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Agilent GC/MS Triple Cuadrupolo.
Sensibilidad y robustez en
aplicaciones en matriz compleja –
Parte II
Juan AybarEspecialista de Producto
GCMS LCMSAGILENT TECHNOLOGIES
901.11.68.90
Agenda1. Principales aplicaciones de interés con sistemas
GC Triple Cuadrupolo
2. Importancia del backflush y los sistemas de flujo capilar
3. Determinaciones de anabolizantes en laboratorios de dopaje
4. Screening de dioxinas
5. Conclusiones
Notas de aplicación GC Triple Cuadrupolo
• Aplicaciones medioambiente, alimentación, toxicología, clínica …
• Alta sensibilidad
• Elevada presencia de material coextraído de la matriz
• Importancia de la confirmación MS/MS
• Aplicaciones básicamente cuantitativas
• Entorno regulado
Principales aplicaciones emergentes en mercado alimentario
Hormonas Esteroideas (difíciles de medir con técnicas convencionales)
• GC/QQQ
Micotoxinas (más de 3,000 conocidas; efectos tóxicos inmediatos)
• Típicamente LC/MS
Dioxinas en alimentos (tradicionalmente requiere high-res y personal especializado)
• GC/QQQ – Rápido, simple, más sensible que convencional GC
Toxinas marinas (pequeña molécula producida por mariscos)
• LC/QQQ (cuantificación de targets conocidos)
• LC/TOF (descubrimiento de desconocidos)
Alérgenos (aspectos químicos de la identificación)
• LC/MS, LC/Q-TOF, GC/QQQ – Alérgenos de pequeña molécula
GCQQQ
7890A GC y 7000 Series Triple Cuadrupolo GC/MS Características dirigidas al alto rendimiento
Todos los beneficios del Agilent 7890
Las capacidades del GC son aún más valiosasen análisis MS/MS de trazas en matriz compleja:
• Nuevo 7693 Automatic Liquid Sampler (ALS)
• Nuevo Multi-mode Inlet (MMI)
• Nuevas configuraciones de backflush usando la Pressure-Controlled Tee (PCT)
7890A-7000B GC/MS/MSCaracterísticas dirigidas al alto rendimiento
El único sistema MS/MS del mercadodotado de una celda de colisión de altapresión, dotada de aceleración lineal y “quenching por helio” para reduccióndel ruido por neutros
Nueva Extraction Source de altasensibilidad. La mayor temperatura de trabajo (hasta 350 ºC) fabricada con el material más inerte
El único MS/MS del mercado con dos analizadores cuadrupolares e hiperbólicosde cuarzo y trabajando a alta temperatura(hasta 200 º C)
Dotado del neuvo software MassHunter para datosGC/MS/MS
El único sistema MS/MS del mercadocon las novedosos ramped-iris, detección de triple eje y EM de triple canal
Todos los beneficios del
7890 GC
Pérdida de señal en inyecciones replicadas con alta presencia de matriz
Multi-baffled liner –Típico de PTV clásicos
Backflush minimiza el efecto memoria, lasinterferencias provenientes de la matriz y los cambiosen RT disminuyendo las necesidades de mantenimiento
Extractos de lechuga y pimiento inyectados 3 veces con 2 min backflush y 3 veces sin backflush.Se muestra la primera/tercera inyección de cada serie. Sin backflushing, la tercera inyección (B) muestra carryover y cambios en RTs comparado con la primera inyección (A).
MEZCUA ET AL.: JOURNAL OF AOAC INTERNATIONAL VOL. 92, NO. 6, 2009
Nuevas configuraciones paraGC/MS Backflush
Vent
EPC
Column 1 Column 2
Purged Ultimate Union (PUU)
Agilent MS System
5975C MSD7000A QQQ
Agilent 7890A GC
Injection Port
Z ml/min
Z+ ml/min
P
Control integrado en software
Purged UltimateUnion
Horno GC 7890
Análisis de esteroides
anabolizantes en
laboratorios de dopaje
P. Van Eenoo, W. Van Gansbeke, N. De Brabanter, K. Deventer, F.T. DelbekeDoCoLab, Ghent University (UGent),
Technologiepark 30, B-9052 Zwijnaarde, Belgium
Quantitative•Steroid Profile
•Testosteron, epitestosterone (d3-Tgluc, d3-EpiTgluc)
