akr1b10阻害剤の創製 - jst...2.9 3.4 trp112 trp21 val301 his111 2.9 3.0 3.1 gln303 tyr49 trp220...
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耐性克服効果を併せ持つ抗がん剤開発を指向したAKR1B10阻害剤の創製
岐阜薬科大学生命薬学大講座 生化学研究室助教 遠藤 智史
健康・医療新技術説明会2017@JST東京本部別館 (2017.10.03)
非小細胞肺癌に対する薬物治療
Satoshi Endo, PhD, Gifu Pharmaceutical University
非小細胞肺癌
扁平上皮癌非扁平上皮癌
EGFR遺伝子変異陽性/
ALK遺伝子変異陽性EGFR遺伝子変異陰性/
ALK遺伝子変異陰性
白金併用療法EGFR-TKI/ALK阻害剤または白金併用療法
白金併用療法またはEGFR-TKI/ALK阻害剤
ドセタキセル、ゲムシタビン、ベメトレキセド、ニボルマブ等
ドセタキセル、ゲムシタビン、ベメトレキセド、ニボルマブ等
ドセタキセル、ゲムシタビン、ベメトレキセド、ニボルマブ等
1次治療
2次治療
3次治療以降
非小細胞肺癌治療薬の耐性化
➢ EGFR-TKI耐性:ほとんどの症例で治療開始から数か月~1年程度で耐性化し再燃する。
Kobayashi et al., NEJM 352:786, 2005
Engelman et al., Science 316:1039, 2007
Yano et al., Cancer res 68:9479, 2008
➢ ALK阻害剤耐性:Crizotinibで8~10か月、Alectinibで28か月程度で耐性化する。
• ALK融合遺伝子の増幅、ALKキナーゼ領域の遺伝子変異、C-Kitの増幅やEGFR活性化などが原因とされる。
Satoshi Endo, PhD, Gifu Pharmaceutical University
非小細胞肺癌治療薬の耐性化
➢ EGFR-TKI耐性:ほとんどの症例で治療開始から数か月~1年程度で耐性化し再燃する。
Kobayashi et al., NEJM 352:786, 2005
Engelman et al., Science 316:1039, 2007
Yano et al., Cancer res 68:9479, 2008
➢ ALK阻害剤耐性:Crizotinibで8~10か月、Alectinibで28か月程度で耐性化する。
• ALK融合遺伝子の増幅、ALKキナーゼ領域の遺伝子変異、C-Kitの増幅やEGFR活性化などが原因とされる。
Satoshi Endo, PhD, Gifu Pharmaceutical University
【目的】
1. 癌治療における新規治療薬の開発
2. 抗癌剤耐性化の克服を可能にする新薬の開発
Aldo-keto reductase (AKR) 1B10
AKRスーパーファミリーに属するNADPH依存性還元酵素●
正常組織では主にヒトの腸や副腎に分布するが、肝癌や肺癌など多くの癌種で高発現する●
Aldose reductase (AR) と71%のアミノ酸配列相同性を示し、基質特異性も類似する●
Cancer References
Upregulation HepatocarcinomaJ Hepatol 2010,
Biochim Biophys Acta 2008
Non-small cell lung cancer
(NSCLC)Clin Cancer Res 2005,
Cancer Res 2007
Uterus cancer Int J Gynecol Cancer 2007
Oral cancer Toxicol Lett 2006
Esophageal cancer J Proteome Res 2008
Gastric cancer Eur J Surg Oncol 2014
Breast cancer Int J Cancer 2012
Pancreatic cancer Mod Pathol 2012
Downregulation Prostate cancer Front Pharmacol 2012
Colon cancer Mol Biol (Mosk) 2012
Satoshi Endo, PhD, Gifu Pharmaceutical University
Aldo-keto reductase (AKR) 1B10
AKRスーパーファミリーに属するNADPH依存性還元酵素●
正常組織では主にヒトの腸や副腎に分布するが、肝癌や肺癌など多くの癌種で高発現する●
Aldose reductase (AR) と71%のアミノ酸配列相同性を示し、基質特異性も類似する●
レチノイン酸ホメオスタシスの調節
レチノイン酸 レチナール レチノール
AKR1B10↑↑
癌細胞の
・分化抑制≒増殖亢進
分化
イソプレノイド代謝
イソプレニルアルデヒド
イソプレニルアルコール
AKR1B10↑↑イソプレニルカルボン酸
イソプレニルピロリン酸
Rasなどの低分子量Gタンパクの活性化
癌細胞の
・増殖亢進アポトーシス
癌細胞に“特徴的”な増殖能の阻害
AKR1B10
阻害剤
【癌における役割】
Satoshi Endo, PhD, Gifu Pharmaceutical University
Aldo-keto reductase (AKR) 1B10
AKRスーパーファミリーに属するNADPH依存性還元酵素●
正常組織では主にヒトの腸や副腎に分布するが、肝癌や肺癌など多くの癌種で高発現する●
