 414-425

61. A 1 o n N , B u s c h e R, T u m m l e r B, R i o r d a n J R (1991) W: R o n i n s o n , I B (red), Molecular and Cellular Biology’ o f Multidrug Resistance in Tumor Cells. Plenum Press, New York, str.

62. W r i g h t L C , D y n e M, H o l m e s K T , M o u n t f o r d C E (1985) Biochim Biophys Res Commun 133: 539-545

218 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

63. R a m u A, G l ä u b i g e r D, W e i n t r a u b H (1984) Cancer Treat Rep 68: 637-641

64. Le M o y e c L, T a t o u d R, D e g e o r g e s A, C a l a b r e s - s e C, B a u z a G, E u g e n e M, C a l v o F (1996) Cancer Res 56: 3461-3467

65. K u 1 i s z k i e w i c z - J a n u s M, B a c z y ń s k i S, M i c h a ­l a k K (1996) W: P o d o F (red) Eurospin Annual 1995-1996, Roma, str. 224-226

66. R a m u A, R a m u N , R o s a r i o L M (1991) Biochem Pharma­col 41: 1455-1461

6 7 . E s c r i b a P V , F e r r e r - M o n t e i 1 A V , F e r r a g u t J A , G o n z a l e z - R o s J M (1990) Biochemistry 29: 2775-2782

68. M a y G L , W r i g h t L C , D y n e M, M a c k i n n o n W B , F o x R M , M o u n t f o r d C E (1988)/«/ JC ancerA l: 728-733.

6 9 . C a b o t M C , G i u l i a n o A E , H a n T, L i u Y (1999) Cancer Res 59: 880-885

70 . H i g g i n s C F , G o t t e s m a n M M (1992) Trends Biochem Sci 17: 18-21

7 1 . R a g g e r s R J , v a n H e l v o o r t A, E v e r s R, v a n M e e r G (1999) J Cell Science 112: 415-422

72 . D o g r a S, K r i s h n a m u r t h y S, G u p t a V, D i x i t B L , G u p t a C M , S a n g l a r d D, P r a s a d R (1999) Yeast 15: 111-121

7 3 . D e b r y P, N a s h E A , N e k l a s o n D W , M e t h e r a l l J E(1997) J Biol Chem 272: 1026-1031

74. M e t h e r a l J E , Li H, W a u g h K (1996) J Biol Chem 271: 2634-2640

7 5 . B o s c h I, D a n u s s i - J o a n n o p o u 1 o s K, W u R L , F u ­r l o n g S T , C r o o p J (1997) Biochemistry, 36: 5685-5694

76. V o Q D , G r u o l D J (1999) J B io l Chem 274:20318-2032777. L a v i e Y, C a o H, B ü r s t e n S I , G i u l i a n o A E , C a b o t

M C (1996) J Biol Chem 271: 19530-1953678. P a j e v a I K , W i e s e M, C o r d e s H - P , S e y d e l J K

(1996) J Cancer Res Clin Oncol 122: 27-40.79 . B a r n e s K M , D i c k s t e i n B, C u t l e r G B J r , F o j o T ,

B a t e s S E (1996) Biochemistry 35: 4820-482780. R o t h i e A, T h e r o n D, S o c e n e a n t u L, M a r t i n C,

T r a i k i a M , B e r r i d g e G, H i g g i n s C F , D e v a u x P F , C a l l a g h a n R (2001) Eur Biophys J 30: 430-442

81. C a l l a g h a n R, R i o r d a n J R (1995) Biochim Biophys Acta 1236: 155-162

82. L o e D W , S h a r o m F J (1993) Br J Cancer 68: 342-3518 3 . W a d k i n s R M , H o u g h t o n P J (1993) Biochim Biophys Acta

1153: 225-23684. W a r r e n L, J a r d i l l i e r J C , M a l a r s k a A, A k e l i M G

(1992) Cancer Res 52: 3241-32458 5 . D u d e j a P K , A n d e r s o n K M , H a r r i s J S , B u c k i n ­

g h a m L, C o o n J S (\995) Arch Biochem Biophys 319: 309-31586. C a l l a g h a n R, S t a f f o r d A, E p a n d R M (1993) Biochim

Biophys Acta 1175: 277-28287. R e g e v R, A s s a r a f Y G , E y t a n D G (1999) Eur J Biochem

259: 18-248 8 . R i n t o u l D A , C e n t e r M S (1984) Cancer Res 44:4978-498089. L a v i e Y, C a o H T , V o l n e r A, L u c c i A, H a n T Y ,

G e f f e n V, G i u l i a n o A E , C a b o t M C (1997) J Biol Chem 272: 1682-1687

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 219http://rcin.org.pl

Receptory nukleotydowe

Nucleotide receptors

EDYTA GENDASZEWSKA-DARMACH

Spis treści:

I. Klasyfikacja receptorów nukleotydowychII. Źródła zew nątrzkom órkow ych nukleotydówIII. Agonisty i antagonisty receptorów nukleotydowychIV. Przekazywanie sygnałów za pośrednictw em receptorów

nukleotydowychV. Rozm ieszczenie receptorów nukleotydowych — znacze­

nie fizjologiczneV -l. Układ sercow o-naczyniowyV-2. Układ oddechowyV-3. Układ nerwowy

VI. Podsum owanie

Contents:

I. C lassification of nucleotide receptorsII. Sources of extracellular nucleotidesIII. Agonists and antagonists o f nucleotide receptorsIV. Signal transduction mediated by nucleotide receptorsV. Distribution of nucleotide receptors — physiological si­

gnificanceV -l. Cardiovascular systemV-2. Pulm onary systemV-3. Nervous system

VI. Sum m ary

W ykaz stosowanych skrótów: AMPS — adenozyno-5’-tiofo- sforan; Bz-ATP — 2 ’ lub 3’-0-(4-benzoilobenzoil)ATP; CFTR — transbłonowy regulator mukowiscydozy; GPCR — receptor błonowy sprzężony z białkami G; IL — interleukina; IP3 — ino- zytolo-l,4,5-trifosforan; IUPHAR — Międzynarodowa Unia Farmakologiczna; KN-62 — l-[N,0-bis(5-izochinolinosulfo- nylo)-N-metylo-L-tyrozylo]-4-fenylopiperazyna; LG1C — kanały jonowe regulowane przez ligandy; LPS — lipopolisacha- ryd; MAPK — kinaza białkowa aktywowana przez czynniki mi- togenne; a,p-MeATP — a,P-metylenoATP; 2-MeSATP — 2-metylotioATP; MRS 2179 — N6-metylo-2’-deoksyadeno- zyno-3’,5’-bisfosforan; NECA — 5’-N-etylokarboksyamido- adenozyna; NOS — syntaza tlenku azotu; PLA2 — fosfolipaza A2; PLC — fosfolipaza C; PPADS — fosforan 2 ’,4’-disulfo- no-6-azofenylopirydoksalu; TNF — czynnik martwicy nowo­tworu; TNP-ATP — 2 ’,3’-0-(2,4,6-trinitrofenylo)ATP.

I. Klasyfikacja receptorów nukleotydowych

Nukleotydy obecne wewnątrz komórek odgry­wają kluczową rolę w procesach metabolicznych, syntezie kwasów nukleinowych oraz regulacji ak­tywności wielu enzymów. Nukleotydy i nukleozydy uczestniczą również w przekazywaniu sygnałów ze środowiska zewnętrznego do wnętrza komórki za po­średnictwem specyficznych receptorów. Najwięcej danych dotyczy aktywności trifosforanu adenozyny,

Mgr, Polska Akademia Nauk, Centrum Badań Molekularnych i Makromolekularnych, Zakład Chemii Bioorganicznej, ul. Sien­kiewicza 112, 90-363 Łódź, e-mail: edyta@bio.cbmm.lodz.pl

który jes t uwalniany do środowiska zewnątrzko- mórkowego m. in. przez neurony, płytki krwi oraz komórki śródbłonka i reguluje takie procesy biolo­giczne, jak agregacja płytek krwi, przekaźnictwo nerwowe, czynności serca czy skurcze mięśni. ATP występujący w środowisku zewnątrzkomórkowym może być ligandem receptorów P2, lub może podle­gać szybkiej degradacji przez ekto-ATPazy i ektonu- kleotydazy. Ostatecznym produktem tych przemian jest adenozyna — ligand receptorów klasy PI [ 1 ]. W 1999 roku wykazano, że ATP może być również w y ­korzystywany jako dawca grup fosforanowych w procesie katalizowanym przez ektokinazy [2], W końcu lat osiemdziesiątych okazało się, że uwalniane nukleotydy urydylowe mogą także aktywow ać re­ceptory P2 [3], Co więcej, zidentyfikowano również receptory, które mogą być aktywowane przez wszystkie naturalnie występujące trifosforany nu- kleozydów [4, 5]. Od kilku lat zaczęły pojawiać się prace o podobnym działaniu modyfikowanych mo- nonukleotydów. Zaobserwowano, że 2-heksylotio- AMP może pełnić funkcję agonisty receptora klasy P2Y szczurzych komórek glejaka i erytrocytów indy­ka [6]. Receptory pewnego typu ( P 2 Y n ) obecne m. in. na powierzchni komórek linii HL 60 [7], ludzkich komórek gwiaździaka 1321N1 i kom órek chomika CHO-K1 [8] mogą natomiast podlegać aktywacji przez adenozyno-5’-tiofosforan (AMPS). Przepro­wadzone badania sugerują, że także deoksyadenozy- no-5 ’-tiofosforan, deoksyguanozyno-5 ’-tiofosforan i tym idyno-5 ’-tiofosforan mogą wpływać na prolife­

220 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

rację komórek poprzez interakcje z receptorami nu- kleotydowymi [9],

W 1978 roku B u r n s t o c k zaproponował klasyfi­kację receptorów purynergicznych, wyróżniając dwie główne klasy: receptory PI aktywowane przez ade­nozynę i receptory P2, wykazujące powinowactwo do ATP lub ADP [10]. Obecna klasyfikacja recepto­rów nukleotydowych P2 opiera się przede wszystkim na kryterium struktury pierwszorzędowej. Wyparła ona stosowany do niedawana podział uwzględ­niający jedynie charakterystykę farmakologiczną (powinowactwo do określonych ligandów nukleoty­dowych). Zgodnie z zaleceniami Komitetu do spraw Nazewnictwa Receptorów i Klasyfikacji Leków Międzynarodowej Unii Farmakologicznej (ang. In ­ternational Union o f Pharm acology — IUPHAR) wyróżnia się dwie grupy receptorów P2: sprzężone z białkami G receptory P2Y oraz jonotropow e recepto­ry P2X. Dotychczas sklonowano cDNA sześciu ludz­kich receptorów P2Y (P2Y,, P2Y 2, P2Y4, P2Y6, P 2Y tl i P 2 Y !2) oraz siedmiu receptorów P2X (P 2 X i.7) pochodzących z komórek innych ssaków (Tabela 1). Liczby (1-n) oznaczają kolejność k lono­wania cDNA poszczególnych receptorów. Do grupy receptorów P2Y zalicza się receptory aktywowane przez trifosforany nukleozydów (P 2Y [ — P2Yj i), re­ceptory obecne na płytkach krwi aktywowane selek­tywnie przez ADP (P 2Y )2) oraz receptory aktywo­wane przez diadenozynotetrafosforan (P2YAP4A) (na­zwy pisane kursywą oznaczają, że dotychczas nie sklonowano cDNA tych receptorów). W literaturze można jeszcze spotkać poprzednie nazwy recepto­rów, kiedy nie znano sekwencji DNA kodujących re­ceptory poszczególnych typów tzn. P2U (obecnie P2Y2), P2Z (obecnie P2X7), P 2 Y adp, P2YAC, P 2 Y c y c , P 2 T ac (obecnie P 2 Y 12) oraz P2 D (obecnie P2YAP4A). Poza tym, zgodnie z zaleceniami IUPHAR mała litera umieszczona przed nazwą receptora wskazuje pochodzenie receptora: h — ludzki, m — mysi, r — szczurzy, b — bydlęcy, t — wyizolowany z indyka, c — z kurczęcia, x — z X enopus laevis.

II. Źródła zewnątrzkomórkowych nukleotydów

Stężenie ATP w środowisku zewnątrzkomórko- wym utrzymuje się na bardzo niskim poziomie, mimo wysokiego stężenia tego nukleotydu w cyto- plazmie (3-5 mM). Wynika to z faktu, że dwuwar- stwa lipidowa błony komórkowej jes t nieprzepusz­czalna dla ATP i MgATP (podstawowa forma w cyto- plazmie). Nukleotydy mogą być uwalniane do środo­wiska zewnątrzkomórkowego w wyniku uszkodze­

nia i nagłej śmierci komórki, co zdarza się przy pęk­nięciu naczyń krwionośnych lub innych urazach tka­nek. Poza tym są one uwalniane w procesach nie związanych z lizą komórki: w wyniku egzocytozy nukleotydów nagromadzonych w ziarnistościach i pęcherzykach wydzielniczych lub w wyniku trans­portu przez kanały i pory błony komórkowej. U w ol­nione na zewnątrz komórki nukleotydy są szybko hy- drolizowane przez ekto-ATPazy, a następnie ektonu- kleotydazy. Dlatego podwyższone stężenie zew ­nątrzkomórkowych nukleotydów jest zjawiskiem przejściowym i ma miejsce po zadziałaniu określo­nych czynników stymulujących. Większość agoni- stów aktywujących płytki krwi (m.in. trombina, epi- nefryna, kolagen, ADP) powoduje również degranu- lację ich ziarnistości i w konsekwencji wzrost stęże­nia ATP w surowicy do około 50 pM [1]. Stwierdzo­no, że ATP może być również uwalniany do środowi­ska zewnętrznego bezpośrednio z cytoplazmy. W przypadku komórek śródbłonka naczyń krwiono­śnych ma to miejsce pod wpływem m.in. stresu fizjo­logicznego (np. niedotlenienie) i związków chemicz­nych (trypsyna, trombina, epinefryna), a nawet stre­su mechanicznego [ 1 1 ].

III. Agonisty i antagonisty receptorów nukleotydowych

Głównym problemem w badaniach nad charakte­rystyką farm akologiczną receptorów nukleotydo­wych jes t brak wysoce specyficznych agonistów i antagonistów oraz jednoczesne występowanie recep­torów różnych podklas na tych samych komórkach.

