agilent 1100 hplc化學工作站操作訓練目錄

Agilent 1100 HPLC化學工作站操作培訓教材

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Agilent 1100 HPLC化學工作站操作訓練

課程編號：H4033A

2004年7月修訂版

客戶服務中心電話：0800-018-768

安捷倫科技有限公司全球網址：http://www.agilent.com/chem

http://www.agilent.com/chem


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Agilent 1100 HPLC化學工作站操作訓練目錄

簡介課程簡介………………………………………………… 1

第一章層析基礎………………………………………………… 3

第二章 HPLC儀器工作原理…………………………………… 24

第三章固定相的選擇…………………………………………… 39

第四章 Agilent 1100 系統硬體概觀………………………… 77

第五章 Agilent 1100 泵和線上除氣機…………………………… 83

第六章 Agilent 1100 自動進樣器………………………………… 107

第七章 Agilent 1100 管柱控溫箱………………………………… 124

第八章 Agilent 1100 檢測器……………………………………… 132

第九章熟悉化學工作站及其作業系統………………………… 151

實驗一重新安裝化學工作站…………………………………… 366

第十章方法編輯、儲存…………………………………………… 184

實驗二方法編輯及資料採集……………………………………… 374

第十一章圖譜最佳化………………………………………………… 213

第十二章積分最佳化………………………………………………… 220

練習實驗

第十三章校正及定量基礎…………………………………………… 231

第十四章建立校正表………………………………………………… 257

實驗三外標法定量………………………………………………… 380

實驗四內標法定量………………………………………………… 387

第十五章設定報告格式……………………………………………… 268

附錄高級功能簡介……………………………………………… 327

第十六章故障診斷與系統維護……………………………………… 276

第十七章日常維護與常見層析故障………………………………… 297

練習實驗、結業考試


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第一章層析基礎

本章內容：

•液相層析發展史

•液相層析的基本概念

•影響峰形擴展的因素


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歷史回顧

0

NN

NN

Mg

CH CH2 3

CH

3CH

3

H C

3

0

CH3

CH3

CH3

0CH

3

00

M.S. Tswett. Ber. Dtsch. Bot. Ges. 24: 384-393 (1906)

1906 - Mikhail Semenovich Tswett (1872-1919)

碳酸鈣吸附劑

石油醚

1940‘s -分配層析和紙層析

1950‘s -氣相, 薄層，凝膠過濾層析

梯度流析層析

1960‘s -商業高效液相層析

層析的起源：

1903年，俄國植物學家Tswett（茨維特）研究植物葉子組成，用碳酸鈣作吸附劑，分離植物乾燥葉子的石油醚萃取物，發現三種顏色六條色帶，他把這種色帶稱為“層析”。1906年，發表於德國植物學雜誌，屬於液固層析法。

層析的發展：

1940年，Martin和Synge提出液液分配層析；1941年，Martin和Synge提出氣相層析可能性；1944年，Consden發展了紙層析；1949年，Macllean製作薄層板，使薄層層析法TLC得以應用；1952年，Martin和Synge發展了氣相層析，並獲得諾貝爾化學獎；1956年，Stahl開發薄層層析板塗布器，使TLC廣泛應用；60年代末，出現了商業高效液相層析HPLC，但是由於泵和檢測器的發展滯後，使得HPLC在80年代以後才得以迅速發展。


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5

傳統管柱層析

載入樣品溶劑淋洗重力流析

玻璃柱

矽膠氧化鋁

纖維素糖類粉末

濾網

1050100150Volume (mL)

Time (hr) 1.02.03.04.0

傳統的管柱層析以重力作為溶劑傳輸的動力，分離速度慢、效率低，而且靠肉眼觀察化合物的分離與流出，具有很大的局限性，現在已經很少有人使用。


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6

高效液相層析（HPLC）

進樣口

檢測器

層析圖

管柱

溶劑

泵

混合器

高效液相層析(High Performance Liquid Chromatography)包括以下幾部分：

•溶劑傳輸系統：相當於人的心臟，不斷地向系統提供連續、穩定、精確

的流量。

•樣品引入系統：將樣品引入整個層析分離系統，要求引入樣品時不改變

系統的流量和壓力。

•樣品分離系統：整個層析系統的關鍵部分，樣品在這裏實現分離。

•訊號檢測系統：對分離後的各個成份進行檢測，輸出回應訊號。

•資料處理系統：對檢測器給出的訊號進行處理，輸出圖譜，並得到對應

的定量結果。


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大分子量化合物聚合物

水相（GFC）有機相（GPC）

Polystyrene Silica體積排阻層析(Size Exclusion)

離子水相/緩衝鹽對離子

Anion or Cation Exchange Resin離子交換層析(Ion Exchange)

離子水/有機溶劑離子對試劑

C18, C-8離子對層析(Ion-Pair)

中性、弱酸性、弱鹼性物質水/有機溶劑C-18, C-8, C-4, C-2

…………反相層析(Reversed-Phase)

在水中絕對不溶解的物質或同分異構體

有機溶劑Silica, Amino, Cyano, Diol正相層析(Normal-Phase)

主要適用範圍(Compound Separated)

流動相(Mobile Phase)

固定相(Stationary Phase)

層析類型(Mode)

常見液相層析類型

正相、反相層析的劃分標準：比較流動相和固定相的極性大小。

正相層析：流動相極性<固定相極性

反相層析：流動相極性>固定相極性

正相層析：分離在水中絕對不溶解的物質或同分異構體，占>10%應用

反相層析：用於常規分析，占~80%的應用。

離子對層析：可看作是反相層析的一個特殊應用，需要在流動相中加入離

子對試劑。

離子交換層析：需要特殊的管柱和檢測器，與離子對層析的應用範圍相同

但原理不同

體積排阻層析：大分子先流出，小分子後流出。不同的管柱分離的分子量

範圍不同。需要專門的軟體。

水相流動相：凝膠斥濾層析GFC (Gel Filtration Chromatography)

有機流動相：凝膠透析層析GPC (Gel Permeation Chromatography)


8

8

層析參數

tR=滯留時間 R: 分離度

t0=呆時間 K': 容量因數

W=峰底寬度

Det

ecto

r R

esp

onse

Time

A B

W WA B

Inje

ct

t0

tR(A)

tR(B)

tR(B) - tR(A)

WA + WBR = 2

tR(B) - tR(A)

W1/2A + W1/2B= 1.176

K'=tR-t0

t0

呆時間t0：完全不滯留成分流出系統的時間。

液相層析中呆時間的幾種測定方法：

1. 有回應的溶劑出峰時間為呆時間；

2. 進樣後的閥切換峰，對應的時間為呆時間；

3. 工作站中輸入管柱的呆容積，自動計算。

（對於C18柱，也可以用硝酸鈉或硫脲來測定）


9

9

不同R值的峰重疊情況示意圖

R >1.5可以得到基線分離

0.4 0.50.6 0.7

0.8 1.00 1.25

分離度R反映的是相鄰兩個峰的分開程度：

•R太小，兩個峰無法徹底分離

•R太大，分離時間過長，工作效率低

一般要求R>1.5，也可遵循行業特殊規定。


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10

影響分離度(R)值的因素

Δt

W=R = 1/4 N x α- 1 x k'

1 + k'

容量因數選擇性柱效

α

需要記憶該公式以便最佳化實驗條件，提高分離度R。

從數學推導來看，分別增大N, α, k ′值，都可以提高分離度R。

R是A，B兩個峰之間的分離度。


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容量因數 K’對分離度(R)的影響

各成份的容量因數（K’）隨溶劑流析強度的變化增大或縮小

增加流動相的流析強度，降低了流析物的容量因數

對於反相層析，增加10％的有機組成等於降低每個層析峰的K’值的 1/2 到 2/3

溶劑流析強度弱

溶劑流析強度強

2 4 6 8 10

1100

700

300

100

60% Acetonitrile

Time (min.)m

AU 40% Water

2000

1600

600

0

80% Acetonitrile

Time (min.)

mA

U 100020% Water

2 4 6 8 10

容量因數k’為物質的特性，當分析條件一定時，容量因數為固定值。

溶劑的流析強度強弱與其極性有關：

反相層析：溶劑的極性越強，流析強度越弱。

正相層析：溶劑的極性越強，流析強度越強。(注意：不可以使用純水作為正相層析的流動相)

一般樣品分析要求：2 < k′< 5

複雜樣品分析要求：2 < k′< 10或2 < k′< 20


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分離選擇性(α)對分離度(R)的影響

改變分離選擇性α的方法

•改用不同的流動相•改變流動相的組成

•改變流動相pH值 α 並非必須大於1.5！•改變管柱溫度•應用特殊的化學效應•改變固定相

t 0 = 1

=k'

k'B

A

A B

2 3

A B

1 2

A B

1 2

= =1.64

1.58= 1.04 =

1.15

0.85= 1.35 =

0.95

0.63= 1.50

k'

k'

B

A

α

α αα

儘量通過前幾種實驗條件來提高α值，避免改變固定相

（買新管柱），以便降低成本。


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13

溫度對分離選擇性(α)的影響

ln α = a/T + b

40 ℃

60℃

100 5

Time in Minutes

升高溫度可以提高分離選擇性，但不要使用過高溫度，以保護管柱。(60℃就已經算是高溫了！)

注意：溫度對平衡常數有影響，有時會影響出峰的順序，注意對化合物進

行定性後再定量。溫度與選擇性之間的關係為：ln α = a/T + b

升溫可以加速分離，縮短分析時間。


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柱效(N)對分離度(R)的影響

Detector

Response

Injec

t

Time

高柱效

低柱效

上下兩張層析圖的k′、α值完全一致，僅僅是由於柱效高低不同使得它們具有不同的分離度。

峰的尖銳程度代表了柱效高低：峰越尖銳，其柱效越高。通常，我們使用理論板數N值的大小來衡量柱效的高低，見下頁。


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15

Inje

ct

t R

W

W

Time

1/2

B

理論板數和理論板高的計算方法

理論板數 N = 16(tR/WB)2 = 5.54(tR/W1/2)2

理論板高 HETP = L / N

理論板數N越大，柱效越高；理論板高HETP越小，柱效越高。

柱效的高低受柱內效應和柱外效應影響。範德姆特仔細研究了柱內效應，提出了範德姆特方程式，見下頁。


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擴散——The Van Deemter Equation

The Van Deemter Equation

A = 渦流擴散B = 自由分子擴散C = 傳質阻力

HETP = A + B/ ν + C ν

理論板高

HE

TP

B/ ν

C ν

A

線性速度ν

1956年，荷蘭科學家範德姆特提出了範德姆特方程式，探討了影響柱效高低的因素。


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A

A = 渦流擴散——多徑擴散

仔細填充管柱

使用均一的填充物

線性速度

初始帶寬

最終帶寬

柱內擴散H

ET

P

以下幾頁的柱內效應，僅供大家瞭解、參考使用。

渦流擴散（多徑擴散）：因為流動相所通過的路徑不同，所以導致帶寬擴

展。


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柱內擴散

B = 自由分子擴散——縱向擴散

在液相中影響小

在低流速中影響大

B

線性速度

HE

TP

自由分子擴散

縱向擴散：分子有從高濃度向低濃度擴散的特性，由於濃度差而產生的擴

散。

該擴散對GC影響顯著，在低流速下影響顯著。


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柱內擴散

C = 傳質阻力 ---質量轉移係數

在低流速下可以降低傳質阻力

使用小顆粒填充物可以降低傳質阻力

滯流的流動相

流動相

固定相C

HE

TP

線性速度

傳質阻力：包括滯流流動相以及固定相C18與溶質間的溶解、解析滯留作

用。

傳質阻力是影響液相層析柱效高低的最關鍵因素！


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20

柱內擴散——The Van Deemter Equation

A = 渦流擴散B = 自由分子擴散C = 傳質阻力

HETP = A + B/ ν + C ν

理論板高

HETP

B/ν

C ν

A

線性速度 ν

使用范德姆特方程式可以最佳化實驗條件，尋找最佳線性速度和流量。

根據范德姆特方程式，我們可以確定最佳流速，但最佳化流速並非主要的最佳化手段，尤其對於LC其流速影響曲線較平緩，對HETP影響較小。

以上都是柱內效應，還有一些柱外效應對分離的影響更大！


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柱外效應

1. 樣品體積2. 連接管路的體積3. 管柱進口設計4. 管柱出口設計5. 檢測池體積6. 輸出回路回應時間

與柱內效應相比，柱外效應對柱效的影響更大。

注意區分兩個概念：

呆容積(Dead Volume): 從進樣口到檢測器出口。

延遲體積(Delay Volume): 從溶劑入口到層析柱入口。


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不同分離度比較

R = 1

R = 1.5

R = 0.5

R = 4

小練習：請指出前幾張層析圖分離度差的原因，並提出解決方案，以提高

分離度？


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23

如何提高分離度(總結)

通過下述方法增加滯留時間:

選擇合適的分離參數增加管柱長度增加固定相濃度

通過下述方法降低峰寬度:使用均一的填充物仔細填充管柱選擇粒度小的填充物最佳化流速減小進樣量降低系統呆容積降低輸出回路回應時間

因為R=Δt/W，所以提高分離度的兩種思路為：增加Δt或降低W。


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第二章 HPLC 儀器工作原理

本章內容：

•往復活塞泵的結構及工作原理

•手動進樣器（六通閥）結構及工作原理

•常見檢測器檢測原理


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25

溶劑傳輸系統

往復式活塞泵

Gold Seal

SapphireInsert

Ruby Ball

SpringInsert

入口

出口自溶劑瓶

至液相系統

右圖單向閥僅可使溶劑從上向下流。

單獨一個泵腔無法滿足溶劑傳輸系統的要求：連續性、穩定性都不符合標準。


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溶劑傳輸系統——並聯活塞泵

A

B

相消干擾

通常也需要阻尼器

增加了單向閥的使用數量

單向閥P

A B

單向閥

使用並聯泵時，由於A、B兩個泵的相位不同，可以補償流量脈衝；但由於單向閥的數量增多，所以容易造成洩漏，增加了維護使用的難度。


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溶劑傳輸系統——串聯活塞泵

單向閥

脈衝阻尼器

減少了單向閥用量

需要阻尼器

壓縮因數補償

左泵腔的活塞運動速度為右泵腔活塞的2倍。因此，相同時間內，左泵提供的流量為右泵的兩倍，左泵提供的溶劑一半直接供給系統，另一半被右泵吸入，稍後供給液相系統。

使用Agilent 1100 HPLC系統時，可以在化學工作站中設置溶劑壓力補償因數，保證流動相流量和比例的準確性。


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To

Waste

Sample Loop

(Fixed Volume)From

To

Column

Sample

Syringe

Load Inject

To

Column

PumpFrom Pump

To Waste

手動進樣器——六向閥

使用手動進樣器時要注意以下事項：

• 進樣針：應選用液相專用的平頭針。

• 進樣量：一則小於定量環體積的一半進樣, 另一則滿刻度進樣(需要推

進3~5 倍定量環體積的樣品)。

• 進樣動作：在Load狀態下推針，動作要平緩，以防樣品沖出。進樣後

先切換到Inject狀態再拔針，以防倒吸或產生氣泡。

• 清洗進樣口：在Inject狀態清洗進樣口。

• 廢液口：廢液管的出口末端應與進針口水平，以防樣品倒流洩漏或產

生虹吸。

思考：如果From Pump和 To Column的管路接反了，會有什麼影響？

注意：不要接錯任何管路！


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29

液相層析常用檢測器

43.0%

22.0%

10.0% 8.0%

7.0%

5.0%

1.0%

4.0%

UV-VIS

DAD

Fluorescence

Refractive Index

Electrochemical

Conductivity

Mass spec

Others

如今質譜檢測器的比例己經遠遠超過1.0%，因為使用質譜檢測器可以實現未知樣品的定性。


30

30

PAH's extracted from soil; Col.: Sup.LC-PAH 150x4.6mm;

Solvent: H2O/CH3OH= 10:90

Fluorescence

UV-Signal

WL

241

/394

WL

270

/388

WL

248

/411

WL

302/

420

WL

247

/504

Pyren

e

Chryse

ne

Benzo

(e)p

yrene

Perylen

e

Benzo

(k)fl

uoran

thene

Benzo

(a)p

yrene

Benzo

(ghi

)pery

lene

Inde

no(1

23-c

d)pyre

ne

不同檢測器的靈敏度不同

為什麼需要使用多個檢測器

FLD靈敏度高.其靈敏度比紫外檢測器高100倍左右。


31

31

Therapeutic concentration: 1.8mg/l, 20ul injected

Flecainide in Serum

FL signal

UV signal


不同檢測器的選擇性不同

FLD的選擇性好。

能使用紫外檢測器檢測的不一定可使用FLD檢測，而能用FLD檢測的樣品，只要濃度足夠大, 基本都可以用紫外檢測器來檢測。


32

32

Take peak spectrum (UV)

Chlortoluron ?

Take peak spectrum (MS)

Atrazine ?

Wavelength (nm)


不同檢測器提供的定性資訊不同

Mass/Charge (m/z)

200

44

68

58

96 132138158

172

215

104

使用質譜檢測器可以更好地定性。


33

33

紫外－可見光檢測器

根據Beer定律，通過檢測池透射光的強度與溶質濃度成正比

I Ic

b

o

Detector Cell

Log = A = abcI0

I

I0：入射光強度I：透射光強度A：吸光度a：摩爾吸光係數b：檢測池長度c：溶液濃度

稀溶液中，物質的吸光度與其濃度成正比。


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34

容槽

光源

檢測器狹縫

可旋轉光柵

可變波長檢測器VWD示意圖

針對不同的成分，VWD可以選用不同的檢測波長，以提高檢測靈敏度。但波長切換對所得層析圖的基線可能會有影響。

VWD只可得到某時刻，某波長的吸光度值，如果要得到紫外吸收光圖譜，必須做“停泵掃描”(犧牲層析圖)。

注意層析圖與吸收光圖譜的區別。


35

35

光源

容槽透鏡

狹縫

二極體陣列

固定光柵

二極體陣列檢測器DAD示意圖

DAD檢測器與VWD的區別：樣品位於光柵之前、光柵不需旋轉。

DAD可得到紫外吸收光圖譜，可做3D圖譜，可最佳化層析檢測條件，可提取所需波長下的層析圖，可進行峰純度檢驗等。

DAD參數設置比較複雜，需要合理設置，以獲得最佳檢測靈敏度。具體參數設置將在工作站中講解。

注意層析圖與光圖譜的區別：

層析圖是某一波長下各個不同時刻的吸光度值描點作圖；光圖譜是某一時刻各個波長下的吸光度值描點作圖。


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36

400200

Purity Match999

Wavelength (nm)200 400

Purity Match764Spectra

Wavelength (nm)

impure pure

Signal

Time (min.)

7.6 7.8 8.0 8.2 8.6

使用DAD進行峰純度檢視

利用DAD採集到的紫外吸收光譜可以進行純度檢驗。純度因數最大值為1000，其數值越大，表明越可能是純物質的流出峰。


37

37

螢光檢測器FLD示意圖

氙燈

激發光柵

發射光柵

透鏡

透鏡反射鏡

容槽

參比二極體

光電倍增管

狹縫狹縫

狹縫

散射器

利用螢光檢測器同樣可以獲得三維圖譜，根據所得的三維圖譜，可以進一步選擇最佳激發波長和最佳發射波長，最佳化層析實驗條件。


38

38

折射率檢測器RID示意圖

1.流路入口

2.加熱器

3.熱交換器

4.容槽

5.Purge閥

6.Recycle閥

7.廢液桶

8.參考池

9.溶劑瓶

折射率檢測器(Refractive Index Detector)的主要工作原理是利用光在不同介質中的折光係數不同，給出回應訊號。


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39

第三章固定相的選擇

本章內容僅供參考。


40

40

液相層析之管柱的選擇

• 正相（極性固定相）• 逆相（非極性固定相）• 離子交換層析• 離子對層析（逆相）• 凝膠斥濾（Gel Filteration）層析法

( 應用在水溶性樣品之大小排除層析法 SEC )

• 凝膠透析（Gel Permeation）層析法( 應用在溶於有機溶劑中的樣品之大小排除層析法 SEC )

液相層析有分很多種，現在目前最常使用的是以水相為移動相之逆相層析法。

然而，也會有一些特定的例子需要一些特定之應用，本身並不適用逆相層析法。

以下之說明將會幫助我們了解哪些物質適用於何種之液相層析。


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41

流析強度l Water/Bufferl Waterl Methanoll Acetonitrilel Isopropanoll Tetrahydrofuran

逆相的HPLC常用之溶劑

類似於氣相層析之應用，對於分析開始到結束之溫度變化從高溫到低溫是很困難的。

上述為液相層析之溶劑的強度變化，從上到下流析強度愈大。它也跟氣相層析一樣，對於分析開始到結束之溶劑的強度變化為從流析強度降大之溶劑到流析強度較低之溶劑是很困難的。

一般來說，弱的溶劑有較好的解析能力能得到較好的分離，強溶劑能提高分析速度和效率。


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42

主要因子

• 管柱內徑• 支持物質的性質–HPLC為填充管柱.