Aldose reductase (AR) と71%のアミノ酸配列相同性を示し、基質特異性も類似する●
【癌における役割】
反応性アルデヒドの解毒還元
異常増殖 抗癌剤投与
細胞障害性の
”反応性アルデヒド”の生成(4-ヒドロキシノネナール、アクロレインなど)
低毒性のアルコール体
癌細胞の
・生存能の亢進・抗がん剤感受性低下
AKR1B10↑↑
AKR1B10
阻害剤
癌細胞の生存戦略の破綻
AKR1B10阻害剤は増殖抑制効果と抗癌剤耐性克服効果を併せ持つ新規抗癌剤になると期待される
Satoshi Endo, PhD, Gifu Pharmaceutical University
AKR1B10阻害剤の想定される用途
Satoshi Endo, PhD, Gifu Pharmaceutical University
• AKR1B10が高発現する癌に対する抗癌剤
• 既存薬との併用によって、作用増強および耐性化抑制効果を示すアジュバンド薬
• 既存薬に対して抵抗性を獲得した癌細胞に対する抗癌剤耐性克服薬
• 研究試薬としてのAKR1B10特異的阻害剤
これまでに発表されたAKR1B10阻害剤
Non-selective AKR1B10 inhibitors
Selective AKR1B10 inhibitors
Tolrestat
IC50 for 1B10 = 54 nM
IC50 for AR = 10 nM
Gallego et al., PNAS, 2007
Isolithocholic acid
IC50 for 1B10 = 27 nM
IC50 for AR = 6,900 nM
Endo et al., ABB, 2009
Chromene derivative 1
IC50 for 1B10 = 6.0 nM
IC50 for AR = 11 nM
Endo et al., BMC, 2010
Bisdemethoxycurcumin
IC50 for 1B10 = 60 nM
IC50 for AR = 5,100 nM
Matsunaga et al., BMC, 2009
Oleanolic acid
IC50 for 1B10 = 90 nM
IC50 for AR = 124,000 nM
Takemura et al., JNP, 2011
HAHE
IC50 for 1B10 = 6.2 nM
IC50 for AR = 4900 nM
Soda et al., EJMC, 2012
Chromene derivative 5n
IC50 for 1B10 = 4.7 nM
IC50 for AR = 24 nMEndo et al., BMC, 2013
Polyhydroxy steroid 6
IC50 for 1B10 = 830 nM
IC50 for AR > 100,000 nM
Chen et al., Steroids, 2016
MK204
IC50 for 1B10 = 80 nM
IC50 for AR = 21,700 nM
Cousido-Siah et al., ACS CB, 2016
260-fold
1400-fold
790-fold85-fold
>120-fold 270-fold
Satoshi Endo, PhD, Gifu Pharmaceutical University
新規AKR1B10阻害剤の設計及び評価
Non-selective AKR1B10 inhibitors
Selective AKR1B10 inhibitors
Chromene derivative 1
IC50 for 1B10 = 6.0 nM
IC50 for AR = 11 nM
HAHE
IC50 for 1B10 = 6.2 nM
IC50 for AR = 4900 nM
Chromene derivative 5n
IC50 for 1B10 = 4.7 nM
IC50 for AR = 24 nM
790-fold
Bisdemethoxycurcumin
IC50 for 1B10 = 60 nM
IC50 for AR = 5,100 nM
85-fold
既存のAKR1B10阻害剤の構造を参考に
新たに誘導体を設計
Chromene derivative KO101
IC50 for 1B10 = 7.5 nM
IC50 for AR = 15 nM
アルキル鎖の延長によって選択性の向上は見られなかった。。。
Satoshi Endo, PhD, Gifu Pharmaceutical University
Non-selective AKR1B10 inhibitors
Selective AKR1B10 inhibitors
Chromene derivative 1
IC50 for 1B10 = 6.0 nM
IC50 for AR = 11 nM
HAHE
IC50 for 1B10 = 6.2 nM
IC50 for AR = 4900 nM
Chromene derivative 5n
IC50 for 1B10 = 4.7 nM
IC50 for AR = 24 nM
790-fold
Bisdemethoxycurcumin
IC50 for 1B10 = 60 nM
IC50 for AR = 5,100 nM
85-fold
Chromene derivative KO104
IC50 for 1B10 = 8.3 nM
IC50 for AR = 180 nM
メトキシフェニル基の除去によって、阻害活性は維持されたまま、選択性が22倍にまで上昇した!
