日 植 病 報69: 349-365 (2003)

Jpn. J. Phytopathol. 69: 349-365 (2003)総 説

Agrobacterium属 細 菌 の 分 類

澤 田 宏 之1＊ ・土屋 健 一1

SAWADA, H.1* and TSUCHIYA, K.1 (2003). Taxonomy of the Genus Agrobacterium. Jpn. J. Phytopathol. 69: 349-365.

Key words: classification, nomenclature, identification, phylogeny, Agrobacterium, Rhizobium.

I. は じめ に

Agrobacterium属 細 菌 はAlphaproteobacteyia綱Rhizobiales

目Rhizobiaceae科 に属 す る グ ラ ム 陰 性,好 気 性 の 周 毛 桿 菌

で あ り(Young et al., 2003a),属 内 に は根 頭 が ん し ゅ病 菌

や毛 根 病 菌 とい っ た 重 要 な 植 物 病 原 菌 が含 ま れ て い る.そ

の た め,本 属 に関 して は 植 物 病 理 学 分 野 で の長 い研 究 の 歴

史 が あ り,病 理 学 上 重 要 な 性 質 で あ る病 原 性 が種 の レ ベ ル

の 分 類 指 標 と し て 重 視 さ れ て きた(Allen and Holding,

1974; Kersters and De Ley, 1984).し か し,後 述 す る よ う

に,Agrobacteyium属 細 菌 に お け る病 原 性 は プ ラ ス ミ ドの

有 無 に左 右 さ れ る 性 質 で あ る こ とか ら,分 類 指 標 と し て 利

用 す る の は 問 題 で は な い か との 指 摘 も あ る(Bradbury,

1986; Holmes and Roberts, 1981; Holmes, 1988; Kersters

and De Ley, 1984;澤 田,1991;澤 田 ・小 柳 津,1993a, 1993b;

Sawada et al., 1993; Young et al., 2001, 2003a).同 様 な 問 題

がAgrobacterium属 とRhizobium属 との 関 係 に お い て も認

め られ て い る.す な わ ち,前 者 は植 物 に病 気 を お こす,後

者 は 根 粒 を形 成 す る とい う性 質 に基 づ い て定 義 さ れ た 属 で

あ るが,い ず れ の 性 質 もプ ラ ス ミ ドに依 存 して い る こ と か

ら,属 の 定 義 に 用 い る の は 不 適 切 で あ る との 見 方 も あ る

(Kuykendall et al., 2003b;澤 田,2003;澤 田 ・小 柳 津,1993a,

1993b; Sawada et al., 2003; Young et al., 2001, 2003a).ま た

近 年,植 物 だ け で な く糸 状 菌,酵 母,キ ノ コ,ヒ ト培 養 細

胞 な どに お い て も,Agrobacterium属 細 菌 の プ ラ ス ミ ドを

遺 伝 子 導 入 の た め の ベ ク タ ー とし て利 用 す る こ とが 試 み ら

れ る よ う に な っ て き た(Gelvin, 2003; Kunik et al., 2001).

さ らに,臨 床 材 料 や 水 圏,土 壌 な ど の さ ま ざ ま な 環 境 か

ら,Agrobacterium属 細 菌 に類 似 した菌 株 が分 離 さ れ る 事

例 が相 次 い で報 告 され て い る(Bedzyk et al., 1999; Clermont

et al., 2001; Effendi et al., 2000; Holmes and Roberts, 1981;

Holmes, 1988; Hugenholtz et al., 1994; Lauff et al., 1990;

Miller et al., 1996; Santini et al., 2000;澤 田,2003; Sawada et

al., 2003;関 谷 ほ か,2002; Struthers et al., 1998).そ の結

果,Agrobacterium属 に 関 わ る 研 究 は,植 物 病 理 学 だ け で

な く育 種 学,生 物 工 学,土 壌 学,環 境 修 復 工 学,医 学,お

よび 関 連 す る さ ま ざ ま な 基 礎 科 学 分 野 に お い て も関 心 を持

た れ る よ うに な っ て き た.そ の た め,Agrobacterium属 の

分 類 体 系 を よ り客 観 的 か つ合 理 的 で,し か も,幅 広 い研 究

分 野 で も使 い や す い よ う な汎 用 性 や 利 便 性 を兼 ね 備 え た も

の へ と修 正 す べ きで は な い か,と い う意 見 も出 て きて い る

(Kuykendall et al., 2003b; Sawada et al., 2003; Young et al.,

2001, 2003a, 2003b).

Agrobacterium属 に 限 ら ず,細 菌 分 類 学 の 初 期 に お い て

は,動 植 物 に対 す る病 原 性 や 有 用 物 質 の生 産 性 とい っ た人

間 生 活 に とっ て重 要 な 少 数 の表 現 形 質 が分 類 指 標 と し て取

り上 げ られ,そ れ に基 づ い て属 や 種 が 定 義 ・命 名 され る と

い う 「人 為 分 類 」 が ご く普 通 に 行 わ れ て い た.し か し,細

菌 に 関 連 す る さ ま ざ ま な 分 野 の 研 究 が 進 む に つ れ,生 理 ・

生 化 学,遺 伝 学 あ るい は 分 子 生 物 学 的 な 性 質 に 関 して 菌 種

間 に 多 様 性 が見 出 され,分 類 や 同定 の た め の 指 標 と し て有

用 で あ る こ とが 明 ら か と な っ て きた.現 在 の 細 菌 分 類 学

(系 統 分 類 学)で は,そ の よ うな 成 果 を 基 に して 「自然 分

類 ・系 統 分 類 」 の 構 築 が 試 み られ て い る.す な わ ち,16S

リボ ソ ー ムRNA遺 伝 子(16S rDNA)の 塩 基 配 列 を 利 用

した 分 子 系 統 学 的解 析 に よ っ て 進 化 の 道 筋 を推 定 した 上 で

(第1図),そ の道 筋(系 統)を で き るだ け反 映 させ る よ う

に し て属 以 上 の レベ ル の 階 層 的 分 類 階 級 が組 み立 て られ て

い る.ま た,属 内 に お け る菌 株 間 の 類 縁 関 係 はDNA-DNA

交 雑 法 に よっ て定 量 的 に 評 価 さ れ,主 にそ の 結 果 に 基 づ い

て 種 の範 囲 が決 め られ て い る.さ らに,以 上 の よ う に し て

構 築 さ れ た枠 組 み の 上 に,さ ま ざ ま な 表 現 形 質,遺 伝 学 的

1独 立 行 政 法 人 農 業 環 境 技 術 研 究 所 生 物 環 境 安 全 部(〒305-8604つ くば 市 観 音 台3-1-3) Department of Biological Safety, National

Institute for Agro-Environmental Sciences, 3-1-3 Kannondai, Tsukuba, Ibaraki 305-8604, Japan

*Corresponding author (E -mail: sawada@affrc .go.jp)

350 日本植物 病理 学会 報 第69巻 第4号 平成15年11月

性質,化 学分類学的性質 などを重ね合わせるこ とによっ

て,分 類群間の境界における不連続性が確認され,自 然分

類群 としての妥当性が検証されている.す なわち,「 分類

体系構築の根幹である16S rDNA系 統樹 を,様 々な形質

を多数用いることによって総合的に評価 ・検証する」 とい

う多相分類学的手法によって,自 然分類 ・系統分類が追究

されるようにな ってきた(Boone et al., 2001; Stackebrandt

et al., 2002;鈴 木 ほか,2001).

Agrobacterium属 細菌をめぐる分類体系に関 しても,こ

のような細菌分類学の進歩 とともにさまざまな修正 ・変更

が実際に試み られて きた.1980年 の細菌学名承認 リス ト

(Approved Lists of Bacterial Names) (Skerman et al.,

1980)の 発表以後 もこの動きは続いている.す なわち,人

為分類色の強 いAgrobacterium属 細菌の分類体系 には,

属 ・種および変種 レベルにまたがって複数の問題 が複雑に

絡み合って存在 していることから(澤 田,1991, 1994; Young

et al., 2003a),そ れ らを解消することを 目指 してさまざま

な提案が相次いでなされてきた.そ の結果 として,3つ の

分類 ・命名システムが並立するような状況 とな ってお り

(第1表),そ のために同定や診断を行う上で も混乱が生 じ

ている.本 稿では,こ の分類 ・命名における変遷の歴史を

簡単に振 り返 りなが ら,そ れぞれのシステムの特徴 と今後

の展望,お よび同定において注意すべき問題点について述

べてみたい.

II. 分類 と命名

1. 病原性と病徴に基づいた属および種の人為的な分類

(第1表A)

(1) 人為分類群 の記載

A. tumefaciensやA. rhizogenesと いう我々が慣れ親 しん

できた学名が記載された当時は,「 植物に対する病原性や

病徴」が植物病原細菌の属や種レベルの分類基準 として重

視 されており,Agrobacterium属 においても主にそれに基

づいて 「人為分類」が行われていた.す なわち,1940年 代

までの間に病原性や病徴 に基づいた分類学的研究 が本属に

おいても進め られ,人 為分類群 としての種が記載 されてい

った.そ の結果,宿 主植物に対 してがんしゅを形成するも

の(根 頭 が ん し ゅ病 菌)はA. tumefaciens (Smith &

Townsend 1907) Conn 1942,毛 根を誘起するもの(毛 根

病菌)はA. rhizogenes (Riker et al., 1930) Conn 1942,

Rubus属 植物 か ら分離 された根頭がんしゅ病菌はA. rubi

(Hildebrand 1940) Starr & Weiss 1943と して記載 された.