• 固定相的性質–液液層析(Liquid-Liquid Chromatography)

–液固層析(Liquid-Solid Chromatography)

當我們在看管柱時，可從管柱上的一些資訊了解管柱的性質。並當我們要決定沖提或者使用何種溶劑時，我們可先從管柱那得到一些資訊。


43

43

管柱尺寸

• 管柱長度–50 , 100 , 150, 200, 250, 300 mm

• 管柱內徑–4.6 mm , 3.0 mm, 2.1 mm

上述為一般管柱之長度，安捷倫的液相層析管柱最長為 300mm 。


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44

常用的流速範圍

Column i.d.(5µm Particles)

FlowmL/min

4.6 1 –23.0 0.4 - 0.82.1 0.2 – 0.41.0 0.05 – 0.09

Flow Ratenew column = Flow Rateoriginal columni.d. new columni.d.original column

2

上述為針對不同的內徑有不同的流速範圍。


45

45

Conventional

Microbore

4.6 mm

4.6 mm

2.1 mm

d = 10 µmp

0 2 4 6 8 10

1.00 mL/min

0 4 6 8 10

0.01 mL/min

2

or

1.0 mm 100 mm200 mm

優點l減少溶劑的浪費.l對於樣品量少的能提供良好的分析l從分析管柱改變成微小型球體管柱能容易更換流速

缺點l儀器的柱外體積很小l過濾蕊（ Frits ）必須經常更換

d = 5 µmp

d = 5 µmp

小型球體與微小型球體管柱

愈小的管柱能得到愈好的效率和愈尖銳的層析峰，但樣品的負載能力相對會減少，可能會影響到偵測極限。

未來的液相層析的發展，管柱會趨向於愈來愈小，它能增加分析的速度並且得到較好的解析度。


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46

增加分析速率並維持解析度

5 µm 3.5 µm 5 µm 3.5 µm

40%

減少

40%

減少

無變化 9% 變化

50%

減少

50%

減少

尺寸 250 x 4.6 mm 150 x 4.6mm 150 x 4.6 mm 75 x 4.6 mm

分析時間 30 min 18 min 18 min 9 min

溶劑的消耗(mL)

30 mL 18 mL 18 mL 9 mL

理論板數 20,000 20,000 12,000 10,000

要轉變原本之方法類似之方法時，上方之提示能提供一些幫助。

選擇較短並且粒子較小之管柱，解析度將會相同，粒子較小之管柱通常會有較大之背壓。.


47

47

4.6 x 15 mm

4.6 x 30 mm

4.6 x 50 mm

4.6 x 75 mm

4.6 x 150 mmmin0 1 2 3 4 5 6 7 8

Abs

orba

nce

SB-C18

Conditions: LC: Hewlett-Packard HP1100Columns: Zorbax SB-C18, 3.5 µm

Mobile Phase: 1 mM octane sulfonic acid, Na salt, pH 2.5 : ACN (80:20)UV: 275 nm; Flow: 2.0 mL / min.; 70°C

Inj Vol: 1 µL

Sample:1. Acetaminophen (4-acetamidophenol)2. Caffeine3. 2-Acetamidophenol

4. Acetanilide5. Aspirin (acetosalicyclic acid)6. Salicylic acid7. Phenacetin (acetophenetidin)

1 23 4 5 6 7

all 7 components resolved in less than 1 min

管柱長度–解析度與管柱長度之關係


48

48

管柱填充物質的性質

• 矽膠本身 ( 極性固定相 = 正相 )

• 烷化矽膠( 球形粒子 )

• 不規則烷化矽膠顆粒Irregular alkylated( 較大的總表面積 ).

• 聚苯乙烯系 ( pH 1 to 12 ).

• 多孔性.( LSC )


49

49

自由矽醇基

管柱填充物質 – 矽膠表面

Si

OH

Si

OH

Si

OH

O

Si

OH

O

羥基

Si

OH

HO

H

矽醇基和水分子吸附

Si

OH OH

Geminal silanolgroups

Si

OH

Si

OH

O

氫鍵

Si

O

Si

O

矽氧烷鍵


50

50

管柱填充物質 –鍵結相

Si CH3H3C

O

O

Si

O

Si

O

OH

Pores

Si-OH + Cl-Si-R Si-O-Si-R + HCl

R1

R2

R1

R2

單體鍵結相

長碳數之鏈

在高 pH 時矽膠會溶解。在低 pH 時矽醇基會被破壞。


51

51

管柱填充物質 – 矽膠

Silica Sols Xerogels

球形

不規則形一般分析管柱粒子大小通常為3-10 µm.


52

52

a 資料來自文獻或商家提供b 矽膠的型態請參閱商品目錄c NA = 無數據資料

Column

Designation

Silica Supportb

Surface

Type

Silica Typeb

Surface

Area, m2/g

Pore

Diameter, Å

Porosity, cm3/mL

Hypersil BDS-C8

A

SolGel

170

130

0.65

Inertsil-C8

B

SilGel

320

150

NAc

Supelcosil ABZ+

A

SolGel

175

120

0.60

Symmetry-C8

B

SilGel

340

100

0.84

YMC-Basic

B

SilGel

325

120

1.0

Zorbax XDB-C8

B

SolGel

180

80

0.50

管柱參數之例子


53

53

球體填充物的大小

• 1.8 µm• 3.5 µm• 5.0 µm• 7.0 µm• 10 µm • 準則 : 球體愈小分析速度越快並且能得

到較好的解析度，不過相對的壓力會愈大


54

54

Mobile Phase, 20% ACN/80% Aqueous 0.1% TFAZorbax SB-C8 Columns; Column i.d., 4.6mm; Ciprofloxacin; 22°C

3-µm

5 -µm

10 -µm

流速

N

理論

粒子大小 – 影響效率

上圖顯示流速和理論板數之間的關係。

上述的例子，75 mm,3.5 µm的管柱最佳流速為大約 0.4 mL/min時，能得到最好的理論板數。其理論板數值大於150 mm, 5 µm的管柱最佳流速約為0.3 mL/min的理論板數值。當流速大於0.3 mL/min時， 3.5 µm的管柱其理論板數值亦都比5 µm的管柱來的高。


55

55

填充物質孔徑之大小

• 70 Å• 80 Å ( Zorbax other than 300 )• 85 Å• 120 Å• 300 Å (分析大分子如胜肽或蛋白質,或想要減少分析時間)• 準則 : 300 SB系列之管柱能減少分析時間並能提供相

近之解析度


56

56

管柱填充物質 – 極性鍵結相

逆相（ Reversed-Phase） HPLC

•C18•C8

•C4•C1

•Phenyl

最常用之HPLC的管柱

蛋白質的分離

弱偶極 –誘導偶極和極性分析物質之間的作用

兩相 HPLC

•CN

•NH2

正相（ Normal-phase） HPLC

•Diol 分離各種極性化合物

CH3|

-0-Si- R|CH3

中等極性

離子交換（ Ion Exchange）

DEAE (diethyaminoethanol)QAE (quaternaryaminoethyl)Carboxymethyl

大小排除（ Size Exclusion）

Glycerylpropyl


57

57

固定相的性質

• CN ( 極性 ,正相 )• Phenyl ( 極性 , 正相 )• C3, C4, C6• C8• C18 ( ODS )• Polystyrene• 其它


58

58

2

2

逆相HPLC之滯留時間順序

C OH

O

C OHH

HNH2C

H

H

水溶解性

> numberCarbons

Branched

Amines, Aldehydes,Ketones

AlcoholsPhenols

滯留時間

LeastRetained

MostRetained

CarboxylicAcids

3

Unsaturated

滯留時間的順序決定於分子上之碳的結構。

在逆相層析中，水溶解性較差之樣品其滯留時間較長。

碳數愈多其滯留時間愈長。

支鏈之化合物其滯留時間比直鏈之異構物短.不飽和的化合物其滯留時間較短。

滯留時間：

脂肪族(Aliphatics) > 誘導偶極(induced dipoles) > 永久偶極(permanent dipoles) > 弱鹼>弱酸> 強酸


59

59

OHC OH

O

CH3

1. 3.2. 4.

預測滯留時間順序

O

C

CH2

CH3

OH

OH

O

C

CH2

CH2

CH3

OH

O

C

CH2

CH2

CH2

CH3

O

C

CH2

CH2

CH2

CH2

CH3

OH

1. 2. 3. 4.


60

60

立體障礙保護(無封端)

傳統ODS管柱(無封端) 傳統

(封端處理)

*鍵有可能被酸水解

H

處理殘留的矽醇基 –封端處理（Endcapped）和立體障礙保護


61

61

封端處理和無封端處理之管柱

• Stable Bond (SB) (Non End-Capped with Hinderance at it base )

• XDB Eclipse ( End- Capped )• Extend ( End- Capped )


62

62

弱酸的分析

R C O H + H2O R C O + H3O+

OO

OR C O H

OR C O

and

pH = pKaHigh pH

OR C O

Little Retention

Low pH

OR C O H

Most Retention


63

63

Buffer pKa Buffer Range Buffer pKa Buffer RangePhosphate Formate 3.8 2.8 - 4.8

pK1 2.1 1.1 - 3.1 Acetate 4.8 3.8 - 5.8pK2 7.2 6.2 - 8.2 Tris(hydroxymethyl)pK3 12.3 11.3 - 13.3 aminomethane 8.3 7.3 - 9.3

Ammonia 9.2 8.2 - 10.2Citrate Borate 9.2 8.2 - 10.2

pk1 3.1 2.1 - 4.1 Pyrrolidine 10.5 9.5 - 11.5pK2 4.7 3.7 - 5.7pK3 5.4 4.4 - 6.4

緩衝溶液

其他一般移動相之添加劑：

Acetic AcidPhosphoric AcidSulfuric AcidTriflouroacetic Acid (TFA)


64

64

Separation of morphine, codeine, and oxymorphone

(a) (b) (c)

(a) (b) (c)

Column A Column B Column C

Column A Column B Column C

Mobile phase: (a) 80 vol %, (b) 40 vol %, and (c) 40 vol % acetonitrile in water, all at pH 6 with 2 mM sodium acetate buffer.

Mobile phase: (a) 16 vol %, (b) 10 vol %, and (c) 7 vol % acetonitrile in water; lower pH (3.5) and higher buffer concentration (25 mM).

LC-GC, 6 (1987) 494

緩衝溶液的濃度


65

65

簡單定律

•長管柱或長碳鏈之滯留時間較長•球形之填充物能得到較好之分析峰對稱性•不規則之填充物有較大之總表面積•封端處理之管柱移動相之容許pH值範圍較大

•管柱內徑愈小解析度越好但壓力較大•分析離子化合物或離子對層析必須使用無封端處理之管柱, 例如 Stable Bond (SB).

•分析LC/MSD 時不能使用離子對和磷酸之緩衝溶液


66

66

比較下列兩者之分析速度

• Zorbax SB C18 4.6mm 150mm 5um.

• Zorbax Eclipse XDB C8 4.6mm 100mm 3.5um.


67

67

何者適用於分析離子化合物？

• Zorbax SB C3 4.6mm 150mm 3.5um.

• Zorbax Eclipse XDB C8 4.6mm 150mm 5 um.


68

68

比較下列兩者之分析速度

• Zorbax Eclipse XDB C18 2.1mm 150mm 3.5um.

• Zorbax 300SB C4 2.1mm 150mm 3.5um.


69

69

分析LC/MSD時何者較適合？

• Zorbax Eclipse XDB C18 2.1mm 50mm 5um.

• Zorbax 300SB C4 4.6mm 150mm 5um.


70

70

離子對之逆相層析－強酸和強鹼

SO3

SO3 N

R

R

R

H+

Na+

鍵結相離子對試劑

樣品

N+

N+

O C RO

H2PO4

Separate Bases withAlkyl Sulfonates

Triflouroacetic acid (TFA)Heptafluorobutyric acid (HFTBA)Hexanesulfonic acid

Separate Acids withQuaternary Alkyltriethylamines

Triethylamine (TEA)Tetramethylammonium phosphate (TMA)Tetrabutylammonium phosphate (TBA)Triethylammonium acetate (TEAA)Nonylamine


71

71

離子交換機制

Cl

Cl

H

H

H

+

+

+

+N H

+N H

CH2 C

O

O

CH2 C

O

O

•機制樣品離子和帶電之固定相支撐物產生結合

•固定相Sulfonates (SCX)Quaternary ammonium (SAX)Carboxymethyl (WCX)Diethylaminoethyl (WAX)

•移動相緩衝溶液反離子有機改質劑

結合之強度依據緩衝系統和緩衝溶液之 pH值，它決定蛋白質表面帶電荷之濃度及填充物質表面之電荷的密度。


72

72

1. F-

2. HCO3-

3. Cl-4. NO2

-

5. Br -6. NO3

-

7. PO4-3

8. SO4-2

離子層析 – 無機離子

電導度偵測器Pump

離子交換管柱抑制柱或薄膜

Na2CO3 無機陰離子陰離子交換樹脂Resin-H+ + Na+HCO3

- Resin-Na+ + H2CO3

HCl 無機陽離子陽離子交換樹脂 Resin-OH- + H+Cl- Resin-Cl- + H2O

1. Li+2. Na+

3. NH4+

4. K+

5. Ca2+

6. Mg2+

陰離子

陽離子


73

73

O

Si

O

Si

O

Si

O

O

H

H

O R

O

H

H

O R

O

吸附層析 – 正相層析

機制•氫鍵•偶極力 -偶極力•π鍵•溶質置換溶劑

固定相•矽膠Silica•氰基Cyano bonded phase•氨基Amino bonded phase•二醇基Diol bonded phase

移動相•有機溶劑

在正相層析中，樣品之滯留時間決定在與固定相之吸附作用。

樣品分子置換吸附在固定相中的溶劑分子。除了置換機制之外，樣品分子也能與固定相產生交互作用。

分離機制主要是在極性固定相和分子上之極性官能基產生作用。


74

74

正相HPLC 之滯留時間順序

滯留時間

極性

C OHO

Acids

O

C NH2

Amides

OHNH2

AlcoholsAmines

C

O

C H

O

KetonesAldehydesEsters

C ORO

NO2

Nitro

R O R

Ethers

F, Cl

Halogens

AromaticsCH3

Hydrocarbons

化合物之極性官能基團決定滯留時間的長短

官能基極性愈大滯留時間愈長。

滯留時間之順序一搬來說跟逆相層析相反。

正相層析對某些極性官能基有很大的選擇性。


75

75

正相HPLC之固定相

Si O SiCH3

CH3

CH2 CHOH

CH2 OH

Si O SiCH3

CH3

(CH2)n C N 正相層析方法之首要選擇

極性大

Si O

H

異構物分析之最好選擇

Si O SiCH3

CH3

(CH2)n NH2 提供可替代的選擇性

鍵結相的優點•不用控制水•可梯度沖提•管柱平衡速度快•極性選擇性廣泛•高負載量•在無鍵結之矽膠上峰不會拖尾

無鍵結之矽膠管柱能運用在一些特殊的例子，例如分析異構物時。

有鍵結之管柱可以用梯度沖提。

不同鍵結的正相管柱有不同的選擇性。

不要使用氨基管柱分析醛類和酮類，會形成Schiff 鹽類。氨基之管柱可應用在分析維他命A和D之正相層析。有鍵結之管柱比無鍵結之管柱平衡時間快。

鍵結管柱的優點包含：可梯度沖提，平衡時間快，對不同的極性官能基有較好的選擇性及較高的樣品負載能力。

當使用鍵結之管柱不合適時，可選擇使用無鍵結之管柱。


76

76

1. 正相層析中預測phthalates之沖提順序?

Dibutyl phthalateDimethyl phthalateDinonyl phthalateDiethyl phthalate

5% Tetrahydrofuran95% Isooctane

試題

2. 如果把移動相改為5% toluene和95% isooctane，那層析會變成如何?


77

77

Thermostattedcolumn compartmentQuaternary pump Control module

G1354A G1316A G1323A

G1313A

Diode-array detectorBinary pump Autosampler

G1315AG1312A

Vacuum degasserIsocratic pump Variable wavelength detector

G1310A G1314AG1322A

第四章 Agilent 1100 系統硬體概觀

Plus,

Manual Injector


78

78

l 最佳化流路減小呆體積l 流路自上而下

安裝配置

Agilent 1100 HPLC系統採用積木式堆積結構，方便客戶按照自己的需要配置不同的儀器系統。

整個系統的流路自上而下設計、連接，減小了系統的呆體積和延遲體積。


79

79

l 每個部分有獨立的電源l 1100各部件均由CAN線連接l 檢測器與化學工作站之間用LAN線連接 (或用HPIB連接)

l 除氣機與泵之間用Remote線連接(錯誤信號輸出)

l BCD板用於外設和讀取樣品瓶數量

儀器背面連線

HPIB卡

LAN卡

Agilent HPLC1100的每個模組都有獨立的電源，方便加入新的模組。

各部件由CAN線進行通訊連接，使得各個部件形成一整套系統。（真空除氣機不需工作站控制，所以真空除氣機用Remote線和系統連接，僅僅用於傳輸錯誤資訊。）

手持控制器可以和任一空閒的CAN介面相連。

化學工作站和儀器系統之間用LAN線（或HPIB線）連接，推薦將網卡（或HPIB卡）插在檢測器上。


80

80

指示燈狀態

儀器LED狀態顯示

電源開關顯示

Off (power off)Ready (power on)Not ReadyRunErrorResident Blink

BlackBlackYellowGreenRedYellow blinking

通過LED顯示儀器六種狀態：

注意：Ready狀態下LED燈不亮，為黑色狀態。

LED燈顯綠色表明為運行狀態。


81

81

Swagelok

Parker

Valco

0.080 in.

0.090 in.

0.090 in.0.170 in.

Waters

Rheodyne

Uptight

0.130 in.

0.090 in.

管線接頭

各家公司的管線接頭長短不一致，注意不可混用！

安捷倫使用的是Swagelok接頭，前端的管子伸出長度為0.09in.。安捷倫液相色譜上的閥(手動進樣閥、自動進樣閥等)採用的是Rheodyne閥，所以連接到閥的一端管線接頭與其他管線不同，其伸出長度為0.17in.。

如果接頭過長，則接不上或者洩露；如果接頭過短，則死體積增大，影響峰形。


82

82

Agilent毛細管的顏色

顏色內徑(mm)

紅色 0.12

綠色 0.17

藍色 0.25

橙色 0.50

不同顏色的毛細管內徑也不相同，注意更換管線時要使用相同配件號的管線，以免增大死體積。


83

83

第五章 Agilent 1100泵和線上除氣機

Agilent 1100系列泵：G1310A, G1311A, G1312A, G1354A

Agilent 1100系列線上除氣機：G1322A


84

84

Agilent 1100真空除氣機——G1322A

建議 ...

l低壓混合進行梯度流析，提高泵的可靠性能。

l提高泵在低流速下的操作性能

l用於需要去氧的檢測器

性能 /用途

l與He除氣相比，更方便，更節省費用。

l高性能除氣，避免了煩瑣的操作，提高儀器穩定性。

l內部延遲體積小，便於快速進行溶劑切換。

l四通路系統，操作靈活。

l與1100其他元件堆積在一起，用Remote線連接，用於傳輸錯誤信號。

新型除氣機的內部延遲體積已經減小到1mL。


85

85

A B C D

自溶劑瓶

至泵

Agilent 1100真空除氣機

習慣上左進右出，但反接並無影響。


86

86

Agilent 1100真空除氣機構造

真空泵

真空室

電磁閥

控制組件

AB C

D

壓力感測器


87

87

線上真空除氣機工作原理

Solenoid valve

使用半透膜管路，允許氣體分子通過，液體分子無法通過。


88

88

使用真空除氣機可以降低噪音

no degassing

helium degassing

Agilent on-line degassing

Abs

orbe

ncy

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Time (min)

Solvent: methanol; UV signal: 210 nm

使用真空除氣機可以更加有效地降低基線噪音。


89

89

溶解酵素分析

24 25 26 27 28 29

60

50

40

30

20

10

0

m AU

Firstanalysis

Last analysis

after 30 hours

24 25 26 27 28 29

60

50

40

30

20

10

0

mAU

Last analysis

after 30 hours

Firstanalysis

使用氦氣除氣

除氣機線上除氣

使用真空除氣機可以保證滯留時間的再現性

使用真空除氣機可以保證滯留時間具有更好的重現性。


90

90

Agilent 1100系列單元泵－G1310A

特徵/用途l流量範圍寬，用途廣泛：0.5 ~ 10 ml/minl雙柱塞，可變衝程，以及阻尼器可以減小流量脈衝。l改進的閥系統可以延長使用壽命，降低維修成本。l容易維護和維修。l直接與溶劑瓶，排放閥和管路連接，便於快速啟動。l可以升級至四元泵。

建議 ...l常規品質控制分析l簡單混合物的分析l用於體積排阻層析l半製備工作

加真空除氣機

l流量範圍可擴展至：0.2~10ml/min


91

91

Agilent 1100系列單元泵前視圖

阻尼器

3. 入口止回閥

1. 出口止回閥

瓶頭元件

溶劑瓶

溶劑盒

泵2. 排放閥

泵頭

請在實際儀器上識別、指認各個部件的名稱。


92

92

單元泵工作原理

阻尼器

排放閥

密封墊

活塞柱

傳動裝置

出口止回閥

入口止回閥

入口閥使用電磁主動閥，可瞬間開關流路，減小延遲時間。


93

93

單元泵/四元泵的泵頭

塑膠鎖定螺絲

泵頭固定螺絲

請指認各個部件的名稱，並指出入口止回閥在何位置？


94

94

泵頭結構圖

1.寶石活塞柱

2.活塞外框架(包括彈簧)