新規AKR1B10阻害剤の設計及び評価
Satoshi Endo, PhD, Gifu Pharmaceutical University
InhibitorStructure
of R1
IC50 (nM) or
% inhibitionRatio
1B10 AR AR/1B10
KO104 3-hydroxy 8.3 ± 1.4 180 ± 1 22
KO102 4-hydroxy 4.2 ± 0.2 204 ± 4 49
KO105 2-hydroxy 6.4 ± 0.4 220 ± 19 34
KO110 4-methoxy 11.3 ± 0.9 390 ± 40 35
KO114 3-fluoro 6.0 ± 1.4 340 ± 420 57
KO112 4-fluoro 3.5 ± 0.1 277 ± 17 79
KO115 2-fluoro 7.7 ± 0.2 210 ± 13 27
KO116 3,4-difluoro 7.7 ± 1.1 310 ± 21 40
KO117 3,5-difluoro 7.8 ± 0.3 320 ± 49 41
KO118 3-methyl 7.0 ± 0.6 200 ± 14 29
23
4
5
新規AKR1B10阻害剤の設計及び評価
Satoshi Endo, PhD, Gifu Pharmaceutical University
ドッキングモデルの比較
HAHE Bisdemethoxycurcumin
Chromene derivative 5n KO102
Gln303
Trp220
Tyr49
Cys299
Phe123
Val301
Ser304
Phe116
Gln114
His111
NADP+
2.9
3.4
Trp112
Trp220
Trp21
Val301
Ser304Gln114
His111
NADP+2.9
3.13.0
Gln303
Trp220Tyr49
His111
NADP+
2.9
2.9
Trp21
Val48
Gln50
Trp220Tyr49
His111
3.0
Trp21
3.4
2.8
Trp80
Leu302
Phe116
Val301
Phe123
Pro124Lys125
Ala131Ile132
Selectivity pocketSelectivity pocket
Satoshi Endo, PhD, Gifu Pharmaceutical University
IC50 for 1B10 = 6.2 nM
IC50 for AR = 4900 nM
IC50 for 1B10 = 60 nM
IC50 for AR = 5,100 nM
IC50 for 1B10 = 4.7 nM
IC50 for AR = 24 nM
790-fold 85-fold
5-fold
NADP+
ドッキングモデルの比較
HAHE Bisdemethoxycurcumin
KO102
Gln303
Trp220
Tyr49
Cys299
Phe123
Val301
Ser304
Phe116
Gln114
His111
NADP+
2.9
3.4
Trp112
Trp220
Trp21
Val301
Ser304Gln114
His111
NADP+2.9
3.13.0
Gln303
Trp220Tyr49
NADP+
2.9
2.9
Trp21
Val48
Gln50
Selectivity pocketSelectivity pocket
Satoshi Endo, PhD, Gifu Pharmaceutical University
IC50 for 1B10 = 6.2 nM
IC50 for AR = 4900 nM
IC50 for 1B10 = 60 nM
IC50 for AR = 5,100 nM
790-fold 85-fold
Trp220Tyr49
His111
3.0
Trp21
3.4
2.8
Trp80
Leu302
Phe116
Val301
Phe123
Pro124Lys125
Ala131Ile132
NADP+
49-fold
肺癌A549細胞の遊走能に及ぼす影響
24 h
0 h
DMSO KO102 KO112
0
20
40
60
80
100
120
- KO102 KO112
Rela
tive m
igra
tio
n(%
)
(*p < 0.05 without inhibitors)
* *
Inhibitor
【Wound-healing assay】イソプレニルアルデヒド
イソプレニルアルコール
AKR1B10↑↑
イソプレニルピロリン酸
Rasなどの低分子量Gタンパクの活性化
癌細胞の
遊走能亢進
MAPK活性化
MMP発現亢進
AKR1B10Vector
MMP9
MMP2
Measurement
of distance
Incubation
for 24 h
Incubation