Biorąc pod uw agę właściwości farmakologiczne, można wyróżnić trzy duże klasy receptorów P2X. Są to po pierwsze receptory P2X] i P2X3, które charak­teryzuje wysokie powinowactwo do ATP (EC50 ~ 1//M), po drugie receptory P2X 2, P2X4, P2X 5 i P2X 6

o mniejszym powinowactwie do ATP (EC5o ~ 10 //M), po trzecie receptory o bardzo niskim pow ino­wactwie do ATP (EC 50 ~ 300-400 //M ), jak np. re­ceptor P2X 7 [12], Z kolei receptory P2Y wykazują zróżnicowane powinowactwo do nukleotydów pury- nowych i pirymidynowych. PŻY^ podobnie jak P2 Y 11 i P2Y i2, je s t określany jako purynospecyficz- ny receptor adeninowy. Receptor P2Y 2 posiada po­dobną selektywność w stosunku do ATP i UTP. R e­ceptorami pirymidynospecyficznymi są p2y3 i P2Y 6

wykazujące wysokie powinowactwo do UDP, a także receptor P2Y 4 aktywowany preferencyjnie przez UTP [13, 14], Z kolei receptor p2y8, wyizolowany z Xenopus laevis [5], a także ptasi receptor tp2y [4] mogą być aktywowane z podobną selektywnością

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 221http://rcin.org.pl

Tabela 1

Wykaz receptorów P2 i właściwości farmakologiczne [20]

Poprzednianazwa

Pochodzenie wyizolowanegoTyp receptora receptora /liczba aminokwasów

w białkuGłówne Ugandy

P2X, człowiek (hP2X,)/h399 szczur (rP2X|)/r399

mysz (mP2X|)/m399

BzATP>2-MeSATP>ATP>a,[3-MeATP

P2Xj szczur (rP2X2)/r472 2-MeSATP>ATP

P2Xj człowiek (hP2X3)/h397

szczur (rP2X3)/r397

BzATP>2-MeSATP>ATP>a,p-MeATP

P2X4 człowiek (hP2X4)/h388

szczur (rP2X4)/r388

mysz (mP2X4)/m388

ATP>2-MeSATP>a,P-MeATP

P2XS człowiek (hP2X5)/h422

szczur (rP2X5)/r455

ATP>2-MeSATP>ADP

P2X6 człowiek (hP2X6)/h431

szczur (rP2X5)/r379

mysz (mP2X6)/m379

ATP>2-MeSATP>ADP

P2X7 P2Z człowiek (hP2X7)/h595 szczur (rP2X7)/r595

BzATP>ATP

P2Y, człowiek (hP2Y|)/h373

szczur (rP2Y ,)/r373

mysz (mP2Y|)/m373

kurczak (cP2Y 1)

krowa (bP2Y 1)

indyk (tP2Y,)

2-MeSATP>ATP=ADP

P2Y2 P2U człowiek (hP2Y2)/li377 szczur (rP2Y2)/r374

mysz (mP2Y2)/m373

ATP=UTP>2-McSATP

p2y3* kurczak (cp2y3/c328) ADP>UTP>ATP?

P2Y4 człowiek (hP2Y4)/h365

szczur (rP2Y4)/r361 UTP=UDP>ATP=ADP

P2Y6 człowiek (hP2Y6)/h328

szczur (rP2Y6)/r328 UTP>ADP=2-MeSATP>ATP

p2y«* Xenopus laevis (xp2y8/x532) ATP=ITP=UTP=CTP

P2Y„ człowiek (hP2Yn)/h371 ATP>2-MeSATP>ADP

P2Y12 P2YADp,P2Y Ac,P2T ac,P2Y cyc człowiek (hP2Y |2)/h342 ADP

P2YAp4A** P2D człowiek (hP2YAp4A) AP4A

*Zgodnie z zaleceniam i IUPHAR, m ałymi literam i oznaczono receptory, których charakterystykę ustalono na podstawie klonowania cDNA nie pochodzącego z kom órek ssaków (brak danych na temat występow ania w kom órkach ludzkich i pełnionej funkcji).**Receptory pisane kursyw ą oznaczają, że ustalono ich w łaściw ości farm akologiczne, ale do tej pory nie sklonowano cDNA

przez wszystkie trifosforany nukleozydów. Receptor p 2 y7 został niedawno zidentyfikowany jako receptor leukotrienu B4 i de fa c to nie należy go zaliczać do grupy receptorów nukleotydowych, podobnie jak re­ceptorów p2y5, P2Y 9 i P2Yio [15, 16].

W badaniach nad funkcjonowaniem receptorów nukleotydowych zazwyczaj wyko-rzystywane są analogi ATP i U T P Są to m. in. 2 ’- lub 3 ’-0 -(4 -ben- zoilobenzoil)-ATP (Bz-ATP), a,p-m etylenoA TP (a,P-MeATP) lub 2-metylotioATP (MeSATP). Nadal jednak brak jes t związków, które działałyby w spo­

sób selektywny na receptory podklas P2X lub P2Y. Bz-ATP, który do niedawna stosowany był jako se­lektywny agonista receptora P2X 7 (EC50 ~ 18 pM), okazał się także skuteczny w aktywowaniu recepto­rów P 2 X[ (EC50 « 1,9 nM) i P2X 3 (E C 50 * 98 nM) [12].

Wśród antagonistów receptorów nukleotydowych najbardziej rozpowszechnionymi są suramina (lek stosowany w leczeniu trypanosomii), PPADS (sól so­dowa fosforanu 2 ’,4’-disulfono-6-azofenylopiryd- oksalu) oraz barwniki takie jak reaktywny błękit 2 ,

222 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

błękit trypanu, reaktywna czerwień. Jednakże związki te nie wykazują na tyle wysokiej selektyw­ności, aby mogły być wykorzystywane do selekcji poszczególnych podklas receptorów nukleotydo- wych. Suramina jest antagonistą zarówno recepto­rów P2X, jak i P2Y, a poza tym hamuje aktywność innych receptorów (nikotynowego, glutaminianowe- go, GABA i 5-hydroksytryptaminy) [17]. Z kolei PPADS — niekompetycyjny inhibitor receptorów

O O oo - i- o - i —O -i'—o

O' o' o" ■ y źHO OH

O O O*J o -ILo - i -o - i 1-

I - • - I -0 0 0

o o o # 11 J °-l-°-l|-o-pl-o 0 ,

o" o" o ' x y

MKS2179V

<U.J

iQ°> n- C X O - n°<

NO,

T N P A T P

VICHO

H° s A p o / ' 0' ll,>Ht c

H J O . S ^ ^ ^ S O, Na

NC H,

0 , 0 ^ > c H [ H — CO —N ^ ) ^ )

R yc.l. Wzory strukturalne niektórych agonistów (I i II) oraz antagoni­stów receptorów nukleotydowych (III-VII)

P2X może również znosić odpowiedź kom órkową wywołaną za pośrednictwem niektórych receptorów P2Y [12]. W i 1 e y i w s p. wprowadzili nowy, selek­tywny bloker receptora P2X 7 oznaczony jako KN-62 ( l - [N ,0 -b is (5 - iz o c h in o l in o s u lfo n y lo ) -N -m e ty lo - L-tyrozylo]-4-fenylopiperazyna), znany wcześniej jako inhibitor kinazy zależnej od kalmoduliny, działający w stężeniach nanomolarnych (IC50 « 9 -1 3 nM) [12, 17]. Selektywnym antagonistą receptora P2X 7 jest również błękit Coomassie [17]. Z kolei TNP-ATP (2 ’,3 ’-0-(2,4,6-trinitrofenylo)A TP) jest przykładem antagonisty receptorów P2X], P2X 2 i

P2 X 2/3. TNP-GTP wykazuje podobne właściwości, co sugeruje, że w oddziaływaniach z białkiem recep­torowym adenina nie odgrywa kluczowej roli, w przeciwieństwie do grup fosforanowych (TNP- ATP>TNP-A DP>TNP-AM P) [12], Badając różne pochodne 3 ’,5 ’ oraz 2 ’,5 ’ bisfosforanów adenozyny stwierdzono, że modyfikacje w pozycji 2 ’ i 3 ’ deok- syrybozy nie zmieniają znacząco właściwości tych związków [6]. 3 ’,5 ’-bisfosforan 2 ’-deoksyadenozy- ny z grupą m etylową w pozycji N 6 wykazywał nato­miast około 17-krotnie silniejsze właściwości anta- gonistyczne. Związek ten, oznaczony jako MRS 2179 ma stałą AT; « 100 nM [18]. Wprowadzenie w pozycji N 6 większych grup alkilowych (etylowej lub propylowej) lub grupy benzoilowej osłabia działanie MRS 2179 [6].

Ze względu na brak wystarczająco selektywnych agonistów i antagonistów receptorów nukleotydo­wych, w badaniach nad ich funkcjonowaniem i właściwościami farmakologicznymi bardzo pom oc­ne mogą być specyficzne przeciwciała. Jednak do­stępność takich przeciwciał również jest ograniczo­na. Tylko nieliczne laboratoria dysponująpoliklonal- nymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko re­ceptorom P2Xi, P2X4 oraz P2X 7 [17]. Dotychczas wyizolowano i scharakteryzowano tylko jedno prze­ciwciało m onoklonalne skierowane przeciwko zewnątrzkomórkowej domenie ludzkiego receptora P2X 7 [19],

IV. Przekazywanie sygnałów za pośrednic­twem receptorów nukleotydowych

Receptory P2X, których liczba aminokwasów waha się od 379 do 595, zawierają dwie transmem- branowe hydrofobowe domeny oddzielone przez ob­szerny region znajdujący się na zewnątrz komórki. W części zewnątrzkomórkowej znajduje się 10 reszt cysteinowych i od 2 do 6 miejsc glikozylacji. Zarów ­no N-, jak i C-końce receptorów P2X znajdują się po stronie cytoplazmatycznej błony komórkowej [17]. Wszystkie receptory P2X w ystępują w formie struk­tur składających się z wielu podjednostek (7 podsta­wowych zostało już sklonowanych), przy czym pod- jednostki te m ogą być identyczne (np. P2Xj w m ię­śniach gładkich) lub różne (np. P2X2/3 w zwoju dol­nym nerwu błędnego). Podjednostki receptora P2X 7

w wyniku agregacji tworzą pory przepuszczalne dla cząsteczek o niskiej masie cząsteczkowej [20]. Pory są na tyle duże, że m ogą przez nie przenikać nawet barwniki takie jak bromek etydyny (394 Da), LY (550 Da) czy YO-PRO-1 (629 Da) [17, 19],

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 223http://rcin.org.pl

Receptory P2X wiążąc specyficzne Ugandy stają się jednocześnie kanałami jonow ym i (ang. Li- gand-G ated Ion Channels — LGIC). Aktywacja re­ceptorów P2X przez ATP i UTP jest związana z szyb­kim wzrostem stężenia C a2+ w cytoplazmie. Wzrost ten może być wynikiem napływu jonów C a2+ bezpo­średnio ze środowiska zewnątrzkomórkowego przez kanały receptorowe [1]. Inną przyczyną wzrostu stę­żenia jonów Ca2+ jest wtórna aktywacja kanałów wapniowych zależnych od napięcia. Związanie przez receptor P2X agonisty powoduje bowiem depolary­zację błony komórkowej [1]. Pod wpływem sy­gnałów zewnątrzkomórkowych wzrost stężenia wap-

Tabela 2

Odpowiedź komórki na stymulację receptora nukleotydowego

nia w cytoplazmie (od około 100 nM do około 1 piM) uruchamia wiele procesów regulujących funkcje k o ­mórki. Odbiorcami sygnału wapniowego sąm . in. k i ­nazy białkowe typu C, kinazy zależne od kalmoduli- ny, fosfolipazy C, D i Zmiany w ew nątrzkom ór­kowego stężenia wapnia m ają również wpływ na ak ­tywację lub inhibicję kanałów jonow ych (np. kanału dla jonów K+) i w konsekwencji na zmianę po ten­cjału błonowego i pobudliwości komórki.

Receptory P2Y są przykładem najliczniejszej ro ­dziny receptorów błonowych sprzężonych z białkami G (ang. G Protein Coupled Receptors — GPCR). R e­ceptory P2Y są integralnymi białkami błonowymi za­wierającymi jeden łańcuch polipeptydowy tworzący siedem helikalnych domen transmembranowych

(TM1 — TM7). Liczba aminokwasów receptorów P2Y człowieka waha się od 328 do 377, a masa cząsteczkowa po glikozylacji od 41 do 53 kDa. N-ko- niec białka znajduje się na zewnątrz komórki, nato­miast C-koniec występuje po stronie cytoplazmatycz- nej [17]. Aktywacja receptorów P2Y moduluje aktyw­ność zarówno białek G q, jak również G s i Gj. Białka G podrodziny G q aktywują fosfolipazę C typu p, która katalizuje powstawanie 1,4,5-trifosforanu inozytolu z fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforanu. Trifosforan inozytolu (IP3) otwiera IP3-zależny kanał wapniowy siateczki śródplazmatycznej. Następuje wypływ jo ­nów Ca2+ do cytoplazmyi i wzrost stężenia jonów

wapnia [1]. Konsekwencją aktywacji receptorów P2Y związanych z białkami Gj jest obniżenie poziomu cAMP w cytoplazmie [21, 22], natomiast w wyniku aktywacji receptorów P2Y związanych z białkami Gs poziom cAMP zostaje podwyższony [7, 23].

Ogromna różnorodność efektów wywoływanych przez nukleotydy i nukleozydy może świadczyć o występowaniu większej liczby receptorów PI (re­ceptorów adenozyny) i P2 (receptorów nukleotydo- wych) niż wynikałoby z ilości sklonowanych cDNA. Wiadomo, że cząsteczki receptorów P2X składają się z wielu podjednostek, przy czym podjednostki recep­torów różnych podklas mogą być identyczne (homo- mery) lub różne (heteromery). Do tej pory sklonowa- no siedem podjednostek receptorów P2X (P2X i_7)

Nazwa receptora B ezpośrednia odpowiedź kom órki W tórna odpowiedź kom órki

P2X, Kanał dla Na+/K+/Ca2+ Napływ Ca2+, depolaryzacja błonyP2X2 Kanał dla Na+/K+ Depolaryzacja błonyP2X3 Kanał dla Na+/K+/Ca2+ Napływ Ca2+, depolaryzacja błonyP2X4 Kanał dla Na+/K+ Depolaryzacja błonyP2X5 Kanał dla Na+/K+/Ca2+ Napływ Ca2+, depolaryzacja błonyP2X6 Kanał dla Na+/K+/Ca2+ Napływ Ca2+, depolaryzacja błonyP2X7 Kanał dla Na+/K+ Depolaryzacja błony

P2Y, Aktywacja białek Gq/n Aktywacja PLCp—>IP3—>Ca2+P2Y2 Aktywacja białek Gq/n, Gi3 Aktywacja PLCp—>IP3—>Ca2+

i inhibicja cyklazy adenylanowej

p2y3 Aktywacja białek Gq/n Aktywacja PLCp—»IP3-»C a2+P2Y4 Aktywacja białek Gq/n Aktywacja PLCp—>IP3—>Ca2+P2Y6 Aktywacja białek Gq/n Aktywacja PLCP—>IP3—>Ca2+

p2y8 Brak danych Ca2+P2Y„ Aktywacja białek Gs, Gq/n Aktywacja PLCP->IP3—>Ca2+

i aktywacja cyklazy adenylanowejP2Y12 Aktywacja białek Gi/o Inhibicja cyklazy adenylanowejP2Yapu Brak danych Brak danych

224 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

mogących asocjować ze sobą, tworząc heterome- ryczne receptory P2X. Obecnie wiadomo o w ystępo­waniu czterech heteromerów P2X: P2 X 2/3, P2X4/6, P 2 X 1/5, P2X 2/6 [24].

Y o s h i o k a , S a i t o h i N a k a t a wykazali m oż­liwość tworzenia na drodze asocjacji dimerów składających się z receptora adenozyny A] i recepto­rów nukleotydowych P2Yi lub P2Y 2 (mniej niż 5% homologii w sekwencji aminokwasowej) [25]. K om ­pleks A]/P2Yi wykazuje odmienne właściwości far­makologiczne w stosunku do receptorów Aj i P2Y], Związki, będące agonistami lub antagonistami re­ceptora adenozyny w ykazują znikome powinow ac­two do powstałego heteromeru, podczas gdy agoni- sta receptora P2Y] (A D PpS) — zwiększone około 400 razy. W wyniku asocjacji receptorów A! i P2Y] zmienia się nie tylko powinowactwo ligandów, ale również uruchamiane mechanizmy przetwarzania sygnału błonowego. Przyłączenie agonisty do recep­tora Ai powoduje zmianę jego konformacji, co poz­wala na oddziaływanie z białkiem Gj/o hamującym aktywność cyklazy adenylanowej. Z kolei receptor P2Yi jest związany z białkiem Gq, aktywującym fos- folipazę C. W komórkach wykazujących ekspresję receptora A)/P2Yi, A DPpS powoduje obniżenie stę­żenia cAMP (aktywacja białek GO, nie mając wpływu na aktywność fosfolipazy C. Rezultaty te wskazują, że tworzenie heteromeru z receptora A] i P 2Y ] zmienia funkcjonalne właściwości na korzyść aktywacji cyklazy adenylanowej. Możliwość asocja­cji różnych receptorów GPCR może wyjaśniać niety­powe właściwości przypisywane przez wielu auto­rów receptorom nukleotydowym np. stwierdzony przez O k a d ę i w s p . wzrost stężenia jonów wapnia w cytoplazmie neuronów pod wpływem adenozyny [26], Podobnie F e r n a n d e z i w s p . wykazali, że ATP, ATPyS i AM P aktywują receptor P2Y w sposób zależny od 8-cyklopentyloteofiliny, lecz niezależny od suraminy i PPADS [27].

