aislamiento demicroorganismos
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7/28/2019 Aislamiento deMicroorganismos
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Trabajo Prctico N4
Aislamiento de Microorganismos
Diversidad Metablica
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Objetivo del Trabajo Prctico
Aislamiento de microorganismos partir dedistintos inculos (agua, ricota, arroz, tierra
y yogurt)
1)Enriquecimiento-Seleccin
2)Seleccin-Diferenciacin3)Obtencin de un cultivo puro (Tincin deGram y Pruebas Bioqumicas)
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Microorganismos a aislar:
Enterobacterias (agua) Pseudomonasspp. (agua) Staphylococcusspp. (ricota) Bacillusspp. (arroz)
Lactobacillusspp. (yogurt) Azotobacterspp. (tierra)
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Medios de Cultivo: caractersticas generales
Disponibilidad de nutrientes (C, N, sales inorgnicas,vitaminas)
Disponibilidad de oxgeno
pH
HumedadTemperatura
Esterilidad
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Medios Definidos o Complejos
Medios Mnimos (definidos) o Ricos(complejos).
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Medio Definido: los componentes del medio (y sus concentraciones)son conocidos.
Ejemplo de Medio DefinidoparaEscherichia coli:
Componente Gramos/litro
Glucosa 5 Fuente de C yenerga
Na2HPO4 6 Buffer, fuente de P
KH2PO4 3 Buffer, fuente de P
NH4Cl 1 Fuente de N
NaCl 0.5 Fuente de Na
MgSO47H2O 0.12 Fuente de Mg
CaCl22H2O 0.01 Fuente de Ca
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Medio Complejo: se agregan ingredientes cuya composicin exacta dedesconoce (extractos, peptonas, etc).
Ejemplo de Medio Complejo para Salmonella:Componente Gramos/litro
Extracto decarne
5 Fuente de aminocidos, nucletidos, vitaminas ymicronutrientes. Tambin fuente de C.
Peptona 6 Fuente de aminocidos, nucletidos, vitaminas ymicronutrientes. Tambin fuente de C.
Glucosa 5 Fuente de C y energa.
Na2HPO412H2O 4 Buffer y fuente de P.
FeSO47H2O 0.3 Indicador de produccin de H2S. Fuente de Fe
y S.IndicadorSulfito deBismuto
8 Inhibe el crecimiento de Gram positivos
Verde Brillante 0.025 Inhibe el crecimiento de Gram positivos
gar 20
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Peptonas: pptidos (aminocidos libres), carbono y nucletidos.
Peptona de casena (triptona): degradacin pancretica de lacasena.
Peptona de carne: degradacin pancretica de la carne.
Peptona de gelatina: degradacin pancretica de la gelatina.
Proteosa peptona: peptona de mayor calidad, con alta proporcinde pptidos de menor PM, aminocidos libres y factores de
crecimiento.
Extracto de levadura: es la parte hidrosoluble de la levaduraautolizada. Alto contenido de vitaminas.
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Medio Mnimo: posee la mnima cantidad de nutrientes requeridospara el crecimiento. Es un medio definido. Por ej.: M9.
Medio Rico: posee gran variedad de nutrientes y en abundancia(provenientes de extractos y peptonas). Por lo general son medioscomplejos.
Por ej: Luria-Bertani (LB):
Componente Gramos/litro
Triptona 10 Aminocidos, carbono, energa, macro y
micronutrientes.Extracto deLevadura
5 Vitaminas, macro y micronutrientes.
NaCl 10 Balance osmtico.
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Medio de Enriquecimiento: se utiliza como primer paso en el aislamiento
de bacterias. Contiene sustancias que permiten enriquecer el cultivo enel organismo de inters.
Medio Selectivo: posee sustancias que permiten el crecimiento de ungrupo de bacterias y queinhibenel desarrollo de otros grupos. Por ej:sales biliares y cristal violeta: inhiben el crecimiento de Gram
positivos.Medio Diferencial: contiene compuestos que permiten detectar algncambio de color en el medio cuando ocurre una determinada reaccinqumica. Por ej: azul de bromocresol: indicador que vira al amarillocuando el pH del medio es cido (permite distinguir a las bacterias
que fermentan lactosa).Medio Selectivo y Diferencial.