3.支持環

4.石墨密封墊

5.泵腔

6.入口止回閥

7.出口止回閥

8.塑膠鎖定螺絲

9.排放閥

10.泵頭固定螺絲

3號支援環可以換成Seal Wash系統，用於緩衝鹽體系。

實驗室中至少應備有一付4號石墨密封墊。零件號碼為：5063-6589(用於逆相層析)；0905-1420(用於正相層析)


95

95

Agilent 1100 單元泵和四元泵的閥

PTFE Frit: 01018-22707

密封金墊

塑膠蓋帽

出口止回閥入口止回閥

過濾芯

排放閥

密封金墊

塑膠蓋帽

PTFE過濾芯

實驗室中至少應備有5〜10個PTFE Frit(過濾白頭)，以備日常所需。

打開purge閥，用水以5mL/min的流量沖洗管路中氣泡時，如果系統壓力大於10Bar就應該更換過濾白頭了！

思考題：入口止回閥中的過濾芯的作用是什麼？

排放閥中的PTFE過濾芯的作用又是什麼？


96

96

Agilent 1100系列密封墊沖洗裝置－Seal Wash ( 可加選元件)

l 當流動相中鹽濃度>0.01M時，使用Seal Wash可以減小密封墊的磨損。

l 對於Agilent 1100系列泵為可加選元件。

l 用10%異丙醇水溶液沖洗

Washer

Support seal assembly

Seal

如果安裝了Seal Wash，無論該次實驗是否使用緩衝鹽，都必須打開Seal Wash，維持每分鐘幾滴的流量即可。


97

97

帶有Seal Wash的泵頭結構圖

3. Seal Wash支撐環

4. Seal Wash密封墊 0905-1175

5. 排放管

6. Seal Wash墊圈

7. Seal Wash密封壓片

8. 泵頭密封墊 5063-6589


98

98

Agilent 1100系列四元泵——G1354A

建議 ...

l使用2，4，8mm內徑的管柱

l流量範圍從 0.2~10ml/min

l應用於研究和常規分析

特徵/優點

l四通路/低壓混合能靈活地進行等梯度或梯度流析。

l無需消耗昂貴的He而能進行高性能真空除氣。

l自動衝程調節，混合非常均勻，降低基線噪音。

l對於高鹽流動相，可選擇Seal Wash清洗密封墊。


99

99

Agilent 1100系列四元泵前視圖

溶劑盒

真空除氣機 G1322A

四元泵 G1311A

四元泵比單元泵多了四元比例閥。由單元泵可以升級到四元泵，除了要加上四元比例閥外，還要更換主板。

真空除氣機為四元泵的標準配置。


100

100

四元泵工作原理示意圖

真空室

四元比例閥

入口止回閥

阻尼器

排放閥

至進樣器

來自溶劑瓶

出口止回閥

請指出四元泵的流路。


101

101

Agilent 1100系列二元泵－G1312A

建議 ...

l使用4mm內徑管柱

l流量範圍從0.5~5 ml/min

優點/特徵

l高壓混合，無需除氣。

l對於有強紫外吸收的流動相，使用靜態混合器可以降低基線噪音。

l可以選擇溶劑切換閥自動進行溶劑切換

l對於高鹽流動相，可選擇Seal Wash清洗Seal

增加真空除氣機,

l流量範圍可擴展至0.05~5ml/min

l推薦使用1，2，4mm內徑的管柱

除氣機不是標準配置。

加入靜態混合器，增加了延遲體積。

如果配置溶劑切換閥，則兩個泵頭可分別控制兩種溶劑，類似四元比例閥，但並不完全一樣，只能同時混合兩種溶劑，不可實現四種溶劑的同時使用。


102

102

二元泵工作原理

阻尼器

排放閥混和器

A B

入口止回閥

出口止回閥

廢液口

入口止回閥

出口止回閥

請對照實際儀器熟悉二元泵的流路。


103

103

帶有溶劑切換閥的二元泵

A B

混和器限流毛細管

混和毛細管

固定夾

阻尼器

溶劑選擇閥

A1

A2

B1

B2

請指出圖上所有的部件名稱，熟悉流路。

靜態混合器的延遲體積為420μL，可以使流動相混合更加均勻，減小基線噪音。


104

104

Agilent 1100 二元泵的閥

密封金墊

塑膠蓋帽

PTFE過濾芯密封金墊

塑膠蓋帽

入口止回閥出口止回閥排放閥

過濾芯

篩網

篩網是二元泵出口單向閥獨有的部件！

請指認各個部件名稱。

篩網Sieve的作用：保證達到二元泵最低流速要求。篩網的孔徑為10μm。Sieve是二元泵獨有的結構！


105

105

Agilent 1100各種型號泵的價格、性能一覽

Isocratic pump

G1310AIsocratic pump with degasser

G1310AG1322A

Quaternary pump

G1354A

Binary pump

G1312A

Binary pump with degasser

G1312AG1322A

0.5-10 ml/min

0.05-5 ml/min

0.2-10 ml/min

0.5-5 ml/min

0.2-10 ml/min

價格/性能

各種類型泵配置的性能和價格示意圖。


106

106

系統延遲體積的比較

泵不帶混合器帶混合器

混合器

自動進樣器標準旁路

管柱控溫箱標準旁路

1090 1050 1100 四元泵 1100 二元泵

300-5001050-1250

750

V (loop)N/A

4.1 or 8.20

180-480600-900

420

300 + V (inj)6.2

3 or 60

800-1100n/a

n/a

300 + V (inj)6.2

3 or 60

800-1100n/a

n/a

327 + V (inj)8

150

min RangeMax Range

304-5041058-1258

189-489906-1206

1203-14061242-1442

(單位：μL)

本頁提供了重要的參考資訊，可以由該表估算需要多少溶劑(流動相)才能完全置換延遲體積。

要求：用5倍以上的總延遲體積沖洗整個系統，以完全更換流動相、平衡系統。一般均需以1mL/min的流量沖洗30min左右。


107

107

第六章 Agilent 1100 自動進樣器

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

Precision

10 25 50 100


108

108

Agilent 1100 系列自動進樣器

推薦 …

l進樣體積從0.1μL到1.8 ml

l最多可容納100個樣品瓶

l自動樣品前處理

性能/優點

l進樣體積再現性高 (典型RSD < 0.5%)

l進樣動態範圍寬

l連續排放流路並有洗針功能－降低樣品殘留

l所有驅動均採用電子驅動

l可以容納不同規格的樣品瓶

l靈活的進樣程式編制可以進行樣品前處理

（例如管柱前衍生）

l使用旁路可以降低延遲體積

如果要進樣1.8mL，則需要更換針座毛細管、定量環等硬體


109

109

自動進樣器管路連接來自泵

至管柱控溫箱

計量泵

和手動進樣器一樣，利用六通閥原理引入樣品。

注意不要將管路接錯！！！在新機器上都有管路的連接示意圖，可不必記憶。


110

110

Agilent 1100 系列自動進樣器結構

機器手臂

樣品盤

計量泵

樣品管

進樣閥

100 x 2ml 樣品盤

15 x 6ml 樣品盤

40 x 2ml 樣品盤

工作站可以自動識別自動進樣器上所安裝的樣品盤類型。


111

111

標準進樣過程

Metering device

6-port valve

Sampling unit

From pump

To column

To waste

準備位置

抓取樣品瓶吸取樣品

進樣和運行位置

請熟悉標準進樣過程。

當針抽完樣品，紮進針座的瞬間，進樣閥同時切換位置，將樣品引入系統，完成進樣動作。


112

112

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

RSD (%)

Injection Vol.( µl)1 3 5 7 9 10 25 50 100

不同進樣體積下的峰面積精確度

在標準進樣範圍內（0.1~100μL），自動進樣器都具有良好的重現性和精確度。

一般儀器分析中要求 RSD<2~5%。


113

113

Agilent 1100 系列自動進樣器進樣測試

min0 5 10 15 20 25 30 35

mAU

0

20

40

60

80

100#1

#10

#5 #8

Repetitive 1 μl injections from 10 μl sample

思考：為什麼前八針的精確度很好，而最後兩針的回應值誤差很大？

自動進樣器的針尖取樣位置可設為負值（-2.5mm），也可使用錐形套管實現對少量樣品的準確取樣。


114

114

Agilent 1100 系列自動進樣器進樣線性

Injection Volume (µL)

Are

a C

ount

s

1000

2000

0 20 40 60 80 100

Correlation: 0.999995

Agilent自動進樣器具有非常好的進樣線性。


115

115

Agilent 1100 系列自動進樣器

樣品容量 l 100 x 2 ml vials in 1 trayl 40 x 2 ml vials in 1/2 trayl 15 x 6 ml vials in 1/2 trayl 117 x 2 ml vials with external trayl Micro vials for small volumes

進樣量 l Standard: 0.1-100 μll Up to 1.8 ml using multi draw optionl Expanded injection range: 0.1-900 μl

精確度 l 5-100 μl typically <0.5% RSDl 1-5 μl typically <1% RSD

殘留 l Without needle wash typically <0.1%l With needle wash typically <0.05%

延遲體積 l Standard 300 μl+injection volumel In bypass mode 6.2 μl

上圖給出了自動進樣器的部分技術指標。


116

116

l 洗針功能把樣品殘留降低到最小限度

l 多次吸液用於進樣量大於100μL的情況

l 程式進樣可以非常靈活地執行客戶進樣程式的要求

Agilent 1100系列自動進樣器特殊功能

自動進樣器具有某些特殊功能，方便客戶使用。


117

117

洗針對樣品殘留的影響（清洗瓶蓋帽/不蓋帽）

Car

ry-

over

(%)

Injection volume (μL)

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.1 0.5 1 5

Primidone

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.3

0.35

0.1 0.5 1 5

Phenacetine0.25

Injection volume (μL)

Car

ry-o

ver

(%)

不洗針洗針(不蓋瓶蓋) 洗針(蓋瓶蓋)

洗針功能可以把樣品殘留降低到最小限度。

注意“洗針”僅僅是清洗針的外側，即將其在某瓶溶劑中沾一下而已。針的內側不需要單獨清洗。


118

118

使用洗針功能可以降低樣品殘留

min5 10

mAU

0

4 Sample: 0.01 M 咖啡因,普裏米酮，非那西汀

Injection volume: 1μL

Blank injection (1μL) with needle wash

Blank injection (1μL) without needle wash

樣品殘留峰

洗針後，樣品殘留峰消失了。


119

119

Injection range: 0.1 - 900µLUp to 1800µL with Multi-draw kit

900µL metering device

Samplingunit

To waste

From pump

To column

1500µL Needle Seat Capillary

900µL needle 900 µl loop extension

帶有多次吸樣裝置的自動進樣器

利用多次吸樣裝置可以將進樣量擴展到1.8ml。


120

120

自動進樣器的程式進樣功能

l 用於樣品衍生或樣品前處理

Metering device

Sampling unit

To waste

From pumpTo column

Sample Reagent

利用程式進樣功能可以方便地實現樣品即時衍生化。（本功能將在工作站中線上地介紹)


121

121

Agilent 1100 系列具控溫功能的自動進樣器

推薦 ...

l對於熱依賴性的樣品使用

l生化、製藥行業

l臨床實驗室

性能/優點

l半導體控制，可以非常方便、準確的升溫和降溫

l控溫範圍: 4- 40℃(室溫為25℃)

l可容納100個樣品瓶 (冷卻)

l可更換樣品盤

使用帶加熱的自動進樣器，可以滿足某些行業的特殊需求。


122

122

自動進樣器加熱原理

室溫空氣入口

熱空氣出口

加熱/冷卻部件

熱交換器

半導體元件


123

123

l 維護功能表:

–更換針

–更換針座

–更換機械手臂

l 自動進樣器機械手臂的定位、校準

l 依次測試各個進樣步驟

自動進樣器測試功能

將在最後一天儀器的維護測試中詳細介紹。


124

124

第七章 Agilent 1100 管柱控溫箱

TCC


125

125

管柱控溫箱的特徵及優點

推薦 ...

l溫度控制範圍：低於室溫10℃~80℃

l滯留時間的再現性需要穩定的溫度

l如果需要在高於或低於室溫進行分離操作時，需要使用管柱控溫箱

特徵/優點

l大空間，可以容納三根長的管柱

l更換管柱非常方便

l降溫非常方便

l安裝管柱識別可以記錄進樣次數

l使用切換閥可以進行管柱切換(可選)

l兩個單獨的加熱區可以分別控制溫度

l可以進行程式升溫

l內部呆容積小(左側3μL，右側6μL)

利用半導體控制溫度，而且溶劑管路先在柱溫箱中預熱，然後才進入管柱，保證了溫度的穩定性。


126

126

Agilent 1100管柱控溫箱與普通管柱控溫箱對比圖

色譜柱: 250 x 1 mm Vydac TP 218; 流動相: Water/Acetonitrile + TFA

70.40

70.50

70.60

70.70

70.80

70.90

71.00

71.10

71.20

71.30

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Hours

rete

ntio

n tim

e

白天

夜晚

傳統普通管柱控溫箱

Agilent 1100 柱溫箱使用Peltier半導體冷熱控溫模組

白天

使用安捷倫柱溫箱可以保證溫度的穩定性，從而保證了保留時間的重現性

。


127

127

管柱控溫箱的控溫性能

Sample PNA EPA StandardColumn 250 x 2.1 mm PAH, 5 μmColumn Temp 18℃Flow rate 0.4 ml/minMobile Phase A: water B: acetonitrileGradient 50 to 95 %B in 22.5 min

1 2

3

4

5

6

min5 10 15 20 25

mAU

0

5

10

15

20

25

30

7

8

9

10

11

12 13

1415

EnvironmentalApplication

Peak Compound %RSD of RT

1 Naphthalene 0.122 Acenaphthene 0.173 Fluorene 0.094 Phenanthrene 0.095 Anthracene 0.086 Fluoranthene 0.087 Pyrene 0.088 Benz(a)anthrac 0.099 Chrysene 0.10

10 Benzo(b)fluor. 0.1011 Benzo(k)fluor. 0.1012 Benz(a)pyrene 0.0813 Dibenz(a)an 0.1014 Benz(ghi)pery 0.1115 Indeno(123)py 0.10

在低於室溫的條件下改善了化合物的分離性能

利用柱溫箱可以控制實驗溫度，保證滯留時間的重現性。


128

128

通過改變管柱溫度實現PNAs分析條件的最佳化

Sample PNA EPA StandardColum 250 x 2.1 mm PAHMobile phase Water/Acetonitrile 50:50Flow rate 0.4 ml/minGradient from 50 to 95 %B in 22.5 minColumn Temp: 18, 25 and 30oC

min5 10 15 20 25

mAU

0

10

20

30

2

1

3

5

4

6

97

8

10

11

12

14

13

15

1617

18°C

25°C

30°C

ColumnTemp

Peak# Compound

1 Naphthalene2 Anthrachinone3 Acenaphthene4 Fluorene5 Phenanthrene6 Anthracene7 Fluoranthene8 Pyrene9 Benz(a)anthrac10 Chrysene11 Benzo(b)fluor.12 Benzo(k)fluor.13 Benz(a)pyrene14 Dibenz(gh)an15 Benz(ghi)an16 Benz(ghi)pery17 Indeno(123)py

分析不同的組份，應使用不同的分析溫度條件。


129

129

管柱控溫箱前視圖

來自自動進樣器

至檢測器

將管柱控溫箱的前面板移走後，可以很方便地接觸到管柱安裝區域、管柱切換閥、管柱識別系統以及洩漏感應裝置。

最多可以安裝三根30cm的管柱。

容槽入口毛細管可以直接接到色譜柱出口處，以減小系統死體積。


130

130

管柱識別系統

Product number 79916OD-552Serial number 951001

Batch number 1675

Geometry [mm] 100x2.1

Stationary phase ODS HypersilParticle size 10 µm

Number of injections 9

Maximum pressure allowed [bar] 400

Maximum temperature recommended [鳦]

70

Maximum pH recommended 12

柱識別必須安裝在距離識別天線2mm範圍之內，且柱識別上Agilent圖示朝上

管柱子上安裝的柱識別器可以儲存每根管柱的獨特資訊。

加熱塊上的柱識別天線可以向柱識別器傳送或接收柱識別器的資訊。但要注意兩者間的距離不可過遠。

兩側的加熱塊上都具有識別感測器，方便柱子的識別、安裝、使用。


131

131

管柱切換閥 (可加選)

管柱切換閥使用Rheodyne閥，為可選配件，使用的原理同樣類似六通原理。


132

132

第八章 Agilent 1100 檢測器

VWD/DAD


133

133

Agilent 1100 VWD檢測器

推薦 …

l產品開發及品質控制

l應用需要高靈敏度檢測器

性能/優點...

l從190~600nm波長範圍，噪音小，基線穩定 (±0.75x10-5 AU)

l可變波長檢測，可以對不同物質的檢測採集最大靈敏度。

l更換氘燈及清洗檢測容槽非常方便

l內置鈥玻璃可以非常快速方便地進行波長校準。

l根據不同需要選擇不同的檢測容槽。

基線的指標檢測是在指定溫度、指定流動相下，以254nm為檢測波長測定的（可參考VWD的說明手冊）。

日常分析基線平穩的標準為：

常量分析: 1~2mAU；微量分析：0.5mAU


134

134

可變波長檢測器VWD前視圖

檢測容槽的背壓非常重要，一定要使用適當的出口連接管。

氘灯檢測容槽

出口管線要抬高或加上限流裝置，以防氣泡進入容槽。但如果壓力過高，容槽的石英鏡片可能破裂。


135

135

光學系統——VWD光路圖

氘灯光源透镜

濾光片（鈥玻璃/遮光）

入射狭缝

反射鏡1＃

反射鏡2＃

光栅

分光器

参比光電二極體

樣品光電二極體

容槽

可變波長檢測器（VWD）特點：在某一時刻僅可得到某一波長下的吸光度值。將各個時刻所得到的吸光度值描點作圖，即可得到所需的色譜圖。

所謂的可變波長是指在不同時刻可以得到不同波長下的吸光度值，進而得到對應的色譜圖。

如果切換波長，需要旋轉光柵。但要注意切換波長可能引起色譜圖的基線波動，可以通過扣除空白基底或自動調零減小基線波動。

光路中鈥玻璃的作用是用於波長校準；分光器的作用是使部分光反射出來作為參考光，另一部分光作為檢測光照射到樣品上。

VWD可以自動扣除參比光，以消除光源波動的影響。

注意色譜圖與光譜圖的區別：

色譜圖是某一波長下各個不同時刻的吸光度值描點作圖；光譜圖是某一時刻各個波長下的吸光度值描點作圖。


136

136

VWD檢測器的高靈敏度

Sample Anthracene standardColumn 100 x 2.1 mm ODSMobile phase Water/Acetonitrile 30:70Flow rate 0.4 ml/min

min0 1 2 3 4 5

mAU

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

Signal: 0.23 mAUBaseline noise: <1x10-5AU

10 pg Anthracene

VWD具有很高的靈敏度。


137

137

利用VWD進行多成份分析的條件選擇

254nm

370nm

204nm

Monitoring impuritiesat 204, 254 nm

min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

mAU

0

500

1000

1500

2000

2500

3000Quercetin

Isohamnetin

Kaempferol

Sensitive quantitationof active compoundsat 370 nm

檢測不同組分時，應該選用不同的檢測波長，以獲得最佳回應信號。


138

138

VWD檢測器的選擇性和靈敏度

min0 2 4 6 8 10 12 14

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

204nm

254nm

368nm

Hydroxybenzotriazole

Trimethoprim

Furazolidone

ChloramphenicolNalidixic Acid

檢測波長如果選擇的不合適，檢測靈敏度就會下降，甚至得不到待測樣品的色譜峰。


139

139

VWD容槽

標準容槽和微量容槽高壓容槽

不同的容槽結構稍有差異，最後一天的日常維護課中會進行容槽的拆洗、維護實驗。


140

140

高性能的Agilent 1100 DAD檢測器


141

141

Agilent 1100 DAD檢測器——二極體陣列檢測器

推薦 ...

l用於研究及方法開發

l用於多波長檢測

l色譜峰純度檢查

l色譜峰確認（定性）

性能/優點...

l靈敏度高 (±1x10-5AU)

l配備紫外光燈和可見光燈，檢測波長範圍寬（190~950nm）

l具有1024個二極體和可變狹縫。

l可根據需要選擇不同的流動池

l可以進行自動峰檢索

l利用紫外譜圖可以進行色譜峰定性

實際上，二極體陣列檢測器DAD的靈敏度和VWD相差不大，但其參數設置複雜，一定要合理設置，否則會極大地影響其靈敏度。DAD的參數設置要求將在隨後的化學工作站參數設置部分詳細講解。


