aktivitas ekstrak etanol daun gaharu (aquillaria microcarpa baill.) terhadap tes toleransi glukosa...
TRANSCRIPT
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
1/125
i
i
AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquil lari a microcarpa
Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL, GLIKOGEN
HATI DAN HISTOPATOLOGI PANKREAS TIKUS PUTIH YANG
DIINDUKSI ALOKSAN
SKRIPSI
untuk memenuhi persyaratandalam menyelesaikan program sarjana Strata – 1 Farmasi
Oleh :
Ranty Rirung Andrunganyan
NIM. J1E111030
PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS LAMBUNG MANGKURAT
BANJARBARU
AGUSTUS 2015
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
2/125
ii
ii
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
3/125
iii
iii
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
4/125
iv
iv
ABSTRAK
AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU ( Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL, GLIKOGEN HATI
DAN HISTOPATOLOGI PANKREAS TIKUS PUTIH YANG DIINDUKSI
ALOKSAN
(Ranty Rirung Andrunganyan; Pembimbing : Nurlely, Fadlilaturrahmah; 2015; 68
halaman)
Daun gaharu ( Aquilaria microcarpa Baill.) secara empiris digunakan sebagai
penurun kadar glukosa darah. Penelitian ini bertujuan mengetahui pengaruh
pemberian ekstrak etanol daun gaharu (EEDG) terhadap penurunan kadar glukosa
darah pada tes toleransi glukosa oral (TTGO), peningkatan glikogen hati dan peningkatan jumlah pulau langerhans tikus yang dibuat diabetes serta menentukan
dosis efektif dari EEDG. Penelitian menggunakan 24 ekor tikus jantan galur Wistar,
dibagi menjadi 6 kelompok yaitu kelompok kontrol normal, kontrol negatif, kontrol
positif (glibenklamid 5 mg/kgBB), serta kelompok EEDG dengan dosis 50, 100 dan
200 mg/kgBB. Semua kelompok kecuali kelompok normal diinduksi aloksan 150
mg/kgBB, sedangkan kelompok normal diinduksi NaCl 0,9%. Hari ke-3 setelah
induksi diperiksa kadar glukosa darah pada hewan uji. Perlakuan dilakukan selama
28 hari setelah pemeriksaan gula darah paska induksi. Hari ke-23 seluruh kelompok
dilakukan TTGO dengan memberikan glukosa 2 g/kgBB. Hari ke-28 dilakukan
pengambilan organ pankreas dan hati melalui pembedahan. Organ hati dianalisis
dengan spektrofotometri UV-Vis untuk melihat kadar glikogennya dan pada organ pankreas dihitung jumlah pulau langerhans. Hasil penelitian menunjukkan EEDG
mampu menurunkan kadar glukosa darah pada TTGO, meningkatkan kadar glikogen
hati, dan meningkatkan jumlah pulau Langerhans. Oleh karena itu dapat dinyatakan
bahwa dosis EEDG yang efektif adalah 50 mg/kgBB.
Kata kunci : Aquilaria microcarpa Baill., Aloksan, TTGO, Glikogen hati, Jumlah
Pulau Langerhans.
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
5/125
v
v
ABSTRACT
THE ACTIVITY OF ETHANOL EXTRACT OF AGARWOOD LEAF (Aquilariamicrocarpa Baill.) TO ORAL GLUCOSE TOLERANCE TEST, LIVER GLYCOGEN
AND PANCREAS HISTOPHATOLOGY OF WHITE MICE INDUCTED WITH
ALLOXAN
(Ranty Rirung Andrunganyan; Advisors: Nurlely, Fadlilaturrahmah; 2015; 68
pages)
Agarwood leaves (Aquilaria microcarpa Baill.) empirically used as a reducer of
blood glucose level. This study aimed to identify the effect of ethanol extract of
agarwood leaf (EEAL) giving to the reducing of blood glucose level on tolerance test
of oral glucose, the increasing of liver glycogen, as will as number of islet of the pancreas diabetic rats and to determine the effective dose of EEAL. This study used
24 male Wistar mice, divided into 6 groups: normal control, negative control,
positive control (glibenclamide 5 mg/kgBB), group of EEAL (doses of 50, 100, and
200 mg/kgBB). All groups except normal group induced with alloxan 150 mg / kg,
while the normal group induced with 0.9% NaCl. The third day after the induction
blood glucose level was examined in the tested animals. Treatment was carried out
during the 28 days after the post-induction checks of blood glucose. On the twenty-
third day the entire group performed oral glucose tolerance test by giving glucose 2
g / kg. On the twenty-eighth day it was done the taking of pancreas and liver organ
through surgery. The liver was analyzed with UV-Vis spectrophotometry to see its
glycogen level and in pancreas organ it was calculated the number of islet of the
pancreas. The study result showed that EEAL was able to reduce blood glucose level
on oral glucose tolerance test, increase glycogen level of liver, and increase number
of islet of the pancreas. Therefore, it can be stated that the effective dose of EEAL is
50 mg/kgBB.
Keywords: Aquilaria microcarpa Baill. , alloxan, OGTT, Liver glycogen, Number of
islet
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
6/125
vi
vi
PRAKATA
Puji dan syukur tidak henti-hentinya penulis panjatkan kehadirat Tuhan Yang
Maha Esa atas segala anugrah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian
yang berjudul “Aktivitas Ekstrak Etanol Daun Gaharu ( Aquillaria microcarpa Baill.)
Terhadap Tes Toleransi Glukosa Oral, Glikogen Hati dan Histopatologi Pankreas
Tikus Putih yang Diinduksi Aloksan”.