また,植 物に対 して病原性は認められない ものの,こ れ ら

の病原菌 と通常の細菌学的検査(生 理 ・生化学的性質)で

は 区 別 で き な い よ う な 細 菌 が 土 壌 か ら分 離 さ れ る こ とか

ら,こ れ ら をA. radiobacter (Beijerinck & van Delden

1902) Conn 1942と して 記 載 し,種 の レ ベ ル で 病 原 菌 とは

区別 す る と い う措 置 が と られ た.1940年 代 に これ ら4種 が

Agrobacterium属 を 構 成 す る メ ン バ ー と して 出 揃 っ た 後

(第1表A),こ の 人 為 的 な 分 類 ・命 名 シ ス テ ム は 一 般 に

広 く用 い られ る よ うに な り(Allen and Holding, 1974),

Approved Listsに 採 録 さ れ る に至 っ た(Skerman et al.,

1980).

(2) biovarシ ス テ ム に よ る補 完

上 記 の よ う な病 原 性 に基 づ い た 種 の記 載 と並 行 して,さ

ま ざ ま な 生 理 ・生 化 学 的 性 質 も本 属 を対 象 とし た分 類 学 的

研 究 に徐 々 に導 入 さ れ て い っ た.そ の 結 果,A. rubi以 外

の3種 の 内 部 に は,生 理 ・生 化 学 的 性 質 の 異 な る複 数 の 系

統 が 存 在 し て い る こ と が 明 ら か に な っ て きた(Holmes

and Roberts, 1981; Keane et al., 1970; Kerr and

Panagopoulos, 1977; Kersters et al.,1973; Sule, 1978;

White, 1972).そ れ らの 系 統 を 整 理 して 記 載 す る た め に,

そ れ ぞ れ の 種 内 に 変 種 レ ベ ル の 分 類 階 級 で あ る 「生 理 型

(biovarあ る い はbiotype)」 が 設 け ら れ た.Bergey's

Manual of Systematic Bacteriology(以 下,BMSBと 略 す)

の 第1版 が 刊 行 され た1980年 代 に は,A. tumefaciensとA.

radiobacterの 種 内 に は そ れ ぞ れ3種 のbiovar (biovar 1～3)

が,ま たA. rhizogenesに は2種 のbiovar (biovar 1お よ

び2)の 存 在 が 認 め られ て い た(Burr et al., 1987; Kersters

and De Ley, 1984)(第1表A).

本 属 に お け る こ のbiovarを 用 い た 分 類 ・命 名 シ ス テ ム

で は,「 同 じbiovarの 番 号 を 持 つ もの は,た とえ所 属 す る

種 が 異 な っ て い て も同 じ生 理 ・生 化 学 的 性 質 を示 す 」 とい

う こ とを 表 し て い る.す な わ ち,根 頭 が ん し ゅ病 菌 で あ る

A. tumefaciens biovar 1,毛 根病 菌 で あ るA. rhizogenes biovar

1,お よび 非 病 原 菌 で あ るA. radiobacter biovar 1は,生

理 ・生 化 学 的 性 質 に 関 して は ま っ た く同 じで あ り,い わ ゆ

る細 菌 学 的 検 査 に よ っ て これ ら3種 を 区 別 す る こ とは 不 可

能 で あ る(第3表).

2. 種 レベ ル へ の 自然 分 類 ・系 統 分 類 の 導 入 の 試 み(第1

表B)

(1) 多 相 分 類 学 的 手 法 に基 づ く検 討

近 年 に お け る分 子 生 物 学 や 多 相 分 類 学 の進 歩 と と も に,

前 段 で 述 べ た 人 為 分 類 は さ ま ざ ま な 問 題 を 抱 え て い る こ と

が 浮 き彫 りに な っ て き た.そ の 中 で も特 に 重 要 な 点 は 以 下

の2つ で あ る.

(i) 病 原 性 に 関 す る 分 子 生 物 学 的 な 研 究 の 結 果,

Jpn. J. Phytopathol. 69 (4). November, 2003 351

352 日本植 物病理 学会報 第69巻 第4号 平 成15年11月

Agrobacterium属 細 菌 の 病 原 性 や 病 徴 発 現 に 関 わ る多 くの

遺 伝 子 は,染 色 体 で は な くプ ラ ス ミ ド(Tiあ るい はRiプ

ラ ス ミ ド)上 に 存 在 し て い る こ と が 明 ら か と な っ て きた

(Goodner et al., 2001; Moriguchi et al., 2001; Spaink et al.,

1998; Suzuki et al., 2000; Wood et al., 2001).し か も,こ れ

ら の プ ラ ス ミ ドの 多 くは 接 合 性 で あ り,他 の菌 株 へ と伝 達

さ れ る とい う性 質 を有 して い る上,菌 体 内 か ら脱 落 す る こ

と もあ る(Spaink et al., 1998).し た が っ て,病 原 性 や 病

徴 とい っ た プ ラス ミ ドの 有 無 に 左 右 され る よ うな性 質 を種

レベ ル の 分 類 基 準 と して 用 い て い る 限 り(す な わ ち,前 段

で 述 べ た よ うな 人 為 分 類(第1表A)の も とで は),プ ラ

ス ミ ドの 獲 得 や 脱 落 が起 こ る度 に分 類 上 の所 属 が変 わ って

し ま う こ とにな る.そ の 結 果,1つ の 菌 株 の所 属 す る分 類

群(種)が1つ に定 ま らず,種 レベ ル の 分 類 が不 安 定 に な

っ て しま う,と い う問題 が1980年 代 に 入 って か ら徐 々 に 指

摘 さ れ る よ う に な っ て きた(Bradbury, 1986; Holmes and

Roberts, 1981; Kersters and De Ley, 1984;澤 田,1991;

Sawada et al., 1993).

(ii) 種 内 変 異 を記 載 す る た め に 設 け られ た 変 種 レベ ル

のbiovarは,近 年 の 自然 分 類 ・系 統 分 類 の 基 準 に 照 ら し

合 わ せ る と,種 の レベ ル で 扱 うべ き 自然 分 類 群 で あ る こ と

が 明 らか とな って きた.す わ な ち,染 色 体 に コ ー ドさ れ た

さ ま ざ ま な生 理 ・生 化 学 的 性 質(Bouzar et al., 1993; Holmes

and Roberts, 1981; Keane et al., 1970; Kerr and

Panagopoulos, 1977; Kersters et al., 1973; Sule, 1978; Sawada

et al., 1990; Sawada and Ieki, 1992a; White, 1972),血 清 学

的 性 質(Keane et al., 1970; Ophel and Kerr, 1990; Sawada

et al., 1992c),菌 体 脂 肪 酸 組 成(Bouzar et al., 1993; Jarvis

et al., 1996; Sawada et al., 1992b; Tighe et al., 2000; Yokota

et al., 1993),全 菌 体 タ ン パ ク 質 の 電 気 泳 動 パ タ ー ン

(Kersters and De Ley, 1975)お よびDNA-rRNA相 同 性

(De Smedt and De Ley, 1977; Jarvis et al., 1986)な どの 指

標 に 基 づ い て 解 析 が 行 わ れ た 結 果,biovar 1, 2, 3お よび

A. rubiは そ れ ぞ れ が均 一 性 の 高 い 分 類 群 とし て ま とま っ

て お り,し か も分 類 群 間 の 違 い も 明 瞭 で あ っ て容 易 に識 別

で き る,と い う こ とが 明 ら か とな っ て き た(第3表).ま

た,16S rDNAに 基 づ く分 子 系 統 学 的 解 析 に お い て も,こ

れ ら4つ の 分 類 群(biovar 1, 2, 3お よ びA. rubi)は 系 統

樹 上 で そ れ ぞ れ が 異 な っ た 位 置 を 占 め る こ とが認 め られ た

(Sawada et al., 1993; Willems and Collins, 1993; Yanagi and

Yamasato, 1993)(第1図).さ らに,種 レベ ル の範 囲 を 決

め る 上 で 重 要 な 指 標 で あ るDNA-DNA相 同 値 に 関 し て

も,こ れ ら4つ の 分 類 群 は そ れ ぞ れ独 立 した 相 同性 グ ル ー

プ と して ま とま る こ とが 明 ら か とな っ た(De Ley et al.,

1973; De Ley, 1974; Ophel and Kerr, 1990;澤 田,1994).

以 上 の2点 を 主 な 根拠 とし て,人 為 的 に定 義 され て き た

Agrobacterium属 の種 レベ ル の 分 類 を,自 然 分 類 ・系 統 分

類 に 沿 った 形 へ修 正 す べ き で あ る との 意 見 も出 て き た.す

な わ ち,今 ま で 変 種 レ ベ ル の 分 類 群 と し て 扱 わ れ て き た

biovar 1, 2お よび3を,種 レベ ル の 分 類 群 と して 取 り扱 う

べ き で あ る との 指 摘 が な さ れ る よ う に な り(Bradbury ,

1986; Holmes and Roberts, 1981; Kersters and De Ley,

1984),以 下 に述 べ る よ うに1990年 代 に 入 っ て か ら筆 者 ら

を 含 め た 複 数 の グ ル ー プ に よ っ て 正 式 に 提 案 さ れ て い っ

た.

