aislamiento e identificación molecular de levaduras autóctonas de colombia para la producción de...
TRANSCRIPT
Aislamiento e identificación molecular de levaduras autóctonas de Colombia para la producción de etanolPedro F. B. Brandão1, Adelina del Pilar Melendez2 y Mario E. Velásquez-Lozano3
1 Grupo de Estudios para la Remediación y Mitigación de Impactos Negativos al Ambiente (G.E.R.M.I.N.A.), Laboratorio de Microbiología Ambiental y Aplicada, Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá - COLOMBIA.2 Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá - COLOMBIA3 Grupo de Investigación de Procesos Químicos y Bioquímicos, Laboratorio de Ingeniería Bioquímica, Departamento de Ingeniería Química y Ambiental, Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá – COLOMBIA
1
Trabajo perteneciente al Proyecto:“Aislamiento, caracterización y evaluación de
levaduras nativas del municipio de Puerto López (Meta) para la producción de
etanol”
Ejecutado por: Universidad Nacional de ColombiaFinanciado y Evaluado por: Colciencias y Ecopetrol
Apoyo y interés comercial de: Ecopetrol y Bioenergy
2
Bioetanol en Colombia• Alcohol carburante de Colombia
• caña de azúcar• valle geográfico del Río Cauca• región con 13 ingenios azucareros y 5
destilerías de alcohol• Otros puntos de interés objeto de estudio
• Costa Atlántica• Hoya del río Suarez (Boyacá-Santander)• Llanos Orientales (hasta el Tolima)
• Proceso general de obtención de alcohol carburante• fermentación con levaduras empleando como
sustrato los azúcares extraídos de la caña de azúcar
3
Biocombustibles en Colombia, 2009. Consultada en: http://www.upme.gov.co/Docs/Biocombustibles_Colombia.pdf
Fermentación con levaduras
4
• Metabolismo etanol• Conversión de hexosas
Proceso industrial de producción de bioetanol
5
• Levadura comercial• Proceso controlado• Reutilización levaduras
Levaduras Autóctonas vs. Comerciales• Potencial para mejorar rendimientos
de fermentación• Mejor adaptación a los jugos de caña• Mayor competencia contra otras
levaduras autóctonas
Importante recuperar levaduras de las zonas de cultivo y proceso de la caña para obtener las que puedan contribuir a un mejoramiento del proceso local de fermentación
6
Kosaric, N. and F. Vardar-Sukan, Potential source of energy and chemical products, in The Biotechnology of Ethanol: Classical and Future Applications. 2001, M. Roehr ed. Wiley-VCH:: New York.
Potencial levaduras autóctonas en la producción de bioetanol
7
Basso L. C. et al (2008) Yeast selection for fuel ethanol production in Brazil. FEMS Yeast Res 8 (2008) 1155–1163
• Aparente baja diferencia en el rendimiento de etanol entre levaduras corresponde a un aumento de 2,1 millones de litros de etanol por temporada de cosecha en una destilaría de mediana capacidad.
Recuperación de Levaduras Ambientales• Muestras ambientales usadas
para encontrar levaduras de interés
• Extenso proceso de aislamiento
• Posible presencia de réplicas de una misma cepa
Técnicas de diferenciación permiten discriminar réplicas y así utilizar cepas únicas en la fermentación
8
Métodos moleculares para diferenciar levaduras• Análisis de polimorfismos en la longitud de los fragmentos de
restricción de regiones ITS (ITS-RFLP)
9
• Regiones ITS (Internal Transcribed Spacer)• RNA no-funcional
situado entre rRNA’s estructurales
• usado en taxonomía y filogenia microbiana
• alta variabilidad entre especies relacionadas
• fácil de amplificar por PCR (alto numero de copias de genes rRNA)
http://www.studyblue.com/#flashcard/view/9823159
Enzimas restricción
10
Métodos moleculares para diferenciar levaduras• Análisis de polimorfismos en la longitud de los fragmentos de
restricción de ADN mitocondrial (mtDNA-RFLP)
http://www.studyblue.com/#flashcard/view/9823159
• Alto poder de diferenciación de levaduras
• Método rápido y relativamente sencillo
• Digestión con HinfI o RsaI permite obtener polimorfismo con alto poder discriminativo
11
http://www.studyblue.com/#flashcard/view/9823159
• Separación del cromosoma de levadura por electroforesis de campo pulsado (Cariotipado)
• Útil para identificación de cepas de levaduras
• Revela gran variabilidad de la composición del cromosoma
• Complejo, laborioso, consume tiempo cuando se requiere analizar muchas cepas
Métodos moleculares para diferenciar levaduras
Objetivo general investigación desarrollada
• Recuperación y aislamiento de levaduras autóctonas
de Puerto López (Meta), Colombia, con potencial para
la producción de etanol, y el establecimiento de
metodologías moleculares para su identificación.
