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AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE FLORA BACTERIANA
NATIVA DEL SUELO DE LOS PÁRAMOS CRUZ VERDE Y GUASCA
(CUNDINAMARCA)
GERMÁN DAVID BENAVIDES RODRIGUEZ ANA MARÍA HERMIDA SILVA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Bogotá D.C
2008
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE FLORA BACTERIANA
NATIVA DEL SUELO DE LOS PÁRAMOS CRUZ VERDE Y GUASCA
(CUNDINAMARCA)
GERMAN DAVID BENAVIDES RODRIGUEZ ANA MARÍA HERMIDA SILVA
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial
Para optar el título
MICROBIOLOGO INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Bogotá D.C
2008
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946 “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por
sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no
contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien que se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE FLORA BACTERIANA
NATIVA DEL SUELO DE LOS PÁRAMOS CRUZ VERDE Y GUASCA
(CUNDINAMARCA)
GERMAN DAVID BENAVIDES RODRIGUEZ ANA MARÍA HERMIDA SILVA
APROBADO
DIRECTOR
Rubén Darío Torrenegra Químico
JURADO JURADO
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE FLORA BACTERIANA
NATIVA DEL SUELO DE LOS PÁRAMOS CRUZ VERDE Y GUASCA
(CUNDINAMARCA)
GERMAN DAVID BENABIDES RODRIGUEZ ANA MARÍA HERMIDA SILVA
APROBADO
DECANO ACÁDEMICO DIRECTOR DE CARRERA
Ingrid Schuler, ph.D. Janeth Arias Palacios, M.Sc. M.Ed.
RESUMEN
En el presente trabajo se realizó el aislamiento y la identificación de la
flora nativa del suelo de los páramos Cruz verde y Guasca; con el fin de
contribuir al estudio de la población bacteriana de estos ambientes
extremos.
El muestreo se basó en la norma ICONTEC NTC 4113-6 y se llevó a cabo
por medio de tres métodos diferentes: Caja rodac, Pala y Barreno. Se
realizaron dos técnicas de aislamiento que fueron la técnica de dilución en
tubo y dispersión directa, en los medios Agar Extracto de Suelo y Medio
Agar Nutritivo. Por medio de la coloración Gram se hizo la identificación
microscópica dividiendo así las cepas en dos grupos Gram positivos y
Gram negativos y posteriormente en subgrupos los esporoformadores y
no esporoformadores,obteniendo un alto porcentaje de bacterias Gram
positivas; mediante el uso de bioquímicas y medios de cultivos selectivos
se identificaron 40 cepas bacterianas correspondientes a los siguientes
géneros: Amphibacillus, Bacillus, Brochothrix, Caryophanon, Kurthia,
Lactobacillus, Lactococcus, Listeria, Micrococcus, Pediococcus,
Sacharococeus, Sarciana, Sporolactobacillus, Sporosarcina,
Staphylococcus y Trichococcus. Los géneros Bacillus y Lactobacillus
fueron los géneros más predominantes en este proyecto.
Finalmente las cepas identificadas se conservaron con el propósito de
mantener este material biológico en un estado viable y estable, la
conservación se hizo por tres métodos diferentes: Suelo estéril, Glicerol,
Sensidiscos.
TABLA DE CONTENIDO
TÍTULO PÁGINA
1. Introducción 2
2. Marco Teórico 3
2.1. Suelo 3
2.1.1. Perfil del Suelo 4
2.1.2. Textura del suelo 4
2.1.3. Componentes del Suelo 4
2.1.4. Microorganismos del Suelo 5
2.1.5. Muestreo del Suelo 7
2.2. Páramo 7
2.2.1. Vegetación de los páramos 7
2.2.2. Suelo de los Páramos 8
2.3. Crecimiento Microbiano 9
2.3.1. Efecto de la Temperatura 10
2.3.1.1. Crecimiento Microbiano a Temperaturas Extremas 10
2.3.2. Acidez y Alcalinidad 11
2.3.3. Oxígeno 12
2.4. Identificación Bioquímica 12
2.4.1. Prueba de Voges Proskauer 14
2.4.2. Prueba Rojo de Metilo 14
2.4.3. Prueba LIA (Descarboxilación Lisina) 15
TÍTULO PÁGINA
2.4.4. Hidrólisis de Almidón 16
2.4.5. Prueba SIM 16
2.4.6. Prueba TSI 17
2.4.7. Prueba Citocromo Oxidasa 17
2.4.8. Prueba de Citrato 18
2.4.9. Prueba de Ureasa 18
2.4.10. Prueba Reducción de Nitratos 19
2.4.11. Prueba de Catalasa 19
2.4.12. Licuefacción de gelatina 20
2.4.13. Prueba de fermentación de hidratos de carbono 20
2.5. Bioconservación 21
3. Formulación del Problema y Justificación 23
3.1. Formulación del Problema 23
3.2. Justificación 23
4. Objetivos 25
4.1. Objetivo General 25
4.2. Objetivos Específicos 25
5. Metodología 26
5.1. Recolección de las Muestras 26
5.2. Procesamiento de las Muestras 28
5.2.1. Técnicas de aislamiento 28
5.2.1.1. Lavado de Suelo 28
TÍTULO PÁGINA
5.2.1.2. Técnica de placa de conteo de Warcup 28
5.2.1.3. Técnica de cultivo líquido 29
5.3. Identificación Bacteriana 29
5.3.1. Identificación Microscópica y Macroscópica 29
5.3.2. Identificación Bioquímica 29
5.4. Conservación de Cepas 30
5.4.1. Métodos de Conservación 30
5.4.1.1. Conservación en Aceite Mineral 30
5.4.1.2. Conservación por suspensión en agua destilada 30
5.4.1.3. Conservación en Suelo estéril 30
5.4.1.4. Conservación en Sílica Gel 31
5.4.1.5. Conservación por Liofilización 31
5.4.1.6. Criopreservación 31
5.4.1.7. Conservación por Desecación en papel de filtro 32
6. Experimentación 33
6.1. Reconocimiento de la Zona 33
6.2. Recolección de Muestras 34
6.3. Procesamiento de las Muestras 36
6.4. Aislamiento de Bacterias 37
6.4.1. Aislamiento Primario 37
6.4.1.1. Técnica Dilución en Tubo 37
6.4.1.2. Técnica de Aspersión Directa 37
TÍTULO PÁGINA
6.4.1.3. Aislamiento a Partir de Caja Rodac 37
6.5. Identificación Bacteriana 38
6.5.1. Identificación Microscópica 38
6.5.2. Identificación Bioquímica 38
6.6. Conservación de Cepas 39
6.6.1. Conservación en Suelo Estéril 39
6.6.2. Conservación en Glicerol 40
6.6.3. Conservación en Sensidiscos 40
7. Resultados y Discusión 41
7.1. Parámetros para la selección de géneros 41
7.2. Bacilos esporoformadores Gram positivos 42
7.2.1. Género Amphybacillus 44
7.2.1.1. Amphybacillus sp. 44
7.2.1.2. Amphybacillus xylanus 45
7.2.2. Género Bacillus 46
7.2.2.1. Bacillus azotoformans 47
7.2.2.2. Bacillus cereus 48
7.2.2.3. Bacillus circulans 49
7.2.2.4. Bacillus globisporus 50
7.2.2.5. Bacillus marinus 51
7.2.2.6. Bacillus pasteurii 52
7.2.2.7. Bacillus sphaericus 53
TÍTULO PÁGINA
7.2.3. Género Sporolactobacillus 54
7.2.3.1. Sporolactobacillus inulinus 54
7.3. Cocos eporoformadores Gram positivos 55
7.3.1. Género Sporosarcina 55
7.3.1.1. Sporosarcina ureae 56
7.4. Bacilos Gram positivos no esporoformadores 57
7.4.1. Género Bochotrix 57
7.4.1.1. Brochothrix campestris 58
7.4.1.2. Brochothrix thermosphacta 59
7.4.2. Género Caryophanon 60
7.4.2.1. Caryophanon latum 60
7.4.2.2. Caryophanon tenue 61
7.4.3. Género Kurthia 62
7.4.3.1. Kurthia gibsonii 62
7.4.3.2. Kurthia sibirica 63
7.4.3.3. Kurthia zopfii 64
7.4.4. Género Lactobacillus 64
7.4.4.1. Lactobacillus agilis 65
7.4.4.2. Lactobacillus collinoides 66
7.4.4.3. Lactobacillus confusus 67
7.4.4.4. Lactobacillus fructosus 68
7.4.4.5. Lactobacillus kandleri 69
TÍTULO PÁGINA
7.4.4.6. Lactobacillus sake 70
7.4.4.7. Lactobacillus viridescens 71
7.4.5. Género Listeria 72
7.4.5.1. Listeria murrayi 72
7.4.5.2. Listeria welshimeri 73
7.5. Cocos Gram positivos no esporoformadores 74
7.5.1. Género Lactococcus 74
7.5.1.1. Lactococcus lactis 75
7.5.2. Género Micrococcus 76
7.5.2.1. Microccocus luteus 76
7.5.2.2. Micrococcus roseus 77
7.5.3. Género Pediococcus 77
7.5.3.1. Pediococcus sp. 78
7.5.4. Género Sacharococeus 79
7.5.4.1. Sacharococeus thermophilus 79
7.5.5. Género Sarcina 80
7.5.5.1. Sarcina ventriculi 80
7.5.6. Género Syaphylococcus 81
7.5.6.1. Staphylococcus arlettae 81
7.5.6.2. Staphylococcus auricularis 82
7.5.6.3. Staphylococcus equorum 83
7.5.6.4. Staphylococcus hominis 84
TÍTULO PÁGINA
7.5.6.5. Staphylococcus lentus 85
7.6. Coco-Bacilos no esporoformadores Gram positivos 86
7.6.1. Género Trichococcus 86
7.6.1.1. Trichococcus flocculiformis 86
8. Conclusiones 87
9. Recomendaciones 88
10. Referencias 89
TABLA DE FIGURAS
TÍTULO DE FIGURA PÁGINA
FIGURA 1. Recorrido en toma de muestras en suelo 26
FIGURA 2. Barrenos 27
FIGURA 3. Mapa de cuadrantes de muestreo 34
FIGURA 4. Toma de muestras con cajas rodac 35
FIGURA 5. Toma de muestras con pala 35
FIGURA 6. Toma de muestras con barreno 36
FIGURA 7. Transporte de muestras 36
FIGURA 8. Aislamiento primario en cajas rodac 38
FIGURA 9. Microscopia 100X de Amphybacillus sp. 44
FIGURA 10. Amphybacillus sp. en Agar Nutritivo 44
FIGURA 11. Microscopia 100X de Amphybacillus xylanus 45
FIGURA 12. Amphybacillus xylanus en Agar Nutritivo 45
FIGURA 13. Microscopia 100X de Bacillus azotoformans 47
FIGURA 14. Bacillus azotoformans en Agar Nutritivo 47
FIGURA 15. Microscopia 100X de Bacillus cereus 48
FIGURA 16. Bacillus cereus en Agar Nutritivo 48
FIGURA 17. Microscopia 100X de Bacillus circulans 49
FIGURA 18. Bacillus circulans en Agar Nutritivo 49
FIGURA 19. Microscopia 100X de Bacillus globisporus 50
FIGURA 20. Bacillus globisporus en Agar Nutritivo 50
FIGURA 21. Microscopia 100X de Bacillus marinus 51
FIGURA 22. Bacillus marinus en Agar Nutritivo 51
FIGURA 23. Microscopia 100X de Bacillus pasteurii 52
FIGURA 24. Bacillus pasteurii en Agar Nutritivo 52
FIGURA 25. Microscopia 100X de Bacillus sphaericus 53
FIGURA 26. Bacillus sphaericus en Agar Nutritivo 53
FIGURA 27. Microscopia 100X de Sporolactobacillus inulinus 54
FIGURA 28. Sporolactobacillus inulinus en Agar Nutritivo 54
FIGURA 29. Microscopia 100X de Sporosarcina ureae 56
FIGURA 30. Sporosarcina ureae en Agar Nutritivo 56
FIGURA 31. Microscopia 100X de Brochothrix campestris 58
FIGURA 32. Brochothrix campestris en Agar Nutritivo 58
FIGURA 33. Microscopia 100X de Brochothrix thermosphacta 59
FIGURA 34. Brochothrix thermosphacta en Agar Nutritivo 59
FIGURA 35. Microscopia 100X de Caryophanon latum 60
FIGURA 36. Caryophanon latum en Agar Nutritivo 60
FIGURA 37. Microscopia 100X de Caryophanon tenue 61
FIGURA 38. Caryophanon tenue en Agar Nutritivo 61
FIGURA 39. Microscopia 100X de Kurthia gibsonii 62
FIGURA 40. Kurthia gibsonii en Agar Nutritivo 62
FIGURA 41. Microscopia 100X de Kurthia sibirica 63
FIGURA 42. Kurthia sibirica en Agar Nutritivo 63
FIGURA 43. Microscopia 100X de Kurthia zopfii 64
FIGURA 44. Kurthia zopfii en Agar Nutritivo 64
FIGURA 45. Microscopia 100X de Lactobacillus agilis 65
FIGURA 46. Lactobacillus agilis en Agar Nutritivo 65
FIGURA 47. Microscopia 100X de Lactobacillus collinoides 66
FIGURA 48. Lactobacillus collinoides en Agar Nutritivo 66
FIGURA 49. Microscopia 100X de Lactobacillus confusus 67
FIGURA 50. Lactobacillus confusus en Agar Nutritivo 67
FIGURA 51. Microscopia 100X de Lactobacillus fructosus 68
FIGURA 52. Lactobacillus fructosus en Agar Nutritivo 68
FIGURA 53. Microscopia 100X de Lactobacillus kandleri 69
FIGURA 54. Lactobacillus kandleri en Agar Nutritivo 69
FIGURA 55. Microscopia 100X de Lactobacillus sake 70
FIGURA 56. Lactobacillus sake en Agar Nutritivo 70
FIGURA 57. Microscopia 100X de Lactobacillus viridescens 71
FIGURA 58. Lactobacillus viridescens en Agar Nutritivo 71
FIGURA 59. Microscopia 100X de Listeria murrayi 72
FIGURA 60. Listeria murrayi en Agar Nutritivo 72
FIGURA 61. Microscopia 100X de Listeria welshimeri 73
FIGURA 62. Listeria welshimeri en Agar Nutritivo 73
FIGURA 63. Microscopia 100X de Lactococcus lactis 75
FIGURA 64. Lactococcus lactis en Agar Nutritivo 75
FIGURA 65. Microscopia 100X de Micrococcus luteus 76
FIGURA 66. Micrococcus luteus en Agar Nutritivo 76
FIGURA 67. Microscopia 100X de Micrococcus roseus 77
FIGURA 68. Micrococcus roseus en Agar Nutritivo 77
FIGURA 69. Microscopia 100X de Pediococcus sp 78
FIGURA 70. Pediococcus sp en Agar Nutritivo 78
FIGURA 71. Microscopia 100X de Sacharococeus thermophilus 79
FIGURA 72. Sacharococeus thermophilus en Agar Nutritivo 79
FIGURA 73. Microscopia 100X de Sarcina ventriculi 80
FIGURA 74. Sarcina ventriculi en Agar Nutritivo 80
FIGURA 75. Microscopia 100Xde Staphylococcus aerlettae 81
FIGURA 76. Staphylococcus aerlettae en Agar Nutritivo 81
FIGURA 77. Microscopia 100X de Staphylococcus auricularis 82
FIGURA 78. Staphylococcus auricularis en Agar Nutritivo 82
FIGURA 79. Microscopia 100X de Staphylococcus equorum 83
FIGURA 80. Sacharococeus equorum en Agar Nutritivo 83
FIGURA 81. Microscopia 100X de Staphylococcus hominis 84
FIGURA 82. Sacharococeus hominis en Agar Nutritivo 84
FIGURA 83. Microscopia 100X de Staphylococcus lentus 85
FIGURA 84. Sacharococeus lentus en Agar Nutritivo 85
FIGURA 85. Microscopia 100X de Trichococcus flocculiformis 86
FIGURA 86. Trichococcus flocculiformis en Agar Nutritivo 86
AGRADECIMIENTOS
• Al Dr. Rubén Darío Torrenegra, por sus excelentes aportes de
conocimiento.