(2) 新 た に認 識 され た 自然 分 類 群 へ の 命 名

自然 分 類 群 と して のbiovar 1(第1表Aの1)の 中 に は,

前 段 で 述 べ た 人 為 分 類 に お け るA. radiobacterとA.

tumefaciensの 基 準 株 が と も に 含 ま れ て い る.し た が っ

て,biovar 1を 種 の レ ベ ル の 分 類 群 へ と格 上 げ す る 場 合

は,A. radiobacterかA. tumefaciensの ど ち らか を 種 名 と

して 用 い る こ とに な る.国 際 細 菌 命 名 規 約(Lapage et al.,

1992)の 規 則38に よ る と,そ の場 合 は 発 表 の 優 先 権 に従 う

こ とに な っ て い るの で,こ の規 則 を そ の ま ま 適 用 す る と よ

り早 く記 載 され て い るA. radiobacterがbiovar 1の 種 名 と

な る は ず で あ る(Sawada et al., 1993).と こ ろが,国 際細

菌 分 類 命 名 委 員 会 の 裁 定 委 員 会 公 表 見 解 で あ るOpinion

33に は,「A. tumefaciensをAgrobacterium属 の 基 準 種 と

す る」 こ とが 明記 され てい る こ とか ら(Judicial Commission,

1970), A. tumefaciensと い う学 名 を 廃 棄 す る こ とは で き

な い とい う 判 断 が な され た(Bouzar, 1994; Kersters and

De Ley, 1984; Oyaizu and Sawada, 1994).そ の結 果,biovar

1に 関 して は,後 か ら記 載 さ れ たA. tumefaciensの 方 が種

名 と して 採 用 され る こ と とな っ た(Bouzar, 1994; Judicial

Commission, 1995; Oyaizu and Sawada, 1994)(第1表B

の1).

biovar 2(第1表Aの2)に 関 して は,人 為 分 類 に お け

るA. rhizogenesの 基 準 株 が 含 ま れ て い る こ と か ら,A.

rhizogenesを 学 名 と して 与 え て 種 と して 取 り扱 うの が適 当

で あ る と判 断 し,筆 者 らが1993年 に 正 式 発 表 した(Sawada

et al., 1993)(第1表Bの2).ま た,biovar 3(第1表A

の3)に 対 して は,Ophel and Kerr (1990)がA. vitisと

い う学 名 を新 た に与 え,種 と して 取 り扱 う べ きで あ る とい

う正 式 発 表 を 行 って い る(第1表Bの3).

A. rubi(第1表Aの4)は 「Rubus属 植 物 の 根 頭 が ん

し ゅ病 菌 」 として 記載 さ れ た種 で あ り(Allen and Holding,

1974),病 原 性 に基 づ い て 設 け られ た とい う意 味 で は,人

為 分 類(第1表A)に お け る他 の3つ の種(A. tumefaciens,

Jpn. J. Phytopathol. 69 (4). November, 2003 353

第1図 16S rDNA配 列 に基 づい たRhizobium/Agrobacteriumお よびそ の近縁 細菌 の系 統 関係

進 化 速度 の不 均 質性 を考 慮 したモ デル(GTR+I+G)を 用 い て最小 進化 法 に よ って系 統樹 を構 築 した.枝 の長 さは推 定塩

基 置 換数 に比例 して い る.系 統樹 の枝 上 の数 値 は ブー トス トラ ップ確 率(反 復1000回)で あ る.ア ウ トグル ー プ と して用

い たPhyllobacteriaceae, Brucellaceaeお よびBartonellaceae科 に属 す る菌種 は本 図 か ら省 い た.

学 名(正 式発 表 名)で 表 示 した菌種 に ついて は,type strainの16S rDNAデ ー タを使 って 解析 を行 った.な お,こ こで は

BMSB第2版 に おい て採 用 され た学 名 が用 いて あ る.す なわ ち,Agrobacterium属 細 菌 に つい ては,第1表Bの シ ステ ム

に基づ いて表 記 を行 ってい る.根 頭が ん しゅ病菌 は緑色,毛 根病 菌 は青 色,根 粒菌 は ピン ク色 で示 した.Allorhizobium undi-

colaお よびEnsifer adhaerensに つ いて は,そ れぞ れ・ お よび★ を付 け て位 置 を 示 して あ る.ま た,正 式発 表名 でな い菌名

に ついて は,引 用 符(“ ”)で 囲ん で表示 した.

A. rhizogenesお よびA. radiobacter)と 同 じ 出 発 点 に た っ

て い る よ う に思 え る.し か し,前 述 の よ う に各 種 表 現 形 質

やDNA-DNA相 同 値 の 点 で も特 異 性 が 認 め ら れ る こ とか

ら,A. rubiは 染 色 体 レベ ル の 特 異 性 を反 映 し た 自然 分 類

群 で あ る とい う こ とが 明 らか とな って きた(Holmes, 1988;

Kersters and De Ley, 1984).す な わ ち,プ ラ ス ミ ドの 情

報 を 主 な 拠 り所 に し て組 み 立 て られ た 人 為 分 類 体 系(第1

表A)の 中 で,A. rubiだ け が 種 の 分 類 基 準 と し て 本 来 用

い る べ き もの に 図 らず も合 致 して い た とい う こ とにな る.

した が っ て,A. rubiに つ い て は 従 来 か ら の 学 名 の ま ま

で,種 レベ ル の分 類 群 と して 今 後 もそ の ま ま扱 わ れ る べ き

で あ る と考 え られ て い る(Bradbury, 1986; Kersters and

354 日本植 物 病理 学 会報 第69巻 第4号 平 成15年11月

De Ley, 1984; Sawada et al., 1993)(第1表Bの4).

以 上 の よ う に,Agrobacterium属 の種 の レベ ル へ 自然 分

類 ・系 統 分 類 の考 え 方 を導 入 し よ う とい う試 み は,既 知 の

分 類 群 に 関 し て は1995年 ま で に 提 案 が す べ て 出揃 い,属 内

に4つ の 種,す な わ ち,A. tumefaciens(=人 為 分 類(第

1表A)に お け るbiovar 1に 相 当 す る),A. rhizogenes

(=biovar 2), A. vitis (=biovar 3)お よ びA. rubi (=A.

rubi)が 設 け られ た(第1表Bの1～4).こ の よ う な 状

況 を も とに 筆 者 ら は,BMSB第2版 の 第2巻 に お い て,

この 「種 レベ ル に 自然 分 類 を導 入 した シ ス テ ム 」 に基 づ い

てAgrobacterium属 の記 載 を 行 っ た(Young et al., 2003a).

な お,こ こ で 注 意 す べ き 点 は,A. tumefaciensやA.

rhizogenesと い うま っ た く同 じ種 名 が 第1表 のAとBの

シ ス テ ム で用 い られ て い る も の の,そ の 中 身 は 異 な っ て い

る とい う こ と で あ る.Aの シ ス テ ム に お け る 種 は い ず れ

も病 原 性 に基 づ い て 定 義 され た人 為 分 類 群 で あ り,病 原 性

に 関 し て は 種 内 は 均 一 で あ る.す な わ ち,A. tumefaciens

に は 根 頭 が ん し ゅ病 菌 の み が 含 ま れ て お り,A. rhizogenes

は毛 根 病 菌 の み が構 成 メン バ ー とな って い る.た だ し,生

理 ・生 化 学 的 性 質 に 関 して は種 内 に 大 き な変 異 を 抱 え て い

る.一 方,Bの シ ス テ ム に お け る種 は い ず れ も病 原 性 に 関

し て は 均 一 で は な く,A. tumefaciensと 。A. rhizogenesに は

そ れ ぞ れ 「根 頭 が ん し ゅ病 菌,毛 根 病 菌 お よび 非 病 原 菌 」

とい う3つ の タ イ プ が す べ て 含 ま れ て い る.た だ し,生

理 ・生 化 学 的 性 質 に 関 して は どち らの 種 内 もそ れ ぞ れ 均 一

で あ り,自 然 分 類 群 と して よ くま とま っ て い る(第3表).

(3) A. larrymooreiの 記 載

フ ロ リダ で イ チ ジ ク の が ん し ゅ組 織 か ら分 離 さ れ た 根 頭

が ん し ゅ病 菌 は,生 理 ・生 化 学 的 性 質,DNA-DNA相 同

値 お よ び16S rDNAに 基 づ く分 子 系 統 に 関 し て,Agro-

bacterium属 の い ず れ の既 知 菌 種(第1表Bの1～4)と

も 異 な っ て い る こ と が 明 ら か と な っ た(Bouzar et al.,

1995; Bouzar and Jones, 2001).そ れ を根 拠 と してBouzar

and Jones (2001)は,こ の 分 離 菌 株 をAgrobacterium属

の 新 種 と し て 扱 う べ きで あ る と考 え,2001年 にA. larry-

mooreiと 命 名 して記 載 した(第1表Bの5).

「イ チ ジ ク の 根 頭 が ん し ゅ病 菌 」 で あ るA. larrymoorei

は,一 見 病 原 性 に基 づ い て定 義 さ れ た 人 為 分 類 群 の よ うに

も 思 え る.し か し,本 種 の 各 種 性 状 は,A. rubiと 同 様 に

本 種 も 自然 分 類 ・系 統 分 類 に 基 づ い て設 け られ た 自然 分 類

群 で あ る とい う こ と を 明確 に 示 し て い る.し た が って,現

時 点(2003年7月 現 在)で は,上 述 の4種(A. tumefa-

ciens, A. rhizogenes, A. vitisお よ びA. rubi)にA. larry-

mooreiを 加 え た 合 計5種 が,Agrobacterium属 を 構 成 す る

種 レベ ル の 自然 分 類 群 と して 認 め られ て い る こ とに な る

(第1表Bの1～5) (Bouzar and Jones, 2001; Young et

al., 2003a).