Wielu autorów sugeruje również występowanie niesklonowanych do tej pory receptorów nukleoty­dowych. Stwierdzono, że uwalnianie noradrenaliny z tętnicy ogonowej szczura zachodzi zarówno pod wpływem 2-chloroadenozyny, jak i ATP [28]. R ów ­nież działanie ATP i adenozyny wywołujące zwiot­czenie mięśni tętnicy piersiowej królika należy przy­pisać receptorom innym niż PI i P2 [29], podobnie jak stymulowane przez ATP i 2-chloroadenozynę uwalnianie norepinefryny z nerwów adrenergicz- nych tętnicy usznej królika [28]. S a i t o h i N a k a t a wyizolowali białko pochodzące z mózgu szczura, wykazujące powinowactwo do 5 ’-N-etylokarboksy- amidoadenozyny (ang. 5 ’-N -ethylcarboxam idoade-

nosine — NECA) [30]. Specyficzność wiązania li­gandów zapisano następująco: 5 ’-N-etylokarboksy- amidoadenozyna = A D PpS > cAMP = (3,y-MeATP > A P4A > a ,P -M eA T P > 5 ’-deoksy-5’-metylotioade- nozyna. Kolejność wiązania ligandów przez białko wyizolowane z mózgu szczura odpowiada aktywacji białka receptorowego opisanego przez C h i n e 1- 1 a t o i w s p. i aktywowanego w następującej kolej­ności przez ligandy: 5 ’-N-etylokarboksyamidoade- nozyna > adenozyna > ATP [29]. Uwalnianie norad­renaliny z nerwów adrenergicznych tętnicy ogono­wej szczura jes t stymulowane przez 2 -chloroadenoz­ynę > ATP > adenozynę [28], a indukcja prądu K+ w pęcherzykowych oocytach X enopus laevis w rów­nym stopniu zależy od adenozyny, ATP i p,y-M- eATP [31]. Receptory aktywowane zarówno przez ATP i adenozynę zaliczane są obecnie do nowej kla­sy receptorów P3 lub tzw. białek P3LP (ang. P 3 p u ri- noreceptor-like p ro te ins — P3LP). Aktywacja re­ceptorów P3 moduluje aktywność białek G s, czego konsekwencją jest wzrost stężenia cAMP w cytopla­zmie [31, 32], Takiej aktywacji nie wywołują związki będące antagonistami receptorów PI (1,3- dipropylo-8-(2-amino-4-chlorofenylo)ksantyna i P2 (suramina), a także 2-M eSATP i UTP (agonisty re­ceptorów P2Y) [29]. Antagonistyczne działanie w o­bec receptora P3 wykazuje 8-(p-sulfofenylo)teofili- na. Dopóki nie zostanie sklonowany cDNA hipote­tycznego receptora P3, nie można jednak wykluczyć, że efekty przypisywane temu białku są wywołane asocjacją receptorów P2Y i PI.

V. Rozmieszczenie receptorów nukleotydo­wych — znaczenie fizjologiczne

Nukleotydy obecne w środowisku zewnątrzko- m órkowym w pływ ają na funkcjonowanie komórek wielu typów za pośrednictwem receptorów P2. W y­kazano, że nukleotydy działają jako m iędzykom ór­kowe przekaźniki informacji w procesach zw iąza­nych ze skurczem mięśni gładkich, przekazywaniem sygnałów nerwowych i regulowaniem funkcji układu krwionośnego. W ciągu ostatnich 10 lat okazało się, że trifosforany i difosforany nukleozydów stanowią jedne z najbardziej rozpowszechnionych cząsteczek sygnałowych.

V -l. Układ sercowo-naczyniowy

Od 1961 roku wiadomo, że ADP powoduje agre­gację płytek krwi [33]. Na poziomie komórkowym objawia się to wzrostem wewnątrzkomórkowego stę­żenia jonów Ca2+, aktywacją fosfolipazy C i inhibi­

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 225http://rcin.org.pl

cją cyklazy adenylanowej. Poza tym ADP wywołuje zmianę kształtu płytek krwi i aktywację receptorów fibrynogenu [15, 33]. Do niedawna sądzono, że wszystkie przedstawione efekty są w ywoływane za pośrednictwem jednego receptora nukleotydowego P2j. Okazało się jednak, że na powierzchni tych ko­mórek występują trzy rodzaje receptorów nukleoty­dowych (Tabela 3). Receptor P2Y) odpowiedzialny jest za uwalnianie C a2+ ze struktur komórkowych po­przez aktywację fosfolipazy C. Jonotropowy recep­tor P2 X! pośredniczy w napływie jonów w apnio­wych ze środowiska zewnętrznego, natomiast recep­tor P 2 Y 12, sklonowany niedawno przez H o 11 o p e - t e r a i w s p. [34], wpływa na zahamowanie aktyw ­ności cyklazy adenylanowej. Receptor P2Y ]2, związany z białkiem Gj najprawdopodobniej nie b ie­rze udziału w indukowanej przez ADP zmianie kształtu płytek krwi, natomiast wraz z receptorem

Tabela 3

lują powstawanie pęcherzyków pinocytowych [17]. Mimo obecności na tych komórkach zarówno recep­torów P2Y, jak i P 2X 7, różnice w wartościach EC 50

dla ATP (odpowiednio 50-70 pM i 250-400 pM) wskazują, że łatwiej i częściej aktywowane są recep­tory P2Y [17]. ATP i inne nukleotydy aktywują ma- krofagi w odpowiedzi na uszkodzenia tkanek lub in­wazję bakteryjną: s tym ulują wytwarzanie nadtlen­ków i czynników o charakterze humoralnym, takich jak T N F -a i interleukina 1(3 ( IL -ip ) , chociaż m ole­kularny mechanizm tego zjawiska nie jest poznany. Wiadomo, że pod wpływem bakteryjnego lipopolisa- charydu makrofagi, w przeciwieństwie do monocy- tów krwi obwodowej, w ytwarzają wysokocząstecz- kową (31-34 kDa), nieaktywną biologicznie formę pro-IL -ip . W 1992 roku P e r r e g a u x i w s p . stwierdzili, że ATP (poprzez wiązanie się z recepto­rem P2X7), podobnie jak nigerycyna, powoduje ob-

Znaczenie fizjologiczne receptorów nukleotydowych obecnych na płytkach krwi [17, 34]

C harak terystyka receptora/odpow iedź kom órki R eceptor P2Yi2 R eceptor P2Yi R eceptor P2Xi

Napływ jonów Ca2+ ze środowiska zewnętrznego (aktywacja kanałów jonowych) - - +

Uwalnianie jonów Ca2+ z siateczki śródplazmatycz- nej (aktywacja fosfolipazy C)

- + ?

Inhibicja cyklazy adenylanowej + - -

Synteza IP3 - + -

Powinowactwo do ATP + + -

Powinowactwo do ADP + + +

Udział w zmianie kształtu płytek krwi - + -

Udział w agregacji płytek krwi + + -

P2Yi ma wpływ na ich agregację. Związki będące antagonistami tego receptora (tiklopidyna, klopido- grel) znoszą efekt inhibicji cyklazy adenylanowej i częściowo przeciwdziałają agregacji płytek krwi [15, 17]. Mimo wyizolowania m RNA receptora P 2 X t z płytek krwi nie stwierdzono jego znaczącego udziału ani w agregacji tych komórek, ani w zmianie ich kształtu [33].

Zew nątrzkomórkowe nukleotydy uwalniane np. w wyniku uszkodzenia naczyń krwionośnych w yw ie­rają wpływ nie tylko na płytki krwi, ale również na inne komórki krwi (monocyty /makrofagi, limfocyty, erytrocyty, komórki dendrytyczne) oraz na komórki śródbłonka. Już pod koniec lat sześćdziesiątych C o h n i P a r k s stwierdzili, że nukleotydy adenino- we dodane do hodowli mysich makrofagów stymu-

niżenie stężenia jonów K + w cytoplazmie, co z kolei uaktywnia enzym przekształcający nieaktywną for­mę interkeukiny p ro - IL - ip do formy dojrzałej IL - ip (17 kDa) [35]. ATP może również stymulować w y­dzielanie interleukiny 1 p poprzez aktywację egzocy- tozy pęcherzyków (późnych endosomów i lizoso- mów) zawierających tę cytokinę [17].

Innym enzymem pośredniczącym w lizie m akro­fagów, który podlega regulacji przez zewnątrzko­mórkowe trifosforany nukleozydów jest indukowal- na syntaza tlenku azotu (ang. inducible nitric oxide synthase — iNOS). ATP i UTP podane wraz z lipopo- lisacharydem w ywołują silniejszą stymulację aktyw ­ności indukowalnej syntazy tlenku azotu niż sam LPS [17]. Nukleotydy uczestniczą nie tylko w proce­sie fagocytozy czynników chorobotwórczych. O ka­

226 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

zało się, że nukleotydy są toksyczne dla zainfekowa­nych makrofagów, a w procesie tym bierze udział re­ceptor P2X 7 (cytotoksyczny wpływ ATP zostaje zniesiony po zablokowaniu tego receptora). Stwier­dzono, że ATP indukuje lizę makrofagów zainfeko­wanych przez prątki M ycobacterium za pośrednic­twem receptora P2X 7 [36]. Aktywność antybakteryj- na trifosforanu adenozyny może więc mieć istotne znaczenie nie tylko w leczeniu gruźlicy, ale również innych infekcji bakteryjnych.

Na powierzchni ludzkich limfocytów B występują receptory P2X i P2Y. Te ostatnie ulegają aktywacji nie tylko przez ATP i UTP, lecz również przez pozo­stałe trifosforany nukleozydów (GTP, CTP i ITP) [17]. Nadekspresję receptora P2X 7 stwierdzono w komórkach przewlekłej białaczki leukocytarnej [17]. Ludzkie limfocyty T, pochodzące z krwi obwodowej wykazują ekspresję receptorów P2Xi, P2X4 i P2X 7, ale do tej pory nie zidentyfikowano na ich p o ­wierzchni receptorów P2Y [17]. Obecność recepto­rów P2 Y( i P2Y2 udokumentowano natomiast w przypadku mysich tymocytów, które ulegają apopto- zie pod wpływem ATP.

Nukleotydy uwalniane z płytek krwi, neuronów i uszkodzonych komórek regulują również aktywność komórek śródbłonka naczyń krwionośnych. Na po­wierzchni ludzkich komórek śródbłonka żyły pępo­winowej stwierdzono obecność receptorów czterech podklas P2Y: P2Y,, P2Y2, P2Y 4 i P2Y 6 [37], ATP i ADP, za pośrednictwem receptorów P2Y! i P2Y2, stymulują wydzielanie tlenku azotowego oraz pro- stacykliny (PGI2) poprzez aktywację odpowiednio syntazy tlenku azotowego (NOS) i fosfolipazy A 2

[38, 39]. Związki te rozszerzają naczynia krwiono­śne i hamują agregację płytek krwi. Zewnątrzkomór- kowe nukleotydy zwiększają także adhezję neutrofili do komórek śródbłonka.

Stymulacja receptorów P2Y występujących na powierzchni komórek śródbłonka prowadzi również do fosforylacji reszty tyrozyny dwóch izoform (p42 i p44) kinazy białkowej aktywowanej przez czynniki mitogenne (ang. m itogen-activa ted protein kinase — MAPK) [40]. Chociaż rola białek G w procesach ak­tywujących kinazy MAP jest słabo poznana, aktywa­cja ta jest niezbędna dla indukowanej przez zewnątrzkomórkowe nukleotydy produkcji prosta- glandyny I2 [40],

W warunkach fizjologicznych ATP wydzielany z neuronów współczulnych reguluje napięcie naczyń krwionośnych poprzez oddziaływanie na komórki mięśni gładkich. Kiedy śródbłonek naczyń zostanie uszkodzony ATP, ADP i UTP uwalniane z płytek

krwi mogą bezpośrednio wpływać na komórki m ię­śni gładkich powodując ich skurcz i w efekcie ha­mując krwotok. W procesie tym uczestniczą zarów­no receptory jonotropow e (głównie P2Xi), jak i me- tabotropowe (P2Y2, P2Y 4 i P2Y 6) [15]. Ich aktywa­cja powoduje wzrost wewnątrzkomórkowego stęże­nia jonów C a2+, które odgrywają kluczową rolę w za­leżnym od nukleotydów skurczu mięśni. W przypad­ku komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych ATP (za pośrednictwem receptora P2Y2) jest rów ­nież czynnikiem stymulującym syntezę DNA i białek, ekspresję genów wczesnej odpowiedzi ko­mórkowej (m. in. protoonkogenu c-fos) [41]. W pro­liferacji kom órek mięśni gładkich może również uczestniczyć receptor P2Y4, którego stymulacja przez ATP powoduje z kolei aktywację kaskady ki­naz MAP [15].

V-2. Układ oddechowy

Zewnątrzkomórkowe nukleotydy mogą wpływać na funkcjonowanie komórek wielu typów górnych dróg oddechowych oraz płuc. ATP i UTP stymulują transport jonów Cl' w komórkach nabłonkowych za­równo u osób zdrowych, jak i chorych z torbielowa­tym zwłóknieniem tych komórek (mukowiscydoza). Wynikiem aktywacji receptora P2Y2, występującego na powierzchni komórek nabłonkowych, jes t wzrost stężenia jonów Ca2+ w cytoplazmie. Wzrost ten jest niezbędny do aktywacji kanału transportującego jony chlorkowe. Transbłonowy regulator mukowi- scydozy (ang. cystic fib ro sis transm em brane regula­tor — CFTR) jes t aktywowany przy niskim stężeniu jonów Ca2+. U chorych pacjentów białko CFTR jest zmutowane i ulega aktywacji przy znacznie w yż­szym stężeniu jonów wapnia. Wymagany wzrost stę­żenia wapnia w cytoplazmie ma miejsce po podaniu chorym UTP. Zewnątrzkomórkow e nukleotydy po­w odują również wzrost wydzielania mucyny przez komórki kubkowe, a następnie jej transport oraz w y­dzielanie surfaktantu (substancji lipidowej pokry­wającej c ienką w arstw ą powierzchnię nabłonka od ­dechowego) przez komórki pęcherzyków płucnych drugiego rzędu. Z tych względów ATP, a zwłaszcza UTP (uracyl — produkt rozpadu UTP — w przeci­wieństwie do adenozyny nie wywołuje efektów ubocznych) znalazły zastosowanie w terapii chorób układu oddechowego [12, 39]. Obecnie UTP jest po­dawany w postaci aerozolu chorym na mukowiscy- dozę, jak również pacjentom cierpiącym na prze­wlekłe zapalenie oskrzeli.