142

142

二極體陣列檢測器 DAD前視圖

來自層析柱出口

氘燈容槽室鎢燈

DAD的前視圖。要熟悉各個元件。


143

143

光學系統——DAD光路圖

鎢燈

耦合透鏡氘燈

光源透鏡(消色差透鏡)

氧化鈥濾光片

支撐透鏡

容槽

光譜透鏡

光柵

二極體陣列

狹縫

DAD檢測器可以得到任一時刻各個波長下的吸光度值，即可以得到樣品在各個時刻的吸收光譜圖。

DAD檢測器可以方便地提取所需檢測波長下的層析圖。

DAD使用的是固定光柵，但狹縫寬度可調整。


144

144

二極體陣列檢測器與可變波長檢測器對比示意圖

VWD檢測器 DAD檢測器

Source Entranceslit

Concave

grating

Diode-arraydetector

Flowcell

Source

Entranceslit

Exitslit

Flowcell

Detector

Concave

grating

對比DAD與VWD的差別：

1.容槽的位置

2.光柵轉動與否

3.某一時刻，VWD僅可得到某一波長下樣品的吸光度值，DAD可以得到樣品的吸收光譜


145

145

DAD流通池

高壓容槽

標準容槽和半微量容槽

常用的DAD的容槽（參見消耗品手冊）如下：

標準池：10 mm, 13μL, 120 bar

半微量池：6 mm, 5μL, 120 bar

高壓池：10 mm, 1.7μL, 400 bar

除墊圈孔徑不同外，標準池和半微量池具有相同的設計。


146

146

DAD的可變的光學狹縫——超微機械設計

馬達

狹縫

Agilent 1100 DAD具有可由軟體控制的可變光學狹縫，便於進行狹縫調整。狹縫可調範圍為：1、2、4、8、16nm。


147

147

狹縫對光譜解析度的影響

1 nm

2 nm

4 nm

8 nm

16nm

狹縫越小，光譜解析度越高，可以清晰地分辨出苯的“五指”吸收峰。


148

148

狹縫對層析靈敏度的影響

1 nm

2 nm

4 nm

8 nm

狹縫越小，層析的靈敏度越低，S/N比越低。

總之，狹縫越小，所得的光譜解析度越高，層析圖的噪音越大；狹縫越大，所得的光譜解析度越低，層析圖的噪音越小，基線越平穩。

實際樣品分析過程中，可以根據不同的需求選擇合適的狹縫寬度，其預設值為4nm，可以同時兼顧層析的靈敏度和光譜的解析度。


149

149

定性分析——探索三維立體影像

Spectral Acquisition ModeslAll spectralEvery 2nd spectrumlAll in peaklApex+Slopes+BaselineslApex+BaselineslNone

Abs

orba

nce

Time Wavelength

使用DAD可以獲得三維譜圖，進而得到等吸收圖，提取所需檢測波長下的層析圖，具體操作將在高級功能簡介部分講解。


150

150

DAD測試功能及診斷

l DAD自檢l 暗電流測試l 燈強度測試l 鈥玻璃測試l 容槽測試

l 濾光片測試l 波長校正l 類比訊號輸出測試

同樣，我們可以利用化學工作站方便地進行DAD各種性能測試。


151

151

第九章熟悉化學工作站及其作業系統

本章內容：

•Windows 作業系統概述

•如何建立快捷鍵

•如何維護電腦系統

使用Ctrl-Alt-Del組合鍵可以結束某一任務。例如：強行結束化學工作站工作時，就可以使用該組合鍵，在彈出視窗中選擇Task Manager，然後選中Processes欄目下NTVDM.EXE程式（即化學工作站程式），點擊End Processing，即可結束工作站的運行。


152

152

Windows桌面介紹

利用My Computer進行磁片及檔案管理

資源回收筒，用於放置被刪除的子目錄及檔案

Start鍵用於開啟某個應用程式

執行欄


153

153

Windows功能表介紹

Program: 包括Windows Explorer, Word

Pad, Paint, ChemStation等

Document: 顯示最近使用過的檔案

Settings: 包括Control Panel, Printers,

Taskbar

Shutdown: 用於關閉電腦


154

154

Windows實用功能簡介

•把常用的程式快捷鍵放在Start功能表的第一級：用滑鼠右鍵單擊Start鍵，選擇Open命令，打開Windows Start Menu視窗，用滑鼠單擊Program圖示，打開Windows\Start Menu\Program視窗，用滑鼠右鍵拖拽所需應用程式圖示到Windows Start Menu當再打開Start 功能表時，所選擇的應用程式顯示在Program功能表之上

Windows Start Menu 窗口

Windows\Start\Program窗口

使用滑鼠右鍵將某應用程式的快捷圖示拖拽到Start處，然後鬆開滑鼠右鍵，即可將該應用程式的快捷鍵添加至一級功能表中。


155

155

•在Desktop建立快捷鍵：

用滑鼠右鍵單擊Start鍵，選擇Open命令，打開Windows Start Menu視窗，用滑鼠單擊Program圖示，打開Windows\Start Menu\Program視窗，用滑鼠右鍵拖拽所需應用程式圖示到Desktop上。此步驟完成後，所需應用程式圖示顯示在Desktop上

•改變 Desktop的屬性：

用滑鼠右鍵單擊Desktop的任意位置，在出現視窗選擇Properties, 在Display Properties視窗選擇設置專案

使用滑鼠右鍵將某快捷圖示拖拽到桌面上，鬆開滑鼠右鍵，在彈出的功能表中選擇Copy to Here，即可在桌面上建立該應用程式的快捷方式。

使用Ctrl-Alt-Del組合鍵可以結束某一任務。例如：強行結束化學工作站工作時，就可以使用該組合鍵，在彈出視窗中選擇Task Manager，然後選中Processes欄目下NTVDM.EXE程式（即化學工作站程式），點擊End Processing，即可結束工作站的運行。


156

156

•化學工作站軟體目錄結構

所有資料檔案均存放在Data子目錄下，副檔名為.D，每個資料檔案為Data子目錄下一單獨子目錄，裏面包括各種副檔名的檔：

•.REG－二進位檔•.LOG－logbook文件•.M－方法檔

工作站軟體及檔案的維護

Demo

C:

Excel Hpchem

1 2

Data

Lab1.d

Methods Sequence Temp Verify

Backup Core Drivers Gc Helpenu Language Lc Repstyle Speclibs Sys

Windows

•.CH－層析圖文件•.UV－紫外圖譜文件•.MAC－樣品資訊檔

所有方法檔均儲存在Method子目錄下，副檔名為.M。

所有序列檔均儲存在Sequence子目錄下，副檔名為.S。

請記住化學工作站中資料檔案的儲存路徑。

注意一個資料檔案實際上是一個小檔案夾，包含了多種檔案。


157

157

•定期複製有用的檔案

在工作站中有用的檔主要是：

1. 資料檔案(xxx.D)

2. 方法檔(xxx.M)

3. 序列檔(xxx.S)

定期複製這些檔後，清除工作站子目錄下的這些檔，以節省硬碟空間，使運算速度正常

•禁止使用盜版軟體

•運行工作站的同時，不要使用中文系統或軟體

工作站軟體及檔案的維護

禁止使用盜版軟體！


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158

ItIt’’s Lab Time Now!s Lab Time Now!


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159

啟動化學工作站

Add License：添加或查看工作站軟體的License號碼

Agilent 1100 Series CDROM：維護光碟(安裝後才出現此功能表)

Configuration Editor：配置儀器

Installation Qualification：進行軟體的安裝認證

Instrument 1 Online：進入線上工作站，可以控制儀器

Instrument 1 Online：進入離線工作站，不可控制儀器

Readme.txt：提供參考資訊

Schedular：化學工作站的任務、日程安排


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160

啟動化學工作站

利用化學工作站的Tutorial功能可以極其方便地獲得線上的說明資訊。


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161

化學工作站Views功能表

Full menu/short menu切換

顯示當前日記本，察看錯誤資訊等內容

利用View功能表可以進行化學工作站五個工作介面的切換。

lMethod and Run Control：此介面為儀器控制介面，在此介面中主要進行方

法的編輯和運行，也可以進行序列的編輯和運行。

lData Analysis：此介面為資料分析介面，在此介面中主要進行資料處理功能

，包括圖譜最佳化、積分最佳化、建立校正表、設定報告格

式等功能。

lReport Layout：此介面為客戶化報告的編輯介面(本課程不涉及)。

lVerification (OQ/PV)：此介面為儀器性能確效介面(本課程不涉及)。

lDiagnosis：此介面為儀器性能測試、故障診斷和維護的介面。

注意：

•Full Menu：如果功能表中顯示Full Menu則表明當前處於Short Menu，可以

進入Full Menu。上圖中顯示Short Menu則表明已經處於Full Menu。

•Change Access Level：改變進入工作站的使用級別。如果使用密碼，注意

要選中提示框。千萬不要忘記密碼。

•ChemStation Schedular：使用時要注意儲存，否則工作站不予以執行。

•Logbook：自動記錄工作站的某些重大操作，經常用於故障診斷。


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162

化學工作站的Change Access Level功能

如果要使用密碼保護化學工作站，請選此選項

點擊View功能表下的Change Access Level，即可彈出右圖視窗，進行登錄化學工作站時的許可級別設置。如果要使用不同的許可級別管理並設置密碼，注意要選中圖中的選項，並牢記密碼。


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163

化學工作站Scheduler的使用

使用時要注意儲存，否則工作站不予以執行

點擊 View功能表下的 ChemStation Scheduler即可彈出右圖的 AgilentChemStation Scheduler窗口。輸入時間和對應的Command並點擊儲存圖示後即可使用Scheduler功能，化學工作站會在指定時間自動完成客戶所指定的命令。

您還可以規定該命令的執行模式：

•Do Once：僅執行這一次命令

•Do Daily：每天的同一時間都執行這一命令

•Do Weekdays：每個工作日(週一至週五)的同一時間都執行這一命令

•Do Weekly：每週同一時間執行一次這一命令

另外，點擊視窗中的？圖示可以查找各種化學工作站固有的命令。


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164

化學工作站Scheduler的使用

Result欄中可以顯示化學工作站執行Command的結果

在Result欄中，我們可以很方便地看到化學工作站是否執行了指定的命令：

•Accepted：完成了指定的命令

•Rejected：沒有完成指定的命令

另外請注意上圖的Scheduler中規定了工作日每天10:00都要執行Pumpall Off的命令，所以在2004年7月17日(週六)執行了關泵的命令後，自動生成了下一行命令，即在2004年7月19日(週一)上午10:00還要執行Pumpall Off命令。


165

165

查看Logbook

從View功能表選擇Logbook，單擊Current Logbook即可顯示當前Logbook的內容

儀器出現任何問題後，您的第一反應就應該是查看化學工作站的Logbook，檢查儀器故障所在。

除點擊功能表打開Logbook外，也可點擊Logbook的圖示，快速打開Current Logbook。


166

166

化學工作站Data Analysis介面

此介面為資料分析介面，在此介面中主要進行資料處理功能，包括圖譜最佳化、積分最佳化、建立校正表、設定報告格式等功能。本部分的功能將在本課程中詳細講解。


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167

化學工作站Report Layout介面

此介面為客戶化報告的編輯介面(本課程不涉及)，在LC Advanced課程中將詳細講解本介面功能和參數設置。


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168

化學工作站Verification(OQ/PV)介面

此介面為儀器性能確校介面(本課程不涉及)，本介面主要是為Agilent工程師進行儀器性能確效而準備的介面。


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169

化學工作站Diagnosis介面

此介面為儀器性能測試、故障診斷和維護的介面。在本課程的最後一天，將詳細講解本介面的功能。


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170

化學工作站五個介面的切換

進行化學工作站五個工作介面切換時，可以使用各個介面View功能表下的前五行功能表，也可以使用各個介面左上角的下拉視窗進行切換。


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171

圖形快捷介面(GUI)

滑鼠左鍵單擊任一模組圖示均可彈出快顯功能表

使用滑鼠左鍵單擊各個模組右下角圖示均可對該模組進行控制：開、關或實現基線歸零等功能

所有模組同時開、關控制

單擊任一圖示都可以進入該模組的參數設置功能表或模組控制功能表等介面。也可以通過點擊各個模組右下角的小圖示開啟、關閉該模組。

圖上的On、Off 按鈕分別對應打開、關閉所有模組。

注意：對於檢測器而言，其右下角的按鍵可以打開檢測器的燈，但不能實現關燈，在燈點亮的情況下點擊該鍵，僅可實現基線歸零。要關閉檢測器的燈，請使用Control功能表。


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172

圖形快捷介面——各個模組的控制

使用滑鼠左鍵單擊各個模組圖示，在彈出的功能表中選擇Control功能表，即可彈出右圖。在Control視窗中，您可以規定該模組的狀態：開、關或待機狀態(On、Off或Standby)，還可以設置定時打開該模組，或將當前方法中的參數設為系統故障時的默認安全方法。

上圖給出了泵的Pump Control窗口圖。注意Standby狀態與On、Off的區別：Standby狀態時，泵並不向系統提供流動相，與Off狀態類似，但是由Standby切換到On狀態的泵啟動速度更快，不需要進行泵的初始化。

自動進樣器、管柱控溫箱和檢測器不存在Standby模式。


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173

圖形快捷介面——溶劑瓶的填量

使用滑鼠左鍵單擊溶劑瓶，在彈出的功能表中選擇Solvent Bottles Filling選項，即可彈出右圖視窗。右上圖給出的是二元泵溶劑瓶填充量視窗。在各瓶的Actual Volume欄中填入當前溶劑瓶中的實際溶劑體積，在Total Volume欄中填入各個溶劑瓶的總容積。如果選中下半部分的兩個選項，則當溶劑瓶中剩餘溶劑的體積小於指定量(默認為0.1L)時，化學工作站會自動停止進樣分析；當溶劑瓶中剩餘溶劑量為零時，化學工作站會自動關閉整個液相系統，停止泵的運行，以防將氣泡吸入液相系統影響儀器性能。


174

174

圖形快捷介面——各種參數的顯示

點擊下拉功能表，可以分別顯示各種所需的參數：

LC採集參數、資料分析參數等，且便於客戶變更設定

如果某個參數設置不合理，可以直接點擊該參數，化學工作站會自動打開對應的參數設置畫面，以便於客戶進行參數的修改、設置。


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175

Instrument功能表簡介

設置各個模組的參數

開啟、關閉整個系統

查看儀器Firmware及序列號

查看、輸入層析柱資訊

使用了Wellplate自動進樣器才出現該功能表

對化學工作站進行儀器配置

從Instrument功能表下也可以設置各個模組的參數(Set up…)、開啟/關閉整個系統(System On/Off)、查看硬體的版本號及序列號(Revisions&Serial#)查看管柱資訊(Column)、配置儀器(Configure 1100 Access)。


176

176

選擇Instrument / More Pump/ Auxiliary功能表，即可彈出下圖視窗

泵的輔助功能

在該視窗可以設置:

泵的最大升流速率

泵衝程大小

溶劑的壓縮補償因數

一般不需要設置、改動該視窗的參數。上圖給出的是二元泵的Pump Auxiliary窗口。為了保證二元泵溶劑的流量和比例更加精確，可以分別輸入A、B溶劑不同的壓縮補償因數。點擊Help鍵，可以查找常見溶劑的壓縮補償因數。


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177

自動進樣器的延伸功能

利用自動進樣器的Configuration功能表，可以配置自動進樣器所使用的硬體，實現多次取樣的大體積進樣功能，進樣體積最大可以擴展到1.8ml（分析型自動進樣器）。

利用Reset Injector、Gripper Home、Release Vial等命令還可以完成自動進樣器的日常維護與診斷。


178

178

可變波長檢測器VWD的停泵掃描功能

進樣之前選擇VWD Scans功能表，打開VWD光譜掃描視窗

要利用VWD進行停泵掃描，得到樣品中某個化合物的吸收光譜，應該在進樣前先點擊View功能表中的VWD Scans功能表，以便打開VWD Scan的光譜視窗，線上地顯示所得的吸收光譜。


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179


進樣後，流動相流經容槽，給出層析基線訊號時，點擊More VWD功能表中的Blank Scan，掃描空白流動相的吸收光譜，如下圖所示

按照正常進樣方式進樣、運行方法後，觀察層析訊號視窗，當流動相流經容槽時，即層析給出基線訊號時，點擊Instrument功能表下More VWD中的Blank Scan功能表，掃描流動相的吸收光譜。注意觀察此時化學工作站的VWD儀器圖示。VWD圖示上出現黃色的雙箭頭，表明檢測器正在進行全波長範圍的光譜掃描。所得的流動相吸收光譜如下頁所示。


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180


掃描得到的流動相吸收光譜

上圖的VWD Scan光譜窗口給出了經Blank Scan後的流動相吸收光譜。


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181


出現層析峰時，點擊Sample Scan，掃描樣品峰的吸收光譜

時刻觀察層析訊號視窗(Online Signal視窗)，當出現層析峰時，表明某個化合物流經容槽，點擊Instrument功能表下More VWD中的Sample Scan功能表，掃描該化合物的吸收光譜。

注意：此時VWD掃描直接得到的吸收光譜應該是流動相和該化合物的混和光譜，因為此時容槽中不僅存在化合物，還存在流動相。但是化學工作站會自動扣除提前掃描所得的流動相空白光譜，給出單純化合物的吸收光譜，如下頁所示。


182

182


光譜窗口中給出扣除流動相吸收光譜後的樣品峰吸收光譜

VWD Scan視窗中給出了扣除流動相空白吸收光譜以後的樣品吸收光譜。本次停泵掃描的實驗示例中，我們把流動相的層析波動峰當作了樣品層析峰，所以進行光譜掃描時，給出的光譜是兩次流動相吸收光譜的扣除結果，近似於一條吸光度接近於零的直線。

VWD Scan視窗中的吸收光圖譜無法做為化學工作站的資料檔案儲存下來，如需儲存該吸收光譜，請先使用電腦鍵盤的“Prt SC”鍵，把當前電腦螢幕做為圖形拷貝到剪貼板中，然後把該圖形粘貼到畫圖軟體中，儲存成圖片，以便以後參考。

如果進行了停泵掃描，那麼當前這張層析圖(或者說是當前的層析資料檔案)就沒有使用價值了，該層析圖的滯留時間已經不能準確地反映各個化合物的滯留特性，層析峰也會發生變形，無法用於準確的定量計算。


183

183

層析管柱資訊的輸入

點擊Instrument功能表下的Columns功能表即可彈出右側層析柱資訊視窗。如果使用了管柱識別器，則化學工作站會自動識別當前所用的層析柱資訊和層析柱安裝位置。如右上圖上半部分所示，該層析柱為ZORBAX Eclipse柱，安裝在管柱控溫箱右側，該層析柱的進樣次數為41次等。同時，我們可以看到該層析柱的呆容積為2ml，化學工作站可以據此體積和當前流量，自動計算系統的呆時間。

如果沒有使用管柱識別器，那麼您可以利用右上圖的下半部分輸入層析柱資訊。當前所用的層析柱資訊輸入完畢後，滑鼠左鍵單擊Installed欄，將No改為Yes，即可讓化學工作站記住當前所用的層析柱資訊。

所有的層析柱資訊都會儲存在所採集的資料檔案中，如有需要可以在列印報告時將採集該資料時的層析柱資訊一併列印出來。


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184

l 方法中所包含的內容

l 如何編輯採集參數

l 如何填寫樣品資訊

l 如何顯示即時顯示檢測訊號

第十章方法的編輯、儲存

本章內容：


185

185

方法的組成：

l方法資訊(Method information)

l儀器參數/採集條件(Instrument/Acquisition)

l資料分析參數(Data Analysis)

l運行時間對照表(Run Time Checklist)

方法是一個參數集，它包括分析一個樣品所需要的所有參數：

資料採集參數、資料分析參數及命令或巨集指令等內容

方法的概念

方法由四部分組成，可以將方法形象地想像成為一本書，那麼，方法的四個組成部分就是書的四章內容，可以修改其中的任意一部分。


186

186

編輯方法

2.選擇Method功能表下的Edit Entire Method功能表，即可編輯一個完整的方法

1.選擇Method功能表下的New Method功能表，載入化學工作站的默認方法

Method 功能表下的Edit Entire Method是編輯一個完整方法的好的起點。一般說來，我們都會先載入化學工作站的默認方法Def_lc.m，在默認方法的基礎上編輯一個完整的新方法，以免改動其他客戶的方法。


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187

編輯完整方法的快捷圖示

點擊快捷圖示，同樣可以彈出下頁的完整方法編輯視窗，編輯完整方法

該圖示：書上畫了一支筆，表示用“筆”寫“書(方法)”，即表示對整個方法進行編輯、修改。


188

188

指定要編輯方法哪一部分內容

首先選擇所要編輯方法哪一部分內容。注意：不選擇某一部分內容，並不意味著方法中不含有該部分內容，而僅僅意味著本次對該部分內容不進行編輯，使用原方法中設置的參數。


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189

方法資訊 (Method Information)