3. 属 レベ ル へ の 自然 分 類 ・系 統 分 類 の 導 入 の 試 み(=属

の 統 合)(第1表C)

(1) 属 レベ ル に お け る 自然 分 類 群 の 認 識

前 段 の よ う に し てAgrobacterium属 内 の 種 レ ベ ル へ と 自

然 分 類 ・系 統 分 類 を 導 入 す る試 み が 進 め られ て い っ た が,

Agrobacterium属 に は 属 レ ベ ル に も分 類 上 の 問 題 が あ り,

そ れ が 未 解 決 の ま ま 残 さ れ て い た.す な わ ち,Agro-

bacterium属 お よび そ の 近 縁 の 複 数 の 属 は い ず れ も人 為 分

類 群 で あ り,こ れ らの 「属 の 定 義 お よび 範 囲 」 と分 子 系 統

学 や分 子 生 物 学 に お け る解 析 結 果 との 間 に整 合 性 が 認 め ら

れ な い こ とが 以 下 の よ うに 明 らか とな っ て きた.

(i) Rhizobium属 やAllorhizobium属 は い わ ゆ る 根 粒 菌

(マ メ 科 植 物 に 根 粒 を形 成 し て 共 生 窒 素 固 定 を 行 う土 壌 細

菌)を 構 成 メ ン バ ー とす る属 で あ る.す な わ ち,い ず れ の

属 も 「根 粒 菌 を 含 む 種 」 の み が構 成 メン バ ー と して 認 め ら

れ て お り,属 の 定 義 上 「根 粒 菌 を 含 ま な い種 」 は正 式 メ ン

バ ー と して 受 け 入 れ て も ら え な い状 況 に あ る(Kuykendall

et al., 2003b; Kuykendall and Dazzo, 2003; Sawada et al.,

2003).こ れ ら の2属 がAgrobacterium属 と近 縁 で あ る こ

とを 示 唆 す る デ ー タ は 以 前 か ら報 告 さ れ て い た(De Ley,

1968; Graham, 1964; Heberlein et al., 1967; Kerr, 1992;

White, 1972).近 年,こ れ らの 関 係 に つ い て 分 子 系 統 学 的

に詳 しい 解 析 が 行 わ れ る よ う にな り,16S rDNA系 統 樹 に

お い てRhizobiumお よ びAllorhizobium属 細 菌 は,Agro-

bacterium属 細 菌 な ど と と も に1つ の 独 立 し た 単 系 統 群

(第1図 にRhizobium/Agrobacterium cladeと し て示 し た)

を形 成 す る こ とが 明 らか とな って き た.し か も,い ず れ の

解 析 例 に お い て も,形 成 さ れ た 単 系 統 群 内 で こ れ ら3属 の

メ ンバ ー は無 秩 序 に 混 在 して しま い,そ れ ぞ れ の属 ご と に

ま とま る とい う よ う な 傾 向 は ま っ た く観 察 さ れ て い な い

(第1図;な お,Allorhizobium属 細 菌(Allorhizobium undi-

cola)に は ・ を 付 し て 位 置 を 示 し た)(De Lajudie et al.,

1999; Sawada et al., 1993, 2003; Willems and Collins, 1993;

Yanagi and Yamasato, 1993; Young et al., 2001).

(ii) 以 下 に 述 べ る よ う に,病 原 性 や 共 生 窒 素 固 定 に 関

す る分 子 生 物 学 的 な 研 究 の 結 果,こ れ ら3つ の属 の メ ン

バ ー は 基 本 的 に類 似 した遺 伝 的 背 景(染 色 体)を 共 有 し て

お り,互 い に プ ラ ス ミ ドの 交 換 が 可 能 で あ る こ とが 明 ら か

と な っ て き た.Rhizobium属 の 根 粒 菌 は 共 生 プ ラ ス ミ ド

(Symプ ラ ス ミ ド)を 有 して お り,こ の 上 に 根 粒 形 成 や 窒

Jpn. J. Phytopathol. 69 (4). November, 2003 355

素 固 定 に 関 与 す る遺 伝 子 群(共 生 窒 素 固 定 遺 伝 子 群)の 多

くが 存 在 し て い る(Kuykendall et al., 2003b; Spaink et

al., 1998).近 年 に な り,こ のSymプ ラ ス ミ ド はAgro-

bacterium属 の 病 原 性 プ ラ ス ミ ド(Tiお よびRiプ ラ ス ミ

ド)と 系 統 進 化 上 きわ め て 近 縁 で あ っ て,共 通 の 祖 先 に 由

来 す る と考 え ら れ る よ う に な っ て き た(Freiberg et al.,

1997; Moriguchi et al., 2001).ま た,Symプ ラ ス ミ ドはTi

お よびRiプ ラ ス ミ ド と同様 に 伝 達 性(他 の 接 合 性 プ ラ ス

ミ ドに よ っ て可 動 化 され る タ イ プ の も の も含 む)で あ り,

Agrobacterium属 細 菌 へ も伝 達 さ れ う る こ とが 知 られ て い

る(Spaink et al., 1998).さ ら に,プ ラ ス ミ ドを受 容 した

接 合 体 中 で は,プ ラス ミ ド上 の 遺 伝 子 群 が 正 常 に発 現 して

機 能 す る こ と も認 め ら れ て い る.す な わ ち,Symプ ラ ス

ミ ドが 伝 達 さ れ たAgrobacterium属 細 菌 は 共 生 窒 素 固 定

能 を 獲 得 す る こ とが認 め ら れ て い る(Brom et al., 1988;

Martinez et al., 1987; Novikova and Safronova, 1992).ま

た,逆 にTiプ ラ ス ミ ドを 獲 得 したRhizobium属 細 菌 が が

ん し ゅ形 成 を 行 う こ とも確 認 さ れ て い る(Hooykaas et al.,

1977).以 上 の こ とか ら,プ ラ ス ミ ドの 脱 落 に よ っ て病 原

性 や 共 生 窒 素 固 定 能 が 失 わ れ た り,プ ラ ス ミ ドの伝 達 に よ

っ て これ らの 性 質 が 他 の 菌 株 へ と新 た に 付 与 さ れ た りす る

よ う な こ とが,遺 伝 的 背 景 の 類 似 し て い るRhizobium/

Agrobacterium cladeの メ ン バ ー 間 に お い て,進 化 の 過 程

で 実 際 に行 わ れ て きた こ とが 予 想 され て い る(De Lajudie

et al., 1999; Kuykendall et al., 2003b; Laguerre et al., 2001;

Segovia et al., 1991; Suominen et al., 2001).そ の結 果 と し

て,そ れ ぞ れ の プ ラス ミ ドを 有 す る菌 株 が 単 系 統 群 内 にお

い て 不 規 則 に点 在 す る よ うな 状 況(第1図)が もた ら され

た の で あ ろ う と思 わ れ る.

根 粒 菌 の 分 類 体 系 は以 上 の よ うな 遺 伝 学 的 ・生 態 学 的 な

背 景 が 十 分 に解 明 され て い な い 時 期 に構 築 さ れ た た め,人

間 生 活 に 関 わ る実 用 的 な形 質 と して 共 生 窒 素 固定 能 が 最 初

に 注 目さ れ,属 レベ ル の分 類 基 準 と して 重 要 視 さ れ る こ と

に な っ た よ う で あ る.こ の あ た り の 事 情 は,前 述 の

Agrobacterium属 に お け る属 や 種 の 成 立 過 程 と き わ め て 類

似 し て い る.そ の結 果 と し て,Rhizobium/Agrobacterium

cladeの 中 か ら特 定 の プ ラ ス ミ ドを有 し て い る菌 株 が 人 為

的 に 拾 い 上 げ られ て属 と して ま とめ られ る こ と とな った.

す な わ ち,Tiあ る い はRiプ ラ ス ミ ドを 有 して い る もの は

Agrobacterium属 細 菌,Symプ ラ ス ミ ドを有 して い る もの

はRhizobiumあ る い はAllorhizobium属 細 菌 と し て記 載 さ

れ て い っ た.そ の た め に,3つ の 属 の メン バ ー が 系 統 樹 上

で 不 規 則 に入 り乱 れ て しま う よ うな 混 乱 し た状 況(第1図)

が もた ら され た と考 え られ て い る(De Lajudie et al., 1999;

Kuykendall et al., 2003b;澤 田,2003; Sawada et al., 1993,

2003; Young et al., 2001, 2003b).し た が っ て,Rhizobium/

Agrobacterium cladeの 中 に含 ま れ て い る こ れ ら3つ の 属

は,進 化 の 過 程 を考 慮 す る こ とな く便 宜 的 ・恣 意 的 に構 築

さ れ た 人 為 分 類 群 で あ り,自 然 分 類 ・系 統 分 類 とは相 反 す

る もの で あ る こ とは 明 らか で あ る.

そ れ で は,Rhizobium/Agrobacterium cladeに お け る属

レ ベ ル の 分 類 体 系 は,こ れ か ら どの よ う に見 直 され て い く

の で あ ろ う か.可 能 性 として は,以 下 の3つ の 選 択 肢 が 考

え ら れ て き た(Broughton, 2003; Farrand et al., 2003;

Gaunt et al., 2001; Kuykendall et al., 2003b;澤 田,2003;

Sawada et al., 2003; van Berkum et al., 2003; Young et al.,

2001, 2003a, 2003b).す な わ ち,

(I)属 レベ ル に お け る人 為 分 類(第1表Aあ る い は

B)が 持 つ と され る 実 用 性 ・利 便 性 を 重 視 し,

今 後 も そ の ま ま 存 続 させ て い く.