• A Andrea García y Sindy Lorena Rodríguez por su colaboración.
• A Colciencias, por su financiación parcial para éste proyecto,
12010-IT0101103.
• A nuestros padres por su paciencia y apoyo para lograr el objetivo
de ser profesionales.
1. INTRODUCCIÓN
La búsqueda de microorganismos importantes en la producción de
metabolitos de interés industrial, ha conducido a los investigadores a
realizar búsquedas en nuevas zonas poco estudiadas en gran mayoría
aquellas con climas extremos, debido a la necesidad de mejorar el
rendimiento, eficacia y el contrarrestar otros organismos que durante el
paso del tiempo han ganado tolerancia a metabolitos ya existentes.
Así mismo mediante la identificación de especies microbianas en estas
zonas se pretende ampliar la gama de microorganismos conocidos,
contribuyendo así al conocimiento de la biodiversidad de nuestro país,
microbiota que puede ser capaz de producir metabolitos de interés
industrial por consecuencia de interacciones microbianas o algún tipo de
estrés ambiental.
El páramo se ha considerado como una fuente muy importante en
almacenamiento de recursos ambientales, pero así mismo en
comparación con otras zonas de investigación, es poco el número de
proyectos desarrollados en los mismos y es alta la taza de explotación y
contaminación que se espera en unos años.
Los sistemas de páramo juegan un papel importante como reguladores
del recurso hídrico, albergue de un gran número de especies animales y
vegetales, riqueza paisajística y procesos socioeconómicos del territorio
colombiano.
Conjuntamente en la actualidad los ecosistemas paramunos tienen una
gran demanda de explotación para caracterizar microbiota y con esta
investigación se pretende contribuir al estudio de la microbiología de
suelos con el aislamiento e identificación de bacterias nativas del páramo
de Cruz Verde y Guasca.
2. MARCO TEÓRICO
2.1. Suelo
El termino suelo, que deriva del latín solum, y significa piso, puede
definirse como la capa superior de la tierra que se distingue de la roca
sólida y en donde las plantas crecen. Los suelos deben considerarse
como formaciones geológicas naturales desarrolladas bajo condiciones
muy diversas de clima y materiales de origen, lo cual justifica su continua
evolución. El suelo independientemente de su origen tiene una función:
soportar una vegetación y en él se deben dar las condiciones necesarias
para el desarrollo de las plantas. Con una concepción fisiológica vegetal,
el suelo se define como la mezcla de partículas sólidas pulverulentas, de
agua y de aire que provee de los elementos nutritivos necesarios para las
plantas (Forsythe, 2002).).
El suelo posee carga negativa, esta propiedad física del suelo también
esta relacionada con la densidad y el espacio entre partículas o
porosidad, consecuentemente en relación con la microbiota, los rangos
entre estas propiedades permiten una retención de nutrientes y la
viabilidad para que los microorganismos los aprovechen (Ömer, et al.
2007).
Se sabe que el suelo es el mayor hábitat de colonias bacterianas y en
cualquier área de la industria las cepas microbianas en su gran mayoría
son aisladas e identificadas del suelo, obviamente debido a la gran
variabilidad de condiciones y ambientes que toleran (Shayne, et al.
2003).
Actualmente se ha venido buscando la renovación del grupo de células
manejadas en la industria con microorganismos poco comunes en su
mayoría no cultivables, en consecuencia se han desarrollado y modificado
técnicas y medios de cultivo con el fin de recuperar aquellos
microorganismos (Shayne, et al. 2003).
2.1.1. Perfil del Suelo
Básicamente el perfil del suelo comprende tres horizontes principales:
El Horizonte A está formado por el suelo superficial y en él se encuentra
la mayor parte de materia orgánica procedente de las raíces de las
plantas y otros restos que son depositados sobre la superficie. Presenta
un color oscuro debido a la materia orgánica presente (Merchan S, 2007).
El Horizonte B constituye la capa intermedia y suele estar altamente
meteorizado. De color más claro, en él se sitúan las raíces de los arbustos
y árboles. El contenido en materia orgánica es mucho menor (Merchan S,
2007).
El Horizonte C comprende la capa más profunda del perfil. Está formado
por partículas de roca poco desmenuzadas y prácticamente sin actividad
por parte de organismos vivos (Merchan S, 2007).
2.1.2. Textura del Suelo
Independiente de los horizontes, los suelos contienen proporciones
variables de arcilla, aluviones y partículas de arena. La proporción de
estas partículas de diferente tamaño constituye la textura del suelo, la
cual es una propiedad importante para la ecología de los
microorganismos, ya que determina el área de la superficie disponible
como hábitat para el crecimiento de los microorganismos. Los suelos con
mayor composición en arcilla tienen una mayor área de superficie
disponible que aquellos en los que predomina la concentración de granos
de arena, cuyo tamaño es mucho mayor que el de las partículas de arcilla
(Atlas y Bartha, 2002)
2.1.3. Componente suelo
En la mayoría de los suelos el reservorio principal de nutrientes se
encuentra presente en los compartimentos de la materia orgánica y en el
suelo mineral, con solamente una pequeña cantidad disponible para las
plantas en un corto tiempo (en los nutrientes cambiables/extractables y en
la solución del suelo) (Navarro y Navarro, 2000).
La materia orgánica del suelo es heterogénea con respecto a la actividad
biológica y la biomasa microbiana por si misma representa una fuente
significativa de nutrientes. Así, son importantes los grupos de
bacterias nitrificantes, los hongos y las bacterias solubilizadoras de
fósforo y las interacciones micorrizas vesículo-arbusculares que permite al
ecosistema aumentar la eficiencia de la captación de algunos de los
nutrientes, necesarios para el crecimiento de las plantas (Cárdenas y
Moreno, 1993).
2.1.4. Microorganismos del suelo
Los microorganismos del suelo representan la mayor proporción de uso a
nivel industrial, la comunidad edáfica dependen del conjunto de nutrientes
en el ecosistema pero pueden ser considerados como el principal agente
transformador en el movimiento de los nutrientes a través del suelo y
como una fuente productora de compuestos para las plantas durante sus
ciclos de renovación (Duxbury, et al. 1989).
El suelo contiene el más alto número de grupos filogenéticos existentes,
aproximadamente hay > 10 9 células bacterianas por gramo de suelo,
pero existe una gran problemática, no es cantidad de microorganismo, es
la sensibilidad de una fracción de grupos bacterianos muy alterables al
cambio de condiciones ambientales, el mas pequeño cambio climático y
en respuesta dejan de producir metabolitos y enzimas muy importantes en
el campo científico (Duxbury, et al. 1989)
El suelo es generalmente un hábitat favorable para la proliferación de
microorganismos y en las partículas que lo forman se desarrollan
microcolonias. Típicamente en los hábitats del suelo se encuentran de 108
a 1010 bacterias por gramo de suelo. Los microorganismos aislados de
suelo comprenden virus, bacterias, hongos, algas y protozoos. (Atlas y
Bartha, 2002).
La mayoría de la población bacteriana organotrófica aerobia de gran parte
de los suelos está compuesta por géneros Gram Positivos. No sería
correcto generalizar los porcentajes de varios grupos, pero no es extraño
encontrar que hasta el 70% de la totalidad de los aislamientos bacterianos
del suelo se clasifican dentro de las denominadas bacterias Gram
positivas del género Arthrobacter sp, siendo la mayoría de la microflora
restante Bacillus sp, y Microccus sp (Grant, 1989).
La población Gram negativa generalmente está compuesta en su mayor
parte por Pseudomonas sp. y Flavobacterium sp. Otros géneros
relativamente frecuentes considerados nativos incluyen Acinetobacter sp,
Agrobacterium sp., Alcaligenes sp. y Nocardia sp. (Grant, 1989)
La variabilidad de las comunidades microbianas en el suelo dependen
mayormente de la viabilidad par metabolizar una fuente de carbono, la
disponibilidad de macro y micro elementos, el contenido de agua, el pH y
el tamaño de las partículas. Cuando estas características se alternan se
producen ambientes anaerobios, saturados o tóxicos según sea el nivel
de presencia, hay es donde se encuentran especies bacterianas con
propiedades metabólicas incomparables y procesos adaptativos regidos
por componentes enzimáticos desconocidos (Hansel, et al. 2008).
Muchos géneros de bacterias aisladas de climas extremos se han
utilizado en biorremediación de hidrocarburos en diferentes tipos de
terrenos, con un óptimo resultado frente a otros mecanismos físicos o
químicos, más demorados, costosos o con residuos no tan tóxicos pero
de difícil degradación. De estos géneros se han creado diferentes
inóculos de variados tipos de microorganismos que interaccionan de
forma más insuperable y cómodo control (Albert, 1996).
2.1.5. Muestreo del Suelo
Se han desarrollado numerosos métodos con el objetivo de examinar
cuantitativamente y cualitativamente las poblaciones microbianas en
diversos ecosistemas (Hurst, et al.1997), para examinar microorganismos
en sistemas naturales basándose en el número total de individuos, en el
número de poblaciones especificas, o en sus actividades metabólicas, se
han analizado submuestras representativas de los mismos y los
resultados se han aplicado a la totalidad de la comunidad o del
ecosistema (Board, et al. 1973).
En muestreos de suelos en donde también importa la profundidad de las
respectivas muestras se pueden introducir tubos en cinco áreas
anteriormente seleccionadas basadas en el tipo de terreno, profundidad.
(Albert, 1996)
2.2. Páramo
Se denomina Páramo al ecosistema húmedo de los Andes tropicales.
Sobre 3000m de altura excluyendo de esta definición las alturas de Perú y
Bolivia, porque en ellas predomina la sequedad; Colombia posee así el
60% de los páramos del mundo, el resto lo comparten Venezuela y
Ecuador (Guhl, 1982). Estos ecosistemas son de gran importancia como
reservorio de agua y juegan un papel importante como albergue de un
gran número de especies de animales, vegetales y cepas microbianas
nativas (Bernal, 2006), (Chitiva, et. al. 2002).
2.2.1. Vegetación de los Páramos
En los páramos la vegetación natural dominante está representada por:
• Musgos: Entre estas especies se encuentran los musgos de la
turba (Sphagnum spp) y el llantén de páramo (Plamtago rigida),
característicos de zonas pantanosas.
• Pajonales o Gramíneas: Están representados por la paja ratón
(Callamagrostis), carrizo (Cortadeiras), frailejón (Espeletia spp), chite
(Hypericum), vira-vira (Gnaphalium spp), chusque (Chusque spp),
romero de páramo (Senecio spp), gaque (Clusia spp), y cardo
(Puyas)
• Arbóreas y arbustivas: Compuestas por mortiño (Hesperomeles
spp), chilco (Baccharis spp), quiebra barriga (Pernettya spp), y
encenillo (Weinmania spp). (Cárdenas, et al. 1993).
Estas especies ayudan a la regulación y captación de agua proveniente
de los procesos de condensación en ésta zona. La estructura y
composición del subpáramo corresponden a un mosaico de formaciones
arbustivas, que también cumple una función esencial de protección,
mantenimiento y recarga de acuíferos (Cárdenas, et al. 1993).
2.2.2. Suelo de los Páramos
En la mayor parte de los páramos de Colombia el material a partir del cual
evolucionan los suelos son las cenizas volcánicas y como resultado se
tiene la presencia de suelos de tipo Andisoles, aunque también se
presentan Entisoles, Inceptisoles e Histosoles. Si bien existe una variada
gama de suelos en los páramos colombianos, éstos se caracterizan por
ser similares en sus propiedades morfológicas, físicas, químicas y
mineralógicas (Malagón, et al. 2000).
En general, son suelos con estructura de bloques finos y medianos,
mediana a alta retención de humedad, porcentajes altos a muy altos de
carbono orgánico, altos valores de CIC, baja cantidad de bases de
cambio, altos contenidos de aluminio, escasos contenidos de fósforo
disponible y marcada acidez (Malagón, et al. 2000).
Las condiciones del suelo en el páramo incluyen: una escasa capa de
hojarasca con grandes fracciones de suelo descubierto, con un horizonte
A rico en humus que descansa sobre un horizonte C (de material
parental) donde los organismos del suelo son muy escasos, determina la
presencia de una comunidad edáfica localizada principalmente en el
horizonte A (Cárdenas, et al. 1993).
2.3. Crecimiento Microbiano
A nivel molecular las bacterias precisan de al menos 10 elementos para
producción de hidratos de carbono, lípidos proteínas y ácidos nucleicos,
otros elementos no son tan necesarios pero forman parte de enzimas y
cofactores (Prescott, 2004).
Las moléculas de nutrientes, con frecuencia no pueden atravesar por
difusión pasiva las membranas plasmáticas selectivamente permeables.
En este caso deben ser transportadas por uno de los tres mecanismos
principales de transporte que comprenden la participación de proteínas
transportadoras (Prescott, 2004)
La célula bacteriana es esencialmente una máquina que es capaz de
duplicarse a sí misma. Los procesos sintéticos del crecimiento celular
bacteriano implican no menos de 2000 reacciones bioquímicas. Algunas
de estas reacciones implican transformaciones de energía. Otras,
implican la síntesis de pequeñas moléculas así como cofactores y
coenzimas necesarios para las reacciones enzimáticas (Madigan, et al.
2000)
En la mayoría de los procariotas, el crecimiento de una célula individual
continua hasta que se divide en dos nuevas células, un proceso llamado
fisión binaria (binario, para expresar el hecho de que se forma dos células
a partir de una) (Madigan, et al. 2000).
Pero también en el crecimiento microbiano hay un parámetro de gran
importancia y es la relación entre microorganismos para favorecer o evitar
la proliferación celular, por ejemplo la contribución entre especies
bacterianas y fúngicas en la descomposición de sustratos en función de
un ecosistema o contrariamente la interacción antagonista bacteriana
frente a hongos, debido a su amplio rango de crecimiento y al mas alto
índice de reducción y producción metabólica (Rousk, et al. 2008)
2.3.1. Efecto de la Temperatura
En todo el mundo la diversidad de especies microbianas principalmente
se debe a la variabilidad de temperaturas tanto a nivel geográfico,
alteración humana o de estaciones ambientales; debido a esto el
crecimiento a latencia de la célula depende del favorecimiento ambiental
(Hansel, et al. 2008)
La temperatura es unos de los factores ambientales más importantes que
afecta al crecimiento y a la supervivencia microbiana. Puede afectar a los
microorganismos vivos de dos formas muy diferentes. A medida que la
temperatura sube, las reacciones enzimáticas son más rápidas y el
crecimiento se hace más rápido. Sin embargo, por encima de una cierta
temperatura, las proteínas, ácidos nucleicos y otros componentes
celulares pueden dañarse irreversiblemente. Por encima de este punto las
funciones celulares paran. Por tanto, para cada microorganismo existe
una temperatura mínima por debajo de la cual no existe crecimiento, una
temperatura optima a la cual el crecimiento es el más rápido posible y una
temperatura máxima rebasada la cual no existe crecimiento. (Mandigan,
et al. 2000)
2.3.1.1. Crecimiento Microbiano a Temperaturas Extr emas
Algunos aislamientos de grupos bacterianos en ambientes extremos se
han podido llevar acabo modificando las temperaturas de incubación, de
las manejadas comúnmente (35°C), existiendo cepas b acterianas tan
sensibles a estos cambios de temperatura que son incapaces de
recuperarse si no se cultivan a la temperatura exacta donde ellas crecían
(Kathryn, et al. 2005)
Existen cuatro grupos microbianos en relación con su temperatura óptima:
psicrófilos, con temperaturas óptimas bajas, mesófilos con temperaturas
óptimas medianas, termófilos con temperaturas óptimas más altas e
hipertermófilos con temperaturas muy altas (Mandigan, et al. 2000)
Los psicrófilos son los microorganismos de interés en este estudio, son
aquellos que son capaces de crecer con una temperatura óptima de
crecimiento de 15 ºC o más bajo, una máxima por debajo de 20 ºC y una
mínima de 0 ºC o menor. Los psicrófilos se encuentran en ambientes
permanentemente fríos y mueren rápidamente si se exponen a
temperatura ambiente (Mandigan, et al. 2000).