12
Procedimiento experimental
Análisismolecular
Discriminación por huella molecular
Selección de cepas para análisis de
fermentación
Formación cepario
Secuenciación para
identificación
Muestreo Puerto López
(Meta)
Aislamiento levaduras autóctonas
Selección morfológica levaduras
Aplicación industrial
Análisis de diversidad
Zonas de muestreo - Puerto López (Meta)• Cultivo Caña• Agua de irrigación• Trapiche• Productos fermentados
(guarapo)
Se realizaron muestreos en época seca y de lluvias con el objetivo de recolectar diferente carga microbiológica
14
Muestras Ambientales• Agua riego• Suelo cultivo• Caña de azúcar• Jugos de caña• Mieles• Melaza• Bagazo• Suelo con jugo de
caña del trapiche panelero con olor a fermentado
15
Aislamientos• Técnicas dependientes de cultivo• Worten Agar• Potato Dextrose Agar• Yeast Glucose
Chloramphenicol Agar
16
Cepario
17Primer cepario (epoca seca)
Segundo cepario (epoca de lluvias)
105-5/105-10/106-4/106-5/108-4/109-1 /110-2/110-3/110-5/112-6/112-8/112-9/ 112-10/112-11/112-12/113-1/113-2/ 113-5/117-
1/117-2/117-3/117-4/ 117-7/117-8/120-4/121-1/121-2No encontrado
107-3/107-4/109-5/109-8/109-9/109-11/ 109-12/110-1/110-6/112-4/120-6/120-8
Cepa tipo: Saccharomyces cerevisiae AH22 (NRRL Y-12843)Cepas patrón: A, B, Sucromiles
202-3/204-1/204-2/205-3/205-4/206-3/206-7/ 209-2/209-5/210-1/210-2/212-1/212-8/213-1/ 213-2/213-4/213-6/213-7/213-8/214-
1/214-2/ 214-3/214-4/215-2/215-4/215-5/216-1/216-4
103-1/103-2/104-1/104-2/104-3/105-1 /105-8/105-41/105-16/106-3/108-2/ 108-3/112-2/113-3
No encontrado
106-1/107-2 No encontrado105-2/105-4/105-7/115-1 No encontrado
112-1/112-3/112-5/112-7/117-5/117-6 No encontrado109-10 No encontrado109-7 No encontrado109-6 No encontrado109-4 No encontrado
120-12/120-14 No encontrado120-5/120-9/120-10/120-13 No encontrado
120-11 No encontrado120-1 No encontrado108-5 No encontrado114-1 No encontrado
116-2/116-3/116-5 No encontradoNo encontrado 202-1/202-2No encontrado 203-1/203-2No encontrado 203-4No encontrado 204-3/206-1/206-4/209-3No encontrado 205-1/206-2/209-4/210-4/213-3No encontrado 205-2/205-6/208-7/209-1/214-5No encontrado 205-8No encontrado 208-6No encontrado 210-3/215-1No encontrado 212-2/212-5No encontrado 212-4No encontrado 212-6/212-7No encontrado 213-9No encontrado 213-10No encontrado 215-3
• Se recuperaron 239 cepas de levaduras autóctonas de Colombia
Junto con diferentes cepas patrón de Saccharomyces cerevisiae se llevó a cabo el análisis molecular
Amplificación de la región ITS
(PCR)
Purificación de los productos
de amplificación
Secuenciación de las regiones
ITS
Análisis bioinformático
de las secuencias
(Blastn)
Identificación Molecular Levaduras
Extracción de ADN levaduras
Método mecánico (bead-
beater)
Método enzimático (Liticasa)
Análisis región ITS Levaduras Autóctonas• Diferentes tamaños de fragmentos ITS entre levaduras• Varias cepas mostraron ITS con el mismo tamaño baja discriminación
19