(II)分 子 系 統 解 析(第1図)の 結 果 を 重 視 し,単 系

統 群(Rhizobium/Agrobacterium clade)全

体 を1つ の 属 と して ま と め る.

(III)単 系 統 群 の 中 に 認 め られ る よ り小 さ な 系 統(例

え ば,第1図 にIG I (intrageneric cluster I

の 略)やIG IIと して 示 した よ うな 系 統)ご と

に 属 と して 独 立 させ る.

こ の う ち,選 択 肢(I)は 以 下 の よ う な 問 題 を抱 え て い

る.(i)こ の よ う な 人 為 的 な 分 類 群(属)を 容 認 し続 け て

い る と,人 為 的 に 定 義 され た 新 属 が 次 々 に誕 生 す る とい う

事 態 を 招 きかね な い とい う問題 が あ る.す な わ ち,Rhizobium

/Agrobacterium cladeに は植 物 病 原 菌 や 根 粒 菌 だ け で は な

く,湖 沼 な ど か ら分 離 され た 出 芽 で 増 殖 す るBlastobacter

属 細 菌(Bla. aggregatusお よびBla. capsulatus),亜 ヒ酸 酸

化 細 菌(NT-26お よび “Agrobacterium albertimagni”),

脱 窒 菌(Pseudomonas sp. G-179)な ど を 始 め とす る さま ざ

ま な 環 境 由 来 の “雑 菌 ”(い わ ゆ る 環 境 微 生 物)も 多 数 入

り込 ん で くる こ とが 明 ら か に な っ て き た(Bedzyk et al.,

1999; Effendi et al., 2000; Hugenholtz et al., 1994; Lauff et

al., 1990; Santini et al., 2000; Sawada et al., 2003;澤 田,2003;

関 谷 ほ か,2002).第1図 に は そ の よ う な 環 境 微 生 物 の う

ち の ご く一 部 を代 表 として 示 して あ る.し か し,属 レベ ル ー

に お け る 人 為 分 類(第1表Aあ る い はB)の も とで は,

「病 原 性 や 共 生 窒 素 固 定 能 が確 認 で き て い な い 菌 株 の み で

構 成 さ れ た 種 」 が,Agrobacterium属 やRhizobium属 の 正

式 な 「新 種 」 と して 受 け 入 れ られ る こ とは 考 え られ な い.

ま た,第1表Aに お け るA. radiobacterは 非 病 原 菌 か らな

る分 類 群 で は あ る が,同 じ生 理 ・生 化 学 的 性 質 を 有 す る病

356 日本 植物病 理 学会報 第69巻 第4号 平成15年11月

原 菌 がA. tumefaciensやA. rhizogenesの 「biovar 4」 と し

て記 載 さ れ て い な い 以 上,新 た に見 つ か った 非 病 原 菌 だ け

をA. radiobacterへ 「biovar 4」 と して記 載 す る こ と も受 け

入 れ られ な い で あ ろ う.し た が っ て,ど こに も行 き場 が な

い この よ う な環 境 微 生 物 を 正 式 に記 載 す るた め に は,そ の

受 け 皿 と な る 人 為 的 な 新 属 をRhizobium/Agrobacterium

clade内 に新 た に 設 け る 以 外 に 手 は な い.し か し,そ の よ

う な こ とを 行 う と,clade内 に 人 為 的 な 属 が 今 以 上 に 乱 立

す る こ とに な り,属 レベ ル の 混 乱 が ま す ま す 悪 化 して し ま

う こ と に な る.(ii)上 記 の よ うな 環 境 微 生 物 が 新 属 新 種

として 一 旦 記 載 さ れ た 後 で,こ れ らに プ ラ ス ミ ドが伝 達 さ

れ て 病 原 性 や 共 生 窒 素 固 定 能 が 新 た に付 与 さ れ る よ うな こ

とが 起 こ る と,当 該 種 をAgrobacterium属 やRhizobium属

へ と移 さざ る を得 な くな る.す な わ ち,伝 達 性 プ ラ ス ミ ド

を受 け 取 る こ とに よ っ て,受 容 菌 の 分 類 上 の 位 置 づ け(所

属 す る属)が 変 わ っ て し ま う こ とに な り,分 類 が 不 安 定 に

な って し ま う とい う深 刻 な 問題 も生 じ る.こ の よ うな 事 例

はRhizobium/Agrobacterium cladeの 姉 妹 群 で あ るSino-

rhizobium cladeに お い て 以 下 の よ う に 実 際 に観 察 さ れ て

い る.Sinorhizobium clade内 に は,根 粒 菌 を:構 成 メ ン

バ ー とす るSinorhizobium属 と,非 根 粒 菌 が 構 成 メ ン バ ー

とな っ て い るEnsifer属 とが 含 ま れ て お り,後 者 に は 「他

の細 菌 に 吸 着 し て 溶 菌 す る能 力 を 有 す る土 壌 細 菌 」 と定 義

さ れ たEnsifer adhaerensと い う 種 が 記 載 さ れ て い る

(Casida, 1982)(第1図 に お い て ★ を付 して 示 した).最 近

に な り,共 生 窒 素 固 定 能 を 有 す るEnsifer adhaerensの 野

生 株 が 新 た に 発 見 さ れ た こ とか ら,Ensifer adhaerensを

Sinorhizobium属 へ と移 してSinorhizobium adhaerensと す

る こ とが提 案 さ れ た も の の,そ の 是 非 を め ぐ って 論 争 が 始

ま って い る の で あ る(Willems et al., 2003; Young, 2003a).

(iii)選 択 肢(I)の も とで は,病 原 性 や 共 生 窒 素 固 定 能 を

確 認 す る こ とが 属 レベ ル の 分 類 ・同 定 を行 う上 で 必 須 とな

るが,植 物 以 外 の 分 離 源 か ら得 られ た 未 知 の環 境 微 生 物 を

対 象 とす る場 合,こ の 作 業 は大 変 な 困 難 を伴 うで あ ろ う.

どれ だ けの 検 定 植 物 を 用 い れ ば い い の か,と い う問 題 を 解

決 した 上 で,こ の 確 認 作 業 を説 得 力 あ る形 で完 了 す る こ と

は果 た して 可 能 な の で あ ろ う か?以 上 の よ うに,選 択 肢

(I)の も とで は,Rhizobium/Agrobacterium cladeに 関 わ

る分 類 ・同定 の い ず れ の 場 面 に お い て も,こ れ か らま す ま

す混 乱 に拍 車 が か か って し ま い そ うで あ る.

ま た,選 択 肢(III)も 以 下 の よ う な 問 題 点 を 抱 え て い

る(De Lajudie et al., 1999; Gaunt et al., 2001; Sawada et

al., 2003;澤 田,2003). (i) IG IとIG IIの どち らの 系 統 に

関 して も,そ れ ぞ れ の 系 統 の ま とま りを示 す ブ ー トス トラ

ッ プ 確 率 は低 い こ とが 認 め られ た(第1図).(ii)そ れ ぞ

れ の系 統 内 の菌 種 は,系 統 樹 上 に お け る位 置 が 必 ず し も安

定 して い る わ け で は な く,解 析 条 件 を変 え る と も う一 方 の

系 統 内 へ と移 動 して し ま う,と い う現 象 が しば しば 観 察 さ

れ た(澤 田,2003; Sawada et al., 2003; Young et al., 2001).

以 上 の よ うな 傾 向 は,atpDやrecAを 用 い た 解 析 で も 同 様

に認 め られ て い る(Gaunt et al., 2001). (iii) IG IとIG II

の 間 に は表 現 形 質 に 関 す る不 連 続 性 が 見 出 さ れ て お らず,

そ れ ぞ れ の系 統 を 表 現 形 質 を 用 い て 特 徴 づ け る こ とが 今 の

と ころ で きて い な い.以 上 の こ とは,IG IとIG IIは どち

ら も 自然 分 類 群 と して 認 め る だ け の 要 件 を満 た して お ら

ず,そ れ ぞ れ を 属 と し て 扱 う の は 現 段 階 で は 不 適 当 で あ

る,と い う こ と を示 して い る.Rhizobium/Agrobacterium

cladeの 内 部 に認 め ら れ るIG IやIG IIの よ うな系 統 の 分

類 上 の位 置 づ け に 関 して は,今 後 も慎 重 に検 討 して い く必

要 が あ りそ うで あ る.

選 択 肢(II)に 関 し て は,以 下 の よ うな 点 か ら現 時 点 で

は 最 も有 望 な 選 択 肢 と言 え る の で は な い だ ろ うか.(i)

Agrobacterium, Allorhizobiumお よ びRhizobium属 に 属 す

る既 知 菌 種 が,Rhizobium/Agrobacterium cladeと して1

つ に ま とま っ て い る.第1図 で は この 単 系 統 群 の ま とま り

を 示 す ブ ー トス トラ ップ 確 率 は75%と な っ て い るが,最 尤

法 に よる解 析(Young et al., 2001)やatpDやrecAを 用 い

た 解 析(Gaunt et al., 2001)で は 高 い値 が得 られ て い る.