Los psicrófilos producen enzimas que funcionan óptimamente en frío y
que se desnaturalizan rápidamente a temperaturas moderadas. Otras
características de los psicrofilos si se compara con los mesófilos, es que a
bajas temperaturas tienen lugar procesos de trasporte activo, lo que es
una clara indicación de que la membrana de estos microorganismos es de
distinta naturaleza, pues a bajas temperaturas pueden seguir llevando a
cabo su función. Sus membranas contienen una mayor proporción de
ácidos grasos insaturados lo que ayuda a mantener el estado semifluido
de la membrana a bajas temperaturas. (Mandigan, et al. 2000)
2.3.2. Acidez y Alcalinidad
La acidez o alcalinidad de un medio influye sobre el crecimiento
microbiano. Algunos microorganismos se desarrollan mejor a pH alto 9-14
alcalinófilos, mientras que otros a pH bajo 5-2 acidófilos, estos rangos
pueden variar debido a la adaptabilidad de muchas cepas. Aquellos
microorganismos que crecen a rangos de pH de 6-8 se llaman neutrófilo;
hay que tener en cuenta que el pH intracelular debe permanecer próximo
a la neutralidad, aunque el pH externo sea altamente ácido o básico. En
muchos casos el microorganismo como consecuencia de su metabolismo
crea un gradiente extracelular de iones OH- o H+ (Rico, 2004).
Cada organismo tiene un rango de pH dentro del cual es posible el
crecimiento y normalmente posee un pH óptimo muy bien definido. La
mayoría de los ambientes naturales tienen valores de pH de 5,9 y los
organismos con pH óptimo equivalente son los habituales. Solo unas
pocas especies pueden crecer a pH inferior a 2 o mayor a 10. Los que
crecen a pH bajos se llaman acidófilos y por el contrario los que crecen a
pH altos se llaman alcalófilos (Mandigan, et al. 2000)
2.3.3. Oxígeno
Como elemento constituyente, también es requerimiento para la
respiración aeróbica para cubrir sus necesidades energéticas y para ello
el oxigeno funciona como agente oxidante terminal, organismos
denominados aerobios estrictos (Stanier, 1992).
Los organismos que carecen de sistemas respiratorios no pueden utilizar
el oxígeno como aceptor termina de electrones. Tales organismos se
llaman anaerobios, pero existen dos clases de anaerobios: los anaerobios
aerotolerante, que pueden tolerar el oxígeno y crecer en su presencia aún
cuando no pueden utilizarlo como por ejemplo las bacterias ácido lácticas,
q poseen un metabolismo productor de energía que es exclusivamente
fermentativo y los anaerobios estrictos que mueren en presencia del
oxígeno (Mandigan, et al. 2000) (Stanier, 1992).
2.4. Identificación Bioquímica
Una especie bacteriana es una colección de cepas que comparten
características comunes. El metabolismo bacteriano es un equilibrio
dinámico entre biosíntesis (reacciones anabólicas) y degradación
(reacciones catabólicas). La reacciones catabólicas además de proveer
las unidades más pequeñas para los procesos biosintéticos posteriores,
provee la energía “para manejar” las reacciones biosintéticas (Koneman,
2001).
En este proceso, la energía proviene de la hidrólisis de uniones químicas
es capturada de las uniones fosfato de alta energía del adenosintrifosfato
(ATP). Estas uniones suministran la energía para la activación y la
continuación de otros elementos bioquímicos. Así mismo requieren de la
polimerización de proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos y lípidos
(Rico, 2004).
Los anteriores elementos deben encontrarse preformados en el medio
donde se encuentra el microorganismo o deben ser sintetizados por la
propia célula (Rico, 2004)
La capacidad de un microorganismo dado para producir ácido a partir de
una variedad de carbohidratos (p. ej., maltosa, sacarosa, manitol,
manosa, etc.) refleja la capacidad enzimática de estos microorganismos
para convertir inicialmente estos carbohidratos en glucosa, que es el
punto de partida tanto para el metabolismo aeróbico de los carbohidratos
como el anaeróbico (Koneman, 2001).
En general muchas pruebas empleadas en microbiología involucran la
detección de productos finales del metabolismo bacteriano en medios de
cultivo líquido agotados, tanto por medio de indicadores de pH presentes
en el medio como por cromatografía gas líquido (Prescott, 2004).
Las pruebas bioquímicas consisten en distintos test químicos aplicados a
medios biológicos, los cuales, conocida su reacción, permite identificar
distintos microorganismos presentes. Su sistema de funcionamiento
generalmente consiste en determinar la actividad de una vía metabólica a
partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la
bacteria al crecer incorpora o no (Mandigan, et al. 2000).
Existen gran cantidad de bioquímicas usadas para la identificación
bacteriana, las utilizadas en esta investigación fueron las siguientes:
2.4.1. Prueba de Voges Proskauer
La prueba Voges-Proskauer se basa en la producción de
acetilmetilcarbinol o acetoína, un producto final neutro derivado del
metabolismo de la glucosa, que al reaccionar con los indicadores produce
un color rojo; se emplea para diferenciar especies de Bacillus y bacterias
entéricas (Prescott, 2004).
La glucosa es metabolizada a ácido pirúvico, el principal intermediario en
la glucólisis. A partir del ácido pirúvico, las bacterias pueden seguir
muchos caminos metabólicos; la producción de acetoína es una de las
vías metabólicas de la degradación de la glucosa en las bacterias
(Koneman, 2001)
El primer reactivo agregado es el catalizador α-naftol, este actúa como
intensificador del color, lo que incrementa la sensibilidad de la reacción
sin pérdida de la especificidad. El segundo reactivo es el KOH al 40%, el
cual ayuda a la absorción de CO2 en el medio (MacFaddin, 2003)
La prueba positiva muestra un color rosado-rojo en la superficie del medio
(acetoína presente) y en una prueba negativa se observa un color amarillo
en la superficie del medio (anexo 1) (MacFaddin, 2003)
2.4.2. Prueba Rojo de Metilo
Es una prueba cuantitativa basada en el uso de un indicador de pH, el
rojo de metilo, para determinar la concentración del ion hidrógeno cuando
un microorganismo fermenta la glucosa (Koneman, 2001). La validez de la
prueba rojo de metilo depende de una incubación prolongada para
permitir que ocurra la diferencia en el metabolismo de la glucosa
(MacFaddin, 2003).
Para una prueba positiva el cultivo es suficientemente ácido para permitir
que el reactivo rojo de metilo permanezca con un color distintivo rojo
brillante, mientras que en una prueba negativa se observa un color
amarillo en la superficie (anexo 1) (MacFaddin, 2003).
2.4.3. Prueba LIA (Descarboxilación Lisina)
La descarboxilación es el proceso por el cual las bacterias que poseen
enzimas descarboxilasas específicas atacan los aminoácidos en su
carboxilo terminal (COOH) para formar amina o una diamina y dióxido de
carbono (Prescott, 2004).
El aminoácido L-lisina es descarboxilado para formar cadaverina (una
diamina) y dióxido de carbono por la acción de la enzima específica lisina
descarboxilasa. El aminoácido L-ornitina es descarboxilado por la enzima
ornitina descarboxilasa para formar la diamina putrescina y dióxido de
carbono. El aminoácido L-arginina es catabolizado por medio de dos
sistemas que pueden ocurrir de manera simultánea o separada. Estas dos
vías metabólicas son el sistema de la arginina dihidrolasa y el sistema de
la arginina descarboxilasa (MacFaddin, 2003).
También se utiliza el componente citrato amónico férrico para la detección
en la producción de H2S (Prescott, 2004).
En la prueba positiva se observa un color púrpura turbio a amarillo
apagado (el microorganismo produjo cadaverina) y una prueba negativa
se ve un color amarillo brillante, claro (el microorganismo solo fermentó la
glucosa) (MacFaddin, 2003).
2.4.4. Hidrólisis de Almidón
El almidón es un homopolisacárido; la estructura básica del almidón es
una mezcla de dos moléculas de polisacárido poliglucosa: amilosa lineal y
amilopectina ramificada (Prescott, 2004).
Las amilasas son enzimas que catalizan la hidrólisis de 1,4 α - D –
Glucanos como el almidón y glucógeno generando dos moles de glucosa
(Pedroza, 1999).
Para observar la actividad enzimática se utiliza el agar almidón que es
fundamental por el contenido de almidón que se encuentra disponible, el
cloruro de sodio encontrado en este agar es de vital importancia pues las
α amilasas al ser metaloenzimas requieren de calcio para su estabilidad y
su actividad (Serrano, 1990) (Wulf, 1993).
Como reactivo se utiliza el lugol, el yodo contenido en el lugol (Yodato-
Yoduro) se une a los enlaces α 1-4 del almidón generando una coloración
azul-negro mientras que los sitios en que se genera hidrólisis permaneces
incoloras poniendo en evidencia a las colonias de acción amilolítica
(Serrano, 1990).
2.4.5. Prueba SIM (Producción de sulfuro de Hidróge no)
Esta prueba tiene tres própositos:
1. Determinar si la bacteria a través de Triptofanasas puede degradar el
Triptófano a indol.
2. Determinar si hay producción de H2S a partir de aminoácidos
azufrados.
3. Determinar si la bacteria es móvil.
La presencia de anillo rojo muestra la presencia de indol, es decir, el
triptófano fue degradado, presencia de un precipitado negro muestra la
producción de H2S y movilidad difuminación de la bacteria hacia los lados
(Prescott, 2004).
2.4.6. Prueba TSI (Agar con azúcar triple y hierro)
El agar TSI es un medio de cultivo diferencial. Para la determinación de
fermentaciones de tres hidratos de carbono (glucosa, lactosa y sacarosa),
la producción de CO2 al fermentar los hidratos de carbono y la
determinación de la producción de H2S. Además contiene sulfato amónico
ferroso y tiosulfato sódico (Prescott, 2004).
La fermentación tiene lugar tanto en aerobiosis como anaerobiosis. El
monosacárido glucosa es catabolizado inicialmente por la vía metabólica
anaerobia de Embden-Meyerhof-Parnas, usada por aerobios y anaerobios
para producir el intermediario clave ácido pirúvico. El ácido pirúvico es
degradado luego a través del ciclo de Krebs por aerobio o anaerobios
facultativos para rendir CO2, H2O y energía (Koneman, 2001).
Se emplea para identificar los microorganismos entéricos por su
capacidad de fermentar la glucosa, la lactosa o la sacarosa, y liberar
sulfuros de sulfato amónico o del tiosulfato sódico (Prescott, 2004).
2.4.7. Prueba Citocromo Oxidasa
Los citocromos son hemoproteínas que transportan electrones,
normalmente como componentes de la cadena transportadora de
electrones (Prescott, 2004).
La prueba de oxidasa se basa en la producción bacteriana de una enzima
oxidasa intracelular. Esta reacción de oxidasa se debe a un sistema de
citocromo oxidasa que activa la oxidación del citocromo reducido por el
oxígeno molecular, el que a su vez actúa como un aceptor de electrones
de la fase terminal del sistema de transferencia de electrones (Koneman,
2001).
El sistema citocromo, por lo común presente sólo en los microorganismos
aerobios, permite a éstos utilizar el oxígeno como aceptor final de
hidrógeno para reducir el oxígeno molecular a peróxido de hidrógeno
(Koneman, 2001).
2.4.8. Prueba de Citrato
El citrato de sodio es una sal del ácido cítrico en el ciclo de los ácidos
tricarboxilicos, esta prueba determina si este producto es usado como
única fuente de carbono, por lo tanto el medio utilizado no debe tener
proteínas e hidratos de carbono como fuentes de carbono. Se detecta por
la producción de subproductos alcalinos, puesto que el citrato de sodio es
un anión, la única fuente de nitrógeno es el fosfato de amonio que puede
convertirse en amoniaco produciendo hidróxido de amonio (NH4OH)
(Koneman, 2001).
En medio citrato de Simmons si se observa un intenso color azul en el
pico de flauta la prueba es positiva y si el medio conserva el mismo color
inicial (verde) la prueba es negativa (anexo 1) (MacFaddin, 2003).
2.4.9. Prueba de Ureasa
El sustrato urea, una diamina del ácido carbónico, a menudo se designa
como una carbamida. Todas las amidas son hidrolizadas con facilidad
(MacFaddin, 2003).
Los microorganismos que poseen la enzima especifica ureasa hidrolizan
la urea, con la cual se libera moléculas de amonio como producto final,
virando a rojo violeta el indicador rojo de fenol (anaxo1) (Koneman, 2001).
Al desdoblar la urea en amoniaco también hay liberación de CO2, se
utiliza para diferenciar géneros como: Proteus, Klebsiella pneumoniae y
bacterias entéricas (Prescott, 2004).
2.4.10. Reducción de nitratos
La reducción de nitrato (NO3) a nitrito (NO2) y a nitrógeno gaseoso (N2)
por lo común se produce en condiciones de anaerobiosis, en las cuales
en un microorganismo produce su oxígeno del nitrato. El oxígeno actúa
como un aceptor de hidrógeno, es decir, el protón y el aceptor final de
electrones (MacFaddin, 2003).
La prueba para la presencia de nitritos en el medio, se realiza añadiendo
en cada tubo 0.5 ml de reactivo de Griess, y se observa un color: una
prueba positiva color rojo, una prueba negativa incoloro; si no se observa
cambio de color se adicionara una pequeña cantidad de polvo de zinc y si
presenta una coloración se informará como negativo, si no presenta
cambio será positiva (anexo 1) (Carrascal, 2003).
Las posibilidades del producto final en la reducción del nitrato son
muchas: nitrito, amoniaco, nitrógeno molecular, óxido nítrico, óxido nitroso
o hidroxilamina. El producto formado depende de la especie bacteriana
(MacFaddin, 2003).
2.4.11. Prueba de Catalasa
La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrogeno
(H2O2) en agua y oxígeno (anexo 1). Es una hemoproteína similar a la
hemoglobina excepto que sus cuatro átomos de hierro están en estado
oxidado, debido a que el peróxido de hidrógeno se forma como producto
final de la oxidación en el metabolismo aerobio de hidratos de carbono, si
se acumula resulta letal para la célula, se utiliza en la diferenciación de
Streptococcus (-) de Staphylococcus (+) y Bacillus (+) de Clostridium (-)
(Koneman, 2001) (Prescott, 2004).
2.4.12. Licuefacción de Gelatina
La gelatina es una proteína derivada del colágeno animal, ésta se siembra
a diferentes medios de cultivo para determinar la capacidad de un
microorganismo de producir enzimas proteolíticas, detectadas por
digestión o licuefacción de la gelatina (MacFaddin, 2003).
En la prueba de la licuefacción de la gelatina, la gelatina se siembra
previamente y se lleva a incubar por 24 horas a 35°C, su lectura se realiza
visualizando un cambio en la consistencia dura de la gelatina, por una
consistencia liquida, lo que indicara una licuefacción. Es importante
destacar que la gelatina a 35°C es liquida, por lo que es necesario enfriar
las bioquímicas en el chorro de agua fría para evitar falsos positivos
(Carrascal, 2003).
2.4.13. Pruebas de fermentación de Hidratos de Carb ono
Los hidratos de carbono están formados por carbono, hidrogeno y
oxigeno. Se clasifican en: monosacáridos, aldehídos polhidroxilados o
cetonas; en polisacáridos u oligosacáridos y en alcoholes polihídricos y
ciclitoles. A partir de ellos se obtiene energía, también realizan funciones
de reserva energética (glucógeno) y estructurales como la celulosa
(Salve, 1997).