with inhibitors
for 24 h
6 well plate
(90% confluent cells)10 μL tip
Morikawa et al., Chem Biol Interact, 2015
Satoshi Endo, PhD, Gifu Pharmaceutical University
肺癌A549細胞の増殖能に及ぼす影響
(*p < 0.05 with A549 cells)
(#p < 0.05 with Vehicle in A549/1B10 cells)
0
5
10
15
20
25
30
35
0 48 96
Cells
(x 1
04)
Culture (h)
*
#
0
5
10
15
20
25
30
35
0 48 96
Culture (h)
Cells
(x 1
04)
A549/1B10 cells
10 μM KO102
20 μM KO102
A549 cells
VehicleA549/1B10 cells
10 μM KO112
20 μM KO112
A549 cells
Vehicle
AKR1B10
Cell counts
Incubation with inhibitors
for 48 or 96 h
48 well plate
(2× 104 cells)
*
#
Satoshi Endo, PhD, Gifu Pharmaceutical University
マウス尾静脈肺転移モデルにおける転移能に及ぼす影響
Vehicle
KO102 (20 µM)
KO112 (20 µM)
5 mice/group
A549-Luc cells
24 hr ivImaging
4 days
(*p < 0.05 from Vehicle)
Satoshi Endo, PhD, Gifu Pharmaceutical University
103 104
Radiance
(photon/sec/cm2/sr)
Luminescence
(x104, photon/sec)
0 2 4 6
KO102
KO112
Control
*
*KO102
KO112
Control
非小細胞肺癌のシスプラチン耐性
Satoshi Endo, PhD, Gifu Pharmaceutical University
シスプラチン (CDDP)
• 単独での非小細胞肺癌の奏効率は約20%と高くないが、骨髄抑制の副作用が起こりにくいため、他の抗癌剤との併用で用いられる。
• 耐性獲得しやすい。
想定されているCDDP耐性機構
• 細胞内に移行した薬剤の排出機構を強化する (MDR1などのABCトランスポー
ター)
• 細胞内に入った薬物を無毒化する機構を増強する (チオレドキシン、グルタチオン-
S-トランスフェラーゼなどの抗酸化酵素)※AKR1B10などのAKR酵素もこれに該当
• 核酸の修復機構を強化する (DNAトポイソメラーゼ、RNA結合タンパク質YB-1など)
抗癌剤耐性細胞におけるAKR1B10発現亢進
Cell Anticancer Drug Reference
Colon cancer
HT29Oxaliplatin
Mitomycin C
Front. Pharmacol. 2012
Anticancer Drugs 2011
Breast cancer
MCF-7Doxorubicin
Doxorubicin/Idarubicin
BMC Cancer 2012
PLoS One 2017
Stomach
cancer MNK45Doxorubicin
Cisplatin
Chem. Biol. Interact. 2015
Chem. Biol. Interact. 2016
Lung cancer
A549Cisplatin Free Radic. Res. 2014
Prostate cancer
Du145Docetaxel Free Radic. Res. 2016
Satoshi Endo, PhD, Gifu Pharmaceutical University
0
20
40
60
80
100
120 40 μM CDDP
A549 A549/CDDP
Inhibitor - - - 10 20 40 - 10 20 40
KO102 KO112
Via
bilit
y (
%)
**
*
*
(#p < 0.05 from A549 cells with 40 μM CDDP)
μM
CDDP耐性細胞におけるCDDP感受性の回復
(*p < 0.05 from A549/CDDP cells without inhibitors)
WST-1 assay
Incubation with 40 μM CDDP
and inhibitors for 24 h96 well plate
(2× 104 cells)
