aislamiento y caracterizacion de enzimas

7/25/2019 Aislamiento y Caracterizacion de Enzimas

1/26

3. AISLAMIENTO YCARACTERIZACIN DE ENZIMAS

3.1 Tcnicas de purificacin de en!i"as

3.# Tcnicas ana$%&icas para cuan&ificacin de pr'&e%nas

3.3 Medicin de ac&i(idad en!i")&ica


2/26

Organismo Tamao delgenoma (Mpb)*

Nmero decromosomas

Nmero degenes

Secuencias

codificadoras paraprotenas(%)

Virus de laepatitis !

"#$ &'

Escherichia coli # & +',, ,,

Saccharomyces

cervisiae

&' & +""" -"

Caenorhabditiselegants

- &+""" '$

.rro/ " 01$+""" 0&"

Drosophila &," &1+"" &1

2ollo &+'"" 1

3at4n 1+""" '"

Vaca 1+""" 1"

umano 1+""" '1 01$+""" &$

* Millones de pares de bases* * Tamao del genoma 5 nmero de cromosomas referidos a c6lulas 7aploides

Tama8o 5 nmero de cromosomas en diferentes organismos


3/26

*ARA ENTENDER LA +,NCIN DE ,NA ENZIMA-AY ,E *R,+ICARLA

/ +uen&e

/ E$ ensa0'/ C'"' $ierar una $a pr'&e%na de su nic2' na&ura$/ S'$ui$idad Ta"a4' Car5a 0 Afinidad


4/26

*,RI+ICACIN

/ In&erca"i' inic'/ In&eraccin 2idr'fica/ SEC/ +racci'na"ien&' p'r

diferencia de c'efici'en&ede difusin

CARACTERIZACIN

/ 9lectroforesis/ Secuencia peptdica

/ Mapeo Trptico

/ :ltracentrifugaci4n

analtica/ 9spectroscopa

/ ;ispersi4n de lu/

din


5/26

LA +ORMA DE ROM*ER EL TE6IDO

Fundamento Homogeneizador Materiales

Esfuerzo de corte producido porlquidos

Potter-Elvehjem Tejidos blandos

PolytronTejidos blandos yduros

Prensa de French Bacterias

Esfuerzo de corte producido por slidos ortero con mazo !e"etales

#avitacin "aseosaBomba de nitr"eno #$lulas

%onicador &r"'nelos y c$lulas

edios qumicos y bioqumicos

edio hipotnico #$lulas de la san"re

Enzimas (lisozima)*idrlisis de la paredcelular bacteriana


6/26

E$ ensa0'


7/26

Centrifugacin Diferencial. Las clulas se homogenizan y se centrifugan con

cambios en la fuerza centrfuga. El material ms denso se va la fondo del tubo.

Cada una de las fracciones pueden usarse para fines especficos.http!!""".ncbi.nlm.nih.gov!boo#s!$%&''()*!figure!+(()!


8/26

,raccionamiento -alting out y dilisis

Dilisis: Las molculas de protenas crculos ro/os0 1uedan retenidos dentro de la

bolsa de dilisis2 en la medida 1ue molculas pe1ue3as azules0 pueden difundir.

http!!""".ncbi.nlm.nih.gov!boo#s!$%&''()*!4+((5


9/26

Cr'"a&'5raf%a de &a"ices "'$ecu$ares7per"eacin en 5e$ gel filtration8

En la cromatografa de tamices moleculares un mezcla de protenas se

aplica en la parte superior de una columna llena de esferas porosas.

http!!""".ncbi.nlm.nih.gov!boo#s!$%&''()*!4+((5


10/26

Cr'"a&'5raf%a de in&erca"i' inic'

En la cromatografa de intercambio inico se

separan protenas de acuerdo a su carga neta.


11/26

Cr'"a&'5raf%a de afinidad

Como e/emplo2 la Cocanavalina + amarilla0 se une a

un soporte slido 1ue contiene glucosa. La adicin deuna concentracin ms alta de glucosa desprende la

concavalina del soporte.