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 227http://rcin.org.pl

V-3. Układ nerwowy

Wpływ ATP obserwowano zarówno w przypadku komórek nerwowych, jak i glejowych. Stwierdzono, że może on odgrywać rolę neuroprzekaźnika w połączeniach synaptycznych ośrodkowego i obw o­dowego układu nerwowego. W zależności od typu komórek wywołuje stymulację (neurony przedzwo- jowe) lub inhibicję (synapsy nerwowo-mięśniowe) wydzielania acetylocholiny. N eurony hipokampa z kolei pod wpływem ATP wydzie la ją glutaminian [1], ATP bierze udział w przekazywaniu informacji od receptorów bodźców bólowych (nocyceptywnych) w przypadku zespołów zaburzeń neurotroficznych, m i­greny czy bólów nowotworowych. Podanie ATP p o ­woduje powstanie bólu w miejscu iniekcji, a także ułatwia nocyceptywną odpowiedź na inne szkodliwe czynniki. Efekt ten jest znoszony przez związki będące antagonistami receptorów P2 (suramina, PPADS). Stwierdzono, że receptor P2X 3, którego podwyższoną ekspresję wykryto w nocycepty wnych neuronach czuciowych może w znaczący sposób przyczyniać się do indukcji odczuć bólowych. Z tego względu związki będące antagonistami receptora P2X3 mogą być rozważane jako potencjalne leki przeciwbólowe [ 1 2 ].

VI. Podsumowanie

Zewnątrzkomórkowe nukleotydy odgrywają istotną rolę w modulowaniu aktywności poszczegól­nych komórek, tkanek, a nawet całego organizmu. Mimo że od dawna wiedziano o działaniu tych związków za pośrednictwem specyficznych recepto­rów obecnych na powierzchni prawie wszystkich k o ­mórek organizmu, dopiero analiza struktury cDNA i możliwość klonowania w liniach komórkowych nie wykazujących ekspresji żadnego receptora P2, p o ­zwoliła na ustalenie charakterystyki farm akologicz­nej receptorów poszczególnych podklas. Obecnie prowadzone badania m ają na celu zidentyfikowanie poszczególnych elementów i mechanizm ów zw iąza­nych z przekazywaniem sygnałów za pośrednictwem receptorów nukleotydowych. Coraz bardziej realne wydaje się zastosowanie agonistów i antagonistów receptorów P2 w leczeniu procesów zapalnych, za­krzepów naczyń krwionośnych, schorzeń układu od­dechowego i nerwowego, a nawet w terapii now o­tworów. Wykazano, że trifosforany nukleotydów m ogą powodować inhibicję wzrostu kom órek now o­tworowych pewnych typów (np. kom órek raka p ro ­staty), a nawet ich lizę. Prowadząc drugą fazę badań klinicznych stwierdzono, że podawanie ATP pacjen­

tom z zaawansowanym rakiem płuc prowadzi do za­hamowania wzrostu guza i utraty wagi ciała, a także zmniejsza stopień ogólnego wyniszczenia organi­zmu [42]. Badaniom nad Ugandami receptorów nu­kleotydowych wykazującymi działanie terapeutycz­ne powinny jednak towarzyszyć badania nad białkami innymi niż receptory P2, lecz zależnymi od obecności ATP. Aktywność takich enzymów jak ekto-ATPazy, ektonukleotydazy, kinazy białkowe oraz kanały potasowe regulowane przez ATP może się bowiem zmieniać pod wpływem antagonistów re­ceptorów nukleotydowych.

Podziękowania

Dziękuję doc. dr hab. Marii Koziołkiewicz za pomoc w opracowaniu niniejszego przeglądu.

Artykuł otrzymano 18 lutego 2002 Zaakceptowano do druku 21 marca 2002

Piśmiennictwo

1. D u b y a k G R , El — M o a t a s s i m C (1993) Am J Physiol 265: C577-C606

2. R e d e g e l d F A, C a l d w e l l CC, S i t k o v s k y M V (1999) Trends Pharmacol Sci 20: 453-459

3. C o m m u n i D, B o c y n a c m s JM (1997) Trends Pharmacol Sci 18: 83-863

4. B o y e r JL, D e l a n e y SM, V i l l a n u e v a D, H a r d e n T K(2000) Mol Pharmacol 57: 805-810

5. B o g d a n o v YD, D a l e L, K i n g BF, W h i t t o c k N, B u r n s t- o c k G (1 9 9 7 )7 5 /o / Chem 272: 12583-12590

6. C a m a i o n i E, B o y e r JL, M o h a n r a m A, H a r d e n TK, J a ­c o b s o n K A (1998) 7A/e7 Chem 41: 183-190

7. C o n i g r a v e AD, L e e J Y, v a n d e r W e y d e n L, J i a n g L, W a r d P, T a s e v s k i V, L u t t r e l l BM, M o r r i s M B (1998)Rr 7 Pharmacol 124: 1580-1585

8. C o m m u n i D, R o b a y e B, B o e y n a e m s J M (1999) B rJ Pharmacol 128: 1199-1206

9. K o z i o ł k i e w i c z M, G e n d a s z e w s k a E, M a s z c w s k a M, S t e i n C A , S t e c W J (2001) Blood 98: 995-1002

10. F r e d h o l m BB, A b b r a c c h i o MP , B u r n s t o c k G, D u b y a k GR, H a r d e n TK, J a c o b s o n KA, S c h w a b e U, W i l l i a m s M (1997) Trends Pharmacol Sci 18: 79-82

1 1 . Y e g u t k i n G , B o d i n P, B u r n s t o c k G (2000) B rJ Pharmacol 129: 921-926

12. W i l l i a m s M, J a r v i s M F (2000) Biochem Pharmacol 59: 1173-1185

13. C o m m u n i D , G o v a c r t s C , P a r m e n t i e r M , B o e y n a e m s J M (1997) 7 Biol Chem 272: 31969-31973

14. M u r t h y K S , M a k h l o u f G M (1998) 7 Biol Chem 273: 4695-4704

15. K u n a p u l i SP, D a n i e l J L (1998) Biochem 7 336: 513-52316. R a l e v i c V, B u r n s t o c k G (1998) Pharmacol Rev 50:413-492 17 D i V i r g i l i o F, C h i o z z i P, F e r r a r i D, F a l z o n i S, S a n z J

M , M o r e l l i A , T o r b o l i M , B o l o g n e s i G , B a r i c o r d i OR(2001) Blood 97: 587-600

18. M o r o S, G u o D, C a m a i o n i E, B o y e r JL, H a r d e n K, J a c o b s o n K A (1998) J M ed Chem 41: 1456-1466

19. B u e l l G , C h e s s c l l IP, M i c h e l AD, C o l l o G, S a l a z z o M , H e r r e n S , G r e t e n e r D , G r a h a m e s C , K a u r R , K o s c o - V i l b o i s M H , H u m p h r e y P P A (1998) R/oo792: 3521-3528

20. Receptor & Ion Channel Nomenclature Supplement. Trends Phar­macol Sci (1999)

228 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

2 1 . M u r a y a m a T, Y a k u s h i Y, W a t a n a b e A, N o m u r a Y(1998) Eur J Pharmacol 348: 71-76

22. M u r t h y KS , M a k h l o u f G M (1998) M ol Pharmacol 54: 122-128

23. P u c e a t M, B o n y C . J a c o n i M , V a s s o r t G (1998)F EB SLett 431: 189-194

24. K i n g B F, T o vv n s e n d-N i c h o l s o n A, W i l d m a n SS, T h o m a s T, S p y e r K M , B u r n s t o c k G (2000) JN eurosci 20: 4871-4877

2 5 . Y o s h i o k a K, S a i t o h O, N a k a t a H (2001) Proc Natl Acad Sei USA 98: 7617-7622

26. I k c u c h i Y, N i s h i z a k i T, M o r i M, O k a d a Y (1996) E u rJ P harm acology 191-199

27. M e n d o z a-F e r n a n d e z V, A n d r e w RD, B a r a j a s - L o p e z C (2000) J Pharmacol Exp Ther 293: 172-179

28. U m i n o T , Y o s h i o k a K, S a i t o h Y, M i n a k a w a N, N a k a t a H, M a t s u d a A (2001) J M ed Chem 44: 208-214

29. C h i n e l l a t o A , R a g a z z i E, P a n d o l f o L, F r o l d i G , C a p a r r o t t a L, F a s s i n a G (1994) Pharm Pharmacol 46: 337-341

30. Y o s h i o k a K, M a t s u d a A, N a k a t a H (2001) Clin Exp Phar­macol Physiol 28: 278-284

31 . K i n g BF, W i l d m a n SS, T o w n s e n d-N i c h o l s o n A, B u r n s t o c k G (1 998) J Pharmacol Exp Ther 285: 1005-1011

3 2 . M a t s u o k a I, Z h o u Q, I s h i m o t o H . N a k a n i s h i H (1995) Mol Pharmacol 47: 855-62

33. K u n a p u l i S P (1998) Trends Pharmacol Sei 19: 391-39434. H o l l o p e t e r G , J a n t z e n HM, V i n c e n t D, Li G , E n g l a n d

L, R a m a k r i s h n a n V, Y a n g R B , N u r d e n P, N u r d e n A, J u l i u s D, C o n l e y P B (2001) Nature 409: 202-207

35. P e r r e g a u x D, B a r b e r i a J, L a n z e t t i AJ , G e o g h c g a n K F, C a r t y T J, G a b e l C A (1992) J Immunol 149: 1294-1303

36. L a m m a s D A, S t o b c r C, H a r v e y C J, K e n d r i c k N, P a n c h a l i n g a m S, K u m a r a r a t n e D S. (1997) Immunity 7: 433-444

37. J i n J, D a s a r i VR, S i s t a r e FD, K u n a p u l i S P (1998) B rJ Pharmacol 123: 789-794

3 8 . B o e y n a e m s J M, P e a r s o n J D ( 1 990) Trends Pharmacol Sei 11: 34-37

39. B o a r d e r MR, W e i s m a n G A, T u r n e r JT, W i l k i n s o n G F (1995) Trends Pharmacol Sei 16: 133-139

40. P a t e l V, B r o w n C, G o o d w i n A, W i l k i e N, B o a r d e r M R(1996) B iochem J 320: 221-226

41 .M a 1 a m — S o u l e y R, C a m p a n M, G a d e a u A P , D e s g r a n g e s C (1993) Am J Physiol 264: C783-C788

42. B u r n s t o c k G, W i l l i a m s M (2000) J Pharmacol Exp Ther 295: 862-869

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 229http://rcin.org.pl

Adenozyna — neuroprzekaźnik i neuromodulator w centralnym układzie nerwowym

Adenosine — neurotransmitter and neuromodulator in central nervous system

MAŁGORZATA ROMANOWSKA1, MICHAŁ KOMOSZYŃSKI2

Spis treści:

I. WstępII. Stężenie adenozyny w komórce i przestrzeniach między­

komórkowychII-l. Metabolizm adenozyny w komórce II-2. Źródła ektoadenozyny

III. Receptory adenozynowe w centralnym układzie nerwo­wym

IV. Regulacja stężenia ektoadenozynyIV-1. Transport adenozyny przez błonę komórkową

IV-1.1. Transport bierny nośnikowy IV-1.2. Transport aktywny

IV-2. Lokalizacja i funkcja deaminazy ektoadenozyny w centralnym układzie nerwowymIV-2.1. Lokalizacja deaminazy adenozyny w strukturach mózguIV-2.2. Udział deaminazy adenozyny w regulacji stężenia ektoadenozyny

V. Funkcje adenozyny w centralnym układzie nerwowymV -l. Regulacja wydzielania neuroprzekaźników z

udziałem receptorów adenozynowych AiV-2. Regulacja wydzielania neuroprzekaźników za po­

średnictwem receptorów A2a, A2B i A3.VI. Podsumowanie

Wykaz stosowanych skrótów: CGS 21680 — 2-[p-(2-karbo- nylo-etylo)-fenyloetyloamino]-5’-N-etylokarboksyamidoadeno- zyna; CSC-8-8-(3-chlorostyrylo)kofeina; DMPX — 1,3-dime- tylo-7-propyloksantyna; IB-MECA-N6-(3-jodobenzylo)-adenozy- no-5’-N-metylokarboksyamid; N B M PR — nitrobenzylotioino- zyna; PI — receptory adenozynowe; P2 — receptory nukleoty- dowe; ADA — deaminaza adenozyny; ADA-BP — białko wiążące deaminazę adenozyny (ang. Adenosine Deaminase Bin­ding Protein)', Ado — adenozyna, Ino — inozyna.

'Mgr, 2prof. dr hab., Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, Zakład Biochemii, 87-100 Toruń, ul. Gagarina 9, tel. (0-56) 6114520, e-mail: mal-grom@biol.uni.torun.pl, michkom@dove.boa.uni.torun.pl

Contents:

I. IntroductionII. Intra- and extracellular concetration of adenosine

II-1. Intracellular metabolism of adenosineII-2. Sources of ecto-adenosine

III. Adenosine receptors in central nervous systemIV. Regulation of extracellular adenosine concetration

IV-1. Adenosine transport across the cell membraneIV-1.1. Equilibrative nucleoside transport IV-1.2. Active transport of nucleoside

IV-2. Localization and function of ectoadenosine deami­nase (ADA) in central nervous systemIV-2.1. Distribution of adenosine deaminase in the brain regionsIV-2.2. Participation of adenosine deaminase in the control of ectoadenosine concetration

V. Functions of adenosine in the central nervous systemV -l. Regulation of neurotransmitters secreting by A]

adenosine receptorsV-2. Regulation of neurotransmitters secreting by ade­

nosine receptors A2a, A2B i A3.VI. Concluding remarks.

I. Wstęp

Nukleozydy i nukleotydy purynowe (adenozyna, ADP, ATP, polifosforany adenozyny) oraz p irym idy­nowe (UDP, UTP) obecne w przestrzeniach m iędzy­komórkowych i płynach ustrojowych m ogą funkcjo­nować jako cząsteczki sygnałowe. Związki te, wiążąc się ze zlokalizowanymi na powierzchni błon komórkowych specyficznymi receptorami adenozy- nowymi — P 1 i nukleotydowymi — P2, określanymi dawniej jako purynergiczne, aktywują w komórkach wiele reakcji fizjologicznych [1 ,2]. Ich wynikiem są zmiany powstające natychmiast po aktywacji recep­torów (egzocytoza, zmiana stężenia wtórnych prze­kaźników) lub pojawiające się i trwające przez dłuż­szy okres czasu (zmiana ekspresji genów i szybkości proliferacji komórek). W komórkach są wszystkie elementy niezbędne do przekazywania sygnału z

230 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

udziałem adenozyny: 1 ) adenozyna (cząsteczka sy­gnałowa), 2 ) białkowe transportery tego nukleozydu przez błonę komórkową, 3) substraty i enzymy n ie­zbędne do produkcji adenozyny w przestrzeniach międzykomórkowych, 4) receptory adenozynowe (purynoreceptory P ł ) oraz 5) enzymy — deaminaza adenozyny i/lub białka (transportery adenozyny) n ie­zbędne do inaktywacji sygnału. Udział adenozyny w regulacji aktywności metabolicznej komórek m ię­śnia sercowego wykazano po raz pierwszy już w 1929 roku [3], Jednym z najwcześniejszych donie­sień o wpływie nukleozydu na układ nerwowy było stwierdzenie, że adenozyna stymuluje syntezę cAMP w komórkach kory mózgowej świnki morskiej, a po­wstawanie wtórnego przekaźnika sygnału jest b loko­wane w obecności metyloksantyn [4], Wyniki do­tychczasowych badań wykazały, że adenozyna uczestniczy w regulacji metabolizmu układu nerw o­wego, krwionośnego, immunologicznego, oddecho­wego i wydalniczego [ 1 , 2 ].

Celem artykułu jes t omówienie wyników badań mechanizmów przekazywania informacji z udziałem adenozyny w centralnym układzie nerwowym. W ar­tykule dużo miejsca poświęcono również udziałowi tego nukleozydu w ochronie tkanek w okresie niedo­tlenienia i niedokrwienia, a także deaminazie ekto- adenozyny (ADA), która jak wskazują rezultaty ba­dań, może być odpowiedzialna za inaktywację sy­gnału adenozynowego.