Diferenciación Molecular de regiones ITS• Diferenciación por huella molecular: Análisis ITS-SSCP
Single-Strand Conformation Polymorphism (SSCP)• variaciones en secuencia de ADN desnaturalizado se detecta por
alteraciones en conformación secundaria de ADN de cadena sencilla (ssADN) en gel de poliacrilamida
• Conformación secundaria de ADN es dependiente de la secuencia de bases del fragmento
• Separación en el gel es dependiente de la conformación secundaria enrollada del ADN
20
Muestra A Muestra B
Gel de poliacrilamida no-desnaturalizante
Single-Strand Conformation Polymorphism
Desnaturalización del DNA (95°C, 5 min.)
Muestra A Muestra B
Single-Strand Conformation Polymorphism
Gel de poliacrilamida no-desnaturalizante
Carga de muestras en gel
Muestra A Muestra B
Single-Strand Conformation Polymorphism
Doblamiento de cadenas sencillas de
ADN
Muestra A Muestra B
Single-Strand Conformation Polymorphism
Separación en el gel de las
distintas conformaciones
de cadenas sencillas de
ADN
Muestra A Muestra B
Single-Strand Conformation Polymorphism
Posición final de las
cadenas sencillas de
ADN en el gel
Muestra A Muestra B
Single-Strand Conformation Polymorphism
Perfiles de SSCP
Muestra A Muestra B
Single-Strand Conformation Polymorphism
Análisis ITS-SSCP
28
Se encontraron 39 perfiles ITS-SSCP únicos entre las 239 cepas aisladas
Entre paréntesis se encuentran los códigos de las cepas nativas. La Cepa A y Sc son controles positivos de Saccharomyces cerevisiae, las letras A hasta Q designan los perfiles obtenidos para las muestras del primer cepario (recolectado en epoca seca) y las muestras 1-40 corresponden a las primeras amplificaciones del segundo cepario (recolectado en epoca de lluvias).Condiciones del gel de SSCP: 0.50X MDE, 17h corrida a 5W.
Compilación de perfiles ITS-SSCP únicos obtenidos para las cepas autóctonas de levaduras presentes en el cepario establecido
Perfil ITS-SSCP
Primer cepario (Verano)
Segundo cepario (Invierno)
A105-5/105-10/106-4/106-5/108-4/109-1 /110-2/110-3/110-5/112-6/112-8/112-9/ 112-10/112-11/112-12/113-1/113-2/ 113-5/117-
1/117-2/117-3/117-4/ 117-7/117-8/120-4/121-1/121-2No encontrado
BS. cerevisiae
107-3/107-4/109-5/109-8/109-9/109-11/ 109-12/110-1/110-6/112-4/120-6/120-8
Cepa tipo: Saccharomyces cerevisiae AH22 (NRRL Y-12843)Cepas patrón: A, B, Sucromiles
202-3/204-1/204-2/205-3/205-4/206-3/206-7/ 209-2/209-5/210-1/210-2/212-1/212-8/213-1/ 213-2/213-4/213-6/213-7/213-8/214-
1/214-2/ 214-3/214-4/215-2/215-4/215-5/216-1/216-4
C103-1/103-2/104-1/104-2/104-3/105-1 /105-8/105-41/105-16/106-
3/108-2/ 108-3/112-2/113-3No encontrado
D 106-1/107-2 No encontradoE 105-2/105-4/105-7/115-1 No encontradoF 112-1/112-3/112-5/112-7/117-5/117-6 No encontradoG 109-10 No encontradoH 109-7 No encontradoI 109-6 No encontradoJ 109-4 No encontradoK 120-12/120-14 No encontradoL 120-5/120-9/120-10/120-13 No encontradoM 120-11 No encontradoN 120-1 No encontradoO 108-5 No encontradoP 114-1 No encontradoQ 116-2/116-3/116-5 No encontradoR No encontrado 202-1/202-2S No encontrado 203-1/203-2T No encontrado 203-4U No encontrado 204-3/206-1/206-4/209-3V No encontrado 205-1/206-2/209-4/210-4/213-3W No encontrado 205-2/205-6/208-7/209-1/214-5X No encontrado 205-8Y No encontrado 208-6Z No encontrado 210-3/215-1