•Androsterone, etiocholanolone (d4-Agluc, d5-E)
•DHT, 5a-androstane3a,17b-diol, 5b-androstane3a,17b-diol (d3-DHTgluc, d5-bab)
•DHEA, androstenedione (d3-DHTgluc)
•11b-OH-androsterone, 11b-OH-etiocholanolone (d4-Agluc, d5-E)
• 5a-androstanedione, 5b-androstanedione (MT)
•Norandrosterone (MT)
•THC-COOH (MT)
•Salbutamol (salb-d3)
Qualitative• anabolic agents
• beta-2-agonists
• hormone antagonists and modulators
• narcotics
• beta-blockers
• stimulants
• diuretics/masking agents/corticosteroids
Qualitative
• 52 Anabolic agents (or metabolites)
• 6 Beta-2-agonists• 11 Hormone antagonists and modulators (or metabolites)
• 12 Narcotics (or metabolites)
• 18 Beta-blockers • 32 stimulants (or metabolites)
• 2 diuretics/masking agents & 2 corticosteroids
Objetivo: Quant + Qual cumpliendo con los requerimientos de la WADA (MRPLs)
135 compuestos
MRM-transitions
Establecimiento de los MRMs necesario para QUANT/QUAL
Hasta 500 MRM/sDwell time MRM de
hasta 1 ms
Norandrosterone: 1 ng/ml Clenbuterol: 0.1 ng/ml
Boldenone metab.: 0.5 ng/ml Epimetenediol: 0.1 ng/ml
O
HHO
Cl
NH2
Cl
CH CH2 NH C
CH3
CH3
CH3OH
HHO
OH
HO
OH
Cromatogramas - Validación
Resultados cuantitativosNecesidades cuantitativas6 points, r2>0.98, RSD<2/3RSDmax, bias<15%
• Perfil de esteroides– Testosteron, epitestosterone : 1-200 ng/ml– Androsterone, etiocholanolone : 48-4800 ng/ml– 5a-androstane3a,17b-diol, 5b-androstane3a,17b-diol : 4-400 ng/ml– DHT, DHEA, androstenedione : 4-400 ng/ml– 11b-OH-androsterone, 11b-OH-etiocholanolone : 40-4000 ng/ml– 5a-androstanedione, 5b-androstanedione: 4-400 ng/ml
•Norandrosterone : 1-20 ng/ml
• THC-COOH : 5-100 ng/ml• Salbutamol : 100-2000 ng/ml
El cambio: el detector
Agilent 7000 QqQ MS• MS/MS – increased selectivity/sensitivity
• higher scan rate – more substances in SRM than SIM on 5975
• tested for H2
Objetivo: 1 single method• quantitative: SP, THCA, Salbutamol, NA
• qualitative: all conjugated doping agents
• with a fast turn-around
DIOXINAS, FURANOS y
PCBs
Determinación de dibenzo-p-dioxinas policloradas (PCDDs) ydibenzo-p-furanos policlorados (PCDFs) en alimentos usando elsistema 7000B Tandem Cuadrupolo GC-MS/MS
Chris SandyEMEA GC-MS Food Segment Scientist
Agilent Technologies UK
AgradecimientosDr Karl Petitt, Ms Karolina Songin
Marchwood Scientific Services, UKProf. Peter Fuerst, Dr Thorsten Bernsmann
CVUA-MEL, Munster, Germany
Introduccion / Background
¿Qué son las dioxinas?
• Las dioxinas son un grupo de contaminantes orgánicos altamente tóxicos y persistentes• No se fabrican de manera deliberada, siendo subproductos de la incineración de residuos, fabricación de pesticidas y productos químicos y fabricación de papel• 80% de la exposición en humanos proviene a través de la alimentación• Las dioxinas se acumulan en los tejidos grasos de ternera, pollo, cerdo y pescado• Legislación admite análisis GCMS, pero precisa confirmación HR-GCMS
EC 1881/2006Establecimiento de los nivelesmáximos de contaminantes en alimentos
7890-7000B GC-MS/MS Configuracion para análisis de dioxinas
7000BTQ
7890A
MS-TeeG3186B
PCM2uL cold pulsed splitless injectionCO2 MMI
2.0m x 0.25mm ID Uncoated deactivated Fused silica
60m x 0.25mm ID x 0.25umDB5-MSUI (122-5662UI)
0.9 ml/minConstant flow
1.0 ml/minConstant flow
MS-Tee
0.9 ml/minConstant flow
1.0 ml/minConstant flow
QQQ
PCMMMI
MS-Tee
5.0 ml/minConstant flow
QQQ
PCMMMI
1.0 ml/minConstant flow
Concurrent Back Flush
15 minutos después de la inyección, la pre-columna se ventea en backflushmientras que el análisis sigue en la
columna principal
TSSegment Start Time
(min.)Peak Number Analyte RT (min.) Pre-cursor 1 Product 1 CE (V) Pre-cursor 2 Product 2 CE (V)