(ii)各 種 表 現 形 質 や 化 学 分 類 学 的 性 質 に関 し て も こ れ ら

3属 は 多 く の 共 通 点 を 有 し て お り,し か も 近 縁 の

Sinorhizobium属 細 菌 との 問 に は 不 連 続 性 が 認 め ら れ て い

る(Kuykendall and Dazzo, 2003; Kuykendall et al., 2003a,

2003b; Tighe et al., 2000; Yokota et al., 1993; Young et al.,

2003a, 2003b).以 上 の こ と は,1つ の ま とま った 自然 分

類群 と 見 な す だ け の 要 件 をRhizobium/Agrobacterium

cladeが 満 た して い る こ とを 示 して い る.(iii) Rhizobium

/Agrobacterium cladeに1ま,前 述 の よ う に病 原 性 や 共 生 窒

素 固 定 能 の認 め られ て い な い さ ま ざ ま な環 境 微 生 物 も 含 ま

れ て い る.し か し,こ の 単 系 統 群 全 体 を1つ の 属 と し て ま

とめ て お け ば,た とえ ど の よ うな 環 境 微 生 物 で あ って も,

必 要 に応 じて属 の 定 義 を微 調 整 す る だ け で 「こ の属 の 新 種 」

と して正 式 に記 載 す る こ とが で き る よ うに な る.以 上 の よ

う に選 択 肢(II)は,自 然 分 類 ・系 統 分 類 の 観 点 か ら も,

実 用 上 の利 便 性 の 観 点 か ら も優 れ て い る よ う に考 え られ る

こ とか ら,そ の 実 現 の た め の 第1歩 として 「Agrobacterium,

Allorhizobiumお よ びRhizobium属 を1つ の 属 とし て ま と

め る 」 こ とが 筆 者 ら に よ っ て 提 案 さ れ た(Young et al.,

2001).

Jpn. J. Phytopathol. 69 (4). November, 2003 357

(2) 属 の統 合 後 に お け る 各 分 類 群 の 命 名

統 合 後 の属 の 名 前 は,発 表 の 優 先 権 の 規 則(規 則38)に

従 っ て 決 め ら れ る こ と に な っ て い る(Lapage et al.,

1992).し た が っ て,こ の 場 合 は3属 の うち で 最 も早 くに

記 載 さ れ て い た 「Rhizobium」 が適 用 さ れ る こ と に な る.

そ こで,統 合 の 時 点 でAgrobacterium内 に 記 載 さ れ て い

た そ れ ぞ れ の 種(第1表Bの1～4)に 対 し て,新 し い

学 名(新 組 合 せ)を 以 下 の よ うに提 案 した(Young et al.,

2001).

第1表B-1のA. tumefaciens(=第1表A-1のbiovar

1に 相 当 す る)に 関 して は,以 下 の よ う に判 断 した.す な

わ ち,Opinion33に よ って 「A. tumefaciensはAgrobacterium

属 の 基 準 種 で あ る 」 と宣 言 さ れ て い た た め に,Agro-

bacterium属 を採 用 し て い る 限 りは,よ り古 くか ら存 在 し

て い た 「radiobacter」 よ り 「tumefaciens」 の 方 を 優 先 せ ざ

る を 得 な か っ た.し か し,属 の 統 合 に よ っ てA. tume-

faciens (=biovar 1)がRhizobium属 へ と移 さ れ る と,

Opinion 33の 縛 りか ら解 放 され るの で,優 先 権 の 規 則 に従

っ てradiobacterが 適 用 さ れ る こ と に な る.そ こ で,A.

tumefaciens (=biovar 1)に 対 して はR. radiobacterを 提 案

した(第1表Cの1).

そ れ 以 外 の 分 類 群 に関 して は,以 前 の種 形 容 語(第1表

Bの2～4)を そ の ま ま 属 名 のRhizobiumと 組 み 合 わ せ

る こ とに な る.す な わ ち,A. rhizogenes (=biovar 2)に

対 して はR. rhizogenes, A. vitis (=biovar 3)に 対 して は

R. vitis, A. rubiに 対 し て はR. rubiを そ れ ぞ れ 新 組 合 せ と

して 提 案 した(第1表Cの2～4).

A. larrymoorei(第1表Bの5)に 関 し て は,属 を統 合

す る提 案(Young et al., 2001)の 直 後 にAgrobacterium属

の新 種 と して 発 表 さ れ た(Bouzar and Jones, 2001)の で,

.Rhizobium属 へ と移 す た め の 正 式 発 表 か ら漏 れ て し ま って

い た.し か し,A. larrymooreiの 記 載(Bouzar et al., 1995;

Bouzar and Jones, 2001)を 見 る限 り,本 種 が 統 合 後 の

Rhizobium属 の 記 載 と合 致 し て お り,し か も属 内 の い ず れ

の既 知 菌 種 と も異 な っ て い る こ とか ら,Rhizobium属 に 属

す る 種 レ ベ ル の 独 立 した 自然 分 類 群 で あ る こ とは 明 らか で

あ る.そ こ で,本 種 もRhizobium属 へ と移 し,Rhizobium

larrymooreiと す る こ と が 改 め て 提 案 さ れ た(Young,

2003b)(第1表Cの5).

4. 自然 分 類 ・系 統 分 類 に お け る病 原 性 の 表 記(第1表

Bお よ びC)

属 や 種 の レベ ル へ 自然 分 類 ・系 統 分 類 が導 入 さ れ,属 や

種 が 自然 分 類 群 と して 整 理 さ れ た 場 合,各 菌 株 の 病 原 性 に

関す る情報は どの ようにして表現すればいいのであろう

か?す なわち,第1表 のBやCの システムにおける多 く

の種は,「 種内に根頭がんしゅ病菌,毛 根病菌や非病原菌

が混在 している」状態になっているので,各 菌株の病原性

の状態を何 らかの方法で表記することが実用上求め られる

ことになる.

pathovar (Kerr et al., 1978)やvariety (Keane et al.,

1970; Kerr and Panagopoulos, 1977)の レベルで,tume-

faciensやrhizogenesな どの形容語を利用す ることによっ

て病原性の状態(す なわち,根 頭がんしゅ病菌や毛根病菌

であること)を 表す,と いう方法が1970年 代に提唱されて

いた.し かし,病 原性に関わる多 くの遺伝子が伝達性プラ

スミド上に存在していることか ら,こ のような学名に準ず

るような用語を用いて病原性を表記すると,種 や属のレベ

ルで指摘されていたの と同様な問題 すなわち,分 類体系

そのものが不安定になってしまうという問題が生 じること

になる.

その後,そ の様 な事態を避 け るために,Holmesら に

よ って学名 とは別 の補助 的 な表現 方法 が工夫 され た

(Holmes and Roberts, 1981; Holmes, 1988).筆 者 らは本属

へ と自然分類を導入するにあた り,こ のHolmesら の考え

方を採用 して病原性の表記を行 った(Young et al., 2001;

Young et al., 2003a)(第1表Bお よびC).す なわち,根

頭がんしゅ病菌にはtumorigenicと いう形容詞を学名の前

に付けるか,あ るいは,学 名の後 に(Ti strain)あ るいは

(Ti)を 付記する.毛 根病菌では学名の前にrhizogenic,

あるいは後に(Ri strain)や(Ri)を 付ける.ま た,非 病

原菌の場合にはnonpathogenicを 学名に付ける,と いう表

記方法を用いた.こ の方法は,病 原性大腸菌などの医学細

菌において用いられている方法(例 えば,腸 管出血性大腸

菌はenterohemorrhagic Escherichia coli O157: H7と 表記

され る)と 基本的に同じである.

5. これからどの分類 ・命名システムを用いればいいので

あろうか?

今 まで述 べて きた ように,Agrobacterium属 細菌 の分

類 ・命名システム として現時点で有効なものは3つ 存在 し

ている(第1表A, Bお よびC).自 然分類 ・系統分類の

導入が種のレベル と属のレベルの2回 に分けて行われたた

めに,3タ イプが並立することになったわけである.種 と

属の レベルへの導入を一度にまとめて行っていれば,選 択

肢 の数を1つ 減 らす こと(す なわち,第1表 におけ るB

のシステムを省 くこと)が できたはずである.し かし,

「その ような大幅な変更 を同時に行 うのは混乱をもた らす

358 日本植 物 病理 学会報 第69巻 第4号 平 成15年11月

ので避けるべきだ」という理 由のもとで,Agrobacterium・

Rhizobium分 類小委員会がそういった提案を認めてこなか

ったのである.

ここで注意すべ き点は,こ れ らの分類 ・命名システムは

どれも強制力を持っているわけではないとい うことと,い

ずれの命名 も規約上は有効であ り,現 時点ではどれを用い

ても間違いにはならない,と いうことである(Lindstrom,

2002).す なわち,新 しい分類の提案はそれまでの分類の

持つ欠点を修正することを目的 としているものの,新 しい

提案が出たからといって古い学名が廃棄されるわけではな

く,ど ち らを使 うかは各研究者の裁量 に任 されているので

ある.ま た,本 当に欠点が修正されてよ り良い分類 ・命名

システムになっているかどうかについては,今 後 も科学的

に検証し,客 観的に評価を行ってい く必要があろう.こ の

点については,分 類学の進歩 とともに新 しい手法がいろい

ろと導入され,科 学的な厳密 さの観点から慎重に検討され

てい くもの と思われる.ま た,そ の際は,実 用上の利便性

に関して も同時に吟味 されてい くであろう.最 終的には,

科学的な厳密 さと実用上の利便性の両方がバラソスよく備

わ ってい るシ ステム に収束 して い くもの と思 われ る

(Lindstrom, 2002;澤 田,2003; Sawada et al., 2003).た だ

し,研 究者の間でその方向性がはっきりし,さ らにそれが

一般に認知されて広 く定着するまでにはまだ長い時間がか

かるもの と思われる.