Un monosacárido o azúcar simple por lo común contiene entre 1 y 6
átomos de carbono; la eritrosa es un azúcar de 4 carbonos (C4H8O4); la
ribosa, ribulosa, xilosa y arabinosa son azúcares de 5 carbonos(C5H10O5)
y la glucosa, la fructosa, la galactosa y la manosa son azúcares de 6
carbonos (C6H12O6) (MacFaddin, 2003).
para todos los procesos fermentativos de los hidratos de carbono, se
toma una colonia a examinar y se adicionara en un tubo con la azúcar a
investigar, una coloración amarilla indicara la fermentación del azúcar por
este microorganismo y se informara como positivo, sino se presenta
cambio será negativo, para la fermentación, en el proceso fermentativo
hay producción de ácidos que bajan el pH del medio, existiendo una
variación en el color dada por el indicador de pH rojo de fenol (Carrascal,
2003).
2.4. Bioconservación
A medida que la biotecnología avanza en todos los esquemas de la
innovación moderna en cualquier trabajo que implique el uso de los
microorganismos, es deseable contar con una fuente pura y viable del
agente de interés, ya que es posible afrontar problemas de pureza y
viabilidad de las cepas así como de pérdida de microorganismos por el
simple hecho de no contar con copias adicionales del mismo. Debido a
estas problemáticas se trataron e investigaron tres métodos de
conservación: mediante glicerol al 20%, sensidiscos y en suelo estéril
directo bajo congelación (Garcia, 1999) (Leveau, 2000).
Así mismo las cepas bajo técnicas de conservación, son utilizadas en el
futuro después de varios años, estas técnicas de conservación han
permitido a los científicos, utilizar cepas cultivadas varios años atrás con
nuevas técnicas mejorando el rendimiento y permitiendo obtener nuevos
metabolitos y actividades benéficas (Garcia, 1999) (Leveau, 2000).
El aislamiento e identificación de un microorganismo ideal para un
proceso industrial puede ser un proceso largo y costoso y es esencial que
los microorganismos seleccionados mantengan sus propiedades a lo
largo del tiempo, sin sufrir contaminaciones cruzadas que impidan o
modifique el crecimiento óptimo de la cepa. Los procedimientos de
conservación utilizados para cepas bacterianas, fueron debidamente
seleccionados con el fin de evitar:
• Evitar las mutaciones genéticas o alteración metabólica.
• Evitar que se produzcan contaminaciones y muerte por
metabolismos antagónicos.
• Conservar intacta su viabilidad y mantener intacta las baterías
enzimáticas.
Así mismo los bancos de conservación permiten tener reservas, dado
algún imprevisto. Por otro lado permiten tener una base de
microorganismos puros si se desea ampliar el banco de conservación.
(García, 1999) (Leveau, 2000)
Para conservar correctamente las cepas microbianas en los laboratorios
de microbiología es necesario: que el cultivo a conservar sea puro,
evitando que se produzcan contaminaciones durante el proceso de
conservación; que durante el tiempo de conservación sobrevivan al
menos el 70-80% de las células, y por último, que estas células
permanezcan genéticamente estables (García, 1999).
El propósito de una colección es el de mantener el material biológico en
un estado viable y estable que retenga todas las propiedades originales,
es necesario mantener cepas confiables utilizando técnicas apropiadas de
conservación que eviten variabilidad genética (Sánchez, 2005).
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
3.1 Formulación del problema: El suelo localizado en zonas poco
óptimas para el crecimiento bacteriano no ha sido adecuadamente
estudiado y la poca caracterización de especies bacterianas en suelos
paramunos produce un limitante en información, potencial y beneficios a
la hora de buscar nuevas cepas productoras de metabolitos como
vacunas, primes, antifúngicos, biocidas y bioestáticos, entomopatógenos,
biocontroladores, capaces de reemplazar los biocompuestos
tradicionales.
Muchas de las cepas bacterianas aisladas y conservadas en colecciones,
pierden características metabólicas y estructurales significativas debido al
constante agravio al que son enfrentadas en diversos estudios; así mismo
se ha visto que diversos métodos de conservación interfieren con la
viabilidad de una cepa. Estas causas interfieren gravemente con el
desarrollo en investigaciones en diversos campos de la ciencia al ver
reducido el rendimiento en producción industrial.
3.2 Justificación: Años atrás se trabajaba con un grupo de
microorganismos muy limitado; debido a la falta de preocupación por
innovar; actualmente se busca nuevos microorganismos que remplacen y
mejoren las propiedades con las cuales se trabajan actualmente.
En el transcurso de estos últimos años, la visión científica microbiológica
se ha centrado en caracterizar microorganismos en ambientes extremos,
donde la mano del hombre no haya interferido con estos microcosmos.
Los científicos han reconocido cada vez más que los microorganismos
ocupan una posición clave en el flujo ordenado de materiales y energía a
través del ecosistema global, en virtud de sus capacidades metabólicas.
Consecuentemente en el transcurso del tiempo se han venido
modificando ciertas sustancias para disminuir su toxicidad, pero aun así
existen y se producen muchas más contaminantes, de las cuales el
ambiente no está habituado y por ello se ha incursionado en la búsqueda
de cepas las cuales podrían dar nuevas pautas en biorremediación.
Así mismo la constante demanda de nuevos medicamentos y compuestos
con mayor espectro, duración, economía de producción y menor toxicidad
para otros organismos y el ambiente, ha repercutido en la búsqueda de
microorganismos que no han sido caracterizados y son productores.
Los microorganismos más útiles en distintos campos han sido aislados de
los más diversos y extremos ambientes, debido a su adaptabilidad a
condiciones adversas. El páramo un ambiente extremo y una zona poco
explorada en este país, se ha considerado como una de las áreas de las
cuales se encuentra gran biodiversidad y donde se van adquiriendo
novedosas cepas tanto de hongos como de bacterias debido a las bajas
temperaturas, poca disponibilidad de luz solar y anaerobiosis por
saturación de agua en el suelo.
Otra cualidad interesante en este tipo de zonas es la marcada
transformación causada por el hombre, extinguiendo cepas nativas,
conjuntamente con la intervención por la mano del hombre, viene la
contaminación del suelo, la atmosfera y las corrientes acuíferas,
modificando ampliamente el nicho ecológico en el cual las cepas ya están
adaptadas.
En consecuencia a la persistente contaminación en el ambiente de
diversos productos y restos químicos que son utilizados diariamente, se
ha dado a los microorganismos un papel crucial en la solución de estos
problemas ambientales y económicos.
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo General:
Aislar e identificar cepas bacterianas nativas del suelo de los páramos
Cruz Verde y Guasca.
4.2 Objetivos Específicos:
• Utilizar diferentes métodos de muestreo en suelo, para determinar
aquel que ofrezca mejores condiciones de trabajo, mayor
conservación de condiciones y número de cepas bacterianas
aisladas.
• Identificar mediante estudios en cultivos selectivos, procesos
bioquímicos y observaciones morfológicas a nivel micro y
macroscópico, la microbiota de los páramos Cruz Verde y Guasca
que ha sido recuperada.
• Seguir una cadena de procedimientos que nos permitan
caracterizar de manera rápida y concisa diferentes grupos de
bacterias, presentando resultados verídicos.
• Elaborar un banco de cepas bacterianas a base de la microbiota
nativa obtenida del suelo del páramo Cruz Verde y Guasca, con el
fin de tener varias cepas en excelentes condiciones para futuros
estudios en diferentes campos de la investigación.
5. METODOLOGÍA
5.1. Recolección de muestras
No hay un método único de toma de muestras, debido a la diversidad de
ambientes naturales y los distintos objetivos del análisis. El recorrido a
efectuar en la toma de muestra es de acuerdo a alguno de los siguientes
esquemas:
Figura 1. Recorrido en toma de muestras en suelo.
Fuente: Atlas M. 2002
Cuando se toman muestras de suelo, no se suelen utilizar técnicas
asépticas sino que de forma pragmática se recurre a una pala y a un
cubo; la gran abundancia de microorganismos en el suelo relativiza la
acción de posibles contaminaciones procedentes del aire o de recipientes
no estériles (Atlas y Bartha, 2002).
Si se desea obtener una muestra de suelo de una profundidad
determinada, se usa un muestreador cilíndrico (corer) para suelos, (Ver
figura 1) que está formado por un tubo hueco de funcionamiento manual o
dirigido por un motor, con un borde cortante y afilado (Atlas y Bartha,
2002).
Figura 2 . Barrenos
Fuente: Atlas y Bartha, 2002
El muestreo de microorganismos presentes en el suelo es un número
relativamente bajo puede requerir el uso de atrayentes o cebos. En
muchos casos, es suficiente con ofrecer una superficie que concentrará,
por absorción, los nutrientes disueltos que se encuentran de forma natural
(Atlas y Bartha, 2002).
La técnica de Cholodny-Rossi del portaobjetos enterrado se usa
frecuentemente en la recogida y recuento directo de microorganismos de
suelo y sedimentos. En esta técnica se implanta en el suelo o el
sedimento un portaobjetos (Navarro y Navarro, 2000).
Se supone que la superficie limpia del portaobjetos no es selectiva y actúa
como la superficie de las partículas minerales presentes en el suelo. Por
tanto los tipos de organismos que se adhieren a dicha superficie, así
como su proporción, se pueden considerar representativos de la
comunidad (Navarro y Navarro, 2000).
El estudio de los valores como factor ambiental es muy importante, por su
interferencia en el modo de crecimiento en bacterias (rango óptimo de
crecimiento); debido a la variabilidad de condiciones dentro del
laboratorio se espera conservar el entorno de desarrollo de los páramos
de Cruz de Verde y Guasca.
5.2. Procesamiento de las muestras
5.2.2. Técnicas de Aislamiento:
5.2.2.1. Lavado del suelo: Elaborar un aparato lavador modificando el
descrito por Valencia (1979), el cual consta de dos embudos buzchner de
5cm de diámetro. En el extremo superior colocar el primer embudo con
un tapón de caucho conectado a una manguera de entrada de agua
contenida en un galón. Dicho embudo a su vez se acopla por su extremo
inferior al segundo embudo que contiene papel de filtro para reducir el
tamaño del poro. Este último se acondiciona a un recipiente de vidrio para
recoger el agua del proceso (Chitiva, et al 2002) (Hamaki T. et al. 2005).
Los tapones de caucho, son perforados introduciendo varillas de vidrio
que faciliten la entrada de aire para permitir la circulación de agua. Tomar
20 g de suelo previamente cernido por tamiz de 2mm y colocar en el
aparato lavador. Las partículas de suelo lavadas se toman del segundo
embudo y se secan sobre el papel de filtro en una caja de Petri, para
luego transferir partículas sobre las placas de agar (Chitiva, et al 2002)
(Hamaki T. et al. 2005).
Se manejaron dos medios de cultivo agar nutritivo y agar extracto de
suelo preparado según la metodología descrita (Hamaki T. et al. 2005)
5.2.2.2. Técnica de Placa de Conteo de Warcup: Es el método más
empleado para el aislamiento de microorganismos de crecimiento rápido,
por el método de diluciones seriadas (Valencia, 1979). Con esta técnica
se pretende recuperar la población bacteriana viable y cultivable.
A partir de cada dilución sembrar de forma masiva por triplicado en los
medios de cultivo seleccionados para el aislamiento de bacterias
obtenidas a partir de suelo. Incubar a 32ºC por 48 horas (Camacho y
Hernández, 2002).
5.2.2.3. Técnica de Cultivo Líquido: Esta técnica se utiliza con el fin de
proporcionar a las bacterias presentes en el suelo un medio de
preenriquecimiento con los nutrientes y las condiciones necesarias para
su recuperación (García y Ordoñez, 2003).
Tomar 10 gramos de cada muestra de suelo y adicionar a erlenmeyers
con 90 mL de caldo tripticasa de soya. Incubar a 32 ºC por 18 horas. A
partir de cada muestra realizar siembra masiva por triplicado en los
medios establecidos para el aislamiento, incubar a 32 ºC por 48 horas
(García y Ordoñez, 2003).
5.3. Identificación bacteriana
5.3.1. Identificación microscópica y macroscópica: realizar coloración
Gram para determinar la morfología de las bacterias aisladas,
conjuntamente realizar medidas y tomar fotografías, para comparación y
registro de características en su crecimiento (morfología de colonia,
pigmentación, tipo de borde y tamaño).
5.3.2. Identificación bioquímica: Realizar pruebas de Oxidasa,
Catalasa, Citrato, SIM (H2S, Indol, Motilidad), LIA (Lisina, Hierro Agar),
TSI (Triple Azúcar Hierro), OF (Oxidación-Fermentación), Voges
Proskauer, Rojo de Metilo, Nitratos, Urea, Gelatina, Almidón, Gelatina,
Glucosa, Sacarosa, Maltosa, Manosa, Manitol, Fructosa, Celobiosa,
Celulosa, Melobiosa, Sorbitol, Inositol, Sucrosa, Ramnosa, Xilosa,
Galactosa, Lactosa; para determinar el metabolismo de los
microorganismos aislados.
Finalmente sembrar los microorganismos identificados en medios
específicos como método confirmatorio y distintivo par los diferentes
géneros (Camacho y Hernández, 2002).
5.4. Conservación de cepas
5.4.1. Métodos de conservación
Los métodos más utilizados en las diferentes colecciones a nivel mundial
son:
5.4.1.1. Conservación en aceite mineral: Sembrar las cepas en cajas de
petri con Medio Agar Nutritivo, incubar a 35ºC hasta alcanzar un óptimo
crecimiento, posteriormente hacer coloración Gram para confirmar la
pureza de la cepa y repiques en viales con el mismo medio de cultivo,
incubar a 35ºC hasta obtener un crecimiento abundante. Finalmente
agregar a cada vial 3 ml de aceite mineral estéril para inhibir la actividad
metabólica del microorganismo y sellar con tapón de caucho y agrafe de
aluminio (Corredor, 2002)
5.4.1.2. Conservación por suspensión en agua destil ada: Es un
método alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad
en diversos tipos de microorganismos, tanto hongos filamentosos como
levaduras y algunas bacterias. Consiste en suspender en agua estéril
unas cuantas células del cultivo que se quiere conservar. Se pueden
preparar en criotubos de los anteriormente mencionados. En este caso la
concentración celular no debe ser superior a 104-105 células/ml en el caso
de bacterias y levaduras. (García y Uruburu, 2000)
5.4.1.3. Conservación en suelo estéril: Es una técnica que ha sido
ampliamente usada en laboratorios industriales para el mantenimiento de
cultivos de importancia comercial. Este método es usado para cultivos
que producen esporas y estructuras de resistencia; las cepas pueden
almacenarse en diferentes substratos como arena, papel filtro o perlas de
vidrio. El método consiste en esterilizar y secar el suelo el cual es utilizado
como medio absorbente para una pequeña cantidad de inoculo (Abreu et
al, 2003).
5.4.1.4. Conservación en sílica gel: El método consiste en llenar
frascos de vidrio con una malla de granos lisos de sílica y luego colocarlos
en bandejas con agua, se llevan a congelar a -20ºC, luego se prepara una
suspensión de esporas en leche descremada al 5% (p/v), se adiciona la
suspensión a la sílica enfriada se agita y se distribuye la suspensión de
esporas; los frasco se deben incubar de 10 – 14 días a 25ºC hasta que los
cristales de sílica gel se sequen y se separen, luego se almacenan a 4ºC
en contenedores cerrados (Abreu et al, 2003).
5.4.1.5. Conservación por Liofilización: Es un proceso suave con la
pared celular, mediante el cual se elimina el agua por medio de
desecación al vacio, mediante efecto de sublimación del hielo alrededor
de las células; primero se congela el agua libre de las células y después
se elimina mediante el vacío, sin que haya necesidad de subir la
temperatura, es este paso el mas critico debido a un incremento en las
presiones dentro y fuera del microorganismos. La estabilidad genética es
alta en comparación con otros procesos que utilizan compuestos
alteradores de enzimas (García y Uruburu, 2000) (Abreu et al, 2003).
5.4.1.6. La criopreservación: Es un proceso de almacenamiento no
letal de material biológico de células, tejidos u órganos a ultras–bajas
temperaturas generalmente entre -80°C y -196 °C (el punto de
congelación del nitrógeno líquido). A esas temperaturas, cualquier
actividad biológica que pudieran producir la muerte de una célula, quedan
efectivamente detenidas (Corredor, 2002).