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1. Inocular la muestra (agua, tierra, yogurt, ricota o arroz) en
un caldo de enriquecimiento.
2. Incubar a la temperatura y tiempo adecuados.
3. Estriar en medio selectivo (adems puede ser diferencial).Obtencin de colonias aisladas.
4. Tincin de Gram
5. Pruebas Bioqumicas: TP Nro. 5.
Pasos a seguir para aislar un microorganismo (y caracterizarlo):
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Enterobacterias g-Proteobacteria Bacilos Gram negativos Fermentadores de glucosa Anaerobios facultativos
Flagelos peritricos Escherichia coli (algunas cepas patgenas) Salmonella, Shigella, Enterobacter, Yersinia, Klebsiella,
Proteus, entre otros. Todos con especies patgenas. Oxidasa negativos
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Aislamiento de Enterobacterias (agua)
1. Sembrar en Caldo Mac Conkey (2x): medio de enriquecimiento yselectivo para el aislamiento de enterobacterias de agua y leche.
Peptona de CasenaLactosaBilis de BueyPrpura de BromocresolpH= 7,40,2
Incubar por 48 hs a 37C
Si hay fermentacin de lactosa:
Slo cido Coliformes, sin E. coliGas + cido E.coli(junto a otras coliformes)
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Crecimiento en
Caldo Mac Conkey
Cambio de
color aamarillo
Formacin de
Gas
Escherichia coli
(lactosa +)Bueno S S
Enterobactercloacae
(lactosa +)
Bueno S S
Klebsiellapneumoniae
(lactosa +)
Bueno S S
Proteus mirabilis Bueno No No
Pseudomonasaeruginosa
Malo
Staphylococcusaureus
Malo
Si hay formacin de gas y el pH del medio se acidifica, entonces, elsiguiente paso es estriar en gar Mac Conkey y gar EMB.
Aislamiento de Enterobacterias (agua)
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2. gar Mac Conkey: medio selectivo y diferencial.
Peptona de CasenaPeptona de CarneCloruro de SodioLactosaSales biliaresCristal violetaRojo Neutro
pH= 7,10,1Incubar por 24 hsa 37C
Apariencia de las
colonias
Microorganismo
Grandes, rojas, conhalo
Escherichia coli(lactosa +)
Grandes, rosadas,mucoides
Enterobacter spp., Klebsiellaspp. (lactosa +)
Incoloras,transparentes Salmonella spp., Shigella spp.,Proteus spp.Pequeas, opacas,aisladas
Enterococci, Staphylococci
Aislamiento de Enterobacterias (agua)
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Escherichia coli Salmonella typhimurium
gar Mac Conkey
Lactosa + Lactosa -
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2.gar EMB: medio selectivo y diferencial(enterobacterias patgenas).
Peptona de CarneHidrgenofosfato dipotsicoLactosa
SacarosaEosina AmarillentaAzul de MetilenopH=7,00,2
Incubar por 24 hsa 37C
Apariencia de lascolonias Microorganismo
Transparentes, de colormbar
Salmonella spp., Shigella spp.
Verdosas con brillometlico a la luz
reflejada, con el centronegroazulado a la luztransmitida
Escherichia coli(lactosa +,sacarosa +)
Ms grandes que las deE. coli, mucosas,confluentes, con el
centro pardo-grisceo ala luz transmitida
Enterobacter spp., Klebsiellaspp. (lactosa+, sacarosa-)
Aislamiento de Enterobacterias (agua)
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Escherichia coli Enterobacterspp.
gar EMB
Lactosa + Lactosa +
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Pseudomonasspp. g-Proteobacteria Bacilos Gram negativos Aerobios estrictos Con flagelos polares
Producen pigmentos No fermentadores Oxidasa positivos Patgenos de plantas/infecciones oportunistas en humanos
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Aislamiento de Pseudomonas aeruginosa(agua)
1. Sembar en Caldo M9 (2x) e incubar por 48 hs a 42C:enriquecimiento y seleccin.
2. Estriar en gar Cetrimida: medio selectivo para Pseudomonasaeruginosa
Peptona de Gelatina MgCl2 Cetrimida Glicerina SO4K2
Incubar por 48 hs a 37C.
Pseudomonas aeruginosa
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Staphylococcusspp.