それでは,そ の結論が出るまでの間,と りあえずどう対

処すればいいのであろうか?第1表Aの 「人為分類シ

ステム」は1984年 のBMSB第1版(Kersters and De Ley,

1984)で 採用 されていたものであ り,現 在で も多 くの研究

者が実際に用いている.し かも,既 知の分類群に属する典

型的な菌株のみを扱っている限 りは,不 都合な場面 に出会

うこ とも少 ない と思われるこ とか ら,こ れ か らもこの

biovarシ ステムを用いた人為分類を支持 し続ける研究者

は多い もの と思われる(Broughton, 2003; Farrand et al.,

2003; van Berkum et al., 2003).ま た,第1表Bの 「種レ

ベルに自然分類 を導入 したシステム」については,BMSB

第2版(Young et al., 2003a)やLaboratory Guide for

Identification of Plant Pathogenic Bacteria (Moore et al.,

2001)で 採用 されたことから,今 後 このシステムを用いる

研究者が徐々に増えてい くことも予 想 される.第1表C

の 「属 レベルへも自然分類を導入したシステム」に関して

も,ATCCを はじめ とする菌株保存機関のデー タベース

で採用されていることから,こ れから徐 々に認知 されてい

く可能性もある.

したがって,今 後 しばらくの間は,3つ のシステムのい

ずれ もが並行 して用いられるという混沌 とした状態が続 く

のではないか と思われる.そ のような時に重要なことは,

どのシステムの学名を用いているのかを明確 に示すことで

あろう.こ のうち,Cの システムを用いる場合は,属 名に

よってそれが明示されているので他のシステム と混同され

る心配はない.一 方,AやBの システムを用 いる場合は

注意 が必 要 で あ る.特 に,「A. tumefaciens」 と 「A.

rhizogenes」 に関 しては,ま った く同じ学名がAとBで 用

い られているが,そ の指し示す中身が異なっているので,

どち らのシステムに依るものなのかをはっきりと明示する

ことが是非 とも必要 となる.具 体的には,Aの システム

に基づいている場合は,「BMSB第1版(Kersters and De

Ley, 1984)で 用 いられた分類 ・命名システムに従 う」 と

い うことを最初に明記 した上で,学 名に 「biovarの情報」

を必ず付記す るべきであろう.Bに 従 っている場合は,

「BMSB第2版(Young et al., 2003a)で 用い られた分類 ・

命名 シ ス テム に従 う」 とい うこ とを 明記 した上 で,

「tumorigenicや(Ri)な どの病原性に関する情報」を学

名に付記する,と いう措置が有効ではないだろうか.い ず

れにせ よ,第1表 に示 したように,「種名(属 名 と種形容

語)だ けではな く,そ れに付随 した補助的な表現方法 も含

めて記す」 ことを心掛けるようにすれば,正 確 に情報を伝

えることができる上,将 来た とえ別のシステムが選ばれた

としても,新 しい学名へ と容易に読み替えることが可能で

ある.す なわち,第1表 において同じ行に記された学名は

互いにまった く同じ実体を指 し示 していることから,同 一

行上にある 「最終的に選ばれたシステムの学名」に差 し替

えればいいことになる.

III.同 定

前段で述べた ように種名だけでな く,そ れに付随 した補

助的な表現方法 も含めて分離菌株 を表記で きるようにする

ためには,同 定の際にいかに検査 を行い,ど の ような情報

を得ればいいのであろうか.こ こでは,そ の流れをご く簡

単に紹介 してみたい.な お,こ こで検査対象 として想定す

るのは,根 頭がんしゅ病あるいは毛根病の罹病組織か ら分

離された病原菌に限定 したい.す わなち,罹 病組織か らの

分離後,病 原性が確認できた菌株については,こ こに示 し

た鑑別性状な どを利用することによって簡易同定が可能で

ある.し かし,非 病原性の菌株 については,分 類学的な視

点から慎重 に解析を行い,そ の位置づけを高次分類群のレ

ベルか ら下位へ と順番に検討 してい くことが望まれる.な

お,具 体 的 な検査 方法 について は,Laboratory Guide

(Moore et al., 2001)や 第3表 に示 した文献が参考 となる.

Jpn. J. Phytopathol. 69 (4). November, 2003 359

1. 病 原 性 の 確 認

罹 病 組 織 や 土 壌 な ど か らAgrobacterium属 細 菌 を分 離 す

る た め に さ ま ざ ま な 選 択 培 地 が 工 夫 さ れ て お り,こ れ ら を

目的 に 応 じ て使 い分 げ る こ とに よ っ て分 離 の 効 率 が上 が る

こ とが 期 待 で き る(Moore et al., 2001).分 離 菌 株 の病 原

性 に 関 し て は,根 頭 が ん し ゅ病 菌(Ti strain)の 場 合 は ヒ

マ ワ リ,タ バ コ,ト マ ト,チ ョウセ ン ア サ ガ オ,ブ リオ フ

ィル ム,カ ラ ン コエ な どの,若 くて旺 盛 に 生 育 して い る植

物 体 の 茎 や 葉 に接 種 す る こ とに よ っ て 検 定 す る こ とが で き

る(Moore et al., 2001;澤 田,1994).ま た,毛 根 病 菌(Ri

strain)の 病 原 性 の 確 認 に は,ニ ン ジ ン を 用 い た 検 定 法

(carrot root assay) (Lippincott and Lippincott, 1969)が

利 用 で き る.Moore et al. (2001)は 接 種 試 験 を 行 う上 で

注 意 す べ き こ とを 詳 し く解 説 し て お り,参 考 に な る点 が 多

い.

Tiお よびRiプ ラ ス ミ ドの ど ち ら も 検 出 で き る よ う な

PCR用 の ユ ニ バ ー サ ル プ ラ イ マ ー(Haas et al., 1995;

Sawada et al., 1995)や,特 定 の 系 統 のTiプ ラ ス ミ ドを 検

出 す る た め の プ ラ イマ ー(Eastwell et al., 1995; Kauffman

et al., 1996),あ る い はRiプ ラ ス ミ ドに特 化 し た プ ラ イ

マ ー(伊 予 住 ・市 川,1999)な ど が報 告 され て い る.ま た,

筆 者 らは 以 前 報 告 し た ユ ニ バ ー サ ル プ ラ イ マ ー(VCF/

VCR; Sawada et al., 1995)を さ らに 改 良 し,よ り信 頼 性

を 高 め る作 業 を 続 け て い る(最 新 バ ー ジ ョン は第2表 の 上

段 に示 したVCF3/VCR3で あ る).こ の よ うな プ ラ イ マ ー

を 利 用 し た コ ロニ ーPCRは 非 常 に 簡 単 ・迅 速 で あ る こ と

か ら,接 種 試 験 用 の 供 試 菌 株 を 選 抜 した り,予 備 的 に病 原

性 を 確 認 す る た め の 簡 便 法 と し て 有 用 で あ ろ う.ま た,

BIO-PCRや リア ル タ イ ムPCRな どの 手 法(Schaad and

Frederick, 2002)と 組 み 合 わ せ る こ とに よ っ て植 物 体 や 土

壌 な どの保 菌 検 定 に も応 用 が 期 待 で き る.

2. 鑑別性状などを用いた同定

本属 における既知の5つ の菌種(第1表 の1～5)を 互

いに識別する際に有効 と思われる生理 ・生化学的性質を第

3表 に示した.こ のうち,上 段に示 した5項 目は,各 菌種

内での変異が少な く,し かも菌種間の差が明確に判別で き

ることか ら,効 率の良い鑑別性状 として特に期待できる性

質である.接 種試験によって病原性が確認できた菌株に関

しては,こ れ ら5項 目の検査を行 うことによってどの既知

菌種に相当するのかを明らかにする(す なわち,種 のレベ

ルの同定を行 う)こ とができる.一 方,中 段 に示 したのは

予備的な検査項 目であ り,必 要に応 じて検査 に追加 して補

足 した り,上 段に示 した検査の代替 として利用することが

できる.

菌体脂肪酸組成(Bouzar et al., 1993; Jarvis et al., 1996;

Sawada et al., 1992b; Tighe et al., 2000; Yokota et al., 1993)

や血清学的性質(Bishop et al., 1989; Keane et al., 1970;

Ophel and Kerr, 1990; Sawada et al., 1992c)な ども,種 の

レベルの同定を行 う際に有効な指標であることが確認され

ている.ま た,16S rDNAを は じめ とする染色体上の配列

情報 を利用して菌種特異的 なプライマーを設計すれば,

PCRを 利用 した簡易同定 も可能であろう.

ただし,こ れらの方法にはそれぞれ一長一短があること

か ら,試 験の目的や研究室の事情に応 じて適宜使い分けて

い く必要があ る.植 物病理関係の一般的な研究室に とっ

て,第3表 に示 したような生理 ・生化学的性質を利用する

方法は馴染みやすく,す ぐに導入できる態勢が整っている

ところが多いと思われる.し かし,結 果が得 られるまでに

1週 間か ら10日程度必要であ り,時 間がかかるのが難点で

ある.ま た,第3表 に示した限 られた検査項 目のみでは,

Agrobacterium属 以外の菌種 との異 同を明 らかにするこ と

がで きない場合 も想定すべ きであろ う.し たが って,

Agrobacterium属 細菌であるこ とが期待できるような菌株

(すなわち,罹 病組織 から分離 された病原菌)に 検査対象

第2表 Tiお よびRiプ ラス ミ ド検 出用 のユ ニバ ーサル プ ラ イマ ーセ ッ ト

a)混 合塩 基 は以下 の表 記 に従 った:Y, C+T; R, A+G; N, A+C+G+T.

b)こ こに示 したVCF3/VCR3は 現時 点 での最新 バ ージ ョン で あ るが,プ ラ イマ ーの改 良 は筆者 らが今 後 も継続 してい く予定 で あ

る.