2A No encontrado 212-2/212-52B No encontrado 212-42C No encontrado 212-6/212-72D No encontrado 213-92E No encontrado 213-102F No encontrado 215-3
S. cerevisiae fue la única levadura recuperada en ambas épocas seca y lluviosa
Fragmentos de ADN correspondientes a perfiles ITS-SSCP únicos fueran secuenciados para su identificación
PerfilITS-SSCP
Especie identificada% Identidad
GenBank
A Hanseniaspora guillermondii 99B Saccharomyces cerevisiae 99
C, S, 2F Meyerozyma caribbica 100D, 2J Issatchenkia orientalis 100
E Rhodotorula mucilaginosa 99F, U, 2C Wickerhamomyces anomalus 99
H, J, WPichia sp. CBS 241 (Zygopichia chevalieri var. Fermentati)
100
I Candida parapsilopsis 99M Dekkera bruxellensis 95
NTorulaspora sp. XZ-46A (Torulaspora quercuum)
99
O Candida intermedia 100Q Candida tropicalis 99R Toluraspora delbruekii 100
V, 2B Pichia sp. YS110 (Pichia garciniae) 95Z, 2E, 2H Candida berthetii 100
2D Candida laemsonensis 982A Candida stellimalicola 1002G Candida cf. sorbosivorans 99X Hanseniaspora opuntiae 99T Secuencia no reportada en bases de datos 86
G, K, L, P, Y, 2I, 2K, 2L, 2M
Pendiente resultado -
Identificación Levaduras Autóctonas• Varias cepas han sido
reportadas como contaminantes en plantas de producción de etanol ( )
• S. cerevisiae 51 cepas entre las 239
levaduras analizadas mostraron distintos
perfiles metabólicos de fermentación indicando posible variabilidad intra-específica
Basílio A. C. M. (2008) Detection and Identification of Wild Yeast
Contaminants of the Industrial Fuel Ethanol Fermentation Process.
Curr Microbiol (2008) 56:322–326.
*
**
*
**
*
*
**
*
Diferenciación de subespecies de S. cerevisiae
• Análisis de regiones inter-delta
permite discriminación por debajo del nivel de especie
31
Ness F. et al (1993) Identification of yeast strains using the polymerase chain reaction. J. Sci. Food Agric. 62, 89-94.
Código de la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae
Primer cepario Segundo cepario
107-3 202-3* 209-2** 214-3
107-4 203-7 209-5 214-4
109-5 203-8 210-1 215-2
109-8 204-1* 210-2 215-4
109-9 204-2 212-1 215-5**
109-11 205-3 212-8 216-1
109-12 205-4 213-1 216-4
110-1 206-3 213-2 216-5
110-6 206-6 213-4 -
112-4* 206-7 213-6 Cepas patrón
119-1 206-9* 213-7 AH22
119-3* 207-2 213-8 A
120-6 207-3 214-1 B
120-8* 208-1 214-2 Sucromiles
Las cepas indicadas con el símbolo * corresponden a las que pueden ser de mayor interés a futuro debido a su perfil de fermentación de acuerdo a los resultados de la actividades 3 y 7 del proyecto de investigación. Las cepas con el símbolo ** corresponden a cepas que son S. cerevisiae pero que por problemas de crecimiento en el momento de inocular en el medio YPG no se incluyen en los resultados obtenidos.