5.4.1.7. Conservación por desecación en papel de fi ltro: Se utiliza un
papel absorbente (Whatman nº 3) que se impregna con una solución
concentrada de células y se deja secar al aire (en condiciones estériles)
(García y Uruburu, 2000).
También es posible desecarlos por el procedimiento que se llama
desecación líquida (L-Dry) porque se utiliza para ello el liofilizador, pero
sin que haya habido congelación previa de las células. El vacío producido
por el liofilizador deseca las células, pero hay que evitar que un vacío
excesivo provoque evaporación brusca con ebullición o que la
temperatura disminuya demasiado, ocasionando la congelación
incontrolada de las células (García y Uruburu, 2000).
6. EXPERIMENTACIÓN
6.1. Reconocimiento de la zona
El área de muestreo corresponde a la zona del páramo de Cruz Verde
(departamento de Cundinamarca), en la vereda de San Francisco a 17
Km de Bogotá, vía Choachí (4°36’latitud Norte y 74° 00’ longitud Oeste). El
uso actual de la tierra es principalmente el cultivo de papa y el
levantamiento de ganado de doble propósito. Los suelos corresponden a
inceptisoles que se han desarrollado a partir de cenizas volcánicas
depositadas sobre arcillas (Jaimes y Sarmiento, 2002).
La precipitación promedio anual es de 1254 mm y presenta un régimen
monomodal de lluvias, con una estación lluviosa entre los meses de
marzo a diciembre y un corto periodo seco entre los meses de enero y
febrero. La temperatura media anual es de 8,4ºC y varía mensualmente
entre 6 a 10ºC (Jaimes y Sarmiento, 2002).
La humedad relativa permanece durante todo el año por encima de 80% y
presenta un promedio de 91,7%. La vegetación natural consiste en la
comunidad de Espeletia grandiflora y Calamagrostis fusa (Jaimes y
Sarmiento, 2002).
Por otro lado la zona del páramo de Guasca se encuentra a 40 Km al
noroeste de Bogotá en el municipio de Guasca- Cundinamarca con una
altitud de 3000-350m (IGAC, 1984).
El suelo del páramo Guasca presenta una textura dominante tipo franco
arenoso-orgánica y franco orgánica; estructura de granular a fina;
consistencia en húmedo friable a muy fiable; permeabilidad rápida (IGAC,
1984).
6.2. Recolección de muestras
Se realizaron dos muestreos correspondientes a los meses de Agosto y
Septiembre; basados en la norma ICONTEC NTC 4113-6.
Se realizó una inspección del área para determinar los puntos de
muestreos, a partir de estos se escogió un punto central, se demarco con
lana un cuadrado de 25 m2 y se tomaron 5 submuestras en forma de X,
(figura 3) éstas fueron mezcladas con el fin de obtener una muestra
compuesta representativa de cada cuadrante.
Figura 3. Mapa de cuadrantes de muestreo.
Fuente: Autores.
En el primer muestreo se utilizaron los siguientes métodos: Cajas rodac
con medio Nutritivo (Figura 4), extracción de suelo con el uso de palas
(Figura 5) y perforación por medio del barreno (Figura 6) con el fin de
comparar el mejor método de muestreo.
Figura 4. Toma de muestras con Cajas Rodac.
Fuente: Autores.
Posteriormente se determinó que el mejor método de muestreo era la
perforación con el uso el barreno, y por tanto para el segundo muestreo
solo se utilizó el método mencionado anteriormente.
Las muestras tomadas con el barreno y las palas, se transportaron en
bolsas resellables y en nevera manteniendo una temperatura constante
de 4 ºC (figura 7).
En cada muestreo se midió la temperatura ambiental y del suelo.
Figura 5. Toma de muestras con Pala.
Fuente: Autores.
Figura 6. Toma de muestras con Barreno.
Fuente: Autores.
Figura 7. Transporte de Muestras.
Fuente: Autores.
6.3. Procesamiento de las muestras
Las 5 muestras se tamizaron en un tamiz de 2mm y fueron incubadas a
37 ºC. 24 horas después se tomó el pH del suelo y las muestras fueron
procesadas.
Las muestras tomadas con las cajas rodac se incubaron directamente a
35 ºC por 48 horas.
6.4. Aislamiento de bacterias
6.4.1. Aislamiento primario:
6.4.1.1. Técnica dilución en tubo: Se hizo un pre-enriquecimiento de las
5 muestras, se pesaron 100 g de suelo y se adicionaron a 900 ml de
Caldo Nutritivo, se incubaron a 37ºC por 24 horas (Hamaky et al, 2005).
A partir de la primera dilución (pre-enriquecimiento de las muestras) se
realizaron tres diluciones seriadas (10–2 - 10–4) en 9 ml agua destilada
estéril; cada dilución se sembró en superficie en Agar Nutritivo y Agar
Extracto de Suelo, por duplicado. Se incubó a 37 °C por 48 horas
(Hamaky et al, 2005).
Después de 48 horas de incubación las cepas recuperadas fueron
aisladas mediante el método de siembra por agotamiento en Agar
Nutritivo (García y Ordoñez, 2003), se incubó a 37ºC por 48 horas; para
obtener así cultivos puros de cada cepa aislada (Hamaky et al, 2005).
6.4.1.2. Técnica de aspersión directa: En Medio Agar Nutritivo se
sembró suelo directamente en la superficie del medio distribuida
uniformemente, se incubó a 37 ºC por 48 horas. A partir de las colonias
obtenidas se realizaron aislamientos en Medio Agar Nutritivo (Camacho y
Hernández, 2002), se incubó a 37ºC por 48 horas.
6.4.1.3. Aislamiento a partir de caja rodac: Las cajas sembradas con
agar nutritivo, fueron manejadas en total asepsia, para evitar falsos
positivos. De las cepas recuperadas de los diferentes horizontes en el
suelo, se diferenciaron macroscópicamente y microscópicamente las
cepas (Figura 8) y posteriormente se realizaron aislamientos en Medio
Agar nutritivo con el fin de obtener cepas puras.
Figura 8. Aislamiento primario en cajas Rodac.
Fuente: Autores
6.5. Identificación bacteriana
6.5.1. Identificación microscópica: De cada aislamiento puro obtenido,
se realizó coloración Gram para determinar la morfología de las cepas
obtenidas.
6.5.2. Identificación bioquímica: A partir de cada cepa aislada se
sembraron pruebas bioquímicas de Oxidasa, Catalasa, Citrato, SIM (H2S,
Indol, Motilidad), LIA (Lisina, Hierro Agar), TSI (Triple Azúcar Hierro), OF
(Oxidación-Fermentación), Voges Proskauer, Rojo de Metilo, Nitratos,
Urea, Gelatina, Almidón, Gelatina, Glucosa, Sacarosa, Maltosa, Manosa,
Manitol, Fructosa, Celobiosa, Celulosa, Melobiosa, Sorbitol, Inositol,
Sucrosa, Ramnosa, Xilosa, Galactosa, Lactosa; para determinar el
metabolismo de los microorganismos aislados (Camacho y Hernández,
2002).
Cada bioquímica fue incubada a 37 ºC por 48 horas y pasado el tiempo de
incubación se observaron resultados de acuerdo a cada reacción
bioquímica (Camacho y Hernández, 2002).
Para cada bioquímica se realizaron controles positivos y negativos con los
siguientes microorganismos:
Tabla 1. Controles positivos y negativos de cada bioquímica utilizada
BIOQUÍMICA CONTROL POSITIVO CONTROL NEGATIVO
Voges-Proskauer Klebsiella sp. E. coli
Rojo de Metilo E. coli No inoculado
TSI E. coli Pseudomonas sp.
Reducción de
Nitratos
E. coli No inoculado
Citrato Salmonella sp. E. coli
Citocromo Oxidasa Pseudomonas aeruginosa E. coli
Gelatina Staphylococcus aureus E. coli
Almidón Bacillus subtilis E. coli
LIA Klebsiella No inoculado
Ureasa Proteus E. coli
Catalasa Staphylacoccus aureus Streptococcus
Fuente: MacFaddin, 2003
6.6. Conservación de cepas
La conservación de las cepas identificadas se llevó a cabo por medio de
tres métodos diferentes, la temperatura de congelación a la cual se
llevaron los tres métodos fue -4°C bajo cero.
6.6.1. Conservación en Suelo Estéril: El suelo utilizado para conservar
las cepas fue recogido del páramo Cruz Verde; este suelo fue tamizado
en un tamiz de 2mm y partículas orgánicas y minerales fueron removidas
(rocas, palos, hojas e insectos). Se manejaron recipientes de vidrio color
ámbar para evitar la penetración de la luz, con tapón de goma y tapa
rosca.
Los envases y el suelo fueron esterilizados a 125 °C, 1 atm durante 15
minutos. Previamente se preparo un cultivo líquido de cada cepa en caldo
nutritivo a una concentración respecto al tubo Nº 2 de nefelometro de
MacFarlan que fue anticipadamente incubado por 24 horas a 35 ºC. En
cada recipiente se introdujeron 10 g de suelo y se inoculó con 1 mL de
cultivo bacteriano trabajando en condiciones de absoluta esterilidad.
6.6.2. Conservación en Glicerol: En este método existe una relación de
volúmenes 2-1-1 (cultivo celular – caldo nutritivo – glicerol 20%)
respectivamente. Se trabajó con tubos eppendorf de capacidad 1.5 mL.
Debido a la expansión por efecto de la congelación se manejo un volumen
de trabajo de 1 mL de mezcla para cada vial. La relación de volúmenes
trabajada fue de 0.5 mL de cultivo celular, 0.25 mL de caldo nutritivo y
0.25 mL de glicerol al 20%; estos dos últimos componentes fueron
debidamente esterilizados a 125 °C, 1 atm durante 1 5 minutos; el glicerol
fue preparado a partir de un stock de 99% de pureza (Monroy, 2002)
Cada vial fue llenado mediante micropipeta y bajo condiciones de cámara
de flujo laminar. (Mesa y Monroy, 2002).
6.6.3. Conservación en Sensidiscos: A partir de un cultivo líquido en
caldo nutritivo que fue previamente incubado por 24 horas a 35ºC a una
concentración con respecto al tubo Nº 2 del nefelómetro de MacFarlan
para cada cepa aislada; con el uso de pinzas estériles se sumergieron los
sensidiscos de papel filtro debidamente esterilizados para ser
impregnados; estos sensidiscos se secaron a temperatura ambiente en
condiciones estériles, repitiendo este proceso tres veces. Los sensidiscos
fueron introducidos en tubos eppendorf estériles (125 °C, 1 atm y por 15
minutos) (Pedroza, 2003)
Finalmente todos los frascos y viales utilizados en los tres métodos de
conservación fueron rotulados con el nombre del microorganismo, el
páramo de donde fue aislado y la fecha de inicio del procedimiento de
conservación.
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En el momento del muestreo la temperatura ambiental fue 15 ºC; la
temperatura del suelo 4,7 ºC. Con la muestra compuesta se realizaron
mediciones de pH del suelo obteniendo como resultado un pH de 5.
7.1. Parámetros para la selección de géneros
Del primer muestreo realizado en el páramo de Cruz Verde se
recuperaron 86 colonias bacterianas, con las técnicas de toma de
muestras mediante uso de pala, tubo PVC y método de contacto en cajas
rodac con agar nutritivo.
Del segundo muestreo realizado en el suelo del páramo de Cruz Verde se
recuperaron 37 cepas utilizando solo el método de muestreo con barreno;
todas las cepas fueron enumeradas para evitar confusiones a la hora de
realizar los procedimientos de identificación. En total se aislaron 123
cepas puras, sin embargo, después de la caracterización se comprobó
que muchas eran repetidas; finalmente se aislaron e identificaron 40
cepas.
Para la selección de género bacteriano, mediante el uso de material
bibliográfico, se realizaron varias exclusiones de acuerdo a cuatro
parámetros en general:
Nicho ecológico : Debido a la existencia de ambientes muy similares al
suelo de la zona paramuna, por ejemplo (suelo sabanero, suelo de alta
montaña, suelos de clima alternado por las cuatro estaciones, suelo de
estepas, suelo en nevados); se descartaron aquellos nichos ecológicos
que presentaban una marcada diferencia con la zona muestreada
basados en los siguientes parámetros del suelo: estructura, formación,
compactación, composición mineral, contenido de materia orgánica y por
último variables físicas, químicas y ambientales (temperatura, pH,
contenido de sales, humedad relativa, retención de agua lluvia, etc)
Se descartaron aquellos géneros bacterianos que han sido aislados
únicamente en ambientes marinos, suelos adyacentes a playas, suelos
salinos, suelos con humedad relativa menor al 45%, suelos con un pH
menor a 3 y mayor a 8, es decir, cepas bacterianas que se desarrollan en
ambientes totalmente diferentes al páramo. También fueron descartados
géneros halófilos estrictos con requerimientos de NaCl a concentraciones
mayores al 1%.
Requerimientos metabólicos: El suelo posee todos los nutrientes
necesarios, debido a esto es el mayor hábitat microbiano, en
consecuencia los géneros bacterianos que necesitan compuestos
especializados para su crecimiento pertenecen a otros ambientes
totalmente diferentes al suelo paramuno.
Los géneros bacterianos que requieren compuestos específicos para su
desarrollo como: ácidos mixtos, triptófano, metionina, cisteína, cistina,
entre otros, y atmósfera anaeróbica estricta, fueron descartados debido a
que los géneros encontrados en los páramos no requieren de estos
compuestos específicos para crecer debido a que las cepas fueron
sembradas en agar nutritivo que por su alto contenido de nutrientes
permite un optimo crecimiento, sin ser selectivo para otras cepas
bacterianas.
Patogénicidad: La mayoría de las cepas patógenas son anaerobias,
necesitan condiciones y sustratos especiales para su crecimiento, y son
muy susceptibles a cambios climáticos. Hay géneros que exclusivamente
crecen en ambientes hospitalarios y en órganos humanos o de otro
mamífero.
Esta clase de géneros presentan características metabólicas similares a
las de los géneros encontrados en el páramo, pero por lo anteriormente
mencionado estos géneros patógenos fueron descartados.
Características macro y microscópicas: Las bacterias encontradas
fueron divididas inicialmente en los dos grupos más grandes Gram
positivos y Gram negativas, posteriormente fueron clasificadas dentro de
los subgrupos esporoformadores y no esporoformadores.
Ya con la selección de posibles géneros con los pasos anteriormente
mencionados, se comparo macroscópicamente y microscópicamente con
la ayuda de las medidas obtenidas por medio del microscopio Motic.
NOTA: Las imágenes de macroscopia y microscopia, y las tablas de las bioquímicas publicadas durante todos los resultados en este escrito fueron efectuadas por los autores.
Las abreviaturas utilizadas en las tablas de las ca racterísticas bioquímicas se refieren a: X: xilosa, L: lactosa, SU: sucrosa, M: maltosa, C: celobiosa, MN: manosa, ME: melobiosa, I: inositol, SO: sorbito l, S: sacarosa, R: ramnosa, F: fructosa, G: galactosa, Ma: manitol, GE : gelatina, RM: rojo de metilo, VP: voges preskauer, CI: citrato, AL: almid ón, CA: catalasa
7.2. Bacilos esporoformadores Gram positivos
Los géneros correspondientes a bacilos esporoformadores Gram positivos
teóricamente existentes son: Amphibacillus, Bacillus, Desulfotomaculum,
Sporohalobacter, Sporolactobacillus, Sulfobacillus, Syntrophospora;
(Bergey´s, 2000).
Posteriormente se realizó una selección de estos géneros descartando al
género Sulfobacillus por requerir un pH óptimo de 1.9-2.4 para su
crecimiento, así mismo requiere temperatura de incubación de 50°C.
Adicionalmente no suelen encontrarse en suelo sino en depósito de pirita.
Las cepas aisladas presentaron catalasa positiva, en consecuencia los
géneros con catalasa negativa Amphibacillus, Desulfotomaculum,
Sporohalobacter, Sporolactobacillus fueron descartados, así mismo
Desulfotomaculum es anaerobio estricto y algunas cepas requieren fuente
de azufre. Sporohalobacter es un género estricto anaerobio y halófilo
requiere 0.5 – 2 M de NaCl para su crecimiento y se encuentra en hábitat
salinos (Bergey, 2000) (Bergey, 1984).