12/26

E$ec&r'f'resis en 9e$ de p'$iacri$a"ida 7*A9E8


13/26

Step Total protein(mg)

Total activity(Unidades=micromoles/min)

Specifcactivity,(U/mg)

ield (!) "urifcationlevel

-'"'5eni!a&i'n 1:;;; 1:;;;; 1; 1;; 1

Sa$& frac&i'na&i'n ;;; 3; ?# 3

I'n@ec2an5ec2r'"a&'5rap20

1#B> 11::;; ?; BB ?

M'$ecu$arec$usi'nc2r'"a&'5rap20

=>.> B:;;; 11;; :; 11;

Affini&0c2r'"a&'5rap20

1.B: :#:;; 3;;;; 3: 3;;;

#a actividad enzim$tica es una medida de la cantidad de enzima activapresente y del nivel de actividad de la misma% #a actividad e&presa lacantidad de sustrato convertido por unidad de tiempo, teniendo

condiciones%

' U = ' mol sustrato convertido & min *'


14/26

electroforesis

Elecroforesis de zona

6soelectroenfo1ue 7+8E9-D-


15/26

7+8E9-D-


16/26

6soelectroenfo1ue


17/26

'D


18/26

:7LC


19/26

" is &2e "ass 'f &2e par&ic$e is &2e par&ia$ specific ('$u"e

is &2e densi&0 'f &2e "ediu"f is &2e fric&i'na$ c'efficien& 7a "easure 'f &2es2ape 'f &2e par&ic$e8.T2e 71 @ 8 &er" is &2e u'0an& f'rce eer&ed 0$iuid "ediu"


20/26


21/26

=entrifugaci4n por >ona# +'r"acin de un 5radien&eC'$'cacin de $a "ues&ra Cen&rifu5acin 0 C'$eccin defracci'nes.2&&pFGGHHH.nci.n$".ni2.5'(G''sGNJK##


22/26

MALDI@TO+ Mass Spec&r'"e&r0 2&&pFGGHHH.0'u&ue.c'"GHa&c2(OKR;c&r$;fea&urere$a&ed718 T2e pr'&ein sa"p$e e"edded in an appr'pria&e "a&ri is i'ni!ed 0 &2e app$ica&i'n 'f a $aser ea".7#8 An e$ec&rica$ fie$d acce$era&es &2e i'ns f'r"ed &2r'u52 &2e f$i52& &ue &'Hard &2e de&ec&'r. 738 T2e$i52&es& i'ns arri(e firs&. 7


23/26

2&&pFGGHHH.nci.n$".ni2.5'(G''sGNJK:=;11G


24/26

MALDI@TO+ Mass Spec&ru" 'f Insu$in and $ac&'5$'u$inA "i&ure 'f : p"'$ eac2 'f insu$in 7I8 and @$ac&'5$'u$in 7L8 Has i'ni!ed 0 MALDI H2ic2 pr'ducespred'"ina&e$0 sin5$0 c2ar5ed "'$ecu$ar i'ns fr'" pep&ides and pr'&eins 7I - f'r insu$in and L - f'r$ac&'5$'u$in8. -'He(er "'$ecu$es Hi&2 "u$&ip$e c2ar5es as He$$ as s"a$$ uan&i&ies 'f a sin5$0 c2ar5ed di"er 'f

insu$in 7# I -8 a$s' are pr'duced. Af&er 6. T. Pa&s'n In&r'duc&i'n &' Mass Spec&r'"e&r0 3d ed. 7Lippinc'&&@Ra(en 1??B8 p. #>#.Q


25/26

Tec7ni?ue 2rocess .pplication

#@DE 7#@di"ensi'na$ 5e$ e$ec&r'p2'resis8 S'$u$e pr'&ein separa&i'n in 5e$ 0 is'e$ec&ricf'cusin5 7IE+8 f'$$'Hed 0 separa&i'n ased 'n"'$ecu$ar Hei52& 7SDS@*A9E8