方法資訊(Method Information)僅僅是一些描述性的文字資訊，可以按照自己的需求來輸入。


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190

儀器參數設置——四元泵的參數設置

從本頁開始，進入儀器參數設置部分。

Stop Time：是儀器停止採集資料的時間，並不是泵停止工作的時間。本例

中工作站僅採集0~10min的層析圖，10min後，不再採集資料，

但泵仍然繼續工作，向系統提供流動相。使用自動進樣器的客

戶一定要設置適當的Stop Time，以保證連續進樣的要求。

Post Time：是指一次運行結束後，到第二次進樣前的等候時間，該時間用

於系統為第二次進樣做好準備。例如：將不感興趣的雜質成分

流出層析柱，或等待系統中的流動相真正變成下一次進樣的

初始比例。做梯度流析時，一定要設置該數值。

Pressure Limits：壓力的上下限也要合理設置。壓力上限（Max）不要高於

管柱能夠承受的壓力最大值；而壓力下限（Min）的數值

一般比正常分析壓力低20bar左右。

Timetable：此處可以編輯梯度流析程式，規定溶劑比例變化方式。要注意

程式時間與Stop Time和Post Time之間的協調關係。


191

191

儀器參數設置——單元泵的參數設置

上圖為單元泵的參數設置介面，參數設置的要求與四元泵參數設置要求相同，只是此時只有一種溶劑可供選擇，也無法進行梯度流析實驗。


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192

儀器參數設置——二元泵的參數設置

上圖為二元泵的參數設置介面，參數設置的要求與四元泵參數設置要求相同，只是此時只有A、B兩種溶劑可供選擇。


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193

儀器參數設置——標準自動進樣器參數

標準的進樣體積為0.1~100μL。如果使用洗針功能，指定洗針所用的溶劑瓶號即可。其餘參數一般不需要改動。

選擇Use Injector Programs可以按照客戶的要求，實現程式進樣。

如果希望節省兩次進樣間的取樣間隔時間，可以選擇Optimization選項：

•Overlap Injection Cycle：在前一針樣品運行時，就提前把下一針樣品吸入

定量環中，做好進樣準備。要注意一定要改動後面的時間預設值，以

保證前一針樣品能夠順利進入液相系統，同時保證下一針樣品的擴散

最小。一般建議該時間選擇在上一針樣品Stop Time之前的1~2min。

•Prefetch Sample Vial：在前一針樣品運行時，就提前把下一針的樣品瓶抓

取到針座上等候，做好進樣準備。此時節省的時間比上種選項要少，

但沒有樣品擴散的風險。此時也要注意一定要改動後面的時間預設值

，以保證前一針樣品能夠順利進入液相系統，一般建議該時間選擇在

上一針樣品Stop Time之前的1~2min。

注意要保證Agilent 1100各個模組的Stop Time和Post Time的設置要一致，默認為As pump，即僅在泵的參數設置畫面規定這兩個時間即可。


194

194

標準進樣過程原理示意圖

Metering device

6-port valve

Sampling unit

From pump

To column

To waste

準備位置

抓取樣品瓶吸取樣品

進樣和運行位置

請熟悉整個進樣過程，理解為什麼在上一針採樣過程中就可以進行下一針樣品的提前準備。


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195

儀器參數設置—標準自動進樣器的程式進樣

點擊Use Injector Program選項，並單擊右側的Edit鍵，即可進入上圖的進樣程式編輯視窗，編輯客戶所需的進樣程式。


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196

儀器參數設置—Wellplate自動進樣器參數

新型Wellplate自動進樣器並不抓取樣品瓶，而是將樣品針移動到指定位置吸取樣品。使用該自動進樣器可以提高工作效率，實現高效率進樣分析。而且清洗自動進樣器進樣針時，可以使用Flushport中的流動液體清洗針的外側，保證了永遠使用乾淨的溶劑清洗樣品針，提高了樣品針的洗淨度。


197

197

儀器參數設置——管柱控溫箱參數

管柱控溫箱的左、右兩個加熱模組溫度可以單獨設置(相同或不同)，默認的設置是左右管柱控溫箱溫度相同。

如果安裝了管柱切換閥，還可以在此介面選擇使用哪一根層析柱進行樣品分析。


198

198

儀器參數設置——DAD檢測器參數

一定要清楚地掌握上圖視窗中的DAD各項參數設置要求，以便充分利用DAD並得到最佳靈敏度。

Signals視窗規定的是採集層析圖所需的參數，要求樣品的檢測波長Wavelength(Sam.)設在化合物的最大吸收波長處，且大於溶劑的截止波長20nm以上。參考波長Wavelength(Ref.)應設在樣品沒有吸收的地方，且越靠近樣品的檢測波長越好。另外，要求BW(Ref.) > BW(Sam.) > Slit，其中樣品的譜帶寬度BandWidth(Sam.)應約等於其紫外吸收峰的半峰寬。注意記得儲存所需通道的層析圖，否則層析資料將不被儲存。

Spectrum視窗規定的是採集吸收光譜時的參數。可儲存所需張數的光圖譜None, Apex+Baselines, Apex+Slopes+Baselines, All in Peak, Every 2nd Spectrum或All。若需要進行峰純度檢測或最佳化完全未知的樣品檢測條件，建議選擇All的模式。

Peakwidth的設定影響了層析圖的資料採集頻率，Peakwidth應略小於層析圖上最窄的層析峰的半峰寬。資料採集速率太快，則層析圖的毛刺過多，資料採集速率太慢，則所採集的資料點過少，造成層析峰變形，無法進行準確定量。


199

199

光學系統——DAD光路圖

鎢燈耦合透鏡氘燈

光源透鏡(消色差透鏡)

氧化鈥濾光片

支撐透鏡

容槽

光譜透鏡

光柵

二極體陣列

狹縫

DAD檢測器可以得到任一時刻各個波長下的吸光度值，即可以得到樣品在各個時刻的吸收光圖譜。

DAD檢測器可以方便地提取所需檢測波長下的層析圖。


200

200

儀器參數設置——VWD檢測器參數

VWD檢測器參數設置要求與DAD檢測器參數設置要求相似，但要簡單得多，主要注意樣品檢測波長和Peakwidth的設置即可。當然，您可以根據實際實驗的要求，在Timetable中進行波長切換。

點擊參數設置視窗右下角的Setup鍵，即可彈出右上圖的視窗，規定訊號的極性正負、光譜掃描波長範圍和Step等。此外，還可以指定是否在檢測器燈未點亮時運行方法正常運行。如果當前所編輯的方法為清洗層析柱的方法，那麼就應該選擇Enable Analysis When Lamp Is Off選項，以便清洗層析柱時關閉紫外燈，而清洗方法照常運行，節省紫外燈的工作時間，延長其使用壽命。


201

201

VWD光路原理示意圖

氘燈光源透鏡

濾光片（鈥玻璃/遮光）

入射狹縫

反射鏡1＃

反射鏡2＃

光柵

分光器

參比光電二極體

樣品光電二極體

容槽

從光路圖中可以看到，某一時刻，只能有一個波長的檢測光通過狹縫對樣品進行檢測，得到單張層析圖。


202

202

儀器參數設置——MWD檢測器參數

多波長檢測器MWD與DAD檢測器極其類似，其參數設置的要求完全類似與DAD參數設置的要求，甚至其光路設計都與DAD完全相同，兩種檢測器主要的差別在於主機板不同，MWD檢測器無法儲存光譜資料。


203

203

儀器參數設置——FLD檢測器參數

與使用DAD檢測器類似，使用螢光檢測器FLD時，您同樣可以同時設定多個激發波長或發射波長，以同時獲得多張層析圖。此外，您還可以同時採集、儲存激發光譜或發射光譜的資料，最終獲得三維圖譜資料，進行層析條件的最佳化和選擇。


204

204

螢光檢測器FLD示意圖

氙燈

激發光柵

發射光柵

透鏡

透鏡反射鏡

容槽

參比二極體

光電倍增管

狹縫狹縫

狹縫

散射器

利用螢光檢測器同樣可以獲得三維圖譜，根據所得的三維圖譜，可以進一步選擇最佳激發波長和最佳發射波長，最佳化層析實驗條件。


205

205

儀器參數設置——RID檢測器參數

使用折射率檢測器RID時，您可以更改層析圖的正負極性，以便翻轉原來所得的負峰；可以規定在分析結束後，自動切換到溶劑回收狀態，以節省流動相；可以規定開始運行方法時，自動進行系統的排放(Automatic Purge)，並規定排放時間。如果實驗進行過程中參考池中的流動相成分會發生變化，那麼建議選擇該選項。選中自動排放系統選項後，點擊運行方法時，會先排放整個系統一段時間(在時間視窗中指定)，然後等待一段時間(同樣在時間視窗中指定)，以保證基線穩定，隨後會按照本介面自動基線歸零的要求進行基線歸零，最後才會向系統中引入待測樣品進行數據採集。


206

206

折射率檢測器RID示意圖

1.流路入口

2.加熱器

3.熱交換器

4.樣品容槽

5.Purge閥

6.Recycle閥

7.廢液桶

8.參考容槽

9.溶劑瓶

折射率檢測器(Refractive Index Detector)的主要工作原理是利用光在不同介質中的折光係數不同，給出回應訊號。


207

207

選擇在方法中要執行的專案，或輸入需要使用的命令

運行時間表(Run Time Checklist)

雖然方法中規定了儀器採集參數、資料分析參數，但是否執行資料採集或資料分析，要服從運行時間對照表(Run Time Checklist)的規定。

除非有特殊要求，一般不建議選擇GLP、Method選項，選擇這兩種選項都會浪費電腦硬碟空間。

上圖實例中，方法運行結束後，會自動執行Standby命令，關閉整個液相系統。


208

208

從Method功能表選擇Save Method或Save Method as，以儲存或另存方法。也可以點擊儲存方法的快捷圖示直接快速儲存方法

儲存或另存方法

方法修改後一定記得要儲存或另存。


209

209

儲存或另存方法

每次儲存或另存方法時，都會彈出左圖視窗，請在其中輸入必要的方法修改歷史的描述資訊，以便日後察看該方法的發展、修改、最佳化的過程。點擊 Method功能表下的Method Change History功能表，即可看到下圖視窗，察看方法修改歷史。


210

210

選擇Online Signal視窗的監測訊號

從 View功能表, 選擇 Online Signals, 單擊 Change，在Edit Signal Plot視窗選擇要監控的訊號

在Online Signal視窗除了可以監測層析圖外，還可以同時監測泵的壓力波動曲線、溶劑組成變化曲線或柱溫變化曲線等儀器性能曲線。


211

211

Online Signal訊號顯示

使用滑鼠左鍵單擊紅色或藍色標題行，即可將Y軸顯示成對應的回應值和單位。


212

212

如果要採集單個樣品資料，點擊樣品瓶圖示或選擇RunControl功能表中的Sample Info…功能表，先輸入樣品資訊，然後再運行方法，採集資料。

樣品資訊包括：操作者姓名(Operator Name)，資料檔案命名方式(Data File)，樣品參數(Sample Parameters)及備註等內容。

運行方法、完成進樣分析

當觀測到Online Signal視窗中的層析基線穩定後，可以先填寫樣品資訊，然後進樣分析，採集樣品資料。

建議選用首碼加計數器的資料檔案命名方式，以防發生資料檔案覆蓋的情況，但首碼不要過長，否則可命名的檔就會太少。首碼加計數器共8個字元，作為資料檔案名。

瓶號如果空白，意味著要測定空白流動相的層析圖，即空白樣品。所以，即使是手動進樣器也應填寫一個瓶號，再單擊Run Method鍵。

•Sample Amount(樣品量)：該值僅用於外標百分比法(ESTD%)和內標百分

比法(ISTD%)的定量計算。

•ISTD(內標量)：用於內標法(ISTD)和內標百分比法(ISTD%)的定量計算。

•Multiplier、Dilution：分別為乘數因數和稀釋因數，兩者選用一個即可。

在正式給出報告前，工作站會自動將所得結果分別乘以這兩個數值，然後再給出計算結果。


213

213

第十一章圖譜最佳化

本章內容：

•圖譜載入

•圖譜最佳化

•圖譜加標注

從本章開始介紹化學工作站的資料分析參數，所有內容都是在化學工作站的Data Analysis介面下實現的。


214

214

載入資料檔案

在Data Analysis介面，File功能表下選擇Load Signal。

可以從File Information中查看資料的資訊。也可以在載入資料的視窗中指定載入哪一張層析圖。


215

215

載入資料檔案時使用Signal Details的規定

如果使用DAD檢測器，同時採集多張層析圖時，一般要使用Signal Details的規定，指定載入資料時僅載入、分析哪一張或哪幾張層析圖。當多個檢測器串聯同時採集層析資料時，也經常使用此處的規定，有選擇地載入資料、分析資料。


216

216

圖譜顯示的參數最佳化

利用Signal Options功能表，可以進行層析圖顯示的最佳化。

本視窗中最重要的參數是最佳化層析圖顯示的量程範圍(Ranges)。

•Full：保證層析圖上最高峰滿刻度顯示，適用於一般的液相層析資料；

•Use Range：可以自行規定顯示的時間軸和回應值範圍；

•Auto Scale：自動最佳化層析圖縱坐標的顯示範圍，一般會保證層析圖上

第二高的層析峰滿刻度顯示，常適用於氣相層析資料。

在本視窗還可以更改層析圖上標注的類型、標注的字體及顏色、多張層析圖的顯示方式等。

此處的規定影響到最終在報告上的圖譜顯示結果，而下頁講述的快捷列更改的參數僅僅影響到當前視窗的顯示，對最終報告中的圖譜顯示沒有影響。


217

217

圖譜最佳化的快捷列

點擊該圖示，彈出右側圖譜最佳化快捷列

首先點擊Data Analysis介面中的快捷圖示，就可以在圖譜視窗的右側彈出圖譜最佳化工具欄。從上至下，各個圖示含義分別為：

•設置文字標注的字體、樣式

•在圖譜上添加文字標注

•在圖譜上添加線形標注

•移動圖譜上所添加的文字標注、線形標注或WMF圖形標注

•刪除圖譜上所添加的文字標注、線形標注或WMF圖形標注

•在圖譜上添加WMF格式的圖形標注

•多張層析圖分開顯示或重疊顯示的切換鍵

•多張層析圖使用同一尺寸顯示或各自滿量程顯示的切換鍵

•是否顯示化合物名稱的切換鍵

•是否顯示化合物滯留時間的切換鍵

•是否顯示圖譜基線的切換鍵

•是否顯示圖譜標題資訊的切換鍵

•是否顯示圖譜坐標軸的切換鍵

•列印當前視窗中的圖譜

•將當前視窗中的圖譜拷貝到剪貼板中


218

218

進行文字標注設置：

l字體和字型

l字體大小

l字體顏色、旋轉角度等

圖譜最佳化的功能表選項

不使用前頁所述的圖譜最佳化快捷列，也可以從Graphics功能表下找到對應的圖譜最佳化命令行。例如：上圖中點擊New Annotation即可彈出對應的添加文字標注的視窗，進行文字標注的輸入。如果在Enter New Text Annotation視窗中點擊Options選項，也可以更改本次所添加的文字標注的字體、大小、顏色、旋轉角度等。


219

219

圖譜處理工具

1. 切換到圖譜處理介面2. 得到圖譜處理圖示

首先點擊層析圖Data Analysis介面左上角第三個圖示，將介面切換到圖譜處理介面，就可以在介面的右上方找到對應的圖譜處理圖示。

注意：這幾個圖譜處理圖示的功能是無法在工作站功能表中找到的。各個圖

示的功能分別為(從左至右)：

左下方圓圈中：設置時間參考點、移動時間參考點、刪除時間參考點、刪

除當前顯示的圖譜。

右上方圓圈中：按照時間參考點進行橫軸對齊、縱軸對齊、圖譜復原、進行

多張圖譜的三維類比顯示、兩張圖譜進行鏡像顯示、兩張圖

譜進行差減顯示、進行圖譜積分(此功能可以通過Integration

功能表下的Integrate命令完成)。


220

220

•如何進行自動積分

•如何進行積分參數設置

•如何使用手動積分

本章內容：

第十二章積分參數最佳化


221

221

自動積分的過程

•檢查層析峰開始和結束區域，確定噪音

•賦予初始Slope Sensitivity和Height Reject值

•對第一次積分賦予一個臨時峰寬值

•設置Area Reject為0

•執行測試性積分，有可能重複幾次

•基於較早流析出的層析峰寬計算峰寬值

•最佳化Slope Sensitivity和Height Reject

•由初始的峰寬和噪音水準計算Area Reject值

點擊Integration功能表下的Auto Integrate命令，或點擊上圖所示的自動積分圖示，化學工作站即可對當前層析資料進行自動積分。如果自動積分的結果不能夠滿足客戶需要，可以由客戶自行設置積分參數，重新積分，詳細介紹見下頁。


222

222

積分參數設置——積分事件表

積分參數初始值

訊號選項框

高級基線選項

是否自動使用手動積分參數

點擊Integration功能表中的Integration Events選項，或者單擊上圖所示的快捷圖示，即可打開積分事件表，進行積分參數的修改、設置，或添加時間性的積分事件。

積分參數表的初始五行參數含義如下：

•Slope Sensitivity：斜率靈敏度

•Peak Width：峰寬靈敏度

•Area Reject：峰面積最小值

•Height Reject：峰高最小值

•Shoulders：肩峰處理方式選擇。 Off(不識別肩峰)、Tan(按切線方式分離

肩峰)、Drop(按垂直方式分離肩峰)。

注意：Slope Sensitivity和Peak Width的數值改動要慎重，因為選用不同數值，將影響層析峰起止點的識別，得到不同的峰面積，進而影響到所得定量結果的準確程度。一定要保證處理同一系列資料(各個標樣資料和未知樣品資料)時，這兩個參數值是一致的。

Area Reject和Height Reject僅僅是層析峰的判斷依據，其數值大小不會影響所得峰面積。


223

223

高級基線模式對峰的處理方式

12 13 14 15 16 17 18 19 20

Abs

orba

nce

Time [min.]

Options OffAdvanced IntegrationOptions On

Advanced Integration

Peak

Baseline

Peak

AreaUnassigned

啟用Advanced Baseline後，工作站對層析圖的基線處理方式就有所不同。


224

224

積分事件表

添加積分事件

刪除積分事件

積分工具欄(詳見下頁)

通過添加、刪除積分事件，可以進一步最佳化積分。

請掌握指定基線起止點(Baseline Now)、峰面積加和(Area Sum)、積分器開啟/關閉(Integration on/off)等功能。


225

225

1.切換到積分介面

按當前積分參數對當前層析圖進行積分進行自動積分

進行積分參數設置

設置Baseline Now

設置Baseline Hold

設置切線撇去拖尾峰

設置積分器開關設置斜率靈敏度

設置最小峰面積

設置固定峰寬

設置肩峰檢測模式

積分工具欄 (積分事件表打開的狀態下)

點擊Data Analysis介面中左上角第一個圖示，切換到積分介面。在積分事件表打開的狀態下可以看到上圖所示的各種快捷圖示，其具體含義如上所示。


226

226

1.將積分事件儲存到方法中

儲存積分參數

2.儲存方法

注意：積分事件表中的積分參數並不是孤立於方法的參數，它們屬於方法的一部分內容，所以儲存積分參數時應先將積分事件儲存到方法中，然後再儲存方法，積分參數就會被儲存下來。


227

227

手動積分畫基線

手動積分負峰

手動積分切線撇去

手動積分裂分峰

手動積分去除峰

積分工具欄 (積分事件表關閉的狀態下)—手動積分工具欄

如果自動積分和利用積分事件表設置積分參數都不能滿足客戶積分的具體要求，那麼退出積分事件表，即可看到上圖所示的手動積分工具欄，您可以使用手動積分的功能進行積分條件最佳化。

一般說來，各個層析資料的滯留時間不能完全吻合，所以不建議儲存手動積分參數。


228

228

手動積分

在Integration功能表下同樣可以找到如下手動積分命令：

•Draw Baseline：手動畫基線

•Negative Peak(s)：對負峰積分

•Tangent Skim：切線方式去除拖尾峰

•Split peaks：劈裂層析峰

•Delete Peak(s)：刪除層析峰

•All Valleys：峰谷積分

把手動積分參數儲存到方法中

使用方法中的手動積分參數

刪除方法中的手動積分參數

可以通過前頁所說的手動積分快捷鍵完成手動積分，也可以從功能表中找到手動積分功能功能表。

手動積分不能被直接儲存到方法中！也不建議儲存手動積分參數！！


229

229

峰起止點符號

B 基線 P 基線滲透

V 峰谷點 H 水準基線

M 手動積分 T 切線撇去

其他符號

+ 參考峰 I 內標峰

A+ 面積加和峰 N 負峰

S 溶劑峰

警示符號

+ 高於含量上限－低於含量下限

可以參考《瞭解您的化學工作站》一書中的內容

積分結果和峰類型符號

積分結果中Type欄給出的是峰類型，其中常見符號的含義如上所示。


230

230

基線符號

B BB B

B=基線

B V B

V=峰谷點

B P B

P=基線滲透

B H H

H=水準基線


231

231

第十三章校正及定量基礎

本章內容:

•校正的概念

•校正的必要性

•如何進行校正

•工作站中各種定量方法的原理


232

232

• 校正即是利用某個峰的峰高或峰面積來確定其對應成分的濃度或含量

• 當檢測器靈敏度針對不同的成分而變化；及檢測器對同一成分不同含量回應值發生變化時須做校正

校正的概念及校正的必要性

可以回憶、對照利用座標紙繪製工作曲線的過程，工作站的校正、定量過程與之完全類似。


233

233

•首先準備一個混合標樣，其中感興趣成分的濃度須準確知道

•運行標準樣品

•建立校正表

•運行待測樣品並使用校正表分析它

•需要時進行再校正

校正的過程

1.感興趣成分即欲分析、定量的成分（化合物）

2.標樣最好是混合標樣，即將各個化合物的純品事先混和，配成混和標樣

3.“需要時進行再校正” ，理解“需要時”的含義：使用控制樣品Control Sample衡量工作曲線是否仍然適用，是否需要再校正。


234

234

•對每一峰只做一次校正

•單級校正中做了如下假設：

回應因數不會因為某峰對應物質的含量變化而發生變化

回應曲線須通過原點

單級校正

單級校正：即單點校正、單點法。僅有一個濃度的標樣，無論進樣幾針取平均值，只要濃度相同，都相當於只做一次校正。

單點校正的兩種假設都不合理，使得單級校正定量結果不準確。但其具有簡單、快速的優點，常適用於以下情況：

1.做簡單的粗定量

2.當未知樣品的濃度小於且接近於標樣濃度時，所得定量結果較準確

3.主要用於檢出實驗，即不需要準確定量未知樣品含量


235

235

單級校正工作曲線

含量

回應值

(A或H)


236

236

•對每一峰需做至少兩次校正

•可以補償檢測器對不同含量的樣品成分而給出非線性回應

•回應曲線可以不通過原點

多級校正

多級校正糾正了單級校正的缺點，可以進行準確定量。


237

237

•首先準備一個混合標樣，其濃度應高於欲分析物濃度

•將濃標樣等梯度稀釋，運行每一級稀釋好的標樣

•在每一級上進行校正

•繼續稀釋混合標樣，使其包含感興趣樣品的濃度範圍，並輸入每一級

對應的含量值

•運行待測樣品並使用校正表分析它

•需要時進行再校正

多級校正的過程

一定先準備一個濃度高於未知樣品濃度的濃標樣。而且最終標樣的濃度範圍應包含未知樣品的濃度。


238

238

多級校正工作曲線——分段連接(Piecewise)

含量

回應值

(A或H)

如果其他回歸所得定量結果都不準確，可嘗試採用此方式回歸。


239

239

多級校正工作曲線——線性回歸(Linear)

含量

回應值

(A或H)

利用最小二乘法進行線性回歸是最常用的回歸方式。


240

240

多級校正工作曲線——非線性回歸

含量

回應值

(A或H)

含量

回應值

(A或H)

工作站提供了多種非線性回歸方式，可以按需選擇。


241

241

在這一節中您將學習：

•各種不同定量方法的概念

•每一種定量方法固有的假定

•明白在選擇定量方法時須考慮的各種因素

•觀察選擇不同定量方法時定量結果的差異

化學工作站的定量方法


242

242

•百分比法PERCENT

•歸一化法NORM%

•外標法ESTD

•內標法ISTD

•外標百分比法ESTD%

•內標百分比法ISTD%

化學工作站的六種定量方法

如上所示，化學工作站提供的定量方法共有六種。


243

243

AREA(pk)

AREA% = ×100%

ΣAREA(pk)

假定

檢測器回應都相同

所有成分都流出

所有成分都被檢測到

優點缺點

無需做校正以上所有的假定

簡單、快速的定量過程需測量所有的成分

進樣量不要求嚴格所有的面積都必須準確

面積百分比法 (PERCENT)

百分比法常用於粗定量，或用於成分簡單、結構相似的混合物分析，以及無法找到標準樣品時的分析。

百分比法也可用於科研中的探索性研究以及平行比較實驗（如：比較不同產地的枸杞子中有效成分的含量多少）。


244

244

面積百分比法舉例

面積值面積百分比法%

C12 280 26.2%

C14 250 23.4%

C16 220 20.6%

C18 320 29.9%

----------- ------------

1070 100.1%

使用面積百分比法分析某脂肪酸甲酯未知樣品中C12, C14, C16, C18的含量

本例為未知樣品的定量結果。


245

245

校正因數(RF)的概念

絕對校正因數 RF = 含量/面積

•RF值與成分的含量及其它成分的存在無關

•在分析條件一定的條件下，RF為物質的特性

•RF值可以校正檢測器回應

含量 100 100 200面積 3000 2500 4000

通過引入RF值，校正不同樣品對檢測器的不同回應，可以克服百分比法的致命缺陷。


246

246

校正因數計算舉例

標樣量面積值 RF

C12 25ng 250 25/250=0.100

C14 25ng 290 25/290=0.086

C16 25ng 330 25/330=0.076

C18 25ng 370 25/370=0.068

樣品為含C12, C14, C16, C18均為25ng的脂肪酸甲酯標樣

本例為使用標準樣品資料計算校正因數RF值。


247

247

歸一化法(NORM%)

RF(pk) x AREA(pk)

NORM% = x100%Σ[RF(pk) x AREA(pk)]

假定

所有成分都流出

所有成分都被檢測到

優點缺點

進樣量不要求嚴格所有成分峰都要流出

需測量所有的成分

必須校正所有的峰

歸一化法的致命缺點是需要尋找所有層析峰的標樣、校正所有的層析峰、計算所有層析峰的RF值。


248

248

脂肪酸甲酯歸一化法舉例

AREA RF RFxAREA NORM% AREA%

C12 280 0.100 28.0 31.8% 26.2%

C14 250 0.086 21.5 24.4% 23.4%

C16 220 0.076 16.7 19.0% 20.6%

C18 320 0.068 21.8 24.8% 29.9%

88.0 100% 100.1%

使用歸一化法對脂肪酸甲酯未知樣品進行定量


249

249

外標法（ESTD）

含量＝面積(pk) x RF(pk)

假定

待測成分在標樣中和未知樣中的RF值相同

優點

可以校正檢測器的回應

只對欲分析的成分峰做校正

無需所有峰都能被檢測到

缺點

進樣量必須準確

儀器必須有良好的穩定性

需定期做再校正

定量的前提假設是：標樣中、未知樣品中待測成分的RF值相同。

使用外標法時，必須保證進樣量準確！！！除非使用手動進樣器的滿刻度進樣模式(即使用定量環進樣)，否則不推薦利用手動進樣所得資料進行外標法定量。

要求儀器必須具有良好的穩定性，而且應定期進行再校正，否則標樣中和未知樣品中RF值不相等，就無法進行準確定量。


250

250

ESTD法計算舉例

面積值 RF 含量

C12 280 0.100 28.0ng

C14 250 0.086 21.5ng

C16 220 0.076 16.7ng

C18 320 0.068 21.8ng

使用外標法分析與前例相同的脂肪酸甲酯未知樣品


251

251

內標法（ISTD）

面積(pk) x 含量(ISTD) x RF(pk,標樣)

含量(pk) ＝面積(ISTD) x RF(ISTD,標樣)

假定

RF值的比值(相對RF值)恒定

優點

進樣量不嚴格要求

只對欲分析的成分峰做校正

校正檢測器的回應

缺點

必須加一個成分進到樣品

內標法認為RF值的比值恒定，消除了外標法對儀器穩定性和進樣量的嚴格要求。

內標法的缺點是在標樣和未知樣品中都要加入內標化合物，而且引入的內標量必須相同、準確。

注意：內標法工作曲線的橫、縱坐標分別為含量比(Amount Ratio)和面積比(Area Ratio)；而外標法工作曲線的橫、縱坐標分別為含量(Amount)和面積(Area)。


252

252

ISTD法計算舉例

Area標 RF標 Area未 RF未含量ESTD 含量ISTD

C12 250 0.100 280 0.110 28.0ng 30.8ng

C14 290 0.086 250 0.094 21.5ng 23.5ng

C15 310 0.081 280 0.089 (22.7ng) 25.0ng

C16 330 0.076 220 0.084 16.7ng 18.4ng

C18 370 0.068 320 0.075 21.8ng 24.0ng

脂肪酸甲酯標樣中C12, C14, C16和 C18四種成分含量均為25ng。

脂肪酸甲酯未知樣、標樣中均加入內標化合物(C15)，加入量為25ng。


253

253

選擇內標物的標準

1. 樣品中不存在

2. 可迅速容易得到

3. 化學性質與樣品相似

4. 與樣品有相似的響應值(濃度範圍)

5. 不會與樣品發生反應

6. 在感興趣成分附近流出

7. 可得到分離良好的、乾淨俐落的峰

8. 層析性質穩定

如果需要，也可使用、加入多個內標物，用於內標定量。

要注意內標和樣品應具有相近的濃度範圍，以得到相近的回應值。


254

254

各種定量方法比較

AREA% NORM% ESTD ISTD

C12 26.2% 31.8% 28.0ng 30.8ng

C14 23.4% 24.4% 21.5ng 23.7ng

C16 20.6% 19.0% 16.7ng 18.4ng

C18 29.9% 24.8% 21.8ng 24.0ng

使用不同的定量方法，同一個未知樣品的定量結果也有所不同


255

255

各種定量方法總結

優點缺點

AREA% 無需校正檢測器的回應必須一致進樣量不嚴格要求所有成分峰都需流出

所有成分峰都需被檢測到所有面積都需準確

NORM% 進樣量不嚴格要求所有成分峰都需流出所有成分峰都需測定必須校正所有的峰

ESTD 校正檢測器的回應進樣量必須準確只對感興趣峰做校正儀器需有很好穩定性無需所有峰都流出無需所有峰都被檢測到報告可選擇各種含量單位

ISTD 進樣量不嚴格要求必須在所有樣品中加入只對感興趣峰做校正一個成分校正檢測器的回應樣品和標樣的準備工作報告可選擇各種含量單位


256

256

採樣前在 Sample Info中輸入Sample Amount.

而且選擇對應的報告格式ESTD%或ISTD%

外標百分比法、內標百分比法

外標百分比法和內標百分比法是在外標法或內標法的定量基礎上，用所得化合物的含量除以樣品總含量，得到該化合物的百分含量。上圖的樣品資訊參數的詳細介紹參見第212頁備註。


257

257

• 如何建立外標法、內標法校準曲線

• 如何進行校正設置(Calibration settings)

• 如何進行再校正(Recalibrate)

本章內容:

第十四章建立校正表

本章給出了在工作站中實現定量的操作步驟。


258

258

•配置多級別標準品濃度，然後逐一進樣分析，採集標準品資料檔案

標準品濃度範圍要包含未知樣品濃度

•載入低濃度標準品資料，最佳化圖譜顯示

•最佳化積分參數，獲得滿意的積分結果後儲存積分事件到方法

•從Level 1開始做校正曲線

•逐個對每個標準品進行最佳化圖譜，最佳化積分後，分別加入校正表

•檢查校正曲線，把校正表和校正曲線存入方法

建立校準表的過程概述

上圖給出了建立校正表的過程概述。


259

259

指定用於定量的層析訊號(Signal Details)

可以先從Calibration功能表選擇Signal Details，規定該方法使用哪一張層析資料進行定量分析。(從File功能表下，Load Signal選項中也可以進入Signal Details畫面)。

如果使用DAD檢測器，同時採集多張層析圖時，一般要使用Signal Details的規定，指定載入資料時僅載入、分析哪一張或哪幾張層析圖。當多個檢測器串聯同時採集層析資料時，也經常使用此處的規定，有選擇地載入資料、分析資料。


260

260

進行校正設置Calibration Settings

在完成整個校正參數設置之前必須完成校正設置。

在校正設置視窗中重點設置樣品濃度單位、工作曲線類型及原點處理態度。另外也可以補救、更改錯誤的樣品資訊(尤其要確認未知樣品中的內標含量)和默認滯留時間視窗寬度(用於峰的識別、定性)。

如果您進行內標法實驗，而且是在進樣前直接向樣品中添加內標，那麼請不要選擇最下方的ISTD Correction選項。如果是在原始樣品中添加了內標，也就是說把內標和樣品同時進行稀釋、濃縮處理，請選中該選項。


261

261

載入標準品資料進行積分參數最佳化

首先，載入低濃度的標樣資料，進行積分最佳化。參見積分參數最佳化一章的講解。


262

262

建立一級校正曲線

然後，選擇Calibration功能表下New Calibration Table，按照默認方式選擇自動建立新的校正表，單擊OK鍵。

當使用歸一化法定量時，可以選擇是否單獨對各個通道訊號進行歸一化(Calculate Signals Separately)。


263

263

填入:化合物名稱化合物含量

選擇:參考峰內標峰內標峰號

校正表的建立

在秀出的校正表中，重點輸入化合物的名稱、含量。

如果進行內標法定量，還需要指定內標峰、內標峰編號，並確認未知樣品中的內標含量。

如果滯留時間漂移較大，可以指定參考峰(Ref.)以幫助化學工作站完成層析峰的定性識別。

參考峰的設置原則是：

1.如果有內標峰，則以內標峰為參考峰。

2.如果沒有內標峰，則以居中的峰為參考峰。

注意：如果使用內標法或內標百分比法定量，一定要指定內標峰，否則化學工作站會警告內標化合物遺失，無法完成定量。


264

264

在校正表中添加第二級標準品資料

3.依次輸入二級標準品含量

1.載入二級標樣數據 2.選擇Calibration>>Add Level

載入第二個濃度的標樣資料(如有必要，還可以再次進行圖譜最佳化、積分最佳化)，選擇Calibration功能表中的Add Level，在校正表中分別輸入第二級標樣中各個化合物的含量。


265

265

在校正表中添加更多濃度級別標準品資料

線性相關係數

按上述方式，在校正表中逐級添加各個濃度的標樣資料。從視窗右下角的小圖中看到所得工作曲線及其線性相關係數。


266

266

儲存方法，即可將校正表儲存起來

儲存校正表

校正表編好後，也要作為方法的一部分存入方法。


267

267

進行定期再校正

當控制樣品的濃度超出允許的誤差範圍時，就需要進行再校正

再校正方法如下：

•採集所需濃度的標樣資料

•在資料分析介面載入此資料檔案

•在Calibration功能表下，選擇Recalibrate…

•在彈出的視窗中選擇該資料對應的濃度級別，並規定再校正的方式(Average

或Replace)，單擊OK即可。化學工作站會自動進行再校正。

如果需要再校正，只要載入適當的標樣資料，選擇正確的再校正級別和再校正模式即可。

再校正的模式分為平均和取代兩種。


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268

第十五章設定報告格式

• 如何指定報告的定量模式

• 如何指定報告的輸出方式

• 如何選擇各種報告類型

本章內容:


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269

報告參數的設定

從Report功能表下選擇Specify Report即可進入報告參數設置介面。

本介面重點選擇合適的定量方式(Quantitative Results)、報告的輸出位置(Destination)及報告類型(Style)。

此外，在輸出報告前還可以進行圖譜參數的設置(Signal Options)。


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270

報告輸出位置的選擇

報告可以輸出成下列格式的檔案：

.TXT—只輸出報告的文本內容，以純文

本形式輸出

.WMF—將報告以WMF圖形檔形式輸出

.DIF—將報告以資料交換檔(DIF)形式輸

出，可以用Excel等程式打開該檔案

(Data Interchange Format)

.CSV—將報告以逗點分隔資料庫檔案(CSV)形式輸出，可以用Excel等程式打開該檔(Comma Separated Values)

.XLS—將報告以EXCEL檔形式輸出

.HTM—將報告以超文字檔案形式輸出可以使用IE瀏覽器打開該檔

定量報告可以直接在印表機上列印輸出、也可以顯示在電腦螢幕上或者以檔案的形式輸出

定量報告的輸出方式有多種，要選擇適當的輸出位置。


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271

定量方法及報告類型的選擇

NoneShortDetailHeader + ShortGLP + Short

GLP + DetailShort + SpectrumDetail + SpectrumFullLibrary Search

PerformancePerformance + NoisePerformance + Library SearchExtended Performance

六種定量方法的選擇

報告類型的選擇

• 百分比(Percent)• 外標法和外標百分比法(ESTD、ESTD%)• 歸一化法(Norm%)• 內標法和內標百分比法(ISTD、ISTD%)

化學工作站提供了13種默認的報告類型。

•Short為常用報告格式

•Detail報告可以給出工作曲線

•Performance報告可以給出柱效、選擇性、分離度等系統性能資料

•Performance+Noise報告可以給出各個層析峰的S/N比(要額外選擇Report功能表下的Edit Noise Range指定噪音的範圍)


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272

儀器參數曲線編輯

點擊Report功能表下的Edit Instrument Curves選項，可以在彈出的視窗中選擇要在報告中顯示的儀器曲線。

(也可以在File功能表下Load Signal介面中找到Instrument Curves選項。)


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273

報告參數的儲存

報告也是方法的一部分內容，需要儲存到方法中去，所以儲存方法即可將報告參數儲存下來。


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274

列印報告

直接在印表機上輸出報告

預覽報告

按照指定方式輸出報告

使用Report功能表中的Print Report命令，會按照報告輸出方式的設置要求將報告列印到指定位置。

使用印表機圖示快捷鍵則可以直接將報告在印表機上列印出來，而不服從報告輸出位置的規定。

如果方法還不成熟，建議先使用列印預覽圖示，預覽所得報告效果。


275

275

報告快捷圖示

1.切換到定量介面

2.設定報告參數

3.預覽報告

4.直接列印報告

使用圖示可以快速地進行參數設置。


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276

第十六章故障診斷與系統維護

l 儀器詳細結構和資訊

l 如何顯示、輸入日記(Logbooks)資訊

l 預先維護回饋EMF(Early Maintenance Feedback)功能

l 內置的儀器診斷功能

l 如何使用維護光碟

本章內容：


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277

診斷介面（Diagnosis）

利用工作站的診斷介面可以線上地進行儀器硬體的診斷、測試。


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278

•選擇Update Variables Display可以顯示某一模組的詳細資訊，例如該模組的Firmware版本、該模組的序列號等

•選擇Show Module Details可以顯示該模組的結構圖

•選擇Show Module Tests可以進行該模組的性能測試

更新顯示模組資訊


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279

更新顯示模組資訊


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280

顯示模組結構圖和日記Logbooks

點擊Show Module Details，可以顯示該模組的結構圖。點擊視窗右方的Logbook圖示，選擇Update Variables Display，即可查看各種Logbook，如隨後幾頁所示。重點掌握維護日記輸入，選擇Maintenance Logbook Entry，即可在完成該模組維護後輸入維護資訊。


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281

Error Logbook

Error Logbook顯示的是系統出錯資訊。


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282

Runs Logbook

Runs Logbook記錄了各次運行的起止時間。


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283

Maintenance Logbook等日記檔儲存在各個模組的主機板中

Maintenance Logbook

Maintenance Logbook記錄了所有的硬體維護資訊，更換硬體時要注意輸入正確的資訊。


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284

各個模組的性能測試功能

滑鼠左鍵單擊某個模組的圖示，在秀出的功能表中選擇Show Module Tests即可彈出下方Test Selection視窗中選擇需要進行測試的模組及需要測試的專案。點擊Start鍵，即可直接按照化學工作站默認的標準測試步驟執行儀器性能測試。


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285

泵的測試項目選擇

泵的測試項目為：

•壓力測試(Pressure Test)：測試整個系統(不包括檢測器)是否洩漏

•洩漏測試(Leak Test)：僅測試泵系統是否洩漏


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286

自動進樣器的測試項目選擇

自動進樣器的測試包括進樣步驟測試和機械手臂校準兩項。進樣步驟測試的測試方式見下頁，而機械手臂校準一般不需要客戶自己執行，以防發生自動進樣器機械手臂的定位錯誤。


287

287

自動進樣器的進樣步驟測試

使用進樣步驟測試可以分步檢查自動進樣器整個進樣過程中哪一步驟出現了故障。


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288

自動進樣器的維護

進入自動進樣器的維護畫面更換自動進樣器的進樣針和針座毛細管。


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289

DAD檢測器的測試項目選擇

待檢測器的氘燈和鎢燈點亮一段時間，能量穩定後，才可以進行DAD檢測器的測試。常用的測試項目有：

•DAD Intensity Test：測試各個波長範圍內的光源強度

•DAD Holmium Test：使用檢測器內置的氧化鈥玻璃進行波長準確度測試

•DAD Cell Test：測試檢測器容槽的潔淨程度

•DAD WL Calibration Test：測試紫外燈的發射光波長是否準確

進行DAD Cell Test時，容槽內需要充滿純水以消除流動相吸收的影響。一般說來，測試結果為>0.6，表明容槽很乾淨；如果測試結果<0.2表明容槽很髒，需要徹底清洗。


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290

DAD檢測器的維護——波長校正

如果DAD檢測器的波長不準確，需要進行波長校準，請按如下步驟進行，對應視窗畫面如上圖所示：

•先選擇Maintenance功能表下DAD Calibration命令

•按要求取出DAD容槽，然後單擊彈出視窗中的OK鍵

•等待檢測器自動完成波長校準測試，測試結果見下頁


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291

DAD檢測器的維護——波長校正

如果發現波長偏差較大，可以單擊上圖中的Adjust鍵，DAD檢測器即可自動完成波長校準。如果發現波長偏差不大，不需要進行校準，也可以直接點擊上圖中的OK鍵，退出本視窗。