7.2.1. Género Amphibacillus
7.2.1.1. Amphibacillus sp.
Amphibacillus, se diferencia de los otros géneros bacilo Gram positivo
esporoformador por ser catalasa negativo, motilidad positivo y su
presencia en suelos con alta concentración de materia orgánica vegetal
en descomposición (Bergey, 2000) (Bergey, 1984).
Figura 9. Microscopia 100x de Figura 10. Amphibacillus sp en Amphibacillus sp Agar Nutritivo.
Tabla 2. Microscopia y macroscopia de Amphibacillus sp.
Características Microscópicas Características Macroscópicas
Bacilo Gram positivo; largo 3,1 µm, ancho 1,1 µm
Colonias de forma circular con bordes irregulares, con apariencia cremosa, de
pigmentación amarillo claro.
Tabla 3. Características Bioquímicas de Amphibacillus sp.
X L SU M C MN ME I SO S R
---- ++++ ++++ ++++ ---- ++++ ++++ ++++ ---- ---- ++++
F G Ma GE UREA RM LIA TSI CI AL CA
++++ ++++ ---- ++++ ++++ ---- - Alk/alk - - -
7.2.1.2. Amphibacillus xylanus
Amphibacillus xylanus es descrito por (Niimura, et al. 1990), como un
microorganismo anaerobio facultativo, bacilo Gram positivo,
esporoformador, que pueden crecer en medios alcalinos.
Figura 11. Microscopia 100x de Figura 12. Amphibacillus xylanus en Amphibacillus xylanus. Agar Nutritivo.
Tabla 4. Microscopia y macroscopia de Amphibacillus xylanus
Características Microscópicas Características Macroscópicas
Bacilo esporoformador Gram positivo; largo 3,5 µm, ancho 1,1
µm
Colonias de forma circular con bordes irregulares, con centro cremoso, de
pigmentación amarillo claro.
Tabla 5. Características Bioquímicas de Amphibacillus xylanus
X L SU M C MN ME I SO S R
---- ---- ++++ ++++ ---- ++++ ++++ ---- ---- ++++ ----
F G Ma GE UREA VP LIA TSI CI AL CA
++++ ++++ ---- + - + + Alk/ac - + -
Solo existe una especie reportada que es A. xylanus debido a que este
género no aparece en los anteriores volúmenes del manual Bergey´s y
solo aparece en la versión del año 2000, porque fue creado en 1990 por
Niimura et al. Por tanto las otras especies que no pertenecen a
Amphibacillus xylanus deben ser catalogadas como Amphibacillus sp
para que en futuros estudios sean realmente diferenciadas (Bergey, 2000)
(Bergey, 1984).
7.2.2. Género Bacillus
Este género presenta bacilos Gram positivos esporoformadores, poseen
gran adaptabilidad y se disponen en pares o cadenas. Poseen gran
adaptabilidad y baterías enzimáticas que les permiten ser aislados en
diversos hábitats con respecto al calor, pH y salinidad (Ordoñez, 1998).
Es catalasa positiva y crece en medios sintéticos que contengan
azúcares, ácidos orgánicos, alcoholes, como únicas fuente de carbono.
Producen una enzima hidrolítica que degrada polisacáridos, ácidos
nucleicos y lípidos, lo que permite a estos usar dichos productos como
fuente de carbono y donadores de electrones. Este género contiene 77
especies reconocidas (EPSA, 1991).
Este género se encuentra comúnmente en suelos y plantas donde tiene
un papel importante en el ciclo del carbono y nitrógeno. Son habitantes
comunes de aguas frescas y estancadas, son particularmente activos en
sedimentos (Rusell Et al 1987).
La diferenciación entre especies del género Bacillus se centro en los
resultados de la fermentación de lactosa, sorbitol, manitol, melobiosa,
hidrólisis de la urea y descarboxilación de la lisina (Bergey, 2000)
(Bergey, 1984).
7.2.2.1. Bacillus azotoformans
Figura 13. Microscopia 100x Figura 14. Bacillus azotoformans Bacillus azotoformans. en Agar Nutritivo.
Tabla 6. Microscopia y macroscopia de Bacillus azotoformans.
Características Microscópicas Características Macroscópicas
Bacilo Gram positivo; esporoformador, largo 2,7 µm,
ancho 1,1 µm.
Colonias de forma circular, pequeña, de consistencia cremosa, bordes regulares
y de pigmentación blanco grisáceo.
Tabla 7. Características Bioquímicas de Bacillus azotoformans.
X L SU M C MN ME I SO S R
---- ---- ++++ ---- ---- ---- ++++ ++++ ---- ---- ----
F G Ma GE UREA RM LIA TSI CI AL CA
---- ---- ---- ++++ ++++ ---- ---- Alk/acid ---- ++++ ++++
7.2.2.2. Bacillus cereus
Figura 15. Microscopia 100x de Figura 16. Bacillus cereus en Agar Bacillus cereus. Nutritivo.
Tabla 8. Microscopia y macroscopia de Bacillus cereus.
Características Microscópicas Características Macroscópicas Bacilo Gram positivo;
esporoformador, largo 2,8 µm, ancho 1,0 µm
Colonias de forma circular, de tamaño grande, de consistencia cremosa y presenta una pigmentación beige.
Tabla 9. Características Bioquímicas de Bacillus cereus.
X L SU M C MN ME I SO S R
++++ ---- ++++ ++++ ---- ++++ ---- ---- ---- ---- ----
F G Ma GE UREA VP LIA TSI CI AL CA
++++ ---- ---- ++++ ++++ ---- ---- Alk/alk - - +
7.2.2.3. Bacillus circulans
Figura 17. Microscopia 100x de Figura 18. Bacillus circulans en Agar Bacillus circulans. Nutritivo.
Tabla 10. Microscopia y macroscopia de Bacillus circulans.
Características Microscópicas Características Macroscópicas Bacilo Gram positivo;
esporoformador, largo 2,3 µm, ancho 1,0 µm
Colonia redonda, lisa, de contextura cremosa, crecimiento irregular, elevación plana presenta y color blanco amarillento.
Tabla 11. Características Bioquímicas de Bacillus circulans.
X L SU M C MN ME I SO S R
++++ ++++ ++++ ++++ ---- ++++ ---- ++++ ++++ ---- ++++
F G Ma GE UREA VP LIA TSI CI AL CA
++++ ---- ---- ++++ ---- ---- +/+/+/+/---- Alk/alk - ++++ ++++
7.2.2.4. Bacillus globisporus
Figura 19. Microscopia 100x de Figura 20. Bacillus globisporus en Bacillus globisporus. Agar Nutritivo.
Tabla 12. Microscopia y macroscopia de Bacillus globisporus.
Características Microscópicas Características Macroscópicas Bacilo Gram positivo;
Esporoformador (endoespora), largo 2,8 µm, Ancho 1,5 µm
Colonias irregulares, grandes, con bordes irregulares, de consistencia polvorienta, no cremosa y de color
blanco.
Tabla 13. Características Bioquímicas de Bacillus globisporus.
X L SU M C MN ME I SO S R
++++ ++++ ++++ ++++ ---- ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ----
F G Ma GE UREA VP LIA TSI CI AL CA
++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ---- Ac/Ac ++++ ---- ++++
7.2.2.5. Bacillus marinus
Figura 21. Microscopia 100x de Figura 22. Bacillus marinus en
Bacillus marinus. Agar Nutritivo.
Tabla 14. Microscopia y macroscopia de Bacillus marinus
Características Microscópicas Características Macroscópicas Bacilo Gram positivo;
esporoformador (endoespora), largo 3,2 µm, ancho 1,3 µm
Colonias de forma circular, grandes, con bordes irregulares, de
consistencia cremosa, elevación plana y de color blanco.
Tabla 15. Características Bioquímicas de Bacillus marinus
X L SU M C MN ME I SO S R
++++ ++++ ++++ ++++ ---- ++++ ---- ---- ---- ++++ ----
F G Ma GE UREA VP LIA TSI CI AL CA
++++ ---- ---- ++++ ---- ---- ---- Al/ac
H2S
++++ ---- ++++
7.2.2.6. Bacillus pasteurii
Figura 23. Microscopia 100x. Figura 24. Bacillus pasteurii en Agar
Bacillus pasteurii Nutritivo.
Tabla 16. Microscopia y macroscopia de Bacillus pasteurii
Características Microscópicas Características Macroscópicas
Bacilo Gram positivo; esporoformador ; largo 3,5 µm, ancho 1,0
µm
Colonia redonda, de consistencia cremosa y de color Crema.
Tabla 17. Características Bioquímicas de Bacillus pasteurii
X L SU M C MN ME I SO S R
---- ---- ++++ ---- ---- ++++ ++++ ---- ---- ---- ----
F G Ma GE UREA RM LIA TSI CI AL CA
++++ ---- ---- ++++ ++++ ---- ---- Alk/Ad ---- ---- ++++
Para la identificación de ésta cepa, se enfatizó en la hidrólisis de la urea;
del cual existen cuatro especies que corresponden a este resultado,
conjuntamente se utilizo la fermentación de la melobiosa, obteniendo solo
dos especies: Bacillus globisporus y Bacillus pasteurii; esta última fue
seleccionada, debido a la diferenciación en la no fermentación de lactosa
y sorbitol (Bergey, 2000) (Bergey, 1984).
7.2.2.7. Bacillus sphaericus
Figura 25. Microscopia 100x Figura 26. Bacillus sphaericus en Bacillus sphaericus. Agar Nutritivo.
Tabla 18. Microscopia y macroscopia de Bacillus sphaericus.
Características Microscópicas Características Macroscópicas
Bacilo Gram positivo; esporoformador, largo 2,8 µm,
ancho 1,5 µm
Colonias de irregular, de consistencia cremosa. Presenta color beige oscuro y con producción de pigmentación rosado
claro en el medio.
Tabla 19. Características Bioquímicas de Bacillus sphaericus
X L SU M C MN ME I SO S R
---- ---- ++++ ++++ ---- ++++ ---- ---- ---- ++++ ----
F G Ma GE UREA RM LIA TSI CI AL CA
---- ---- ---- ++++ ---- ---- ---- Alk/ac
H2S +/+/+/+/---- ++++ ++++
7.2.3. Género Sporolactobacillus
Este género está compuesto por 5 especies y se caracteriza por ser
catalasa negativo, anaerobio facultativo o microarofílico esporoformador.
El hábitat de los miembros de éste género incluye productos de leche,
pollo, suelos y plantas (Sanders.et al 2003).
7.2.3.1. Sporolactobacillus inulinus
Sporolactobacillus inulinus se caracteriza por producir ácido láctico pero
es incapaz de fermentar la lactosa, su optimo crecimiento es de 35 ºC
(rango 15 ºC – 40 ºC) (M. Sanders. 2003)
Figura 27. Microscopia 100x de Figura 28. Sporolactobacillus inulinus
Sporolactobacillus inulinus. en Agar Nutritivo.
Tabla 20. Microscopia y macroscopia de Sporolactobacillus inulinus
Características Microscópicas Características Macroscópicas
Bacilo Gram positivo; esporoformador ; largo 3,8 µm, ancho
1,0 µm
Colonias de consistencia cremosa, con bordes irregulares, lisas y presenta
pigmentación blanco.
Tabla 21. Características Bioquímica de Sporolactobacillus inulinus
X L SU M C MN ME I SO S R
---- ---- ++++ ++++ ---- ++++ ---- ---- ---- ---- -
F G Ma GE UREA RM LIA TSI CI AL CA
++++ ---- ---- - + + - Alk/alk - - -
Se determinó que ésta cepa, pertenecía al género Sporolactobacillus,
debido a su formación de esporas, su catalasa negativa y su nicho
ecológico (suelo). De este género se selecciono como especie S.inulinus,
debido a su capacidad fermentativa de las siguientes hexosas: fructosa,
glucosa, maltosa, manosa, rafinosa, sucrosa, trehalosa, manitol y sorbitol;
la no fermentación de pentosas: arabinosa, xilosa, galactosa, lactosa,
melobiosa, celobiosa, ramnosa; la no capacidad proteolítica sobre
gelatina y la no hidrólisis del almidón (Bergey, 2000) (Bergey, 1984).
7.3. Cocos esporoformadores Gram positivos.
7.3.1. Género Sporosarcina
En cuanto a cocos Gram positivos esporoformadores se determinó que
ésta cepa pertenece al género Sporosarcina por ser catalasa positivo y
no es anaerobio estricto en comparación con Clostridium (Bergey, 1984).
Dentro de este género existen dos especies reportadas, Sporosarcina
ureae y Sporosarcina halophila; según su metabolismo se diferencian por
ser urea positiva y gelatina negativa, debido a esto se estableció que la
cepa aislada pertenece a Sporosarcina ureae (Bergey, 1984).
7.3.1.1. Sporosarcina ureae
Ésta especie se encuentra en suelos y en cantidades mayores en
aquellos que reciben aportes de orina, descompone activamente la urea,
transformándola en CO2 y NH3 y crece en medios con pH de hasta 10
(Bergey, 2000).
Figura 29. Microscopia 100x de Figura 30. Sporosarcina ureae en
Sporosarcina urea. Agar extracto se suelo.
Tabla 22. Microscopia y macroscopia de Sporosarcina ureae.
Características Microscópicas Características Macroscópicas Coco Gram positivo;
esporoformador diámetro 1,1 µm Colonias pequeñas, de contextura
cremosa, elevación plana, presenta pigmentación blanco grisáceo.
Tabla 23. Características Bioquímicas de Sporosarcina ureae.
X L SU M C MN ME I SO S R
++++ ++++ ++++ ---- ---- ++++ ++++ ++++ ---- ---- ++++
F G Ma GE UREA VP LIA TSI CI AL CA
++++ ---- ---- ---- ++++ ---- ---- Ac/ac ++++ ---- ++++
7.4. Bacilos Gram Positivos no esporoformadores.
Para el subgrupo de bacilos Gram positivos no esporoformadores, se
descartaron los siguientes géneros: Erysipelothrix por no crecer en el
suelo y no tener otra fuente de aislamiento diferente al de organismos de
mamíferos y aves y su relación patógena frente e ellos, Carnobacterium y
Renibacterium por ser patógena para peces, requerimientos obligatorios
de cisteína y rangos de temperatura de 15-18 °C (Be rgey, 2000) (Bergey,
1984).
7.4.1. Género Brochothrix
El género Brochothrix se caracteriza por ser rojo de metilo y Voges-
Proskauer positivo, así mismo presentan enzima catalasa, crecen a
temperatura desde un rango de 0-30 °C, no son pigme ntadas, no móviles,
no esporoformador, anaerobio facultativo y se encuentran distribuidos por
todo el medio ambiente (Gregory et al 1993).
Este género ha sido clasificado dentro de la rama de Clostridium,
Lactobacillus y Bacillus. Las cepas pertenecientes a este género se
caracterizan por no ser patógenas, y generalmente no crecen a
temperaturas arriba de 30 ºC (Gregory et al 1993).
Las dos cepas B. campestris y B. thermosphacta respectivamente fueron
diferenciadas por la fermentación de la ramnosa con referencia a la
primera cepa (Bergey, 2000) (Bergey, 1984).
7.4.1.1. Brochothrix campestris
Figura 31. Microscopia 100x de Figura 32. Brochothrix campestris
Brochothrix campestris en Agar Nutritivo.
Tabla 24. Microscopia y macroscopia de Brochothrix campestris
Características Microscópicas Características Macroscópicas
Bacilo Gram positivo, largo 3,5 µm, ancho 1,2 µm
Colonias de forma circular, grandes, polvorienta, lisas, elevación plana,
presenta color blanco.
Tabla 25. Características Bioquímica de Brochothrix campestris
X L SU M C MN ME I SO S R
++++ ---- ++++ ++++ ---- ++++ ---- ---- ++++ ++++ ----
F G Ma GE UREA RM LIA TSI CI AL CA
++++ ++++ ++++ + + + + Alk/alk ++++ ++++ ++++
7.4.1.2. Brochothrix thermosphacta
Figura 33. Microscopia 100x de Figura 34. Brochothrix thermosphacta
Brochothrix thermosphacta. en Agar Nutritivo.