II. Stężenie adenozyny w komórce i przestrzeniach międzykomórkowych

Stężenie wewnątrzkomórkowej i pozakomórko- wej adenozyny jes t wynikiem procesów syntezy, transportu przez błonę kom órkow ą oraz degradacji. W warunkach fizjologicznych stężenie pozakomór- kowej adenozyny w mózgu jes t nanomolowe, a w warunkach stresowych takich jak niedotlenienie i niedokrwienie, jak również po depolaryzacji błony komórkowej pod w pływem bodźców elektrycznych czy chemicznych wzrasta do poziomu mikromolo- wego [5-9].

II—1. Metabolizm adenozyny w komórce

Istnieją dwa główne źródła wewnątrzkomórkowej adenozyny (Ryc. 1). Podstawowym jej źródłem w komórce jest hydroliza nukleotydów adeninowych. Wiele badań wskazuje, że wywołane niedotlenie­niem zmiany w metabolizmie komórki powodują spadek stężenia w ewnątrzkom órkowego ATP. Ich efektem jest wzrost ilości ADP, AMP i Ado [10].

S-adenozylohomocysteina

AMP

->• Homocysteina

Adenozyna Inozyna

Ryc. 1. Przemiany adenozyny w komórce. 1 — 5’-nukleotydaza, 2 — kinaza adenozyny, 3 — deaminaza adenozyny, 4 — hydrolaza S-adenozylohomocysteiny.

W ewnątrzkomórkowa Ado może ulegać deaminacji do inozyny (Ino) i jonów amonowych w reakcji kata­lizowanej przez deaminazę adenozyny, lub z udziałem kinazy adenozyny może być fosforylowana do AMP. Rezultaty badań wskazują, że Km kinazy adenozyny względem Ado jako substratu jest o 1-2 rzędy wielkości mniejsze niż Km deaminazy. Z tego względu uważa się, że w warunkach fizjologicznych w iększą rolę w degradacji komórkowej Ado gra ki­naza, podczas gdy rola deaminazy może wzrastać w warunkach zwiększonego stężenia nukleozydu [ 1 1 ].

W komórce adenozyna może powstawać również w wyniku przemiany S-adenozylohomocysteiny (SAH) z udziałem hydrolazy S-adenozylohomocy- steiny (SAHH). Reakcja katalizowana przez tę hy- drolazę jes t reakcją odwracalną syntezy S-adenozy­lohomocysteiny [10]. W mózgu hydrolaza S-adeno­zylohomocysteiny jes t obecna zarówno w neuro­nach, jak i w komórkach glejowych [12]. Wydaje się, że znaczenie SAHH w przemianach adenozyny jest nieduże, ponieważ stężenie SAH wewnątrz komórki jes t niskie.

II-2. Źródła ektoadenozyny

Wysunięto kilka hipotez mówiących o pochodze­niu zewnątrzkomórkowej adenozyny [ 10 ]. Źródłem tego nukleozydu w przestrzeniach pozakomórko- wych może być:— egzocytoza,— transport z udziałem przenośników białkowych

obecnych w błonach komórkowych— hydroliza zewnątrzkomórkowych nukleotydów

adeninowych (ATP, cAMP, polifosforanów ade­nozyny) przez ektoenzymy,

— liza komórek.Precyzyjne określenie udziału białkowych prze­

nośników nukleozydów w transporcie adenozyny na zewnątrz komórki jes t trudne, ponieważ transport

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 231http://rcin.org.pl

adenozyny zarówno do, jak i z komórki odbywa się zgodnie z gradientem stężeń tego związku po obu stronach błony komórkowej. Najlepiej poznanym źródłem ektoadenozyny jest hydroliza ektonukleoty- dów. ATP, podobnie jak inne neuroprzekaźniki, po­jaw ia się w szczelinie synaptycznej w wyniku egzo- cytozy zależnej od jonów C a2+ [13-15], Obecność ektoenzym ów hydrolizujących zewnątrzkomórkowy ATP do ADP, AMP i adenozyny stwierdzono we wszystkich dotychczas badanych strukturach układu nerwowego. W procesie tym uczestniczą następujące ektohydrolazy: ATPaza [EC 3.6.3], ATP difosfohy- drolaza [EC 3.6 .1.5] oraz 5 ’-nukleotydaza [EC 3.1.3.5] [16]. Hydrolizę zewnątrzkomórkowego ATP prowadzącą do powstawania adenozyny obser­w owano między innymi w płytce nerwowo-mięśnio- wej [15], cholinergicznych synapsach prążkowia [17] i h ipokampu [18] oraz skrawkach hipokampu i kory mózgowej [15]. W ydaje się, iż degradacja ATP przez ektoenzymy jes t podstawowym źródłem tego nukleozydu poza komórką.

Innym źródłem zewnątrzkomórkowej adenozyny może być degradacja pozakomórkowego cAMP [19] i polifosforanów adenozyny [16]. Hydrolizę pozako­mórkowego cAMP do adenozyny przez ektofosfo- diesterazę obserwowano w hipokampie, korze m óz­gowej i synaptosomach rdzenia k ręgow ego[10 ].

III. Receptory adenozynowe w centralnym układzie nerwowym

W centralnym układzie nerwowym obecne są wszystkie podtypy receptorów PI — A], A 2a , A 2B, i A 3 [2 ].

Receptory A \ charakteryzujące się w ysokim po­winow actw em do adenozyny m ogą być aktywowane przez nanomolowe stężenie tego związku poza ko­m órką [2]. Obecność tych receptorów wykryto w pre- i postsynaptycznych błonach neuronów takich struktur jak kora mózgowa, hipokamp, wzgórze, móżdżek, prążkowie i rdzeń kręgowy [2 , 2 0 ].

Receptory A 2a sklonowano przy użyciu biblioteki cDNA hipokampu człowieka [21], m ózgu szczura [22] i mózgu świnki morskiej [23]. Receptory te po­dobnie jak Ai m ają duże powinowactwo do adenozy­ny. Do niedawna, stosując techniki o niskiej czułości sądzono, że w centralnym układzie nerwow ym re­ceptory A 2a występują tylko w rejonach bogatych w unerwienie dopaminergiczne. W neuronach prążko­wia receptory A 2a występują razem z receptorami D 2

[24], N owe badania stosujące metodę RT-PCR, która charakteryzuje się w iększą czułością, wykazały nie­w ielką ilość mRNA receptora A 2a w hipokampie, ko­

rze mózgowej, móżdżku, wzgórzu i podwzgórzu [20].

Receptory A 2B sklonowano przy wykorzystaniu biblioteki cDNA hipokampu człowieka [25] i mózgu szczura [26]. Stosując RT-PCR stwierdzono we wszystkich badanych strukturach mózgu szczura ni­ski poziom m RNA tego receptora [20]. Receptory A 2B wym agają do swojej aktywacji wysokich, mikro- molowych stężeń adenozyny. Uważa się więc, że od­grywają większą rolę w warunkach patologicznych, podczas których stężenie pozakomórkowej adenozy­ny wzrasta. Rezultaty badań innych autorów suge­rują, że receptory te mogą być również aktywowane przez fizjologiczne stężenie zewnątrzkomórkowej adenozyny [27]. Funkcje receptora A2B w układzie nerwowym nie zostały poznane. W przeciwieństwie do receptorów Ai i A 2a trudności w badaniu tego podtypu receptora wynikają przede wszystkim z bra­ku selektywnych ligandów.

Receptor A 3 jes t najpóźniej zidentyfikowanym re­ceptorem P 1. Został sklonowany przy wykorzystaniu biblioteki cDNA prążkowia szczura [28] i człowieka [29]. Podobnie jak receptor A 2B wymaga do aktywa­cji wysokich, mikromolowych stężeń Ado. Z udziałem RT-PCR stwierdzono obecność niewielkiej ilości m RNA tego receptora w wielu rejonach mózgu szczura, m. in. w korze mózgowej, hipokampie, prążkowiu, wzgórzu, podwzgórzu i móżdżku [2 0 ],

IV. Regulacja stężenia ektoadenozyny

Adenozyna może być usuwana z przestrzeni poza- komórkowych w wyniku transportu do komórki po­przez przenośniki białkowe transportujące nukleozy- dy i dopiero wewnątrz komórki metabolizowana z udziałem wewnątrzkomórkowej kinazy adenozyny i deaminazy adenozyny lub może ulegać deaminacji poza kom órką w wyniku reakcji katalizowanej przez deaminazę ektoadenozyny [10]. Adenozyna byłaby więc cząsteczką sygnałową, której stężenie w prze­strzeni pozakomórkowej regulowałyby dwa różne mechanizmy: 1 ) degradacja przez ektoenzym i 2 ) transport do komórki i przemiany nukleozydu dopie­ro w jej wnętrzu (Ryc. 2).

IV-1. Transport adenozyny przez błonę komórkową

Nukleozydy są cząsteczkami, które, między inny­mi ze względu na rozmiar i hydrofilność, nie mogą swobodnie przenikać przez błony plazmatyczne. Re­zultaty badań wskazują, że pojedyncze neurony pira­midalne regionu CA1 hipokampu szczura są zdolne do uwalniania adenozyny na zewnątrz, jeśli wzrasta

232 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

cytosol

1 2 3 4

ATP ADP AMP Ado Ino

jej stężenie w komórce [30]. Wyniki tych badań su­gerują, że w błonach komórkowych neuronów muszą funkcjonować przenośniki białkowe, które transpor­tują adenozynę.

W komórkach ssaków transport nukleozydów od­bywa się zgodnie z gradientem stężeń drogą trans­portu biernego nośnikowego (ang. equlibrative nuc­leoside transport) lub aktywnego symportu z jonami sodu (ang. sodium -dependent concentrative nucle­oside transport), gdzie nukleozydy transportowane są wbrew gradientowi stężeń [31]. Oba rodzaje trans­portu nukleozydów występują również w komórkach mózgu [31].

IV-1.1. Transport bierny nośnikowy

Transport nukleozydów przez błonę kom órkową może odbywać się zgodnie z gradientem stężenia przenoszonej cząsteczki. Jest to sposób przenikania substancji przez błony określany jako bierny trans­port nośnikowy lub dawniej jako dyfuzja ułatwiona [31-33]. Przenośniki nukleozydów działające według zasad transportu biernego nośnikowego są obecne w komórkach wielu typów i w ykazują małą selektywność wobec przenoszonych cząsteczek. Transportują zarówno nukleozydy purynowe, jak i pirymidynowe [3 1 ]. W transporcie biernym nośniko­wym nukleozydów uczestn iczą dwa typy nośników białkowych: 1 ) es (ang. equlibrative sensitive) — wrażliwy na działanie inhibitora transportu nukle­ozydów — nitrobenzylotioinozynę (NBMPR) oraz2 ) ei (ang. equlibrative insensitive) — niewrażliwy na NBM PR [32]. W centralnym układzie nerwowym obecność białek transportujących nukleozydy na za­sadzie transportu biernego stwierdzono między inny­mi w synaptosomach kory m ózgu szczura [34] i świnki morskiej [35] oraz w błonach komórkowych

Ryc. 2. Źródła ektoadcnozyny. 1 — ekto- ATPaza, 2 — ektoATPdifosfohy- drolaza, 3 — ekto-5-nukleotyda- za, 4 — kompleks deaminazy ektoadenozyny i białka wiążącego (ADA-BP), 5 i 6 — przenośniki białkowe nukleozydów, Ado — adenozyna, Ino — inozyna

komórek glejowych [36]. Komórki m ogą zawierać jednocześnie obydwa typy białek przenośnikowych, czego przykładem m ogą być synaptosomy z m ózgu świnki morskiej [31].

IV-1.2. Transport aktywny

Przenośniki białkowe uczestniczące w symporcie nukleozydów (kotransporcie) z jonam i Na+ transpor­tują nukleozydy tylko do wnętrza komórki [31, 37-39]. Dotychczas opisano i scharakteryzowano w komórkach ssaków 5 typów przenośników nukleozy­dów wykorzystujących gradient jonów N a+ [38]. Są to przenośniki: N I (selektywny dla puryn, ale trans­portuje również urydynę), N2 (selektywny dla piry- midyn, ale transportuje także adenozynę), oraz p rze­nośniki N3, N4 i N5, które charakteryzują się n iską specyficznością w stosunku do przenoszonych cząsteczek [38]. Dotychczas niewiele wiadomo o ak­tywnym symporcie adenozyny w układzie nerw o­wym i znaczeniu tego procesu dla przekazywania in­formacji z udziałem receptorów PI. Obecność mRNA kodującego przenośnik typu N2 wykazano we wszystkich przebadanych strukturach mózgu szczura, m.in. w splocie naczyniówkowym, tylnym podwzgórzu, korze mózgowej, hipokampie, m óżdż­ku oraz pniu mózgu. W mózgu szczura stwierdzono również obecność m RNA kodującego przenośnik białkowy typu N I [40]. Do tej pory brak jes t inform a­cji na temat występowania tego rodzaju przenośni­ków w rejonie szczeliny synaptycznej.

IV-2. Lokalizacja i funkcje deaminazy ektoadeno­zyny w centralnym układzie nerwowym

Jednym z enzymów, który reguluje stężenie ade­nozyny w komórce i przestrzeniach pozakomórko-

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 233http://rcin.org.pl

wych jes t deaminaza adenozyny (ADA) [EC.3.5.4.4]. Deaminaza adenozyny uczestniczy w regulacji stężenia wewnątrzkomórkowej i zewnątrz- komórkowej adenozyny i deoksyadenozyny. W ięk­szość badań poświęconych lokalizacji komórkowej i subkomórkowej tego enzymu w układzie nerwowym dotyczy form rozpuszczalnych [41,42], Do dnia dzi­siejszego nie udało się wyizolować i oczyścić do ho- mogenności enzymu z błon komórkowych komórek nerwowych lub glejowych.

IV-2.1. Lokalizacja deam inazy adenozyny w strukturach mózgu

Aktywność deaminazy adenozyny w obrębie układu nerwowego jest niższa niż w komórkach in­nych tkanek. Regionami mózgu o największej ak ­tywności deaminazy adenozyny u szczura, myszy oraz świnki morskiej są przednie i tylne podwzgórze, opuszka węchowa i wzgórek górny blaszki czwora- czej. Najniższą aktywność enzymu stwierdzono w prążkowiu, korze mózgowej i hipokampie [43]. B a­dano również subkom órkową lokalizację ak tyw no­ści enzymu między innymi w korze mózgowej, m óż­dżku, hipokampie i podwzgórzu szczura [43,44]. W badaniach tych stwierdzono, że większość ak tyw no­ści deaminazy adenozyny związana jest z frakcją cy- tosolową i tylko około 25% aktywności tego enzymu znajduje się w frakcji błon komórkowych [43, 45].

IV-2.2. Udział deam inazy adenozyny w regulacji stężenia ektoadenozyny

Deaminaza ektoadenozyny uwalnia receptory PI od naturalnego liganda — adenozyny przynajmniej w niektórych obszarach mózgu [17]. Udział deam i­nazy ektoadenozyny w metabolizmie pozakomórko- wego ATP i adenozyny został stwierdzony między innymi w immunologicznie oczyszczonych synap­sach cholinergicznych prążkowia [ 17]. Po stymulacji neuronu obserwowano w tej strukturze uwalnianie acetylocholiny i ATP. ATP był następnie hydrolizo- wany przez szereg ektoenzymów do ADP, AMP oraz adenozyny. Produkt hydrolizy — adenozyna uczest­niczyła w presynaptycznej inhibicji wydzielania ace­tylocholiny. W obszarze synaps obserwowano rów ­nież deaminację adenozyny do inozyny. Powyższe obserwacje sugerują udział deaminazy adenozyny w uwalnianiu purynoreceptorów PI od naturalnego agona [17]. Ci sami autorzy stwierdzili również niską aktywność deaminazy adenozyny w choliner­gicznych synapsach kory mózgowej i hipokampu [17 ,18].