360 日本 植 物病理 学会 報 第69巻 第4号 平 成15年11月

第3表 Agrobacterium属 にお け る種 の鑑別 性状

こ こに 示 し た 性 質 は 以 下 の 文 献 を ま とめ た もの で あ る:Bouzar et al. (1995), Kersters and De Ley (1984), Moore et al. (2001),

Sawada et al. (1990), Sawada and Ieki (1992a),澤 田(1994),澤 田 ら(未 発 表).

+, 80%以 上 が 陽 性;-, 80%以 上 が 陰 性;d,菌 株 間 で 反 応 が 異 な る;W,弱 陽 性;K,ア ル カ リの 産 生;A,酸 の 産 生.

a) Agrobacterium属 内 に 認 め られ て い る5つ の 自然 分 類 群(種)を,第1表 に お け る番 号(1～5)を 用 い て 示 した.

b) 各 分 類 群(1～5)の 学 名 を,分 類 ・命 名 シ ス テ ム(A～C;第1表 お よ び 本 文 参 照)ご と に示 し た.

c) 種 の レ ベ ル を 同 定 す る 上 で最 も効 率 の 良 い と思 わ れ る鑑 別 性 状 を,第 一 次 テ ス ト と し て 上 段 に 示 した.

d) L-チ ロ シ ン の 利 用 はMoore et al. (1988)ま た はKersters et al. (1973), New and Kerr培 地 はNew and Kerr (1971)の 方 法 を

用 い る.そ の 他 の 検 査 方 法 に つ い て は,Moore et al. (2001)お よ び 後 藤 ・瀧 川(1984)を 参 照.

e) 種 内 に は 今 の と こ ろ 根 頭 が ん し ゅ 病 菌(Ti strain)の み が 報 告 さ れ て い る が,非 病 原 菌(nonpathogenic)の 存 在 も予 想 さ れ る.

f) Agrobacterium属 細 菌 に 対 して 人 為 的 にSymプ ラ ス ミ ドを 導 入 す る と,根 粒 形 成 ・共 生 窒 素 固 定 が 認 め ら れ る 場 合 が あ る

(Brom et al., 1988; Martinez et al., 1987; Novikova and Safronova, 1992).

を限定する必要がある.一 方,菌 体脂肪酸組成の分析は迅

速であ る上に汎用性が高 く,Agrobacterium属 以外の菌種

との直接比較 も可能である.し かし,分 析条件 によって結

果が影響を受けやすいので,試 験方法は厳密に統一す る必

要がある.ま た,脂 肪酸組成は比較的高次の分類群の特徴

づけに有効であると考えられてお り,種 レベルの細かい判

別が困難な場合 も将来は出て くるかも知れない.血 清学的

な検査は簡便かつ迅速であ り,多 数の検体を一度に処理す

ることも可能であるものの,事 前に信頼性の高い抗血清を

準備 してお くことが必要 となる.菌 種特異的なプライマー

についても,特 異性が高 く,し か も各菌種内に存在す ると

思われる多様性にも対応できるような,信 頼性の高いもの

を設計することが今後の課題である.

3. 同定できなかった菌株や非病原菌の取 り扱い

接種試験によって病原性が確認できなかった菌株や,病

原性は確認できた ものの,既 知菌種のどの記載 とも一致 し

なかった菌株に関 しては,よ り多 くの性状をさらに詳 しく

調 べて既知菌種 との異 同を慎重に比較検討する必要があ

る.そ れで も既知菌種の中か ら該当するものが見つから

ず,同 定できない場合は,以 下のようにして遺伝学的 ・分

子系統学的な解析を行い,多 相分類学的な視点か ら分類上

の位置づけを検討する必要がある(す わなち,同 定作業か

ら分類学的研究 へ と視点 を移す必要が生ずる):ま ず,

16S rDNAに 基づいてその未同定菌株の系統的な位置づけ

を明らかにし,Rhizobium/Agrobacterium clade(第1図)

内に含まれるか どうかを確認する;さ らに,そ の未同定菌

Jpn. J. Phytopathol. 69 (4). November, 2003 361

株に近縁な既知菌種を選び(16S rDNAの 相同性が97%以

上のものはすべて選ぶ),そ れ らのtype strainと の比較を

DNA-DNA交 雑法に基づいて行う;未 同定菌株 とのDNA-

DNA相 同値 が高 い値(た とえば70%以 上)を 示すtype

strainが あれば,未 同定菌株を当該種 と同定することがで

きる.た だし,そ の場合,そ の当該種の鑑別性状などを見

直す作業が必要 となって くる.い ずれのtype strainと も

低い値 しか得 られない場合は,そ の未 同定菌株は新種であ

る可能性がある.

IV. おわりに

3つ の有効な分類 ・命名システムが並立す るという混沌

とした時代の中で,混 乱が一定の方向に収束 し始めるまで

にはまだ長い時間がかかりそうである(澤 田,2003; Sawada

et al., 2003).最 終的に混乱が解消され るまでの過程で

は,科 学的な厳密 さに基づいた検証が徹底的に行われてゆ

くであろう.そ の際には,現 在の細菌分類学において分類

体系構築 の基礎 となっている16S rDNAだ けでな く,よ

り解像度の高いさまざまな分子指標 も採用 され,新 しい解

析手法 と組み合わされることによって詳細 に系統解析が行

われた上で,多 相分類学的な観点から慎重 に検討が進め ら

れてい くことになろう.16S rDNAの データだけでは情報

量が不十分である上に,進 化の指標 としてはさまざまな欠

点のあ るこ とが指摘 されているか らであ る(Broughton,

2003; van Berkum et al., 2003).今 後は,ゲ ノムの基本骨

格(basic genome)上 に存在 してお り,安 定化選択を受け

ているような複数の必須遺伝子を指標 として選択 し,そ れ

らの情報 を統合 して解析することによって 「basic genome

の進化の道筋」を明らかにすること(い わゆるmultilocus

sequence typing)が,分 類の基礎データ としてまず必要

とされ るようになるのではないだろうか(Stackebrandt et

al., 2002; Turner et al., 2002).さ らに,そ のbasic genome

の進化の過程 で,病 原性プラスミドの ような可動性因子

(accessory genome)が どのように伝達 ・脱落 してきたの

かを把握 した上で,そ の情報をできるだけ反映させるよう

にして分類体系を完成させてい くという形 が,ゲ ノム解析

の時代における科学的な厳密さを求める立場か らは理想 と

されるのかもしれない(澤 田,2003; Sawada et al., 2003).

特にAgrobacterium属 細菌の場合は,こ のようなaccessory

genomeに 関連する情報は,学 名 とは別の補助的方法(第

1表BやCに おけ るtumorigenicや(Ri)な どの ような

修飾語)に よって付記する,と いう方 向に落ち着いてい く

のではないだろうか.

利用者にとってどのシステムが一番 便利 で使い勝手が良

いか,と い うことも方 向性が検討される際に重要なポイン

トとして扱われるであろう.た だし,こ の問題に関しては

立場が異なる と考え方が違って くるようである.植 物病理

学分野の研究者に とって,第1表Cの 「属 レベル へも自

然分類を導入 したシステム」は利点が感 じられに くいか も

しれない.典 型的な病原菌のみを扱っている限 りは,第1

表Aの 「人為分類システム」で間に合 う場合が多いと思わ

れるので,分 類 ・命名システムを変更することに伴 う混乱

を考える と割が合わない という判断がなされるかもしれな

い(Farrand et al., 2003).ま た,根 粒菌を扱 う研究分野で

も同様 な とらえ方 をされ る可能性が ある(Broughton,

2003; van Berkum et al., 2003).一 方,環 境修復を目的 と

して汚染物質分解菌をスクリーニングしている研究者や,

土壌微生物の生態を基礎的な観点から研究 している研究者

のように,未 知の環境微生物を多数扱 うような立場からす

ると,前 述 したように第1表AやBの システムは分類 ・

同定のいずれの場面においても多 くの問題を抱 えてお り,

きわめて不便であるといえる.そ の中で も特に,「 病原性

と共生窒素固定能のいずれ も認められないような環境微生

物」は,Rhizobium/Agrobacterium clade内 に受 け皿 とな

るような新属を新たに設けない限り,新 種 として記載する

ことさえままな らない という問題 は深刻であ る(澤 田,

2003; Sawada et al., 2003).し たがって,Rhizobium/Agro-

bacteyium cladeを 研究対象 とする研究者の構成が今後 どの

ように変化してい くかが,分 類 ・命名システムの方向性を

決める上で大 きな影響を与える要因となってい くのではな

いだろうか.今 までは植物病理 と共生窒素固定 に関係する

研究者によってほぼ独 占的に研究が行われて きたが,よ り

広い分野へ と研究のすそ野が広がって行 くようなことがあ

ると,分 類体系に対 して求められるものが変わってい く可

能性もある.い ずれにしても,分 類体系の利用者 となるさ

まざまな分野の研究者に とって利便性が高 く,し かも学問

的な厳密さ ともバランスの とれた形へと時間をかけて収束

してい くもの と思われる.

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