Tabla 26. Microscopia y macroscopia de Brochothrix thermosphacta.
Características Microscópicas Características Macroscópicas
Bacilo Gram positivo; largo 3,9 µm, ancho 1,5 µm
Colonias irregulares, rugosas, de consistencia cremosa, de pigmentación
crema oscuro.
Tabla 27. Microscopia y macroscopia de Brochothrix thermosphacta.
X L SU M C MN ME I SO S R
---- ---- ++++ ---- ---- ++++ ++++ ---- ---- ++++ ++++
F G Ma GE UREA RM LIA TSI CI AL CA
++++ ++++ ++++ + + + - Ac/ac ---- ---- ++++
7.4.2. Género Caryophanon
Caryophanon es un género muy poco estudiado, debido a su poca
tolerancia a condiciones de estrés, son móviles, no son
esporoformadoras, estrictas aeróbicas y son catalasa positiva. Sus
colonias son de tamaño grande y cambian de tonalidad en su
pigmentación amarilla de oscuro a claro según el tiempo transcurrido de
crecimiento (Nauman, et al. 1974).
7.4.2.1. Caryophanon latum
Figura 35. Microscopia 100x de Figura 36. Caryophanon latum en Caryophanon latum. Agar Nutritivo.
Tabla 28. Microscopia y macroscopia de Caryophanon latum.
Características Microscópicas Características Macroscópicas Bacilo Gram positivo; largo 2,0 µm,
ancho 0,9 µm Colonias redondas, lisas, de consistencia
cremosa, de color amarillo ocre, producción de pigmentación café en el
medio.
Tabla 29. Características Bioquímica de Caryophanon latum.
X L SU M C MN ME I SO S R
++++ ---- ++++ ++++ ---- ++++ ---- ---- ---- ---- ----
F G Ma GE UREA VP LIA TSI CI AL CA
++++ ---- ---- - + - - Alk/ac ---- ---- ++++
7.4.2.2. Caryophanon tenue
Figura 37. Microscopia 100x de Figura 38. Caryophanon tenue en Caryophanon tenue. Agar Nutritivo.
Tabla 30. Microscopia y macroscopia de Caryophanon tenue.
Características Microscópicas Características Macroscópicas Bacilo Gram positivo; largo 1,8 µm,
ancho 1,1 µm Colonias medianas de tonalidad gris,
cremosas y ovaladas
Tabla 31. Características Bioquímica de Caryophanon tenue
X L SU M C MN ME I SO S R
++++ ++++ ++++ ++++ ---- ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
F G Ma GE UREA RM LIA TSI CI AL CA
++++ ++++ ++++ - - + - Ac/ac ++++ ---- ++++
Debido a la similitud de caracterización bioquímica, el parámetro más
importante para la determinación y diferenciación entre estas dos
especies, son las mediciones microscópicas, en este estudio las
obtenidas mediante el microscopio motic, debido al gran tamaño de la
especie Caryophanon latun 2.8-3.2 µm, existe una diferenciación notable
con Caryophanon tenue 1.4-2.0 µm (Bergey, 2000) (Bergey, 1984).
7.4.3. Género Kurthia
Este género se caracteriza por ser fermentadoras de glucosa, ser
catalasa positiva. También presentan batería enzimática con efecto
proteolítico sobre la gelatina, presenta motilidad, no es patógena para el
ser humano y animales, crece a temperatura optima de 25-30 °C, con
tolerancia a altos y bajos cambios drasticos y se encuentra en todo el
medio ambiente debido a que posee alta actividad degradadora de
materia vegetal (Bergey, 2000) (Bergey, 1984).
7.4.3.1. Kurthia gibsonii
Figura 39. Microscopia 100x Figura 40. Kurthia gibsonii en Agar
Kurthia gibsonii. Nutritivo.
Tabla 32. Microscopia y macroscopia de Kurthia gibsonii.
Características Microscópicas Características Macroscópicas
Bacilo Gram positivo; largo 3,2 µm, ancho 1,0 µm.
Colonias redondas, pequeñas, de consistencia cremosa, lisas, con bordes
regulares, de color blanco.
Tabla 33. Características Bioquímica de Kurthia gibsonii.
X L SU M C MN ME I SO S R
---- ---- ++++ ++++ ---- ---- ---- ---- ---- ++++ ----
F G Ma GE UREA VP LIA TSI CI AL CA
---- ++++ ---- + - - - Ac/ac ---- ---- ++++
7.4.3.2. Kurthia sibirica
Figura 41. Microscopia 100x de Figura 42. Kurthia sibirica en Agar Kurthia sibirica. Nutritivo.
Tabla 34. Microscopia y macroscopia de Kurthia sibirica
Características Microscópicas Características Macroscópicas Bacilo Gram positivo; largo 3,8 µm,
ancho 1,5 µm Colonias de forma irregular, presentan centros cremosos el borde polvoriento,
pigmentación beige.
Tabla 35. Características Bioquímica de Kurthia sibirica
X L SU M C MN ME I SO S R
---- ---- ++++ ++++ ---- ---- ++++ ---- ---- ---- ----
F G Ma GE UREA RM LIA TSI CI AL CA
++++ ++++ ---- + - - - Ac/ac - - +
7.4.3.3. Kurthia zopfii
Figura 43. Microscopia 100x de Figura 44. Kurthia zopfii en agar
Kurthia zopfii. Nutritivo.
Tabla 36. Microscopia y macroscopia de Kurthia zopfii
Características Microscópicas Características Macroscópicas
Bacilo Gram positivo; largo 2,0 µm, ancho 0,9 µm
Colonias pequeñas de tonalidad naranja, contextura cremosa.
Tabla 37. Características Bioquímica de Kurthia zopfii.
X L SU M C MN ME I SO S R
---- ---- ++++ ++++ ---- ---- ---- ---- ---- ---- ++++
F G Ma GE UREA RM LIA TSI CI AL CA
---- ++++ ++++ + - - - Ac/ac ---- ++++ ++++
7.4.4. Género Lactobacillus
Son Bacilos Gram positivos, largos, delgados, formando cadenas. Su
metabolismo es fermentativo y sacaroclásico, el producto final es del
carbono es el lactato. Son microaerofílicos e inmóviles. Bioquímicamente
reducen el nitrato, no utilizan la gelatina, son catalasa y citocromo oxidasa
negativ,. Su hábitat es en la superfice de plantas y frutas (De la Rosa,
1996). Las cepas nombradas a continuación fueron identificadas en el
género Lactobacillus por ser catalasa negativa, no actividad proteolítica
sobre la gelatina, su distribución en el ambiente y la no reducción de
nitratos (Bergey, 2000) (Bergey, 1984).
7.4.4.1. Lactobacillus agilis
Figura 45. Microscopia 100x de Figura 46. Lactobacillus agilis en Agar Lactobacillus agilis. Nutritivo.
Tabla 38. Microscopia y macroscopiade Lactobacillus agilis.
Características Microscópicas Características Macroscópicas Bacilo Gram positivo; largo 2,9 µm,
ancho 0,9 µm Colonias de forma circular, lisas, de
contextura cremosa, blancas.
Tabla 39. Características Bioquímica de Lactobacillus agilis.
X L SU M C MN ME I SO S R
---- ++++ ++++ ++++ ---- ++++ ++++ ++++ ---- ++++ ----
F G Ma GE UREA VP LIA TSI CI AL CA
++++ ---- ++++ - + + - Alk/alk - - -
Esta cepa presenta similitud con 4 especies: L. maltaromicus, L,
plantarum, L. salivarius y L. agilis al presentar fermentación de lactosa,
manitol, melobiosa y no fermentación de ramnosa pero se diferencio L.
agilis por la no fermentación del sorbitol (Bergey, 2000) (Bergey, 1984).
7.4.4.2. Lactobacillus collinoides
Fig 47. Microscopia 100x de Fig 48. Lactobacillus collinoides
Lactobacillus collinoides. en Agar Nutritivo.
Tabla 40. Microscopia y macroscopia de Lactobacillus collinoides.
Características Microscópicas Características Macroscópicas
Bacilo Gram positivo; largo 5,3 µm, ancho 1,3 µm.
Colonias de forma circular, pequeñas, de pigmentación blanca.
Tabla 41. Características Bioquímica de Lactobacillus collinoides.
X L SU M C MN ME I SO S R
---- ---- ++++ ++++ ---- ---- ---- ---- ---- ---- ++++
F G Ma GE UREA VP LIA TSI CI AL CA
++++ ++++ ---- - + + - Alk/alk ---- ++++ ----
7.4.4.3. Lactobacillus confusus
Figura 49. Microscopia 100x de Figura 50. Lactobacillus confusus
Lactobacillus confusus. en Agar Nutritivo.
Tabla 42. Microscopia y macroscopia de Lactobacillus confusus.
Características Microscópicas Características Macroscópicas Bacilo Gram positivo; largo 2,7 µm,
ancho 1,1 µm Colonias de forma circular, de tamaño
variable, de contextura un seca, irregulares, de pigmentación beige claro.
Tabla 43. Características Bioquímica de Lactobacillus confusus.
X L SU M C MN ME I SO S R
---- ---- ++++ ++++ ---- ++++ ---- ---- ---- ++++ ----
F G Ma GE UREA VP LIA TSI CI AL CA
++++ ++++ ++++ - + + - Alk/alk - - -
7.4.4.4. Lactobacillus fructosus
Figura 51. Microscopia 100x de Figura 52. Lactobacillus fructosus en
Lactobacillus fructosus. Agar Nutritivo.
Tabla 44. Microscopia y macroscopia de Lactobacillus fructosus.
Características Microscópicas Características Macroscópicas
Bacilo Gram positivo, largo 4,1 µm, ancho 1,5 µm.
Colonias cremosas, tamaño y forma variable, lisas, de elevación plana, de
pigmentación crema con centro oscuro.
Tabla 45. Características Bioquímica de Lactobacillus fructosus.
X L SU M C MN ME I SO S R
---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- ++++ ----
F G Ma GE UREA RM LIA TSI CI AL CA
++++ ---- ---- - + + + Ac/ac ---- ++++ ----
7.4.4.5. Lactobacillus kandleri
Figura 53. Microscopia 100x de Fig 54. Lactobacillus kandleri en
Lactobacillus kandleri. Agar Nutritivo.
Tabla 46. Microscopia y macroscopia de Lactobacillus kandleri.
Características Microscópicas Características Macroscópicas
Bacilo Gram positivo; largo 4,2 µm, ancho 1,2 µm
Colonias de forma circular, cremosas, lisas, de color amarillo claro.
Tabla 47. Características Bioquímica de Lactobacillus kandleri.
X L SU M C MN ME I SO S R
---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- ++++ ----
F G Ma GE UREA RM LIA TSI CI AL CA
++++ ++++ ++++ - + + + Ac/ac - - -
7.4.4.6. Lactobacillus sake
Fig 55. Microscopia 100x de Fig 56. Lactobacillus sake en Lactobacillus sake. Agar Nutritivo.
Tabla 48. Microscopia y macroscopia de Lactobacillus sake
Características Microscópicas Características Macroscópicas Bacilo Gram positivo; largo 3,1 µm,
ancho 1,0 µm Colonias irregulares, de consistencia
cremosa, lisa y de pigmentación Blanco Hueso.
Tabla 49. Características Bioquímica de Lactobacillus sake
X L SU M C MN ME I SO S R
---- ++++ ++++ ++++ ---- ++++ ++++ ---- ---- ++++ ----
F G Ma GE UREA VP LIA TSI CI AL CA
++++ ---- ---- - + + - Alk/alk - - -
7.4.4.7. Lactobacillus viridescens
Figura 57. Microscopia 100x de Figura 58. Lactobacillus viridescens Lactobacillus viridescens. en Agar Nutritivo.
Tabla 50. Microscopia y macroscopia de Lactobacillus viridescens.
Características Microscópicas Características Macroscópicas Bacilo Gram positivo; largo 3,9 µm,
ancho 1,1 µm Colonias grandes con centro
cremoso, color blanco.
Tabla 51. Características Bioquímica de Lactobacillus viridescens.
X L SU M C MN ME I SO S R
---- ---- ---- ++++ ---- ++++ ---- ++++ ---- ++++ ----
F G Ma GE UREA VP LIA TSI CI AL CA
++++ ---- ---- - + + - Alk/ac - - -
7.4.5. Género Listeria
El género Listeria, se caracteriza por bacterias no son esporoformadoras,
móviles, crecen a temperatura de 20-25 °C, catalasa positiva, así mismo
son cepas no patógenas (Bergey, 2000) (Bergey, 1984).
7.4.5.1. Listeria murrayi
Figura 59. Microscopia 100x Figura 60. Listeria murrayi en Listeria murrayi. Agar Nutritivo.
Tabla 52. Microscopia y macroscopia de Listeria murrayi.
Características Microscópicas Características Macroscópicas
Bacilo Gram positivo; largo 1,9 µm, ancho 1,1 µm
Colonias de forma circular, de contextura cremosa, con bordes regulares,
pigmentación beige claro.
Tabla 53. Características Bioquímica de Listeria murrayi
X L SU M C MN ME I SO S R
---- ++++ ---- ++++ ---- ++++ ---- ---- ---- ++++ ++++
F G Ma GE UREA VP LIA TSI CI AL CA
++++ ++++ ++++ + - + - Alk/alk ---- ---- ++++
7.4.5.2. Listeria welshimeri
Figura 61. Microscopia 100x de Figura 62. Listeria welshimeri en
Listeria welshimeri. Agar Nutritivo.
Tabla 54. Microscopia y macroscopia de Listeria welshimeri.
Características Microscópicas Características Macroscópicas
Bacilo Gram positivo; largo 2,7 µm, ancho 1,0 µm
Colonias irregulares, de una tamaño pequeño, de consistencia cremosa, de
pigmentación blanco
Tabla 55. Características Bioquímica de Listeria welshimeri.
X L SU M C MN ME I SO S R
++++ ++++ ++++ ++++ ---- ---- ++++ ---- ---- ---- ----
F G Ma GE UREA RM LIA TSI CI AL CA
++++ ---- ---- + - + - Alk/alk - - +
7.5. Cocos Gram positivos no esporoformadores
Los géneros de cocos no esporoformadores Gram positivos descartados
por no encontrarse en ambientes similares al páramo fueron:
Marinococcus, Vagococcus, Planococcus y Salinococcus ya que estos
géneros requiere de una temperatura de crecimiento de 30 a 37 °C,
requieren una concentración de 0.5 a 20 % NaCl, así mismo son
encontrados en suelos salinos y hábitat marinos. Aerococcus demanda
pH 9.6 para su crecimiento, 10% NaCl y 40% de bilis. Coprococcus es
estrictamente anaeróbico y es aislado en intestinos y heces humanas.
(Bergey, 2000) (Bergey, 1984).
Gemella, Peptoccoccus, Peptostreptococcus, Stomatococcus y
Streptococcus fueron descartados por ser parásitos obligados de
humanos y mamíferos al ser invasivos de membranas mucosas del tracto
respiratorio, tractos intestinales, glándulas mamarias y tener implicación
en diferentes procesos infecciosos. Por sus características morfológicas
se determinó que las cepas aisladas no pertenecen al género
Deinobacter por mostrar colonias rosadas o rojas y Deinococcus por
presentar colonias rojas o naranjas. Otro requerimiento al momento de ser
cultivados es una atmosfera anaerobia de CO2 para los géneros
descartados Melissococcus y Ruminococcus (Bergey, 2000).
7.5.1. Género Lactococcus
Género de bacterias del ácido láctico formado por cinco especies
relacionadas con Streptococcus. Las bacterias de este género son
típicamente esféricas u ovoides, de 0,5 a 1,2 µm por 0,5 a 1,5 µm, y se
agrupan en pares o en cadenas cortas. Son no formadoras de esporas y
no mótiles (Valbuena et al. 2005).
Del género Lactococcus solo se encontró una cepa, su especie fue
seleccionada por las condiciones de temperatura (40 °C) y concentración
de NaCl para su desarrollo (4%), la especie seleccionada fue L. lactis,
pero esta especie presentaba tres subespecies diferenciadas por la no
fermentación de la lactosa y el manito, correspondiente a Lactococcus
lactis subespecie hordniae (Bergey, 2000).