Interesującą jest obserwacja, że występująca na powierzchni błony komórkowej deaminaza adeno­

zyny nie jest glikoproteiną i nie zawiera peptydu sy­gnalnego kierującego j ą do błony komórkowej [46], Nie wiadomo więc, w jaki sposób enzym może poja­wiać się na zewnątrz komórki, czy odbywa się to w wyniku sekrecji czy lizy [16, 46, 47], Znany jes t na­tomiast sposób umocowania enzymu w błonie ko­mórkowej. Deaminaza adenozyny może ulec asocja­cji z białkami wiążącymi deaminazę adenozyny — ADA-BP (ang. A D A -B inding P rotein) i utworzyć kompleksy o dużej masie cząsteczkowej. Część białek należących do ADA-BP to integralne białka błonowe, z udziałem których enzym może zostać związany z strukturą błony komórkowej. Są znane dwa takie białka: białko CD26 identyczne z dipepty- dylopeptydazą IV oraz receptor A 2B limfocytów T [46], Stosując przeciwciała dowiedziono, że deam i­naza adenozyny i receptory A, mają identyczną loka­lizację (kolokalizację) w strukturze błon komórek mięśni gładkich D DTiM F-2 oraz membran neuro­nów kory mózgowej szczura [48-53]. W 1996 roku S a u r a i in. wykazali, że deaminaza adenozyny w y­stępuje w kolokalizacji z receptorami A) błon pla- zmatycznych kory mózgu wieprzowego [49]. Było to pierwsze doniesienie o kolokalizacji w błonach pla- zmatycznych mózgu ektoenzymu i receptora, k tóre­go naturalny agon jest jednocześnie substratem enzy­mu. W późniejszym doniesieniu ci sami autorzy stwierdzają wspólną internalizację w komórkach de­aminazy adenozyny i receptorów Ai [52, 53]. A uto­rzy sądzą, że receptory A) w ystępują w dwu stanach charakteryzujących się różnym powinowactwem do adenozyny. Receptor o wysokim powinowactwie do adenozyny (K d = 0 .1-0.2 nM) to receptor związany z białkiem G, natomiast receptor niezwiązany z białkiem G ma niższe powinowactwo (K d= l-2 nM). Wykazano, że w nieobecności deaminazy adenozyny receptory te posiadają niskie powinowactwo do ade­nozyny. Badania te sugerują więc, że w komórce oprócz funkcji katalitycznej, jak ą jes t deaminacja zewnątrzkomórkowej adenozyny, deaminaza adeno­zyny, zwiększając powinowactwo receptora do białka G pełni funkcję pozaenzym atyczną [52, 53]. Limfocyty z udziałem białka CD26 i deaminazy ade­nozyny m ogą wiązać się z komórkami zrębu tkanki limfatycznej [46]. Ta obserwacja oraz interakcja i kolokalizacja deaminazy adenozyny zarówno z re­ceptorami Ai i białkiem CD26 stała się podstaw ą hi­potezy, że ADA podczas tworzenia się struktur ner­wowych może pełnić również funkcję cząsteczki ułatwiającej adhezję komórek neuron/neuron, neu­ron/komórka glejowa, komórka glejowa/komórka glejowa podczas tworzenia się struktur nerwowych [46, 47],

234 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

V. Funkcje adenozyny w centralnym układzie nerwowym

Badania roli adenozyny w układzie nerwowym dotyczą jej funkcji jako:

1 ) neuromodulatora biorącego udział w prze­kazywaniu sygnału nerwowego

2 ) cząsteczki odgrywającej istotną rolę w ochronie neuronów w sytuacjach stresowych

3) związku o charakterze parakrynowym uczestniczącym w procesach proliferacji i apoptozy komórek wielu typów [2, 54].

Jedną z głównych funkcji adenozyny w central­nym układzie nerwowym jest regulacja wydzielania neuroprzekaźników [55, 56]. Neuromodulator może wpływać na wydzielanie i efekty fizjologiczne m e­diatorów synaptycznych za pośrednictwem recepto­rów pre-, post- i pozasynaptycznych [57], W m odula­cję wydzielania neuroprzekaźników w szczelinie sy­naptycznej są zaangażowane przede wszystkim re­ceptory A! i A 2a- Niewiele zaś na razie wiadomo o udziale w tym procesie receptorów A 2B i A 3 [2].

V -l. Regulacja wydzielania neuroprzekaźników z udziałem receptorów adenozynowych A,

W obrębie centralnego układu nerwowego za po­średnictwem receptorów A \ adenozyna hamuje w y­dzielanie przez neurony: acetylocholiny [15,58], no­radrenaliny [59, 60] dopaminy [61], glutaminianu [62], serotoniny [63] i G ABA [64, 65].

W warunkach fizjologicznych stężenie pozako- mórkowej Ado wynosi 0,3-300 nM. W sytuacjach stresowych typu niedotlenienie, niedokrwienie, hi- poglikemia lub nadmiar dwutlenku węgla we krwi (hiperkapnia) może wzrosnąć nawet stukrotnie, do poziomu mikromolowego [66]. Podczas niedokrwie­nia mózgu następuje uwalnianie nadmiernych ilości neuroprzekaźników pobudzających (głównie amino­kwasów- glutaminianu i asparaginianu) oraz osłabie­nie wychwytu glutaminianu przez astrocyty. Jakkol­wiek brak jest dowodów to fakt, że ATP jest m agazy­nowane w pęcherzykach synaptycznych wraz z inny­mi pobudzającymi neurotransmiterami, może suge­rować, że aktywacja presynaptycznych receptorów Ai ogranicza również wydzielanie ATP — prekurso­ra adenozyny. Efektem tych procesów jes t nadmierna aktywacja receptorów glutaminianergicznych za­równo metabotropowych jak i jonotropowych (w tym również receptorów NM DA). Prowadzi to do niekontrolowanej depolaryzacji neuronów i przedłu­żającej się ich aktywności. Nadmierna i przedłu­żająca się aktywacja receptorów glutaminianergicz-

nych powoduje degenerację komórek nerwowych. Jest to zjawisko określane jako ekscytotoksyczność. G łów ną i destrukcyjną rolę przypisuje się w tym pro­cesie jonom Ca2+. Wysokie stężenie jonów wapnia w cytoplazmie uruchamia procesy prowadzące do de­generacji neuronów, w wyniku tworzenia wolnych rodników i nadtlenków oraz aktywacji niszczących strukturę komórki proteaz, nukleaz i fosfolipaz [66-69]. W tych warunkach podstawową funkcją adenozyny jes t hamowanie aktywności neuronów przez zmniejszanie ilości neuroprzekaźników pobu­dzających. Zapobiega to degradacji neuronów. W tym procesie uczestniczą głównie receptory Ai związane z błoną presynaptyczną. Autorzy rozw a­żają następujące mechanizmy hamowania presynap- tycznego:— otwieranie presynaptycznych kanałów K + pro­

wadzące do hiperpolaryzacji neuronów i zaham o­wania wpływu jonów Ca2+ przez kanały bram ko­wane napięciem [ 10 ],

— zamykanie kanałów wapniowych w błonach p re­synaptycznych prowadzące do bezpośredniego hamowania egzocytozy uwarunkowanej jonam i Ca2+ [70, 71],

— oddziaływanie na egzocytozę pęcherzyków sy­naptycznych, ale bez wpływu na przemieszczanie się jonów Ca2+ [72].Dodatkowo aktywacja postsynaptycznych recep­

torów A] może powodować zmniejszanie pobudli­wości błony postsynaptycznej oraz hiperpolaryzację poprzez zwiększanie przewodności błony kom órko­wej dla jonów K+ i zmniejszanie przewodności dla jonów Ca2+ [73,74]. Adenozyna za pośrednictwem receptorów A 2 stymuluje na poziomie pozasynap- tycznym powstawanie glukozy w astrocytach w pro­cesie glikogenolizy oraz zwiększa dopływ krwi do rejonów mózgu objętych niedotlenieniem/niedo­krwieniem poprzez rozszerzanie naczyń krw iono­śnych i hamowanie agregacji płytek krwi [66 , 75, 76].

V-2. Regulacja wydzielania neuroprzekaźników za pośrednictwem receptorów A2a, A 2B i A3

Przypuszcza się, że jed n ą z głównych funkcji re­ceptorów A 3 w mózgu jes t regulacja aktywności re­ceptorów Ai [10]. Stwierdzono, że aktywacja recep­torów A 3 w hipokampie szczura powoduje odczule­nie receptorów Ai, których aktywność hamuje w y ­dzielanie neuroprzekaźników pobudzających [77]. Stwierdzono również, że poprzedzający niedokrwie­nie mózgu zróżnicowany czas stymulacji in vivo re ­ceptorów A 3 h ipokampu przez selektywny agon —

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 235http://rcin.org.pl

IB-M ECA (N 6-(3-jodobenzylo)-adenozyno-5 ’-N- m etylokarboksyamid) wywiera istotny wpływ na przeżywalność neuronów i przepływ krwi w naczy­niach. Krótkotrwała stymulacja tego podtypu recep­torów wywołuje zwiększenie uszkodzeń neuronów i zmniejszenie przepływu krwi, natomiast d ługo­trwała stymulacja powoduje prawdopodobnie ich od­czulenie. Prowadzi to do zwiększenia krążenia krwi i zmniejszenia zmian neuropatologicznych [78]. W y­daje się więc, że w przeciwieństwie do receptorów Aj, które w warunkach stresowych pełnią funkcje ochronne wobec neuronów, receptory A 3 m ogą indu­kować śmierć komórek [69, 78].

A denozyna i inne agony receptorów A 2a zwięk­szają uwalnianie neurotransmitterów w obrębie cen­tralnego i obwodowego układu nerwowego [2]. W hipokampie stwierdzono obecność receptorów pre- synaptycznych A \ hamujących, jak i presynaptycz- nych receptorów A 2a zwiększających uwalnianie acetylocholiny [58]. C u n h a i inni stwierdzili rów­nież, że uwalnianie acetylocholiny w różnych regio­nach hipokampu może być regulowane przez od­mienne podtypy receptorów Pj. Selektywny agon re­ceptora A 2a — CGS-21680 powoduje zwiększanie wydzielania [H3]-acetylocholiny podczas stymulacji elektrycznej w regionie CA3 i w obszarze “dentate g yru s” hipokampu. W obszarze CA1 były obecne tyl­ko receptory Aj związane z ham owaniem w ydziela­nia acetylocholiny [58]. Podobnie CGS21680 zw ięk­szał wydzielanie [H3]-acetylocholiny z synaptoso- mów hipokampu i prążkowia [79, 80]. Ten efekt w synaptosomach hipokampu znosił nieselektywny an- tagon receptorów A 2 — DM PX (1 ,3-dimetylo-7-pro- pyloksantyna) oraz antagon receptorów A 2a — CSC (8-8-(3-chlorostyrylo)kofeina) [79]. Bardzo intere­sującym wydaje się fakt, że adenozyna, która stymu­luje receptory A) oraz A 2a w szczelinie synaptycznej hipokam pu może pochodzić z różnych puli nukle­ozydu. Wydaje się, że podczas stymulacji prądem o dużej częstotliwości (100 Hz) adenozyna w szczeli­nie synaptycznej pochodzi głównie z hydrolizy poza- kom órkowego ATP. Ta pula pozakomórkowej adeno­zyny stymuluje głównie receptory A 2A, podczas gdy adenozyna aktywująca receptory A \ jest uwalniana bezpośrednio przez kom órkę [15, 81].

Receptory A 2a, podobnie jak receptory A), m odu­lują tak uwalnianie acetylocholiny jak i wydzielanie innych neuroprzekaźników. Selektywny agon recep­torów A 2a z GABAergicznych neuronów łączących prążkowie z kompleksem gałki bladej — CGS-21680 zwiększa uwalnianie G ABA spowodo­wane stym ulacją elektryczną [82]. Nie jes t do końca poznany mechanizm, dzięki któremu agony presy-

naptycznego receptora A 2a mogą zwiększać wydzie­lanie neuroprzekaźników. Sądzi się, że w przeciwie­ństwie do presynaptycznych receptorów A ^które ha­mują wydzielanie neuroprzekaźników zamykając kanały wapniowe, .receptory A 2a otwierają kanały wapniowe w błonach komórkowych neuronów oraz promują egzocytozę zależną od jonów wapnia [83, 84]. Receptory A 2a aktywują cyklazę adenylanową. Brak jednak dowodów czy związana z receptorami A 2a aktywacja kanałów wapniowych w błonach pre­synaptycznych regionu CA3 hipokampu szczura wy­maga udziału cAMP i kinazy białkowej A, kinazy białkowej C lub tylko białka G [84]. Na powierzchni różnych typów komórek ekspresji może ulegać wię­cej niż jeden podtyp receptora P I. Taka sytuacja za­chodzi między innymi w przypadku receptorów A\ i A 2a błon presynaptycznych regionu CA3 hipokampu szczura oraz zakończeń nerwowych prążkowia [58,85]. Wiadomo, że receptory A 2A z zakończeń nerwowych prążkowia regulują powinowactwo re­ceptorów D 2 do agona [86]. Okazuje się, że selektyw­ny agon receptorów A 2a — CGS21680 może pow o­dować również odczulenie i zmniejszenie pow ino­wactwa receptorów A) do agona. W proces ten jest zaangażowana kinaza białkowa C [85].

Udział receptorów A 2B w regulacji egzocytozy neuroprzekaźników nie jes t do końca wyjaśniony. Niektóre badania wskazują na udział tego podtypu receptora w modulacji wydzielania neuroprzekaźni­ków w pniu m ózgu i hipokampie [27, 87].

VI. Podsumowanie

Ektopuryny i ich receptory występują w przestrze­niach międzykomórkowych każdej tkanki i narządu ssaków. Regulują wiele procesów fizjologicznych, a zmiany w ich metabolizmie lub stężeniu mogą być przyczyną procesów patofizjologicznych [88]. Trud­no przecenić rolę ektoadenozyny w regulacji m eta­bolizmu centralnego układu nerwowego, układu krwionośnego czy nerek. Puryny są stosowane w ha­mowaniu rozwoju chorób Parkinsona i Alzheimera a także w terapii przeciwbólowej [89,90]. Nukleozyd ten używany jest w leczeniu schorzeń serca i naczyń krwionośnych. Adenozyna jes t lekiem stosowanym w terapii zawałów, a jego analogi używane jako czynnik antyagregacyjny [76]. Adenozyna i agony receptorów PI są lekami stosowanymi w leczeniu chorób nerek i układu oddechowego, leczeniu astmy [88]. Z tych też powodów poznanie mechanizmu przekazywania sygnałów z udziałem adenozyny i pu- rynoreceptorów PI ma ogromne znaczenie praktycz­ne. Jednak mimo intensywnych i wieloletnich badań

236 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

nie wyjaśniono szeregu istotnych spraw związanych z przenoszeniem sygnałów z udziałem receptorów PI. Brakuje bezpośrednich dowodów wskazujących na źródła tego nukleozydu i nie poznany jest m echa­nizm eksportu adenozyny poza komórkę, a rola de­aminazy ektoadenozyny również w tych procesach budzi kontrowersje. W ykazano bowiem, że w wielu rejonach m ózgu aktywność deaminazy jes t bardzo niska, a inne są jej pozbawione [17, 18]. Z naszych badań nad enzymami metabolizującymi ektopuryny w naczyniach krwionośnych człowieka wynika, iż aktywność deaminazy ektoadenozyny stanowi n ie­wielki procent aktywności innych ektohydrolaz nu- kleotydów purynowych [91]. Skutkiem tego we krwi utrzymuje się stały wysoki poziom tego nukleozydu. Podobne obserwacje dotyczą synaptosomów kory mózgu świni {personal com unication — Kukulski). Być może nieproporcjonalnie niska aktywność de­aminazy ektoadenozyny (w porównaniu z innymi ektohydrolazami nukleotydów) w korze m ózgu i w endotelium naczyń krwionośnych związana jest z ochronną funkcją tego nukleozydu. Ten problem oraz mechanizm eksportu adenozyny do przestrzeni pozakomórkowej wymaga dalszych badań.