292

292

VWD檢測器的測試項目選擇

和DAD檢測器類似，VWD檢測器也經常進行如下測試：

•VWD Holmium Test

•VWD Intensity Test

•VWD WL Calibration Test

•VWD WL Recalibration Test

•VWD Cell Test


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293

VWD檢測器的維護——波長校正

與DAD檢測器類似，進行VWD波長校準時，如果需要進行校準，請單擊Adjust鍵，再單擊OK鍵退出，否則直接單擊OK鍵退出即可。


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294

•點擊EMF圖示，可以在右側EMF Info Pad中顯示EMF資訊。點擊下拉窗，可以分別選擇各個模組。

•基於儀器的使用情況，計畫儀器維護的週期。

•根據以前的使用經驗，輸入需要維護的限制值( limits)

•當實際值達到需要維護的限制值時，EMF圖示上的綠色對勾標記變成黃色問號。

預先維護回饋（EMF）

EMF可以幫助客戶更好地、有計劃地瞭解、維護儀器狀況，延長儀器使用壽命。限定值根據客戶的實際使用情況來設置，一般設為各個元件實際使用壽命的80%左右。


295

295

1. 從左側下拉功能表中尋找分析過程中您所遇到的問題。

2. 在右側的下拉功能表中，選擇可能的儀器硬體原因。

3. 按下方Possible Causes的提示進行各個模組的測試。

分析問題診斷

化學工作站所給出的僅僅是儀器硬體原因，當遇到分析問題時，首先應考慮的是是否當前的採集、分析方法設置不合理。


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296

Agilent 1100維護光碟

從隨機贈送的維護光碟上可以查到Agilent 1100各個模組的維護方法和步驟、各個元件的Part Number、各個元件的結構示意圖等資訊。


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297

第十七章日常維護與常見層析故障

l 日常維護保養HPLC的注意事項

l 溶劑及樣品的準備

l 層析柱的保護方法

l 系統初始化及平衡方法

l 常見層析故障的原因及解決方案

本章內容：


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298

使用HPLC級的溶劑

過濾裝置

真空

過濾溶劑的目的：

防止固體顆粒損傷儀器或管柱頭端

過濾溶劑的裝置：

使用可以使用過濾裝置，用孔徑<0.5μm的濾膜

溶劑準備——溶劑的過濾

以下要講解的是日常維護需要注意的事項。

如果能夠嚴格按照要求操作，可以最大程度地降低使用、維護成本，提高儀器的工作效率。

注意過濾水相或有機相時應該選用不同的濾膜。常用0.45μm的濾膜，因為0.2μm的濾膜過濾速度太慢。


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299

溶劑準備——定期更換溶劑

不乾淨的溶劑或在溶劑瓶中長菌的溶劑會阻塞溶劑的玻璃過濾頭，降低泵的操作性能

遵從下列建議可以提高性能，延長溶劑玻璃過濾頭的壽命：

l使用無菌溶劑瓶避免溶劑長菌

l用濾膜過濾溶劑去除微生物

l每兩天更換或過濾溶劑

l避免溶劑瓶直接日照

四氫呋喃(THF)、醚類等有機溶劑應放在棕色瓶中，以防光照變質。

水也最好放在棕色瓶中，以防長菌。(也可加入少許疊氮化鈉或有機溶劑，抑制長菌)。

注意要定期更換、過濾溶劑，尤其是水相或緩衝鹽流動相。


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300

溶劑準備——溶劑除氣

•目的•排除溶解在流動相中的氧氣和氮氣

•除氣方法•氦氣除氣•真空除氣•回流加熱除氣•超音波震盪除氣(最為常用)


301

301

溶劑準備——避免的溶劑

避免使用下列對不銹鋼有腐蝕性的溶劑：

l鹵化物鹼金屬溶液和相應的酸溶液

l高濃度的無機酸例如：硝酸和硫酸

l能夠形成鹵素自由基或酸的氯化試劑及其混合物

l含有過氧化物的層析級醚必須用氧化鋁乾燥劑

l在有機溶劑中的有機酸溶液

l含有強絡合劑的溶液

l四氯化碳和異丙醇或THF混合液

請注意本頁所給出的溶劑資訊，避免腐蝕系統。


302

302

溶劑準備——溶劑互溶性

使用流動相時千萬要注意溶劑的混溶性，避免形成乳化的小液滴毀壞管柱！

可以使用異丙醇作為過渡溶劑。實驗室應備有至少一瓶層析純的異丙醇，以作為過渡溶劑或用以清洗備件。


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303

Solvent UVCutoff(nm)

Acetonitrie 190WaterCyclohexane 195Hexane 200Methano 210Ethanl 210DiethylEthr 220Dichloromethane 220

Chlorofom

190

240CarbonTetrachloride 265

Tetrahydrofurn 280 (210)Toluene 280

UV Cutoff is the wavelength at which absorbance equals 1 AU.

溶劑準備——溶劑的截止波長

此處給出的是常用溶劑的截止波長。採集層析資料時，樣品檢測波長Wavelength(Sam.)應至少大於所用溶劑的截止波長20nm以上。


304

304

泵的初始化：

移走溶劑與系統中的氣泡

使溶劑組成變化更容易

系統的初始化和平衡

層析管柱平衡：

確保分析結果再現性

對於反相柱使用5~10倍管柱

體積流動相平衡層析管柱

日常開機操作時需要進行系統的初始化和管柱平衡。

•系統初始化的主要目的是移走管路中的氣泡。

•管柱平衡的主要目的是使得管柱中的流動相組成真正達到分析條件要求。

注意：

新裝到系統上的層析柱也需要進行初始化：先斷開管柱與檢測器間的管路，用流動相將層析柱中的原有流動相或氣泡移出層析柱，然後再將層析柱和檢測器間的管路重新接好。


305

305

保護層析管柱

過濾所有的溶劑和樣品

使用保護管柱

儀器在使用完畢，要清洗整個系統，移走系統中緩衝液

管柱在不使用時，兩端密封儲存

在適當的溶劑中儲存管柱

注意層析柱的pH值使用範圍

不要高壓清洗管柱

不要高溫下過長時間使用矽膠鍵合相

如果層析柱從系統中拆下後，長時間不使用，不僅需要將層析柱兩端密封，而且最好將層析柱浸泡在適當的溶劑中儲存，以防氣泡進入。


306

306

層析管柱測試

使用一根新層析管柱之前，應在流動相組成不變的情況下進行性能測試實驗，列印性能報告：

1. 記錄理論板數N、層析管柱長度及內徑

2. 記錄測試樣品的名稱及K值

3. 記錄所用固定相和流動相

4. 記錄流動相的流速

5. 記錄測試樣品的進樣量

6. 記錄實驗的溫度條件

7. 記錄層析峰的對稱性

8. 記錄測試時層析管柱的壓力

作為儀器分析實驗工作者，應具有良好的實驗記錄習慣。尤其應記錄管柱的狀態，經常進行柱效測試(列印Performance報告)，對管柱有充分的瞭解，以便順利完成分析測試任務。


307

307

樣品準備

樣品完全溶解在流動相中樣品沒有完全溶解

過濾樣品，確保樣品中不含固體顆粒

用流動相或比流動相弱的溶劑溶解樣品

進樣量儘量小

比流動相“弱”的溶劑：此處“弱”的含義是指該溶劑溶解樣品的能力比流動相溶解樣品的能力弱。使用這種溶劑可以防止樣品在流動相中析出固體微粒。

在能夠滿足分析要求的前提下，進樣量越小越好！


308

308

常見層析故障——混合問題

+

原因：

一個有紫外吸收的流動相與一個沒有紫外吸收的流動相動態混合產生噪音，增加靜態混合器可以降低這種噪音。

缺點：

增加了延遲體積(420uL)

靜態混合器

如果因為流動相混合不均勻使得所得層析基線噪音較大，可以使用靜態混合器。


309

309

常見層析故障——基線噪音

可能的原因：

檢測容槽髒

檢測容槽燈能量下降

由泵引起的脈衝

檢測器上的溫度效應

檢測容槽中有氣泡通過

Time (min.)

基線噪音較大的原因有多種，應該如何判斷噪音的來源呢？


310

310

基線噪音

停泵

噪音是否依然存在

是否

檢測器? 泵或流動相?

其他要考慮的問題：

▲是否改變了流動相的組成？

▲是否改變了檢測波長?

▲在你的儀器上使用的最後的流動相是什麼?

▲流動相是否相溶?

▲流動相是否乾淨?

常見層析故障——基線噪音

利用停泵的方法，可以將噪音的來源一分為二，快速找出噪音來源。


311

311

常見層析故障——基線漂移

基線漂移可能的原因：

•梯度流析引起的

•流動相髒

•管柱沒有用流動相平衡

•系統中污染物溢出

•RID檢測器溫度不穩定


312

312

20% ~100% MeOH梯度流析，沒有進樣

鬼峰－沒有進樣就有層析峰出現

原因－流動相髒

常見層析故障——鬼峰

出現鬼峰90%以上原因是流動相髒，尤其是水相髒。

要求使用超純水，最多兩天就應更換一次水。注意：即使使用超純水淨化系統，也要注意經常檢查、更換其過濾柱。


313

313

用較短的、窄內徑的毛細管連接進樣器和層析管柱以及管柱和檢測器

確認連接管的接頭都相互匹配

使用死體積小的檢測容槽

減小進樣量

增加柱外呆體積

常見層析故障——柱外擴散

柱外呆容積增大帶來的柱外效應，會使得層析峰展寬，降低分離度。


314

314

管柱頭塌陷或柱床運動

泵頭過濾芯(Frit)部分堵塞

組份共流出

正常雙峰

常見層析故障——雙峰

柱頭塌陷

請思考：如何區分此三種原因？出現雙峰還可能的一種原因是什麼？


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315

所有峰都擴展

柱效降低或管柱塌陷進樣體積過大流動相粘度大

部分峰擴展

前一次分析樣品的流出物

高分子量樣品－蛋白質或聚合物

常見層析故障——雙峰


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316

正常拖尾

正常拖尾

小峰在大峰後流析出來

管柱頭有污染物堆積

原因：

部分峰拖尾

二次滯留效應

殘留矽醇基的相互作用

重金屬反應

所有峰均拖尾

柱外效應管柱失效

常見層析故障——拖尾峰


317

317

正常前伸

原因：

管柱超載

小峰在大峰之前流析出來

常見層析故障——前傾峰


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318

溶解樣品的溶劑通過管柱時平衡被破壞

原因：

樣品吸收比流動相吸收小。

RID中最常見

正常負峰

常見層析故障——負峰


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319

壓力問題

壓力過高壓力過低壓力波動

常見層析故障——壓力問題


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320

可能的原因：

•管柱進口過濾芯被污染

•PURGE閥過濾芯被污染

•層析柱被污染

•連接管路，尤其是針座毛細管堵塞

•進樣器旋轉密封閥被堵塞

•進樣針或針座被阻塞

壓力測量

使用此閥分割系統

常見層析故障——壓力過高

壓力過高的原因很多，但可以用一個字總結，即“堵”！

查看究竟是哪一段發生堵塞，可以使用分段法來檢查。


321

321

利用化學工作站監測高壓

在工作站中泵參數設置時，應該設置合適的壓力上限。


322

322

可能的原因：

l溶劑進口過濾芯堵塞

l連接管路洩漏或其他備件(泵頭密封墊)

l溶劑或流速改變

l入口止回閥失靈

l四元比例閥失靈

l出口止回閥失靈

l層析柱失效(固定相流失)

阻尼器測量壓力

溶劑進口過濾芯

常見層析故障——壓力過低

壓力過低，一個字“漏”！

但要注意阻尼器之前的某些元件地方堵塞也可能會造成壓力過低！

溶劑入口過濾芯為一次性消耗品，尤其不可以使用超聲清洗。可以使用HNO3浸泡，然後用水充分清洗至中性，以重複使用。


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323

利用化學工作站監測低壓

在工作站中泵參數設置時，應該設置合適的壓力下限。

該數值應比正常分析壓力低20Bar左右。


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324

可能的原因：

•溶劑進口過濾芯堵塞

•溶劑未除氣

•泵的密封墊老化

•出口止回閥失效

•入口止回閥失效

最常見的原因是：泵內有氣泡

常見層析故障——壓力波動壓力測量


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325

利用化學工作站監測壓力變化

可以從化學工作站的Online Signal視窗觀測壓力波動曲線，正常情況下壓力波動應小於1~2Bar。


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326

監測壓力波動是判斷泵的性能的快捷方式。此值應非常穩定。

利用化學工作站監測壓力變化

可以從Diagnosis介面線上觀測壓力波動情況。

點擊泵的圖示，進入泵的詳細結構圖介面(如上圖所示)，再點擊阻尼器圖示，選擇Update Variables Display，即可看到壓力波動情況。Pressure Ripple應小於2％。


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327

附錄：高級功能簡介

•序列功能簡介•如何建立序列表

•如何執行自動再校正

•如何作循環再校正

•資料檔案如何命名

•如何使用 Sequence Summary

•DAD高級功能•如何最佳化層析條件、提取層析圖

•如何提取吸收光譜、建立譜庫

•如何進行峰純度檢測

本附錄中簡單介紹了序列和DAD的高級功能。其目的是給客戶提供一個起始思路，更細節的操作可以由客戶自己進一步摸索、開發，也可以參加安捷倫公司的HPLC 1100 Adv.培訓班，以便進一步提高，充分利用工作站的各種功能。


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328

編輯序列過程概述

1進入Method and Run Control介面

2.在Sequence功能表，選擇New Sequence

3 編輯Sequence Parameters.

4.編輯Sequence Table.

5.編輯Sequence Output.

6.儲存序列

7.從Run Control菜單或從Sequence Table運行序列

具有自動進樣器的客戶可以編輯序列進行自動分析。

需要注意的是：使用序列的前提條件是已經具備了成熟的方法。序列只是按照方法的要求依次對標樣或未知樣進行資料採集和分析。與方法相比，序列並沒有任何額外的附加功能，所以說，編輯序列的前提一定是已經具有一個成熟的方法！

本頁給出的是編輯序列、進行自動分析的主要步驟。


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329

編輯Sequence Parameters

在Sequence Parameters中規定資料檔案的命名方式。如果選用Auto方式，一定要注意每次運行序列前更改資料存放的子目錄，否則很可能發生資料檔案的覆蓋、遺失。

雖然一個序列中可以使用多個方法，但我們推薦的是在一個序列中僅使用一個方法，以防系統的平衡被破壞。如果使用多個方法，一般都需要設置Wait Time，以便使系統達到平衡後才開始進樣分析。

注意選擇適當的Shutdown方式，可以規定序列運行結束後使系統切換到Standby狀態、關燈、關泵或整個系統關閉。


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330

序列表的編輯

在序列表中如果規定樣品類型為Calibration，意味著該樣品為標樣，對當前方法進行再校正，而不是用標樣資料建立校正表。

通常需要在序列表中的前幾行對現有的方法進行再校正，以儘量保證方法的精確、有效性，然後進行控制樣品分析，以衡量該方法的定量是否準確。如果方法定量準確，會繼續進行未知樣品的分析，否則，序列將自動停止運行。


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331

序列表的編輯——自動循環再校正

進樣達到一定次數後，需要重新進行再校正，以保證繼續使用該方法定量的準確性。

可以使用Interval來規定進樣幾次後，自動重新執行再校正。此處規定的是進針次數，而不是分析的樣品瓶數！！！


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332

序列表的編輯——Bracketed方式進行再校正

如果使用Bracketed方式Update RF，可以在分析未知樣品前、後，均進行再校正，然後使用這兩次再校正的標樣資料平均值，對未知樣品進行更準確的定量。


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333

序列表的編輯——使用Insert/FillDown Wizard

使用Insert/FillDown Wizard鍵可以快速地完成序列表的編輯。

點擊Sequence Table中左下角的 Insert/FillDown Wizard鍵，即秀出上圖的Insert/FillDown Wizard窗口。


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334

設置序列輸出參數

使用序列的Sequence Summary選項，列印Sequence Summary Report可以得到樣品或標樣資料檔案的統計資訊。

序列既可以按照方法規定輸出每次分析的結果報告，也可以同時或僅僅給出序列的統計、總結報告。

如果列印序列總結報告，點擊Setup鍵，即可進入下頁的總結報告參數設置視窗。


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335

序列總結報告的參數設置

選擇標準統計或擴展統計

序列總結報告中，可以有多種選擇。一般說來都會選擇第7或第8項，分別對標樣資料和未知樣品資料進行統計(標準統計或擴展統計)。

擴展統計的參數規定見下頁。


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336

序列的擴展統計參數設定

在擴展統計中可以規定要進行數學統計的項目，還可以規定允許的偏差範圍。


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337

儲存序列檔案

儲存當前的序列

序列編輯結束後要儲存或另存序列。


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338

如何運行序列

•單擊多瓶狀態下的Start鍵

•從RunControl功能表選擇Run

Sequence或按F6鍵運行序列

•從Sequence Table運行序列

運行序列有多種方式，除上述幾種外，還可以在Partial Sequence後，單擊Run Sequence，進行序列的部分運行。對應的畫面見下頁。


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339

序列運行及序列的部分運行Partial Sequence

利用Sequence功能表下的Partial Sequence功能，可以先類比序列運行的順序及結果，進行序列模擬運行預覽。還可以從類比運行所得的資料採集順序表中選擇某行或某些行，然後點擊Run Sequence按鈕即可僅運行序列的選中部分。


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340

提取、顯示光圖譜

DAD高級功能

以下講解的是DAD的高級功能。

實現這些功能的前提條件是已經購買了DAD檢測器，並且安裝了G2180AA光譜分析軟體。在安裝了G2180AA軟體後，工作站的Data Analysis介面中會多出一個Spectra功能表，如上所示。

Spectra功能表下前四行功能表的功能分別是：

•提取、顯示任一指定時刻的光譜

•提取、顯示層析峰頂點的光譜

•提取、顯示一段時間範圍內的平均光譜

•提取、顯示某個層析峰上所有的吸收光譜


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341

扣除參考光譜

原始的紫外光譜圖和參考光譜圖扣除背景後的紫外吸收光譜圖

扣除背景後的紫外吸收光譜更接近於化合物本身的吸收光譜。

扣除背景的方式可以是自動扣除，也可以是手動選擇參考扣除，或者不扣除。


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342

選擇第二張參考光譜

切換到圖譜處理介面

光譜選項

提取層析圖上任意一點吸收光圖譜

提取峰頂點光圖譜

提取平均光圖譜

提取層析峰上所有的光圖譜

選擇第一張參考光譜

檢驗層析峰純度

光譜圖譜處理工具

所有的圖示快捷方式都可以在Spectra功能表下找到對應的命令行。


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343

光譜選項參數設置

光譜選項介面可以規定每個層析峰上顯示的光譜張數。


344

344

光譜選項參數設置

利用光譜選項可以設定自動扣除參考吸收光譜，還可以在Display欄中設置光圖譜平滑方式或繪製導數光譜，在Purity欄中設置層析峰純度搜尋的條件等。


345

345

紫外圖譜不特徵

紫外圖譜依賴於流動相的變化而變化

未分離開的峰會給出錯誤結論

重疊峰會給出錯誤結論

沒有商業譜庫

紫外譜庫的局限性


346

346

狹縫寬度

光譜步長

滯留時間窗口

吸收閾值

流動相光譜的干擾

光譜圖噪音大小

是否使用導數光譜

影響圖譜匹配的因素


347

347

建立譜庫

首先從Spectra功能表下選擇Library中New Library建立新的光譜庫。


348

348

輸入光譜譜庫的名稱及描述資訊

逐行輸入譜庫的真實資訊，資訊越全越好。


349

349

提取化合物光圖譜

在自動扣除背景模式下，提取標樣層析峰頂點的吸收光圖譜。


350

350

將光譜圖添加入光譜庫

選擇Add Entries將所提取的吸收光圖譜加入到譜庫當中，並輸入該化合物的真實、詳細資訊。


351

351

光譜庫的管理

譜庫建立以後也還可以對其中的任一光譜進行管理，修改其資訊。


352

352

儲存光譜庫

儲存所建立的譜庫。譜庫文件的副檔名為 .UVL。默認的存儲路徑為x:\hpchem\speclibs(x為工作站所在硬碟位置)。


353

353

光圖譜搜尋——打開光譜庫

可以打開自己工作站中的譜庫，也可以通過網路載入網上的譜庫。

利用網路連接，可以載入網上的譜庫，進行網路資源分享，實現譜庫搜尋，對未知物初步定性。


354

354

光譜圖搜尋——設置搜尋條件

載入所需譜庫後，設置適當的譜庫搜尋條件，有助於快速、準確找到目標化合物。


355

355

光譜圖搜尋——搜尋未知樣光譜

提取未知樣品中某層析峰頂點的吸收光譜(同樣使用自動扣除參考光譜)後，點擊Search Spectrum即可按照設定的搜尋條件進行譜庫搜尋。


356

356

圖譜搜尋——搜尋結果

搜尋結果介面中給出了未知化合物和譜庫中化合物的吸收光譜重疊圖、兩者的吸收光譜差別圖以及搜尋結果列表（列出匹配係數前十位的化合物）。


357

357

編輯譜庫標題資訊

列印譜庫中圖譜

退出當前譜庫

編輯譜庫中圖譜

向譜庫添加光譜

進行譜庫搜尋

編輯譜庫搜尋條件

切換到圖譜處理介面載入譜庫儲存譜庫

圖譜搜尋——光譜庫工具欄

所有快捷方式均可在Spectra功能表下Library中找到對應的命令行。


358

358

層析峰純度搜尋

在峰的流析過程中，通過比較所記錄的吸收光圖譜來評估層析峰是否包含不純的物質。

峰纯度檢測

首先選擇峰純度檢測的快捷圖示工具，然後在層析圖上單擊要進行純度檢測的層析峰即可判斷該層析峰是否為純淨物質的流出峰。


359

359

層析峰純度搜尋結果

等高圖

3-D 顯示

峰純度信息

閾值曲線

類比曲線

SpectralOverlay

在峰純度分析視窗可以從多個角度判斷層析峰是否純淨。其中光譜重疊好壞程度是很重要的一個判斷依據。

可以從視窗下方的提示行看到檢測結果，點擊黃色燈泡圖示，可以進一步瞭解峰純度的資訊。參見下頁。

注意：紫外吸收光譜畢竟不是定性的好手段，我們可以通過吸收光譜斷定某層析峰不純，但不可以斷定該層析峰一定純淨。利用DAD進行峰純度檢測的結果僅僅是一個參考資訊而已。