Satoshi Endo, PhD, Gifu Pharmaceutical University
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 48 96
A549
A549/CDDP
0
50
100
150
200
250
300
Via
ble
cells
(x10
4)
Culture (h)
Via
ble
cells
(%)
Inhibitor - - 10 20 10 20
KO102 KO112
(*p < 0.05 from A549/CDDP cells without inhibitors)
μM
A549 A549/CDDP
* *
低濃度CDDP暴露時の細胞増殖に及ぼす影響
Cell counts
Incubation with 0.5 μM CDDP
and inhibitors for 48 or 96 h48 well plate
(2× 104 cells)
Satoshi Endo, PhD, Gifu Pharmaceutical University
Metastatic potential
Invasive potential
Inhibitor - 10 20 10 20
KO102 KO112
μM
(*p < 0.05 from A549/CDDP cells without inhibitors)
Meta
stati
c an
d in
vasi
ve
po
ten
tial (%
)
シスプラチン耐性A549細胞の転移能、浸潤能に及ぼす影響
Polycarbonatemembrane(8-μm pore)
A549/CDDP cells(1 x 104 cells)
Type I
collagen
Polycarbonatemembrane(8-μm pore)
A549/CDDP cells(1 x 104 cells)
【Boyden Chamber assay】
Invasive potential
Metastatic potential
Satoshi Endo, PhD, Gifu Pharmaceutical University
0
20
40
60
80
100
120
****
***
AKR1B10が関与する抗癌剤耐性化機序
Satoshi Endo, PhD, Gifu Pharmaceutical University
・癌細胞の生存・抗癌剤耐性能の亢進
酸化ストレス
抗癌剤暴露
AKR
1B10
毒性化合物(反応性アルデヒド)
アポトーシス
akr1b10
癌 細 胞 に お け るAKR1B10の高発現は『癌の生存戦略』だと考えられる。
AKR1B10阻害剤の想定される用途
Satoshi Endo, PhD, Gifu Pharmaceutical University
• AKR1B10が高発現する癌に対する抗癌剤
• 既存薬との併用によって、作用増強および耐性化抑制効果を示すアジュバンド薬
• 既存薬に対して抵抗性を獲得した癌細胞に対する抗癌剤耐性克服薬
• 研究試薬としてのAKR1B10特異的阻害剤フナコシ株式会社と販売契約締結(用途:研究試薬)
Conclusion
これまでに見出したAKR1B10阻害剤の構造をもとに、現時点で最も強力で、かつ選択性も向上した新規AKR1B10阻害剤KO102とKO112の創製に成功した。
新規AKR1B10阻害剤は肺癌A549細胞の遊走能や増殖能を抑制し、ラット尾静脈肺転移モデルにおいても転移抑制効果を示した。
新規AKR1B10阻害剤はシスプラチン耐性肺癌A549細胞のシスプラチン感受性を回復させ、耐性化に伴って亢進した転移能や浸潤能を有意に抑制した。
⇒新規AKR1B10阻害剤は肺癌細胞増殖抑制効果に加えて、抗癌剤耐性抑制効果を併せ持つ新しいタイプの抗癌剤になると期待される。
Satoshi Endo, PhD, Gifu Pharmaceutical University
本技術に関する知的財産権
Satoshi Endo, PhD, Gifu Pharmaceutical University
• 発明の名称 :2-オキソ-2H-クロメン-3-
カルボン酸アミド誘導体
• 出願番号 :特願2016-159316
• 出願人 :国立大学法人富山大学, 岐阜市
• 発明者 :遠藤智史, 豊岡尚樹, 早川芳弘,
松永俊之, 五十里彰
お問い合わせ先
Satoshi Endo, PhD, Gifu Pharmaceutical University
岐阜薬科大学
◎生命薬学大講座生化学研究室 遠藤智史
TEL 058-230-8100 (内線3669)
FAX 058-230-8105
e-mail sendo@gifu-pu.ac.jp
◎事務局庶務会計課 近藤直樹
TEL 058-230-8100
FAX 058-230-8200
e-mail syomuk@gifu-pu.ac.jp