Artykuł otrzymano 5 lipca 2001 Zaakceptowano do druku 29 kwietnia 2002

Piśmiennictwo.

1. B u r n s t o c k G (1979) W: B a e r H P , D r u m m o n d G I (red) Physiological and regulatory function s o f adenosine and adenine nucleotides. Raven Press, New York, str. 3-32

2. R a l e v i c V , B u r s t o c k G (\99S) Pharmacol Rev 3: 413-4923. D r u r y A N, S że n t - G y o r g y i A (1 9 2 9 )J Physiol (London) 68:

213-2374. S a t t i n A, R a i l T W (1970) Mol Pharmacol 6: 13-235. L l o y d H G E , L i n d s t r o m K, F r e d h o l m B B (1993) Neuro-

chem ln t 23:173-1856. L a t i n i S , B o r d o n i F . P c d a t a F , C o r r a d e t t i R(1999 )B rit

J Pharmacol 127: 729-7397. B e r m a n R F , F r e d h o l m B B , A d e n U, O ’C o n n o r W T

(2000) Brain Res 872:44-538. K o b a y a s h i S, Z i m m e r m a n n H, M i l l h o r n D E (2000) J

Neurochem 74: 621-6329. D u n w i d d i e T V, D i a o L (2000) Neurosci 95: 81-8210. B r u n d e g e J M, D u n w i d d i e T V ( l 997) Advances in Pharma­

cology 39: 353-3911 1 . A r c h J R , N e w s h o l m E A (1978) Biochem J 174: 965-97712. C e b a l l o s G, T u t t l e J B, R u b i o R (1994) J Neurochem 62:

1144-115313. Z i m m e r m a n n H (1994) Trends Neurosci 17: 420-42614. C u n h a R A, V i z i E S , R i b e i r o J A, S e b a s t i a o A M (1996)

J Neurochem 67: 2180-218715. R i b e i r o J A, C u n h a RA, C o r r e i a - d e - S a P, S e b a s t i a o

A M (1996) Prog Brain Res 109: 231-2411 6 .Zi m m e r m a n n H (1996) Drug Dev Res 39: 337-35217. R i c h a r d s o n P J, B r o w n SJ , B a i l y e s E M, L u z i o J P

(1987) Nature 327: 232-23418. C u n h a R A, S e b a s t i a o A M, R i b e i r o J A (1992) J Neuro­

chem 59: 657-66619. G e r e a u x R W, C o n n P J (1994) Neuron 12: 1121-1129

20. D i x o n K A , G u b i t z A K , S i r i n a t h s i n g h j i D J S , R i c h a r d s o n PJ, F r e e m a n T C (1996) Brit J Pharmacol 118: 1461-1468

21. F u r l o n g T J, P i e r e e K D , S e l b i e LA, S h i n e i( \9 9 2 )M o l Brain Res 15: 62-66

22. C h e r n Y, K i n g K, L a i H L , L a i H T (1992) Biochem Biophys Res Commun 185: 304-309

2 3 . M e n g F, X i e GX, C h a l m e r s D, M o r g a n C, W a t s o n SJ, A k i 1 H (1994) Neurochem Res 19: 613-621

24. S v e n n i n g s s o n P, L e M o i n e C, F i s o n e G, F r e d h o l m B B (1999) Prog Neurobiol 59: 355-396

25. P i e r c e KD, F u r l o n g T J, S e l b i e LA, S h i n e J (1992) Bio­chem Biophys Res Commun 187: 86-93

26. S t e h l e J H , R i v k e e s S A, L e e J J, W e a v e r DR, D e e d s J D, R e p p e r t S M (1992) Mol Endocrinol 6: 384-393

27. K e s s e y K, M o g u 1 D J (1998) Neurosci 84: 59-6928. Z h o u QY, L i C, O l a h ME , J o h n s o n R A, S t i l e s GL ,

C i v e 1 1 i O (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 7432-743629. S a l w a t o r e C A, J a c o b s o n M A, T a y l o r HE, L i n d e n J,

J o h n s o n R G (1993) Pro Natl Acad Sci USA 90: 10365-1036930. B r u n d e g e J M, D u n w i d d i e T M (1998) Neuro Report 9:

3007-30113 1 . G r i f f i t h DA, J a r v i s S M (1996) Bioch Biophys Acta 1286:

153-18132. D e c k e r t J, M o r g a m FF, M a r a n g o s PJ (1988) Life Sci 42:

1331-134533. G u J G, F o g a IO , P a r k i n s o n FE, G e i g e r J D (1995) J Neu­

rochem 64: 2105-211034. B e n d e r AS , W u P H, P h i l l i s J W (1980) J Neurochem 33:

629-64035. B a r b e r i s C, M i n n A, G a y e t J (1981) J Neurochem 36:

347-35436. T h a m p y K G , B a r n e s E M (1983) JNeurochem 40: 874-87937. W u X, Y u a n G, B r e t t C M, H u i AC, G i a c o m i n i K M

(1992) J Biol Chem 267: 8813-881838. W a n g J . S c h a n e r M E , T h o m a s s e n S , Su S F , P i q u e t t e -

M i l l e r M , G i a c o m i n i K M (1997) Pharmac Res 14: 1524-1532

39. C a s s E C , Y o u n g J D, B a l d w i n S A (1998) Biochem Cell Biol 76: 761-770

40. A n d e r s o n C M , X i o n g W, Y o u n g J D , C a s s C E , P a r k i n ­s o n ¥ E (\996) Brain Res Mol Brain Res 42:358-361

4 1 . C c n t e l l e s J J, F r a n c o R, B o z a l J (1988) J Neurosci Res 19: 258-267

42. S z a r o j a n SG, A n t o n y a n A A, M a r d a n y a n S S (1994) Biokchimija 59: 239-245

43. Y a m a m o t o T, G e i g e r J D , D a d d o n a PE, N a g y J I (1987) Brain Res Bull 19: 473-484

44. P u 1 1 I, M c I 1 w a n H (1974) Biochem J 144: 37-41.45. T r a m s E G, L a u t e r C J (1975) Biochem J 152: 681-68746. F r a n c o R, V a l e n z u e l a A, L l u i s C, B l a n c o J (1998) Im ­

munol Rev 161: 27-4247. F r a n c o R , C a s a d o V , C i r u e l a F , S a u r a C , M a l l o l J , C a n

e 1 a El , L l u i s C (1997) Prog Neurobiol 52: 283-29448. N a g y J I, Y a m a m o t o T, U e m u r a H , S c h r a d e r P (1996)

Neurosci 73: 459-47149. S a u r a C, C i r u e l a F, C a s a d o V, C a n e l a El , M a l l o l J,

L l u i s C, F r a n c o R (1996) J Neurochem 66: 1675-168250. R u i z MA, E s c r i c h e M, L l u i s C, F r a n c o R, M a r t i n M,

A n d r e s A, R o s M (2000) J Neurochem 75: 656-66451. Herrera C, Casado V, Ciruela P, Schofield P, Mallol J, Lluis C,

Franco R (2001) M ol Pharmacol 59: 127-13452. C i r u e l a F, S a u r a C, C a n e l a El , M a l l o l J, L l u i s C,

F r a n c o R (1996) FEBS Letters 380: 219-22353. S a u r a C A, M a l l o l J, C a n e l a El , L l u i s C, F r a n c o R

(1998) J Biol Chem 273: 17610-1761754. J a c o b s o n K A, H o f f m a n n C, C a t t a b e n i F,

A b b r a c c h i o M P (1999) Apoptosis 4: 197-21155. D u n w i d d i e T V , H o f f e r B J (1980)B rJP harm aco l69: 59-6856. P h y 11 i s J W, W u P H (1981) Prog Neurobiol 16: 187-19357. B u r n s t o c k G (1998) W: T u r n e r J T, W e i s m a n G A ,

F e d a n J S (red) The P2 nucleotide receptors. Humana Press, Toto- wa, New Jersey, str. 3-40

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 237http://rcin.org.pl

58. C u n h a R A , M i l u s h e v a E, V i z i ES , R i b c i r o J A, S e b a s t i a o A M (1994) J Neurochem 63: 207-214

59. v o n K u g e l g e n I, S p a t h L, S t a r k e K (1992) Na- unyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol 346: 187-196

60. J a c k i s c h R , F e h r R , H e r t t i n g G (1985)Neuropharmacology 24: 499-507

61 . M i c h a e l i s ML, M i c h a e l i s EK, M y e r s S L (1979 ) Life Sci 24: 2083-2092

62. D o l p h i n AC, F o r d a S R , S c o t t R H (1983) J Physiol (Lon­don) 313: 41-61

63. F e u e r s t e i n T J, H e r t t i n g G, J a c k i s c h R (1985) 2s«r7 Pharmacol 107: 233-242

6 4 . W u Y, M e r c u r i NB, J o h n s o n S W (1 995) J Pharmacol Exp Ther 273: 576-581

65. U l r i c h D, H u g u e n a r d J R (1995) Neuron 15: 909-91866. D r a g u n o w M, F a u l l R L M (1 9 8 8 ) Trends Pharmacol Sci 9:

193-19467. R u d o l p h i KA, S c h u b e r t P , P a r k i n s o n FE, F r e d h o l m

B B (1992) Trends Pharmacol Sci 13: 439-44568. R u d o l p h i KA, S c h u b e r t P, P a r k i n s o n FE, F r e d h o l m

(1992) Cerebrovascular and brain metabolism reviews 4: 346-36969. A b b r a c c h i o M P , C e r u t i S , B r a m b i l l a R , F r a n c e s c h i

C, M a l l o r n i W, J a c o b s o n K, v o n L u b i t z D K J E , C a t a b e n i F (1 997) Annals o f the New York Academy o f Science 825: 11-22

70. S c h u b e r t P, O g a t a T, M a r c h i n i C, F e r r o n i S, R u d o l p h i K (1991) Annals o f the New York Academy o f Science 825: 1-10

7 1 . A m b r o s i o A F, M a 1 v a J O, C a r v a l h o A P, C a r v a l h o C M (1997) Eur J Pharmacol 340: 301-310

72. W u L G , S a g g a u P (1994) Neuron 12: 1139-114873. S c h o 1 z K P, M i 1 1 e r R J (1992) Neuron 8: 1139-1150

74. T h o m p s o n SM, H a a s HL, G a h w i l e r B H (1992) J Physiol (London) 451: 347-363

75. G e r b e r U, G r e e n e RW, H a a s RW, S t e v e n s D R (1989)7 Physiol (London) 417: 567-578

76. P i c a n o E, A b b r a c c h i o M P (2000) Brain Res Bull 52: 75-8277. D u n w i d d i e TV, D i a o L , K i m H , J i a n g J L , J a c o b s o n K

A (1997) 7 Neurosci 17: 607-61478. v o n L u b i t z D K J E , P o p i k P , C a r t e r M F , J a c o b s o n K A

(1994) Eur J Pharmacol 163: 59-6779. C u n h a R A, J o h a n s s o n B, F r e d h o l m BB, R i b c i r o JA,

S e b a s t i a o A M (1995) Neurosci Lett 196: 41-4480. K i r k p a t r i c k K A, R i c h a r d s o n P J (1993) Br 7 Pharmacol

110: 949-95481 .R i b e i r o JA , d e M e n d o n c a A, C o r r e i a - d e - S a P,

C u n h a RA, S e b a s t i a o A M (1996)D rugD evR es39: 353-36082. M a y f i e l d RD, S u z u k i F, Z a h n i s e r N R (1993) 7 Neuro­

chem 60: 2334-23378 3 . G u b i t z AK, W i d d o w s o n L, K u r o k a w a M, K i r k p a t ­

r i c k KA, R i c h a r d s o n PJ (1996) J Neurochem 67: 374-3818 4 .G o n c a lv e s M L , C u n h a R A, R i b c i r o J A (1997) Neurosci

Lett 238:73-7785 . D i x o n A K, W i d d o w s o n L, R i c h a r d s o n PJ (\991) J Neu­

rochem 69: 315-32186. F e r r e S , F r e d h o l m B B , M o r e l l i M , P o p o l i P , F u x e K

(1997) Trends Neurosci 20: 482-48787 .U m e m i y a M, B e r g e r A J (1994) Neuron 13: 1439-144688. W i n d s c h e i f U (1996) 7 Pharm Pharmacol 48: 993-101189. K a i s e r S M, Q u i n n R J (1999) DD T 4: 542-55190. M ü 1 1 e r C H (2000) Drugs o f the Future 25:1043-10529 1 . Ł ę c k a J, M o l s k i S, K o m o s z y ń s k i M (2000) W: V a n d u-

f f e l L, [ 2 ] L e m m e n s R (red) Ecto-A TP-ases and Related Nuc­leotidases. Shaker Publishing, Maastricht, The Netherlands, str. 167-174

238 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

Recenzja książki „Wybrane zagadnienia z biochemii ogólnej z ćwiczeniami”

Autorzy: Maria Gałka-Walczak, Teresa Kędryna i Barbara Ostrowska Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków 2001

Przedstawiona do recenzji książka jest zbiorem ćwiczeń studenckich zgrupowanych w 29 roz­działach. Każdy z tych rozdziałów, nazywanych w książce: Ćwiczeniem, zawiera obszerny wstęp teore­tyczny. Całość mieści się na 450 stronach. Ostatni, 30 rozdział poświęcony jes t statystycznemu opraco­waniu wyników doświadczalnych. Książka ta, zgod­nie z zamiarem Autorek, jes t przeznaczona głównie dla studentów Oddziału Analityki Medycznej W y­działu Farmaceutycznego Collegium Medicum U ni­wersytetu Jagiellońskiego oraz dla studentów innych wydziałów medycznych; Lekarskiego, Stomatolo­gicznego i Farmaceutycznego. To w sposób oczywi­sty zdecydowało o doborze' proponowanych ćw i­czeń; duża ich część to ćwiczenia analityczne jak o ­ściowe (np. reakcje charakterystyczne am inokwa­sów, próby redukcyjne dla monosacharydów i disa- charydów, reakcje charakterystyczne dla bilirubiny) oraz ilościowe (np. oznaczanie glukozy, cholestero­lu, HDL, kreatyniny, mocznika, triacylogliceroli, po­ziomu elektrolitów w surowicy krwi; oznaczanie glukozy, kwasu m oczow ego w moczu). Ćwiczenia te są stosunkowo proste i tw orzą klasyczny zestaw, od­powiedni dla wstępnego kursu biochemii, a właści­wie analityki biochemicznej. W przyszłości warto może zastanowić się nad wzbogacaniem podobnych opracowań w coraz nowocześniejsze techniki stoso­wane w laboratorium biochemicznym, nawet kosz­tem opisu niektórych tradycyjnych ćwiczeń anali­tycznych. Nie znaczy to, że w omawianym skrypcie nie ma ćwiczeń nowoczesnych, dotyczących metod współcześnie stosowanych w analityce medycznej.