+rac&i'na&i'n 'f pr'&eins &2r'u52 2i52$0si"p$ified pr'&ein sp'&s

1@DE 71@di"ensi'na$ 5e$ e$ec&r'p2'resis8 S'$u$e pr'&ein separa&i'n in 5e$ 0 is'e$ec&ricf'cusin5 7IE+8 'r "'$ecu$ar Hei52& 7SDS@*A9E8

L'H@res'$u&i'n separa&i'n 'f pr'&eins.9enera$$0 used pri'r &' suseuen&separa&i'n s&eps

DI9E 7differen&ia$ 5e$ e$ec&r'p2'resis8 +$u'rescen& d0e $ae$ed s'$u$e pr'&eins

separa&ed 0 is'e$ec&ric p'in& f'$$'Hed 0separa&i'n ased 'n "'$ecu$ar Hei52&

uan&i&a&i(e #@D frac&i'na&i'n used f'r

accura&e re$a&i(e epressi'n differences 'fs'$u$e pr'&eins

O9E 7'ff@5e$ e$ec&r'p2'resis8 S'$u$e pr'&ein separa&i'n in a 5e$Gufferc'"ina&i'n. Is'e$ec&ric f'cusin5 Hi&2'u&a"p2'$0&es

Separa&i'n 'f in&ac& pr'&eins. ,sed &'ac2ie(e "'dera&e$0 si"p$ified pr'&ein"i&ures

Tar5e& affini&0 enric2"en& *r'&ein inds &' an i""'i$i!ed sus&ancese$ec&i(e f'r &2e pr'&ein 'f in&eres&. *r'&einindin5 is re(ersi$e

Kn'Hn pr'&ein c'"p$ees MARS'ida&i'ns 5$0c's0$a&i'ns p2'sp2'r$0a&i'nsRNAGDNA. +'r 2i52$0 specific pr'&einfrac&i'na&i'n


26/26

Tec7ni?ue 2rocess .pplication

SCUG-*LC 7s&r'n5 ca&i'nec2an5eG-*LC8

On@$ine e$u&i'n 'f &r0p&ic di5es&sased 'n i'nic s&ren5&2 f'$$'Hed0 re(ersed p2ase -*LC

-i52$0 c'"p$e pr'&ein di5es&"i&ures

-*LCGCE On@$ine e$u&i'n ased 'n20dr'p2'ici&0 and c2ar5eG"assra&i'

L'H $e(e$ s"a$$ ('$u"e pr'&einiden&ifica&i'n 'f di5es&s

-*LCGCZE On@$ine e$u&i'n ased 'n20dr'p2'ici&0 and si!e

L'H $e(e$ s"a$$ ('$u"e pr'&ein

C$ass enric2"en& Affini&0 in&erac&i'n 'f pep&ide *referen&ia$ re"'(a$ 'f "'dified

pep&ides

ICAT 7is'&'pe c'ded affini&0 &a58 Ji'&in deri(a&i!ed c0s&eineresidues se$ec&i(e$0 is'$a&ed 0a(idin c'$u"n c2r'"a&'5rap20

Re$a&i(e uan&ifica&i'n andiden&ifica&i'n 'f pr'&eins ased 'nis'&'pic $ae$s

A,A 7as'$u&e uan&i&a&i(e

ana$0sis8

Is'&'pica$$0 $ae$ed pep&ides

uan&ified 0 &2e presence 'f as&a$e is'&'pica$$0 $ae$ed in&erna$s&andard

As'$u&e uan&ifica&i'n 'f pep&ide

c'ncen&ra&i'n

iTRA 7is'&'pe &a55in5 rea5en&sf'r as'$u&e uan&ifica&i'n8

Is'aric $ae$in5 'f pri"ar0a"ines

C'"paris'n 'f up &' f'ur sa"p$esuan&i&a&i(e$0 in MSGMS "'de

aislamiento y caracterizacion de enzimas

Documents