Cocos Gram positivos Anaerobios facultativos
Fermentan glucosa (ac. lctico) Asociados a piel y mucosas Patgenos (S. aureus) Resisten altas concentraciones salinas
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Aislamiento de Staphylococcus aureus(ricota)
1. Ricota en Agua Peptonada: enriquecimiento(2 hs a temperaturaambiente)
2. Mezclar con Caldo Cerebro Corazn (con NaCl 13%): medio selectivopara Estafilococos patgenos.
Infusin de cerebro Infusin de corazn Proteosa peptona D(+) Glucosa NaCl (7.5% final) Hidrgenofosfato disdico
pH=7,40,2
Incubar por 48 hs a 37C
Si hay crecimiento, estriar en gar manitol salado-rojo fenol y gar azida
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Aislamiento de Staphylococcus aureus
3. gar manitol salado-rojo fenol: medio selectivo y diferencial (permite
distinguir entre S. aureusy otras especies no patgenas). Peptona de carne Extracto de carne NaCl 7.5% D(-)Manitol Rojo fenol
pH=7,40,2
Incubar por 48 hs a 37C
3. gar azida: medio selectivo para Staphylococcus spp.Incubar por 48 hs a 37C
Apariencia de las colonias Microorganismo
Con halo amarillo,luminoso; crecimientointenso
Manitol-positivos: S.aureus
Sin cambio de color; pococrecimiento Manitol-negativos: S.epidermidisy otros.
1. S. aureus 2. S. epidermidis3. Micrococcus luteus
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Bacillusspp. Bacilos Gram positivos Forman endosporas Generalmente mviles con flagelos peritricos
Aerobios (facultativos) B. cereus(alimentos) B. anthracis
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Aislamiento de Bacillus cereusy Bacillus subtilis(arroz)
1. Arroz en PBS (80C por 5 min.): seleccin.2. Pasar el sobrenadante a caldo nutritivo: enriquecimiento.3. Incubar por 48 hs a 37C.4. Estriar en gar Mossel con emulsin de yema de huevo: selectivo y
diferencial (permite distinguir entre Bacillus cereusy B. subtilis)
Peptona de carne Extracto de carne D(-)Manitol NaCl Rojo Fenol Emulsin de yema de huevo/Polimixina B
Incubar por 48 hs a37C.Bacillus cereus: colonias rugosas, secas, de color rosado y rodeadas de precipitado
blanco (Manitol y lecitinasa +).
Bacillus subtilis: colonias amarillas y sin precipitado (Manitol + y lecitinasa -).
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Lactobacillusspp. Bacilos o cocobacilos Gram positivos Fermentadores lcticos Aerobios facultativos o microaerfilos
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Aislamiento de Lactobacillus spp. (yogurt)
1. gar De Man, Rogosa y Sharpe (MRS): medio de enriquecimientoselectivo.Polisorbato, acetato, magnesio y manganeso.pH = 5.7.Incubacin en microaerobiosis.
gar MRS-Lactobacillus casei
2. gar Rogosa: medio ms selectivo que elanterior, con mayores concentraciones deacetato y pH = 5.5 que inhiben floraacompaante.Incubacin en microaerobiosis.
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Azotobacterspp. Bacilos o cocos Gram negativos Habitan en el suelo y en el agua Fijan nitrgeno atmosfrico (N2 a NH3) Vida libre Forman quistes (similar a endosporas)
Medio Fred & Waksman: medio selectivo sin fuente denitrgeno. Contiene manitol (azcar fermentable).
Crecimiento a 28C.
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Microorganismo Enriquecimiento-Seleccin
Seleccin-Diferenciacin
Agua Enterobacterias Caldo Mc
Conkey
gar Mc Conkey
y gar EMBAgua Pseudomonas Caldo M9-42C gar Cetrimida
Ricota Staphylococcus Caldo cerebro-corazn con7.5% NaCl
gar manitolsalado rojofenol y gar
azidaArroz Bacillus 80C y caldo
nutritivogar Mossel conemulsin de
yema de huevo yPmB.
Yogurt Lactobacillus gar MRSMicroaerobiosis
gar RogosaMicroaerobiosis
Tierra Azotobacter Caldo Fred&Waskman-28C
gar Fred &Waskman-28C