Teoretyczne wprow adzenia do każdego ćwiczenia zdecydowanie u łatwiają zrozumienie części prak­tycznej. Są one bardzo obszerne, często bardzo szczegółowe i p rzypom inają raczej opracowania podręcznikowe, niż krótkie wstępy do ćwiczeń za­zwyczaj spotykane w zestawach ćwiczeń dla studen­tów. To duży walor recenzowanej książki. Nie udało się jednak A utorkom uniknąć błędów i niejasności. I tak na przykład: na stronach 143 i 156 (tutaj tłustym drukiem) napisano, że „przy stężeniach substratu,

przekraczających stężenia enzymu, reakcja enzym a­tyczna przebiega jako reakcja pierwszego rzędu w stosunku do enzymu oraz jako reakcja zerowego rzę­du w stosunku do substratu” . Tymczasem, jednym z założeń przy wyprowadzaniu równania Michaeli- sa-Menten jes t to, że stężenie substratu jest znacznie wyższe niż stężenie enzymu. Stopień wysycenia en­zymu substratem zależy nie tylko od stężenia tego ostatniego, ale od powinowactwa enzymu do sub­stratu. Reakcja staje się zerowego rzędu w stosunku do substratu, wtedy gdy jego stężenie znacznie (wie­lokrotnie) przekracza wartość K m a szybkość początkowa reakcji zbliży się do szybkości m aksy­malnej. Dalsza część wywodu dotyczącego kinetyki enzymatycznej jest poprawna, a zatem niezrozu­miałe jes t umieszczenie tego niefortunnego stwier­dzenia. Na stronie 230 umieszczono informację, że „fruktozo-2,6-difosforan (nawiasem mówiąc jest to bisfosforan, podobnie jak fruktozo- 1,6-difosforan i 1,3-difosfoglicerynian ze str. 305, 306 są bisfosfora- nami) .... jes t wytwarzany tylko w wątrobie, ...” co nie jes t prawdą, ponieważ tworzy się on także w m ię­śniu sercowym. Jego powstawanie katalizuje rów ­nież fosfofruktokinaza II, różniąca się od enzymu wątrobowego pod względem regulacji aktywności. W Ćwiczeniu 18 poświęconym cukrom napisano, że „większość m onosacharydów ma właściwości redu­kujące” . Sądzę, że należało by podać przykład takie­go cukru prostego, który nie wykazuje właściwości redukujących. W tym samym rozdziale opis budowy cząsteczki glikogenu jes t niejasny. Nie wynika z nie­go, które wiązania tworzą rozgałęzienia, a które łańcuch główny. Ponadto występowanie w glikoge- nie wiązania 1-3 nie jes t powszechnie opisywane w podręcznikach, a zatem warto może podać źródło tej informacji. Termin „dehydrogenaza pirydynowa” (str. 304) nie wydaje się poprawny. Skrótem acetylo- koenzymu A jes t acetyloCoA, a nie acetyloKoA. Uważam, że w opracowaniach przeznaczonych dla studentów, należy szczególnie zawracać uwagę na stosowanie nazewnictwa zgodnego z ogólnymi zale­ceniami.

POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 239http://rcin.org.pl

Ponadto: na stronie 53, przy okazji omawiania metod oznaczania białka podano nazwę błękit kuma- zyny. Oczywiście chodzi tu o błękit Coomassie, nie­kiedy w żargonie laboratoryjnym zwany „kuma- syną” . Błękit kumazyny wydaje mi się określeniem dość niefortunnym. Opis mechanizmu działania en­zymów allosterycznych umieszczony na stronie 167 jes t niejasny i dla osoby nie znającej tego zagadnie­nia - zupełnie niezrozumiały. Podobnie, mało precy­zyjny wydaje się opis syntezy ATP na str. 304. Na stronie 189 napisano, że: „... peroksydaza występuje w komórkach różnych tkanek, na przykład tarczycy, błony śluzowej jelita, w płucach oraz w trzustce” . Sadzę, że zręczniej jes t zastąpić słowo „tkanka” ter­minem „narząd”.

Mimo tych uwag, om aw iana książka stanowi niewątpliwie bogate źródło ogólnej w iedzy b ioche­micznej przydatnej s tudentom kierunków m edycz­nych oraz obszerny zbiór opisów doświadczeń jakie wykonuje się w pracow niach studenckich, nie tylko w uczelniach o profilu farm aceutycznym czy lekar­skim. Dlatego przedstawione mi opracowanie po­winno wzbudzić zain teresow anie studentów i na­uczycieli akademickich prowadzących zajęcia z bio­chemii ogólnej na uniwersyteckich wydziałach bio­logicznych oraz w wyższych szkołach rolniczych.

K rzysztof Zabłocki

Dr, Instytut Biologii Doświadczalnej im. Marcelego Nenckiego PAN 02-093 Warszawa, ul. Pasteura 3

240 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl

http://rcin.org.pl

Wskazówki dla Autorów

W yd a w a n y p rzez Polskie Tow arzystw o Biochem iczne kw ar­talnik „Postępy B iochem ii" publiku je prace p rzeg lądow e om a­w ia jące nowe osiągn ięcia, koncepcje i kierunki badaw cze w dz iedzin ie biochem ii i nauk pokrew nych; publiku je też noty z hi­storii biochemii, zasady po lsk iego słow nictw a b iochem icznego, recenzje nadesłanych książek o raz sp raw ozdan ia ze z jazdów , konferencji i szkół, w których b io rą udz ia ł członkow ie Towarzy­stwa.

Prace p rzeznaczone do pub likac ji w „Postępach Biochem ii" m ogą mieć charakter a rtyku łów m onograficznych (do 2 0 stron tekstu licząc piśm iennictwo i tabele), m inireviews (do 10 stron tek­stu), o raz krótkich not o najnowszych os iągn ięciach i pog lądach (do 5 stron tekstu).

Au to rzy artykułu o d p o w ia d a ją za p raw id łow ość i ścisłość podaw anych in form acji o raz popraw ność cy tow anego piśmien­nictwa. U jęcie prac w inno być syntetyczne, a p rzedstaw ione za ­gadnien ia zilustrowane za pom ocą tabel, rycin: wykresy, schema­ty, reakcje, w zo ry i fo togra fie .

W skazany jest p o d z ia ł a rtyku łów m onograficznych na roz­dz ia ły i podrozdz ia ły , których rzeczow e tytu ły tw orzą spis treści. Zgodn ie z przyjętą konwencją rozd z ia ły noszą cy fry rzymskie, pod ro zd z ia ły o d p ow ie dn io rzymskie i arabskie, np. 1-1, 1-2. Po­prawność log iczna i stylistyczna tekstu warunku je jego jedno­znaczność i czytelność. A u to rzy prze to w inn i unikać składni ob ­cojęzycznej, g w a ry labo ra to ry jne j, a także og ran iczać stosowa­nie doraźn ie tworzonych skrótów, naw et jeśli b yw a ją używ ane w pracach specjalistycznych. Każda z nadesłanych do Redakcji prac pod lega ocenie specja listów i op racow an iu redakcyjnemu. Redakcja zastrzega sobie m ożliw ość skrócenia tekstu i w p row a ­dzenia zm ian nie w p ływ a ją cych na treść pracy, deklaru je też go ­towość konsultowania tekstu z Autoram i.

Przekazanie artykułu do redakcji jest rów noznaczne z oświadczeniem , że nadesłana praca nie by ła i nie będzie publiko­w ana w innym czasopiśm ie, jeżeli zostanie og łoszona w „Postę­pach B iochem ii". W przypadku , g d y Autor(zy) zam ierza(ją) w łączyć do swego artykułu ilustracje pub likow ane przez auto­rów prac cytowanych, na leży uzyskać i p rzekazać nam o d p o ­w iedn ią zgodę na przedruk.

Redakcja prosi A u to rów o przestrzegan ie następujących wskazówek szczegółowych:

TEKST: prosim y o nadsyłanie dw óch egzem p la rzy wydruku o raz dyskietki z tekstem zapisanym jako * .d o c w form acie IBM PC. W yd ruk pow in ien być jednostronny z lewym marginesem około 4 cm, z zachow aniem p o d w ó jn eg o odstępu m iędzy w ie r­szami, z użyciem czcionki A ria l CE 11 lub 12. W p rzypadku sto­sowania w tekście liter a lfabetu greckiego prosim y o w pisanie ołówkiem na marginesie ich fonetycznego brzm ienia.

Strona informacyjna jest n ienum erowana, zaw ie ra im iona i nazw isko (a) Autora (ów), nazw y, adresy, telefony, adresy e-maii

zak ładów , w których p racu ją Autorzy, adres do korespondencji, tytuł artykułu w języku polskim i angielskim o raz - w p raw ym do l­nym rogu: liczbę tabel, rycin, w z o ró w i fo togra fii o raz skrócony tytuł pracy, zam ieszczany na ok ładce czasopisma (do 25 zna­ków).

Strona 1 (tytu łowa) zaw ie ra im iona i nazwiska Autorów , tytu ł p racy w języku polskim i angielskim, rzeczow y spis treści też w obu językach, tytu ł naukow y każdego z A u to rów i ich miejsce p racy z adresem pocztow ym i adresem e-mail o raz w ykaz stoso­wanych skrótów w porządku a lfabetycznym .

Kolejno num erowane dalsze strony obejm ują tekst pracy, piś­m iennictwo, tabele, podp isy i ob jaśnienia rycin, w zo rów i fo togra ­fii.

PIŚMIENNICTWO: W yk a z piśm iennictwa obejm uje prace w kolejności ich cytow an ia w tekście, zaznacza się je liczbam i porządkow ym i ujętymi w naw iasy kw adratow e, np. [3 , 7, 9 -26 ], O dnośnik i b ib liog ra ficzne pow inny mieć nową, uproszczoną for­mę. Sposób cytow an ia czasopism (1), m onografii (2), roz­d z ia łó w z książek jednotom ow ych (3), rozd z ia łó w z tom ów serii op racow anych p rzez różnych redakto rów (5) wskazują poniżej podane przykłady.

1. H i l d e b r a n d t G R , A r o n s o n N N ( 1980) Bio- chim Biophys A cta 631 : 4 9 9 -5 0 2

2. B o s t o c k CJ , S u m m e r A T (1978) The Eucary- otic Chromosome, Elsevier, N orth -H o lland , Amsterdam

3. N o r b e r t h T, P i s c a t o r M (1979) W : F r i- b e r g L, N o r d b e r g G F V o n V B (red) Handbook on the Toxicology o f Metals. Elsevier, N orth -H o lland , Amsterdam, str. 541 -5 5 3

4. D e l e j J , K e s t e r s K (1975) W : F I o r k i n M , S t o t z E H (red) Cmprehensive Biochemistry 129B. Elsevier, N orth-H olland, Amsterdam, str. 1-7

5. F r a n k s N P, L i e b W R (1981) W : K n i g h t C G (red) Research Monographs in Celi and Tissue Physiology, t. 7. Elsevier, N orth-H olland, Amsterdam, str. 2 4 3 -2 7 2

ILUSTRACJE: ryciny pow inny być zapisane na dyskietce jako: *.tif, lub *.cdr, lub *.psd, lub *.eps. Fotografie czarno-b ia łe (kontrastowe) pow inny być w ykonane na pap ie rze m atowym . Ist­nieje m ożliwość w ykonan ia reprodukcji barw nych, a le ich koszty ponoszą Autorzy. N a rycinach nie na leży umieszczać op isów słownych, lecz posług iw ać się skrótami. Osie w ykresów pow inny być opa trzone napisem ła tw o zrozum iałym . Decyzję o stopniu zm niejszenia ryciny podejm uje w yd a w ca . Ilustracji nie należy w łą cza ć w tekst maszynopisu, lecz odp ow ie dn io ponum erow ać: ryciny noszą cy fry arabskiej, w z o ry zaś rzymskie. N a marginesie tekstu na leży zaznaczyć o łów kiem preferow ane miejsce umiesz­czenia ryciny czy w zoru. S łowne objaśnienia znaków gra ficz­nych m ożna umieścić w podpis ie pod ryciną, rysunkowe zaś je­dynie na p lanszy ryciny. Tytuły i ob jaśnienia rycin sporządza się w postaci oddz ie lnego w ykazu. W yd ruk i ilustracji na leży na od ­w rocie podp isać im ieniem i nazwiskiem p ierw szego z A u to rów i pierwszym słowem tytułu p racy o ra z oznaczyć „gó ra -d ó ł" (o łów ­kiem, na odw rocie ). Ze w zg lędu na w ew nętrzną spoistość a rty ­kułu wskazane jest konstruowanie o ryg ina lnych rycin i zb iorczych tabel na podstaw ie danych z piśm iennictwa.

W yd ru k i za łączn ik i (w dw u egzem plarzach) o raz dyskietkę, w łaściw ie zabezp ieczone przed uszkodzeniem w czasie trans­portu, prosimy przesłać na adres:

Redakcja kw arta ln ika „Postępy B iochem ii"Polskie Towarzystwo Biochem iczneul. Pasteura 30 2 -0 9 3 W arszaw a

http://rcin.org.pl

KOMUNIKAT ZARZĄDU GŁÓWNEGO

POLSKIEGO TOW ARZYSTW A BIOCHEMICZNEGO

Prosimy o w noszenie opłat za składki członkowskie na nasze konto w PBK XIII Oddz. Warszawa nr 11101053-411050000371.

Jednocześnie uprzejmie informujemy, że decyzją Zarządu Głównego PTBioch. została zmieniona wysokość składki członkowskiej. W roku 2002 wynosi ona:

dla Członków rzeczywistych 70.- zł.dla Członków studentów 35.- zł

Członkow ie, którzy opłacą składkę członkow ską za rok 2002, otrzym ają bezpłatną prenum eratę kwar­talnika Polskiego T ow arzystw a B iochem icznego „Postępy B iochem ii” . M ałżeństw a m ogą opłacać: 70.- + 45.- = 115.-zł, otrzym ają w ów czas jeden egzem plarz „Postępów B iochem ii” .

Powyższe zm iany nie dotyczą Członków Honorowych Towarzystwa. N atom iast Członkowie-Emery- ci - nadal zwolnieni z opłacania składki członkowskiej - p łacą za prenumeratę „Postępów Biochem ii” 25.- zł.

Biblioteki p łacą za prenum eratę „Postępów Biochemii” w roku 2002 100.- zł.

POLSKIE TOW ARZYSTW O BIOCHEMICZNE

ZAPROSZENIE

Jeżeli chciałabyś/chciałbyś zapisać się na listę e-mailową Polskiego Towarzystwa Biochemicznego wyślij e-mail na adres: infoptbioch@ nencki.gov.pl. W polu „subject „ umieść swoje nazwisko i imię (w takiej kolejno­ści i bez polskich znaków diakrytycznych) oraz adres e-mailu. Wysyłając taki mail zgadzasz się na to, aby na Twój adres e-mailowy przychodziły informacje ZG, listy pojedynczych lub grup członków do ogółu członków, informacje z FEBS o zjazdach i kursach oraz materiały reklamowe. Lista będzie rozsyłać materiały kontrolowa­ne przez moderatora, k tórym będzie Adam Szewczyk, sekretarz Zarządu Głównego Polskiego Towarzystwa Biochemicznego, tak więc nie będzie Ci grozić zalew śmieciowej poczty i zawirusowanych „attachmentów” . M am nadziej ę, że tą drogą poprawi się stan poinformowania naszych członków o różnych wydarzeniach nauko­wych, stypendiach, kursach i wreszcie o aktywności poszczególnych oddziałów naszego Towarzystwa. Być może również „Listy do b iochem ików ” redagowane przez p. Teresę W esołowską będą obok wersji drukowanej kolportowane przez naszą listę. Zapraszam także do odwiedzenia strony ww w naszego Towarzystwa

Adam Szewczyk

Sekretarz Zarządu GłównegoPolskiego Towarzystwa Biochemicznego

http://rcin.org.pl