S. cerevisiae evaluadas por análisis inter-delta
Análisis inter-delta de S. cerevisiae
33
20 perfiles inter-delta únicos grupo de cepas únicas seleccionado para posteriores ensayos de fermentación
Cepa de levadura S. cerevisiae
Perfil interdelta
Cepa de levadura S. cerevisiae
Perfil interdelta
212-1, 213-1 a A, SC ñ
216-1, 216-4, 107-4 b 209-2, 212-1 o
213-4, 214-3 b(I) 205-3 o(I)
215-4, 109-5 b(II) 206-3, 210-1, 210-2 p
213-7, 214-4 b(III) 207-2 p(I)
110-6, 110-1 c 206-6 p(II)
208-1, 109-8 c(I) 205-4 q
109-11 c(II) 215-2 q(I)
213-8 d B r
214-2 e AH22 s
107-3 f 120-6 t
109-9 g 206-9 u
112-4 i 202-3 v
119-1 j 207-3 w
119-3 k 209-5 x
204-1 l 213-6 y
204-2 m 214-1 z
206-7 n 213-2, 120-8, 203-7, 203-8, 216-5
No Amplificó
20 perfiles inter-delta únicos entre 51 cepas de S. cerevisiae
grupo de cepas únicas seleccionado para posteriores ensayos de fermentación
Compilación de perfiles inter-delta únicos obtenidos para las cepas de S. cerevisiae autóctonas
Fermentación con levaduras autóctonas
35
• Varias levaduras autóctonas mostraron nivel de producción de etanol similar a cepa control
- Densidad celular: 1x107 células viables/ml- Temperatura fermentación: 30°C- Sacarosa: 10% p/v- Incubación: 24h
Conclusiones
Secuenciación de las 39
regiones ITS únicas
Fermentaciones con S. cerevisiae
únicas
Amplificación de región ITS
Análisis SSCP
39 perfilesITS-SSCP
únicos
Identificación a nivel de especie
1 de los 39 perfiles corresponde al perfil
de una cepa referencia
S. cerevisiae
Varias de las 50 cepas nativas S. cerevisiae mostraron perfiles
metabólicos distintos
Amplificación y análisis de
regiones inter-delta
20 perfilesinter-delta únicos S. cerevisiae
50 levaduras autóctonas con perfil
ITS-SSCP igual a cepa referencia S.
cerevisiae
Diferenciación por debajo del
nivel de especie
Aislamiento levaduras autóctonas
Muestreo Puerto López
(Meta)
Cepario(239 cepas)
Investigaciones en desarrollo• Segunda fase del proyecto:
“Producción de etanol de segunda generación a partir de hidrolizado de bagazo de caña por levaduras y bacterias autóctonas”• Mejoramiento molecular de levadura autóctona
• Transformación de pentosas
• Resistencia a inhibidores
• Aislamiento de bacterias fermentadoras de pentosas
• Probar posible implementación de microorganismos aislados a nivel industrial (Bioenergy)
37
http://www.bioenergy.com.co/Espanol/Paginas/Video-Corporativo.aspx
Agradecimientos• Integrantes grupo ECOLEVUN
• Astrid Acevedo, Ángela Otálora, Alis Pataquiva, Luisa Gómez, Sandra Rodríguez, Juan Pablo Ortiz, Helver Lesmes
• Estudiantes integrantes grupo GERMINA• Diana Vela, Iván López (2010-2)• Jaime Sánchez (2011-1)• L. Tatiana Morales, Aida Ramírez (2011-2)• Yina Cifuentes (2012-1)• Vivian Covo (2012-2)
• Entidades financiadoras
38
39
Polymerase Chain Reaction (PCR)
• Reacción en Cadena de la Polimerasa
40
Polymerase Chain Reaction (PCR)• Reacción en Cadena de la Polimerasa
41