360

360

層析峰純度信息——純峰

純層析峰的純度因數Purity Factor高於閾值Threshold規定。

純度因數的最大值為1000。


361

361

層析峰純度信息——不純峰

不純峰的純度因數Purity Factor低於閾值Threshold。

閾值的設置合理與否也會影響所得純度搜尋結果。


362

362

l 化合物特徵

l 流動相的吸收影響

l 噪音大小

l 所測化合物的光譜範圍

影響層析峰純度的因素

最佳化條件：

l 使用光強度大的光源，對檢測器進行常規維護

l 選擇合適的流動池和狹縫

l 採集足夠的資料點

l Peakwidth設置值合理

l 樣品濃度應在檢測器的線性範圍內

要使用峰純度檢測功能一定要注意本頁所給出的條件最佳化方法。

閾值的設置合理與否也會影響所得純度搜尋結果。可以在Spectra Options中Purity欄內規定使用化學工作站自動計算的閾值還是使用自行規定的閾值。


363

363

繪製等吸收圖的方法：

•選擇Spectra功能表下Isoabsorbance Plot

•選擇Spectra功能表下Iso/3D Plot Options，然後

在彈出視窗中單擊Make Isoplot

利用等吸收圖最佳化層析條件

等吸收圖是比三維圖譜更為實用的一種曲線圖，可以從中最佳化層析檢測條件、提取所需檢測波長下的層析圖。詳見下頁。


364

364

利用等吸收圖最佳化層析條件

在Quick View模式下，可以通過下方視窗快速察看使用不同檢測波長獲得的不同層析圖；也可以在視窗上方看到各個時刻所採集到的不同的光圖譜。

如果要提取所需檢測條件的層析圖，需要先將Cursor選項的下拉功能表改為Signal，然後選擇適當的樣品檢測波長、譜帶寬度(可以按住Ctrl鍵的同時拖動滑鼠左鍵)、參考波長、譜帶寬度，此時即可得到所需檢測條件的層析圖。單擊視窗左下角Copy鍵，化學工作站會自動將所需的層析圖轉入到資料分析介面，以便客戶進行進一步的資料分析。


365

365

繪製光譜/層析三維圖譜


366

366

實驗一：重新安裝化學工作站

重新安裝化學工作站分為以下四個主要步驟：

一、備份：1. 備份有用的檔案——包括資料檔案，方法檔及序列檔。•資料檔案在 C:\HPCHEM\1\DATA子目錄下；•方法檔在 C:\HPCHEM\1\METHODS子目錄下；•序列檔在 C:\HPCHEM\1\SEQUENCE子目錄下。

2. 備份C:\winnt子目錄下win.ini檔，以防修改該檔時發生錯誤。

二、刪除：1. 刪除HPCHEM子目錄及子目錄下所有檔；2. 刪除所有的快捷方式(包括桌面上和功能表中的所有快捷方式)。3. 修改C:\winnt子目錄下win.ini文件：刪除win.ini文件中以[PCS], [PCS1] 為標題的程式段(具體方法參見下頁)。

三、安裝：(具體方法參見340~34頁)1. 運行光碟上的Setup.exe文件；2. 選擇需要安裝的軟體並輸入其序列號，執行安裝。

四、配置：(具體方法參見350~355頁)1. 選擇儀器的工作狀態；2. 配置儀器的IP位元元址。

千萬不要回去後就在自己的電腦上練習！一定在培訓中心練習、掌握工作站的重新安裝！只有自己的工作站出了問題，確實需要重新安裝時才進行重裝！！！

一定先做好檔備份的工作，以防資料、方法等有用的檔遺失。除了上述的檔案外，如果您編輯了客戶化的報告、編輯使用了巨集指令，請也注意儲存。


367

367

修改完畢，儲存並退出win.ini檔的編輯視窗。

修改win.ini檔的方法

修改Win.ini文件：以Notepad打開該檔案，選中並刪除其中的 [PCS]和[PCS,1]程式段，然後儲存退出即可。(注：從[PCS]開始，到[PCS,1]之前的程式列都屬於[PCS]程式段。[PCS,1]程式段是從[PCS,1]開始到下一個中括弧之前的所有內容。)

記得是修改Win.ini檔，而不是刪除該檔案！！！

要選擇儲存，不能選擇另存，以保證系統使用的C:\Winnt\Win.ini真正地被修改過來！


368

368

•點擊光碟符號，雙擊Setup.exe

•電腦啟動工作站安裝程式，進入工作站安裝畫面。單擊Add/Change鍵，進入下

頁選擇軟體的視窗。

三、化學工作站軟體的安裝

請先參考第130頁的備註頁，記錄您的軟體License和儀器IP address


369

369

1. 選擇G2170AA LC ChemStation軟體，單擊右上方的Add鍵。

化學工作站軟體的安裝(續)

3. 如果要同時安裝光譜分析軟體，請選擇G2180AA Spectral Evaluation軟體、輸入相應的序列號並點擊Add鍵，最後單擊OK退出此窗口。

2. 在New License Number框輸入G2170AA軟體的序列號，再單擊右側的Add鍵。

安裝G2170AA LC ChemStation軟體後，即可控制所有Agilent 1100 HPLC模組(VWD、DAD、FLD等)，完成資料採集的工作。如果您使用的是DAD或FLD檢測器，那麼檢測器在採集層析資料的同時可以採集光譜資料，就需要使用光譜分析軟體處理光譜資料。當您購買了G2180AA Spectral Evaluation軟體後，請在安裝液相層析化學工作站的同時安裝該光譜分析軟體，否則就無法利用化學工作站分析檢測器所採集的光譜資料。


370

370

化學工作站軟體的安裝(續)

確認所選的軟體無誤後，單擊視窗中的Install鍵，進行軟體安裝。從進程條中隨時瞭解安裝的進程。

安裝結束後，會自動彈出下頁Configuration Editor窗口。


371

371

四、配置儀器的工作狀態

•選擇 Configuration Editor 介面中Configure功能表下 Instrument選項，進入右側的儀器選擇介面。不使用光譜分析軟體時選擇Modular LC System；如果要使用光譜分析軟體請選擇Modular 3D LC System。

•選擇完畢，單擊OK。


372

372

1. 單擊Add鍵，在彈出的視窗中選擇Identify by IP Address，並輸入儀器的IP位址後，單擊OK退出

四、配置儀器的IP位元元址

2. 依次點擊各個OK鍵，退出各視窗。最後，儲存配置參數，並退出Configuration Editor介面。


373

373

完成化學工作站的安裝後，打開Agilent 1100 HPLC儀器的各個模組，當各個模組完成自檢後，即可進入Online化學工作站。第一次進入Online化學工作站時，化學工作站可以自動檢測當前儀器的硬體配置情況。如果通訊成功，被自動檢測到的模組會在左側方框中顯示成綠色的圖示。雙擊左側方框中所有綠色圖示，將它們選到右側方框中。最後，單擊OK進入Online化學工作站。

啟動Online化學工作站


374

實驗二、方法編輯及資料採集

實驗目的：1. 瞭解完整方法的編輯和儲存的過程；

2. 重點掌握Agilent 1100 HPLC各個模組採集參數的設置；

3. 熟悉一個樣品資料採集的全過程，完成未知樣品資料採集。

實驗條件：

泵：Agilent 1100四元泵或二元泵

進樣器：Agilent 1100自動進樣器或手動進樣器

管柱控溫箱：Agilent 1100管柱控溫箱(可選項)

層析柱：ODS 5μm, 100×4.6mm

檢測器：Agilent 1100 VWD或DAD檢測器

流動相：A: 水25%，B: 甲醇75%，1.0 ml/min

進樣量：1.0μL

實驗溫度：Not control

檢測波長：254nm

實驗步驟：

1. 打開電腦，進入Windows作業系統，CAG Bootp Server程式將自動運行。

2. 打開Agilent 1100 HPLC各個模組電源開關，等儀器自檢通過並與電腦通訊成功(約1~2min)後，進入Online工作站。

3. 進行系統初始化：(主要目的是排除溶劑管路中的氣泡)

a) 打開Purge閥，加大泵流量至5mL/min，快速分別排放實驗所用的A、B兩個管路至無氣泡從廢液管排出為止。

b) 將流動相流量及比例設成實驗所需條件(1.0 mL/min, A: 25%, B:75%)，單擊OK確認。

c) 關閉Purge閥，完成系統初始化。

4.以當前流動相平衡整個液相層析系統，尤其是層析管柱。


375

5. 點擊System On圖示，將Agilent 1100 HPLC的所有模組同時切換到工作狀態，以穩定整個系統的層析管柱溫度和檢測器燈能量等。

6. 選擇Method>>Edit Entire Method功能表，彈出下圖所示視窗。不選擇視窗中的Data Analysis一項，單擊OK鍵。

7. 在方法資訊視窗中輸入方法的描述資訊後，單擊OK，如下圖所示。

8. 在泵參數設置視窗輸入流動相的流量、溶劑比例及名稱，單擊OK。


376

9. 在自動進樣器參數設置視窗輸入進樣量10uL，單擊OK。

10. 在管柱控溫箱參數設置視窗中選擇不控制柱溫，單擊OK。

11. 在DAD或VWD檢測器參數設置視窗設置檢測波長為254nm，單擊OK。


377

12. 在Run Time Checklist視窗中，僅僅選擇Data Acquisition和Standard Data Analysis兩項，單擊OK，完成整個方法的編輯。

13. 選擇Method>>Save as功能表，輸入方法檔案名稱，將新方法另存起來。

14. 在方法修改歷史的注釋欄中，輸入適當的方法改動注釋資訊。

15. 至此，整個方法的採集參數編輯和儲存已經完成。


378

16. 選擇View>>Online Signal>>Signal Window 1功能表，在彈出的Online Signal視窗單擊Change鍵。

17. 選擇需要監測的層析訊號並設定合適的X軸、Y軸刻度顯示範圍，單擊OK鍵。

18. 觀測視窗中的層析基線，如果基線已經穩定，請點擊Online Signal視窗中的Balance鍵，進行基線歸零。


379

19. 單擊RunControl>>Sample Info功能表，在彈出的視窗中填寫樣品資訊。

20. 樣品資訊填寫完畢後，點擊上圖視窗中的Run Method鍵，直接運行當前方法，採集樣品資料。

使用自動進樣器時：方法直接運行，開始資料採集。

使用手動進樣器時：化學工作站的狀態欄中提醒您手動進樣。完成手動進樣切換至Inject狀態後，開始資料採集。

(注意：上圖樣品資訊視窗中的樣品瓶號應正確填寫，如果空白不填則將直接採集空白樣品流動相的層析資料。)

(如果在上圖的樣品資訊視窗中點擊OK鍵，則只是確認所填寫的樣品資訊，不能自動運行方法。可以通過點擊RunControl>>Run Method功能表，或按下鍵盤的F5鍵，或點擊單個樣品瓶圖示下的綠色Start鍵運行方法，採集資料。此外，如果使用手動進樣器，當手動進樣閥切換到Inject狀態時，即可自動開始方法的運行，而不必進行任何運行方法的選擇。)


380

實驗三、外標法定量

實驗目的：

1.掌握載入層析資料、最佳化圖譜顯示、最佳化積分參數的方法。

2.掌握外標校正曲線編輯的全過程。

3.掌握對未知樣品進行外標法定量的過程。

實驗條件：

1.事先已採集兩個濃度標樣、一個未知樣品的資料，層析圖如下：

2.標樣中化合物C9、C10和C11含量如下表所示，濃度單位為(ppm)：

C9 C10 C11

標樣一 ESTD1.D 9.90 10.00 10.02

標樣二 ESTD3.D 19.80 20.40 20.60

未知樣 ESTD5.D ? ? ?

3.請對未知樣品進行資料分析，得到資料ESTD5.D的外標定量結果。

4.請先載入化學工作站的默認方法Def_lc.m，以該默認方法為基礎進行方法的編輯(或以實驗二所編輯的Lab2.m方法為基礎進行編輯)。


381

實驗步驟：

1.在Data Analysis介面下選擇File>>Load Signal，載入低濃度標樣資料檔

案ESTD1.D(存放資料檔案的文件夾為HPCHEM\1\Data)。

2.對該資料檔案進行圖譜顯示的參數最佳化：選擇Graphics >> Signal Options，在彈出視窗中選擇Autoscale，單擊OK。


382

3.選擇Integration>>Auto Integrate功能表即可。

4.選擇Integration >> Integration Events功能表，打開積分事件表。

5.在積分事件表中輸入適當的面積拒絕值禁止小雜峰積分，並利用積分器開、關的功能禁止第一個層析峰積分，具體參數值如上圖積分事件表中所示。參數設置完成後，點擊Integration>>Integrate功能表，按當前積分參數條件執行積分，得到峰面積。檢查是否獲得三個所需化合物的準確峰面積，而且沒有其他雜峰被積分。確認無誤後，單擊積分事件表中左上角第一個圖示，儲存積分參數並退出積分事件表窗口。


383

6.建立新的校正表：選擇Calibration>>New Calibration Table功能表，在彈出的New Calibration Table視窗中確認為Automatic Setup，單擊OK即可。

7.在螢幕下方的校正表中輸入第一個濃度標樣中各個化合物的名稱和含量並在校正表的右側觀察各個化合物的校正曲線，如下圖所示。

8.繼續進行二級校正：首先按與步驟1相同的方式載入第二個濃度標樣的資料檔案ESTD3.D，若需再次進行圖譜最佳化和積分最佳化，請參照步驟2~5進行(一般不需要再次最佳化)。然後選擇Calibration>>Add Level功能表，在彈出的Add Level視窗中確認新的濃度級別為2級，單擊OK。


384

9.在校正表中輸入第二個濃度標樣中各個化合物的含量，觀察校正表右側的各個化合物校正曲線是否具有良好的線性。最後單擊OK退出校正表。

10. 進行校正設置：選擇Calibration>>Calibration Settings，在彈出的校正設置視窗中更改標樣的濃度單位，確認工作曲線的回歸方式及滯留時間視窗的參數設置。

11.至此，校正參數編輯結束，開始報告參數的設置：選擇Report>>Specify Report，在彈出的報告參數視窗中選擇定量方法為ESTD，確認報告的輸出位置為Screen，確認報告類型為Short，單擊OK，如下頁圖中所示。

利用快捷圖示，可以方便地進行報告參數設置、預覽報告、列印報告。


385

12.外標定量法的資料分析參數編輯徹底結束，儲存方法：選擇File>>Save As>>Method功能表，另存方法為Lab3.m，輸入方法修改資訊，如下所示。

13.載入未知樣品資料ESTD5.D，列印外標法定量報告：選擇Report>>Print Report功能表或者點擊列印預覽圖示，在螢幕上生成未知樣定量報告。

注意：此圖示是用印表機直接將報告列印出來，而不受報告參數視窗中的列印位置限制。


386

14.檢查所得的報告是否與以下報告的定量結果相同，如果定量結果正確，點擊報告預覽視窗右下角的Print鍵，將報告列印出來完成實驗三。

15.思考題：請分析、判斷此定量結果是否準確，在實際的未知樣品定量中如何才能實現準確定量？一個方法中可以有幾個校正表，又可以有幾條校正曲線呢？如何儲存校正表和校正曲線？


387

實驗四、內標法定量

實驗目的：

1.掌握載入層析資料、最佳化圖譜顯示、最佳化積分參數的方法。

2.掌握內標校正曲線編輯的全過程。

3.掌握對未知樣品進行內標法定量的過程。

實驗條件：

1.事先已採集兩個濃度標樣、一個未知樣品的資料，層析圖如下：

2.標樣中化合物C9、C10和C11含量如下表所示，濃度單位為(ng/?L)其中C10為內標化合物。

C9 C10內標 C11

標樣一 ISTD1.D 9.90 10.00 10.02

標樣二 ISTD5.D 49.80 10.05 50.30

未知樣 ISTD3.D ? 9.90 ?

3.請對未知樣品進行資料分析，得到資料ISTD3.D的內標定量結果。

4.請先載入化學工作站的默認方法Def_lc.m，以該默認方法為基礎進行方法的編輯(或以實驗二所編輯的Lab2.m方法為基礎進行編輯)。


388

實驗步驟：

1.在Data Analysis介面下選擇File>>Load Signal，載入低濃度標樣資料檔案ISTD1.D(存放資料檔案的文件夾為HPCHEM\1\Data)。

2.對該資料檔案進行圖譜顯示的參數最佳化：選擇Graphics >> Signal Options，在彈出視窗中選擇Autoscale，單擊OK。


389

3.選擇Integration>>Auto Integrate功能表即可。

4.選擇Integration >> Integration Events功能表，打開積分事件表。

5.在積分事件表中輸入適當的面積拒絕值禁止小雜峰積分，並利用積分器開、關的功能禁止第一個層析峰積分，具體參數值如上圖積分事件表中所示。參數設置完成後，點擊Integration>>Integrate功能表，按當前積分參數條件執行積分，得到峰面積。檢查是否獲得三個所需化合物的準確峰面積，而且沒有其他雜峰被積分。確認無誤後，單擊積分事件表中左上角第一個圖示，儲存積分參數並退出積分事件表窗口。


390

6.建立新的校正表：選擇Calibration>>New Calibration Table功能表，在彈出的New Calibration Table視窗中確認為Automatic Setup，單擊OK即可。

7.在螢幕下方的校正表中輸入第一個濃度標樣中各個化合物的名稱和含量如下圖所示。

8.指認C10為內標化合物：點擊校正表中ISTD欄下C10一行，通過下拉功能表將No改為Yes，在彈出的未知樣品內標量確認視窗中輸入未知樣品ISTD3.D中的內標C10含量為9.9，然後單擊OK。

9.繼續進行二級校正：首先按與步驟1相同的方式載入第二個濃度標樣的資料檔案ISTD5.D，若需再次進行圖譜最佳化和積分最佳化，請參照步驟2~5進行(一般不需要再次最佳化)。然後選擇Calibration>>Add Level功能表，在彈出的Add Level視窗中確認新的濃度級別為2級，單擊OK。


391

10.在校正表中輸入第二個濃度標樣中各個化合物的含量，觀察校正表右側的各個化合物校正曲線是否具有良好的線性。最後單擊OK退出校正表。

11. 進行校正設置：選擇Calibration>>Calibration Settings，在彈出的校正設置視窗中更改標樣的濃度單位，確認工作曲線的回歸方式、滯留時間視窗的參數設置以及未知樣品中的內標含量是否正確。

12.至此，校正參數編輯結束，開始報告參數的設置：選擇Report>>Specify Report，在彈出的報告參數視窗中選擇定量方法為ISTD，確認報告的輸出位置為Screen，確認報告類型為Short，單擊OK，如下頁圖中所示。

利用快捷圖示，可以方便地進行報告參數設置、預覽報告、列印報告。


392

13.內標定量法的資料分析參數編輯徹底結束，儲存方法：選擇File>>Save As>>Method功能表，另存方法為Lab4.m，輸入方法修改資訊，如下所示。

14.載入未知樣品資料ISTD3.D，列印內標法定量報告：選擇Report>>Print Report功能表或者點擊列印預覽圖示，在螢幕上生成未知樣定量報告。

注意：此圖示是用印表機直接將報告列印出來，而不受報告參數視窗中的列印位置限制。


393

15.檢查所得的報告是否與以下報告的定量結果相同，如果定量結果正確，點擊報告預覽視窗右下角的Print鍵，將報告列印出來完成實驗四。

16.思考題：如果在樣品中加入了多個內標化合物，在資料分析時如何對不同成分選用不同內標化合物進行定量？在同一個方法中能夠同時實現內標定量和外標定量嗎？

agilent 1100 hplc化學工作站操作訓練目錄

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