7.5.1.1. Lactococcus lactis
El Lactococcus lactis es un microorganismo mesófilo, capaz de fermentar
la lactosa produciendo ácido láctico en gran cantidad, de la misma forma
es capaz de producir algunas substancias antibacterianas conocidas en
forma genérica como bacteriocinas, entre las cuales destacan la nisina y
la diplococcina. Ambos factores, acidez y bacteriocinas, son capaces de
inhibir el crecimiento de un amplio rango de microorganismos (Valbuena
et al. 2005).
Figura 63. Microsocopia 100x de Figura 64. Lactococcus lactis en Agar Lactococcus lactis. Nutritivo.
Tabla 56. Microscopia y macroscopia de Lactococcus lactis.
Características Microscópicas Características Macroscópicas Coco Gram positivo; diámetro 1,1 µm. Colonias de forma circular, de
tamaño diminuto, de consistencia cremosa y color blanco.
Tabla 57. Características Bioquímica de Lactococcus lactis.
X L SU M C MN ME I SO S R
---- ++++ ++++ ++++ ---- ---- ++++ ++++ ---- ---- ----
F G Ma GE UREA VP LIA TSI CI AL CA
---- ---- ---- + + + - Alk/alk ---- ++++ ----
7.5.2. Género Microccocus
Los microorganismos pertenecientes al género Micrococcus poseen
células esféricas, que pueden agruparse en pares, tétradas o en forma
irregular. Las colonias son pigmentadas. Son aerobios estrictos, su
metabolismo es respiratorio con escasa o nula producción de ácido, y
crecen bien en medios simples. La prueba de la catalasa es positiva, la de
la oxidasa frecuentemente lo es aunque débilmente (Altamirano y Pozzo.
2000).
7.5.2.1. Microccocus luteus
Figura 65. Microscopia 100x de Figura 66. Micrococcus luteus en
Microccocus luteus. Agar Nutritivo.
Tabla 58. Microscopia y macroscopia de Microccocus luteus.
Características Microscópicas Características Macroscópicas Coco Gram positivo; diámetro 1,7 µm. Colonias redondas, lisa, de
contextura cremosa, de pigmentación amarillo.
Tabla 59. Características Bioquímicas de Micrococcus luteus.
X L SU M C MN ME I SO S R
++++ ---- ++++ ++++ ---- ++++ ---- ---- ---- ---- ----
F G Ma GE UREA RM LIA TSI CI AL CA
++++ ---- ---- ++++ ++++ ---- ---- Alk/alk ---- ---- ++++
7.5.2.2. Micrococcus roseus
Figura 67. Microscopia 100x Figura 68. Micrococcus roseus en Micrococcus roseus. Agar Nutritivo
Tabla 60. Microscopia y macroscopia de Micrococcus roseus.
Características Microscópicas Características Macroscópicas Coco Gram positivo; diámetro 0,9 µm. Colonias redondas y lisas,
cremosas, de pigmentación rosa.
Tabla 61. Características Bioquímicas de Micrococcus roseus.
X L SU M C MN ME I SO S R
++++ ---- ++++ ++++ ---- ---- ---- ---- ---- ---- ----
F G Ma GE UREA VP LIA TSI CI AL CA
++++ ---- ---- ++++ ++++ ++++ ---- Alk/acid ---- ---- ++++
7.5.3. Género Pediococcus
Son cocos Gram positivos, inmóviles, no forman esporas.
Microscopicamente se observan formando tétradas, pero también pueden
estar en pares. Son homofermentativos Su rango óptimo de crecimiento
es de 25 ºC a 40 Cº. (De la Rosa 1996)
7.5.3.1. Pediococcus sp.
Según las características ésta cepa, no pertenece al género
Micrococccus, Planococcus o Deinococcus, géneros característicos por
presentar pigmentación en las colonias; debido a la no presencia de la
batería enzimática catalasa, así mismo se determinó que pertenece al
género Pediococcus por su no motilidad, no formación de esporas,
fermentación de glucosa y carbohidratos, no reduce nitratos, no es
patógena para animales o humanos y se ha aislado de material vegetal
(Bergey, 2000).
Figura 69. Microscopia 100x de Figura 70. Pediococcus sp en Pediococcus sp. Agar Nutritivo.
Tabla 62. Microscopia y macroscopia de Pediococcus sp.
Características Microscópicas Características Macroscópicas
Coco Gram positivo; diámetro 1,2 µm Colonias de forma circular, lisas, de consistencia cremosa, de
pigmentación amarillo.
Tabla 63. Características Bioquímica de Pediococcus sp.
X L SU M C MN ME I SO S R
++++ ++++ ++++ ++++ ---- ++++ ++++ ---- ---- ---- ----
F G Ma GE UREA VP LIA TSI CI AL CA
++++ ++++ ---- + + + - Alk/ac ++++ ---- ----
7.5.4. Género Sacharococeus
7.5.4.1. Sacharococeus thermophilus
En diferentes estudios Saccharococcus thermophilus se ha aislado en
refinerías de azúcar, a pesar de su resistencia a altas temperaturas se ha
venido encontrando en otros hábitats con bajas temperaturas (Bergey,
2000).
Figura 71. Microscopia 100x de Figura 72. Sacharococeus thermophilus
Sacharococeus thermophilus. en Agar Nutritivo.
Tabla 64. Microscopia y macroscopia de Sacharococeus thermophilus.
Características Microscópicas Características Macroscópicas
Coco Gram positivo; diámetro 0,9 µm Colonias de forma circular, de consistencia cremosa, lisa, de
pigmentación Beige.
Tabla 65. Características Bioquímica de Sacharococeus thermophilus
X L SU M C MN ME I SO S R
++++ ---- ++++ ++++ ---- ++++ ++++ ---- ---- ++++ ----
F G Ma GE UREA VP LIA TSI CI AL CA
++++ ++++ ++++ + + - + Ac/ac ++++ ++++ ++++
7.5.5. Género Sarcina
El género Sarcina fue seleccionado por su producción de CO2, hidrólisis
de almidón y catalasa negativa, existen dos especies: Sarcina maxima y
Sarcina ventriculi esta última fue seleccionada por ser fermentadora de
melobiosa y celulosa y no fermentadora de xilosa (Bergey, 2000).
7.5.5.1. Sarcina ventriculi
Figura 73. Microscopia 100x de Figura 74. Sarcina ventriculi en Agar
Sarcina ventriculi. Nutritivo.
Tabla 66. Microscopia y maroscopia de Sarcina ventriculi.
Características Microscópicas Características Macroscópicas Coco Gram positivo; diámetro 1,1 µm Colonias de formas irregulares, de
consistencia rugosa, presenta pigmentación blanca.
Tabla 67. Características Bioquímica de Sarcina ventriculi.
X L SU M C MN ME I SO S R
---- ++++ ++++ ---- ++++ ++++ ++++ ---- ---- ---- ----
F G Ma GE UREA RM LIA TSI CI AL CA
++++ ---- ---- + - - +/- Ac/ac
CO2 ---- ++++ ----
7.5.6. Género Staphylococcus
Son cocos Gram positivos, necesita una fuente nitrogenada orgánica y en
sus necesidades de oxígeno es facultativo, se caracteriza por ser catalasa
positivo (Prescott. 1999). La cepas a continuación se determinaron que
pertenecían al género Staphylococcus debido a su no formación de
esporas, no motilidad, sus colonias opacas blancas, raramente amarillas o
naranjas, son catalasa positiva, y no son cepas patógenas (Bergey,
2000).
7.5.6.1. Staphylococcus arlettae
Figura 75. Microscopia 100X de Figura 76. Staphylococcus arlettae en Staphylococcus arlettae. Agar Nutritivo.
Tabla 68. Microscopia y macroscopia de Staphylococcus arlettae.
Características Microscópicas Características Macroscópicas Coco Gram positivo; diámetro 1,1 µm Colonias redondas, de tamaño
pequeño, lisas, de pigmentación blanco.
Tabla 69. Características Bioquímica de Staphylococcus arlettae.
X L SU M C MN ME I SO S R
++++ ++++ ++++ ++++ ---- ++++ ++++ ---- ---- ++++ ----
F G Ma GE UREA RM LIA TSI CI AL CA
++++ ++++ ++++ + - + + Ac/ac ++++ ---- ++++
Esta cepa se diferenció de las otras especies del género Staphylococcus
por ser urea negativa, pero así mismo presentaba dos posibles especies:
Staphylococcus auricularis y Staphylococcus arlettae; ésta última fue
seleccionada por presentar fermentación de lactosa (Bergey, 2000).
7.5.6.2. Staphylococcus auricularis
Esta cepa fue identificaba como Staphylococcus auricularis por no
fermentar manitol y manosa que permitió diferenciarla de otras cepas
bacterianas de especia metabólicamente similares (Bergey, 1984).
Figura 77. Microscopia 100X de Figura 78. Staphylococcus auricularis Staphylococcus auricularis. en Agar Nutritivo.
Tabla 70. Microscopia y macroscopia de Staphylococcus auricularis.
Características Microscópicas Características Macroscópicas Coco Gram positivo; diámetro 0.9 µm Colonias de contextura cremosa, lisa,
de pigmentación Amarillo, translucidas.
Tabla 71. Características Bioquímica de Staphylococcus auricilaris.
X L SU M C MN ME I SO S R
++++ ---- ++++ ---- ---- ---- ++++ ---- ---- ---- ++++
F G Ma GE UREA RM LIA TSI CI AL CA
++++ ---- - + + + - Alk/ac ---- ---- ++++
7.5.6.3. Staphylococcus equorum
Figura 79. Microscopia 100x de Figura 80. Staphylococcus equorum Staphylococcus equorum. en Agar Nutritivo.
Tabla 72. Microscopia y macroscopia de Staphylococcus equorum
Características Microscópicas Características Macroscópicas Coco-Bacilo Gram positivo, largo 1,5
µm, ancho 1,1 µm. Colonias irregulares, lisas, de
consistencia seca, elevación plana, de pigmentación Blanca.
Tabla 73. Características Bioquímica de Staphylococcus equorum
X L SU M C MN ME I SO S R
---- ++++ ++++ ++++ ---- ++++ ++++ ---- ---- ++++ ++++
F G Ma GE UREA VP LIA TSI CI AL CA
++++ ++++ ---- + + + - Alk/alk ---- ---- ++++
7.5.6.4. Staphylococcus hominis
Estas cepas fueron identificadas Staphylococcus equorum y
Staphylococcus hominis por la hidrólisis de la urea, estas dos especies se
diferenciaron respectivamente por no presentar fermentación de la
aldopentosa xilosa y el polialcohol manitol respecto a S. equorum y si
fermentadora por parte de S. hominis (Bergey, 2000).
Figura 81. Microscopia 100x de Figura 82. Staphylococcus hominis Staphylococcus hominis. en Agar Nutritivo.
Tabla 74. Microscopia y macroscopia de Staphylococcus hominis.
Características Microscópicas Características Macroscópicas Coco Gram positivo, largo 1,7µm y
ancho 0,9 Colonias de forma circular, cremosas
y lisas, de pigmentación blanco.
Tabla 75. Características Bioquímica de Staphylococcus hominis.
X L SU M C MN ME I SO S R
++++ ++++ ++++ ++++ ---- ---- ++++ ---- ---- ++++ ----
F G Ma GE UREA VP LIA TSI CI AL CA
++++ ++++ ++++ + + - - Ac/ac
CO2
++++ ---- ++++
7.5.6.5. Staphylococcus lentus
Esta cepa, también urea negativa presentaba dos opciones S. kloosii y S.
lentus pero esta última fue seleccionada por fermentar sucrosa y manosa
(Bergey, 2000) (Bergey, 1984).
Figura 83. Microscopia 100x de Figura 84. Staphylococcus lentus en Staphylococcus lentus. Agar Nutritivo.
Tabla 76. Microscopia y macroscopia de Staphylococcus lentus.
Características Microscópicas Características Macroscópicas Coco Gram positivo; diámetro 1,1 µm Colonias lisas, de consistencia
cremosa, de pigmentación amarillo.
Tabla 77. Características Bioquímica de Staphylococcus lentus
X L SU M C MN ME I SO S R
---- ++++ ++++ ---- ---- ++++ ++++ ---- ---- ++++ ++++
F G Ma GE UREA VP LIA TSI CI AL CA
++++ ++++ ++++ + - + - Alk/ac - - +
7.6. Coco-Bacilos no esporoformadores Gram positivo s.
7.6.1. Género Trichococcus
7.6.1.1. Trichococcus flocculiformis
Figura 85. Microscopia 100x de Figura 86. Trichococcus flocculiformis
Trichococcus flocculiformis. en Agar Nutritivo.
Tabla 78. Microscopia y macroscopia de Trichococcus flocculiformis.
Características Microscópicas Características Macroscópicas
Coco-Bacilo Gram positivo, largo 1,7 µm, ancho 0,8 µm
Colonias redondas, consistencia cremosa y pigmentación blanca
Tabla 79. Características Bioquímica de Trichococcus flocculiformis.
X L SU M C MN ME I SO S R
---- ++++ ++++ ++++ ---- ++++ ++++ ---- ---- ++++ ----
F G Ma GE UREA VP LIA TSI CI AL CA
++++ ++++ ++++ + + + +/- Alk/acid
CO2
---- ++++ ++++
8. CONCLUSIONES
• Se realizó una renovación del grupo de cepas microbianas del
laboratorio de bioensayos de la Pontificia Universidad Javeriana en la
línea de investigación de fitoquímica , con especies bacterianas nativas
que han sido encontradas en diferentes ambientes y lugares del mundo
entero, proporcionando nuevas herramientas microbiológicas.
• Se amplió las expectativas en encontrar cepas bacterianas, que
metabolicen nuevos compuestos con efecto bactericida, antifungicos,
bacteriostáticos y biocontroladores de plagas, necesarios para la
innovación en áreas biotecnológicas y bioquímicas.
• Se aislaron en total 123 cepas, de las cuales se identificaron mediante
estudios de género y especie 40 cepas.
• Se siguió una cadena de parámetros en la identificación, centrándose
en las características metabólicas mediante procesos bioquímicos, sus
requerimientos y condiciones de cultivo, el nicho ecológico y por último
las características taxonómicas: microscópicas mediciones celulares
mediante microscopio motic y macroscópicas con la caracterización
morfológica de las colonias.
• Mediante los diferentes pases en agar nutritivo y agar extracto de suelo
se obtuvieron las diferentes cepas bacterianas puras y viables.
• Utilizando los diferentes métodos de conservación (glicerol al 20%,
sensidiscos y en suelo), se mantuvo la colección de cepas en
condiciones puras y genéticamente estables, para que en tiempos
futuros sean utilizadas mediante nuevas técnicas en descubrimiento de
capacidades metabólicas.
9. RECOMENDACIONES
• Llevar a cabo procesos de aislamiento e identificaci0n in situ, así
mismo cultivar las cepas bacterianas a temperatura de 5ºC
correspondiente a la temperatura aislada del suelo de un páramo,
para recuperar aquellos géneros bacterianos que no son tolerantes a
las temperaturas comúnmente utilizadas en incubación y
enriquecimiento.
• Realizar pruebas confirmativas mediante identificación molecular y
así mismo realizar comparación mediante el banco de genes.
• Ejecutar extracciones en secciones de genes codificantes para
poder establecer una mejor caracterización de las propiedades
metabólicas, de síntesis y tolerancia de una célula bacteriana.
• Evaluar estadísticamente los diferentes métodos de muestra y
técnicas de recuperación celular a partir de suelo según: numero de
colonias aisladas y recuperadas, propiedades de muestra
representativa, número de muestreos entre otros.
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ANEXO 1
RESULTADOS DE LAS BIOQUÍMICAS
• VOGES-PROSKAUER
• ROJO DE METILO
• REDUCCIÓN DE NITRATOS
• UREASA
• PRUEBA DE CITRATO
• PRUEBA CATALASA
• INDOL
Fuente: www.joseacortez.com