1 25.00
1 1 13C-2378-TCDF 35.43 317.8 254 35 315.8 252 35
1 2 2378-TCDF 35.47 305.8 243 35 303.8 241 35
1 3 13C-1234-TCDD 35.77 333.8 270 20 331.8 268 20
1 4 13C-2378-TCDD 36.79 333.8 270 20 331.8 268 20
1 5 2378-TCDD 36.80 321.8 259 20 319.8 257 20
2 40.00
2 6 13C-12378-PCDF 42.55 351.8 288 30 349.8 286 30
2 7 12378-PCDF 42.56 339.8 277 30 337.8 275 30
2 8 13C-23478-PCDF 44.00 351.8 288 30 349.8 286 30
2 9 23478-PCDF 44.02 339.8 277 30 337.8 275 30
2 10 13C-12378-PCDD 44.45 367.8 304 21 365.8 302 21
2 11 12378-PCDD 44.48 355.8 293 21 353.8 291 21
3 46.00
3 12 13C-123478-HxCDF 48.04 385.8 322 35 383.8 320 35
3 13 123478-HxCDF 48.06 373.8 311 35 371.8 309 35
3 14 13C-123678-HxCDF 48.21 385.8 322 35 383.8 320 35
3 15 123678-HxCDF 48.22 373.8 311 35 371.8 309 35
3 16 13C-234678HxCDF 48.96 385.8 322 35 383.8 320 35
3 17 234678-HxCDF 48.97 373.8 311 35 371.8 309 35
3 18 13C-123478-HxCDD 49.17 403.8 340 22 401.8 338 22
3 19 123478-HxCDD 49.19 389.8 327 22 387.8 325 22
3 20 13C-123678-HxCDD 49.30 403.8 340 22 401.8 338 22
3 21 123678-HxCDD 49.32 389.8 327 22 387.8 325 22
3 22 13C-123789HxCDD 49.63 403.8 340 22 401.8 338 22
3 23 123789-HxCDD 49.65 389.8 327 22 387.8 325 22
3 24 13C-123789-HxCDF 50.04 385.8 322 35 383.8 320 35
3 25 123789-HxCDF 50.06 373.8 311 35 371.8 309 35
4 51.00
4 26 13C-1234678-HpCDF 51.84 421.8 358 30 419.8 356 30
4 27 1234678-HpCDF 51.86 409.8 347 30 407.8 345 30
4 28 13C-1234678-HpCDD 53.11 437.8 374 20 435.8 372 20
4 29 1234678-HpCDD 53.13 425.8 363 20 423.8 361 20
4 30 13C-1234789-HpCDF 53.69 421.8 359 30 419.8 357 30
4 31 1234789-HpCDF 53.70 421.8 358 30 419.8 356 30
5 55.00
5 32 13C-OCDD 56.23 471.7 408 20 469.7 406 20
5 33 OCDD 56.24 459.8 397 20 457.8 395 20
5 34 13C-OCDF 56.41 453.7 389.9 35 455.8 391.8 40
5 35 OCDF 56.42 443.7 381 25 441.7 378.6 30
Full GC-QQQ MRM Settings
Isómeros de PCDDs/PCDFs nativosTetra Penta Hexa Hepta Octa
Curva de: 2378-TCDD 100fg – 10pg inyectados
Fuente : CVUA-MEL
Curva de : 12378-PCDD 100fg – 10pg Inyectados
Fuente : CVUA-MEL
Reproducibilidad en area de pico (n=15)Extracto de cerdo añadido - nativas - 200 fg inyectados
Inj # 2378-TCDF 2378-TCDD 12378-PCDF 23478-PCDF 12378-PCDD
Acq. Date-Time Area* Area* Area* Area* Area*
1 09/04/2010 13:39 1039 668 791 898 480
2 09/04/2010 14:43 1189 702 891 877 565
3 09/04/2010 15:47 1104 728 882 879 606
4 09/04/2010 16:51 1035 756 789 852 563
5 09/04/2010 17:55 993 704 806 948 587
6 09/04/2010 18:58 1071 661 834 897 623
7 09/04/2010 20:02 1013 654 799 1012 568
8 09/04/2010 21:06 975 635 864 953 610
9 09/04/2010 22:10 1085 618 792 835 565
10 09/04/2010 23:13 1076 709 829 873 531
11 10/04/2010 00:17 942 799 745 1003 554
12 10/04/2010 01:21 957 679 853 834 540
13 10/04/2010 02:24 1050 584 877 914 579
14 10/04/2010 03:28 935 606 802 923 666
15 10/04/2010 04:32 1051 661 855 891 642
Mean 1034 678 827 906 579
Stdevn 68 57 42 54 46
%RSD 6.60 8.48 5.11 5.98 8.02
* Raw (uncorrected) peak area
Reproducibilidad en área de pico (n=15) Extracto de cerdo añadidoNativas - 200 fg inyectados , 13C-ISTDs - 2pg Inyectados
* Raw (uncorrected) peak area
0.00
2.00
4.00
6.00
8.00
10.00
12.00
Peak
Are
a %
RS
D
Native
13C-ISTD
Conclusiones1. GCQQQ buena elección para
aplicaciones de alta sensibilidad en presencia de matriz
2. Capacidad de implementar métodos Quant/Qual –pesticidas, drogas y esteroides anabolizantes … - gracias al gran número de transiciones/unidad de tiempo que son capaces de manejar
3. Screening de dioxinas (y compuestos similares) como alternativa a los sistemas de alta resolución
4. Más de notas de aplicación:
Juan [email protected]
901.11.68.90AGILENT TECHNOLOGIES