Aislamiento de Acidos Nucleicos:Fagos

Aníbal Valentín, PhD, JA Cardé, PhDBiol 4207 –

Lab Virología y Biotecnología Universidad de Puerto Rico, Aguadilla

Objetivos• Aplicar el métodos de aislamiento de ácidos

nucleicos con fenol/cloroformo para extracción de DNA de fagos.

• Describir las funciones de las diferentes soluciones utilizada en las técnicas de aislamiento de ácidos nucleicos.

• Realizar una extracción de DNA fago M13 utilizando los método de fenol - cloroformo.

Introducción• Los ácidos nucleicos y las proteínas se

encuentran bajo estudio constantemente.• Los problemas asociados con el estudio de estas

son particulares y únicos para cada uno: DNA, RNA, proteínas

• Nos centraremos en el estudio de las técnicas de aislamiento de ácidos nucleicos.

Lísis

• El rompimiento o lísis celular es el primer paso para obtener el DNA genómico.

• Varias técnicas son utilizados para provocar lísis celular.

• Entre ellas se encuentran: – lisis hipotónica – lisis enzimática.

Métodos: Lisis Hipotónica• Se utiliza una solución hipotónica que causa la

hinchazón de la célula y el rompimiento de la membrana plasmática y/o de la pared celular.

• Junto a las sales se pueden añadir detergentes, que ayudan a degradar los lípidos de la membrana. (Detergentes no iónicos, i.e. Tween 20 y Triton X-100, utilizados con células de mamíferos y detergentes iónicos i.e. SDS para células con pared celular o cutícula externa que la protege)

•

Métodos: Lisis Enzimática• Se utilizan las mismas soluciones y detergentes

anteriormente mencionados además de enzimas que catalizan la reacción.

• La función principal de la enzima es la degradación de los peptidoglicanos presentes en la pared celular.

• Entre las enzimas utilizadas en esta técnica se encuentran lisozima y proteinasa K.

Métodos: Extracción FenólicaPosterior a la lísis se realiza una extracción fenólica. Utilizada para remover proteínas que se encuentran contaminando el DNA.

El fenol y/o cloroformo no se mezclan con el agua formando fases separadas cuando se tratan de mezclar.

Cuando la solución acuosa de DNA se mezcla con fenol y/o cloroformo, las proteínas se mueven a la fase orgánica, formada por el fenol y/o cloroformo, dejando así el DNA en la fase acuosa.

La fase acuosa con el DNA se remueve y el DNA es precipitado utilizando etanol y sales.

Extracción Fenólica

Materiales

Lavado de placas y plugs Centrífuga clínica Fenol/Cloroformo/IsoamilIsopropanolEtanol al 70Microcentrifuga refrigeradaCristaleria

MicropipetasMicrotubos de 1.5 mlPipetas desechablesVortexPropipetasPuntas para micropipetasMicrotubos

Protocolo• Colectar ~500uL del medio que contiene el M13 aislado del plug de

agar. • 1. Añadir 500uL de phenol/cloroformo/alcohol isoamílico saturado

con Tris • 2. Mezclar bien/vortex por 30 segundos • 3. Centrifugar a 12,000rpm por 5 min • 4. Recolectar la fase acuosa (~450uL) y transferir a un microtubo • 5. Proceder con la precipitación por isopropanol • 6. Separar la muestra anterior en 2 microtubos (~200uL c/u) • 7. Añadir 1/10 parte del volumen de 3M Acetato de Sodio, pH 4.8

Protocolo• 8. Mezclar bien • 9. Añadir 0.7X el volumen de 100% isopropanol (frío) ~160uL • 10. Centrifugar a 12,000rpm por 30min a 4oC • 11. Descartar el sobrenadante mediante inversión prestando

atención al “pellet” de ácido nucleico. • 12. Añadir 1mL de 70% etanol • 13. Centrifugar a 12,000rpm por 10min a 4oC

• 14. Descartar el sobrenadante mediante inversión prestando atención al “pellet” de ácido nucleico. – Si es necesario, una vez descartado el 70% etanol, volver a

centrifugar por 30 segundos a 12,000 y remover los residuos de etanol utilizando un micropipeta sin perturbar el pellet

• 15. Incubar el microtubo que contiene el ácido nucleico a temperatura ambiente y abierto durante 10-15min – Permitir que los residuos de etanol se evaporen

• 16. Resuspender el ácido nucleico en 25uL de agua destilada • 17. Guardar a -20oC

Protocolo

Preguntas Para que es el fenol? Para que es el cloroformo? Para que es el alcohol isoamilico? Para que es el Acetato? Para que es el isopropanol? Para que es el etanol? Para que es el agua?

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