Penulis dalam kesempatan ini mengucapkan terima kasih atas segala bantuan
dan dukungan kepada:
1. Kedua orangtua yang tidak henti-hentinya memberikan nasehat, motivasi,dukungan moril dan materil baik dalam proses perkuliahan ataupun dalam proses
penyelesaian skripsi.
2. Ibu Nurlely, S. Farm., M.Sc (Pharm)., Apt. selaku dosen pembimbing utama dan
Ibu Fadlilaturrahmah, S. Farm., M.Sc., Apt. selaku dosen pembimbing
pendamping yang telah banyak memberikan bimbingan, nasehat dan motivasi
selama penulisan proposal hingga skripsi.
3. Ibu Difa Intannia, S.Farm., M.Farm-Klin., Apt., Ibu Destria Indah Sari, M.Farm.,
Apt dan Bapak Muhammad Ikhwan Rizki, S.Farm, M.Sc., Apt., selaku tim
penguji. Terima kasih atas kritik, saran dan masukan yang telah diberikan selama
penulisan proposal hingga skripsi.
4. Ibu Nani Kartinah, S.Farm., M.Sc., Apt selaku dosen pembimbing akademik
yang telah banyak memberikan bimbingan, nasehat dan motivasi selama proses
perkuliahan yang sudah dijalani.
5. Dwi Juni Saputra yang selalu mendampingi, memberi semangat dan motivasi
selama proses penyelesaian skripsi.
6. Teman-teman angkatan 2011, khususnya Cha-cha, Nada, Nisa, Tiara, Windi dan
Yuni yang mendukung, menemani selama perkuliahan dan proses penyelesaian
skripsi.
7. Semua pihak yang tidak bisa disebutkan satu persatu baik secara langsung
maupun tidak langsung ikut membantu jalannya penyusunan skripsi ini. Penulis
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
7/125
vii
vii
menyadari masih banyak kekurangan dalam penulisan skripsi ini, namun penulis
berharap semoga skripsi ini dapat berguna bagi perkembangan ilmu pengetahuan.
Banjarbaru, Agustus 2015
Penulis
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
8/125
viii
viii
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL .................................................................................
LEMBAR PENGESAHAN .......................................................................
PERNYATAAN ........................................................................................
ABSTRAK ................................................................................................
ABSTRACT ..............................................................................................
PRAKATA ................................................................................................
DAFTAR ISI .............................................................................................
DAFTAR TABEL .....................................................................................
DAFTAR GRAFIK ...................................................................................
DAFTAR LAMPIRAN .............................................................................
BAB I. PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang .............................................................................
1.2. Perumusan Masalah ......................................................................
1.3. Tujuan Penelitian ..........................................................................1.4. Manfaat Penelitian ........................................................................
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Gaharu ...........................................................................................
2.1.1 Morfologi .............................................................................
2.1.2 Kandungan Kimia ................................................................
2.1.3 Kegunaan Tumbuhan Gaharu ..............................................
2.2 Diabetes Melitus ............................................................................
2.3 Ekstraksi ........................................................................................
2.4 Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ...................................................
2.5 Spektro UV-Vis .............................................................................
2.6 Aloksan ..........................................................................................
2.7 Parameter .......................................................................................
i
ii
iii
iv
v
vi
viii
xi
xii
xiii
1
1
2
33
4
4
4
5
5
5
9
10
11
12
13
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
9/125
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
10/125
x
x
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Pengolahan Elstrak ........................................................................
4.1.1 Penyiapan Bahan untuk Ekstraksi ........................................
4.1.2 Ekstraksi ...............................................................................
4.2 Uji Kandungan Senyawa pada Ekstrak ..........................................
4.2.1 Pengujian Skrining Fitokimia ...............................................
4.2.2 Analisis Kualitatif Senyawa Ekstrak Etanol Daun Gaharu
dengan Kromatografi Lapis Tipis .........................................
4.3 Perlakuan Hewan Uji .....................................................................
4.3.1 Uji Pendahuluan Dosis Aloksan ...........................................
4.3.2 Uji Pendahuluan Dosis Pemberian Ekstrak Daun Gaharu ...
4.3.3 Pengujian Aktivitas ..............................................................
4.3.4 Tes Toleransi Glukosa Oral ...............................................
4.5.5 Glikogen Hati .......................................................................
4.3.6 Histopatologi Pankreas .........................................................
BAB V. PENUTUP
5.1 Kesimpulan ................................................................................
5.2 Saran ..........................................................................................
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
28
28
28
29
30
30
36
38
38
39
40
41
47
52
58
58
58
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
11/125
xi
xi
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
1. Penggolongan Obat Hipoglikemik Oral ...............................................
2. Perlakuan Orientasi Dosis Aloksan ......................................................
3. Perlakuan Orientasi Dosis Pemberian ekstrak Gaharu .........................
4. Hasil Pengujian Skrining Fitokimia Ekstrak Etanol Daun Gaharu ......
5. Hasil Analisis Kualitatif Senyawa Ekstrak Etanol Daun Gaharudengan Kromatografi Lapis Tipis Dengan Reaksi Penyemprot ...........
6. Hasil Uji Pendahuluan Dosis Aloksan .................................................
7. Uji Pendahuluan Dosis Pemberian Ekstrak Daun Gaharu ...................
8
21
22
31
36
38
49
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
12/125
xii
xii
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1. Tumbuhan Gaharu ( Aquilaria microcarpa Baill.) ................................
2. Perbedaan Diabetes melitus tipe I dan Tipe II ......................................
3. Struktur Aloksan ...................................................................................
4. Preparat Pankreas .................................................................................
5. Skema Pengujian Aktivitas Antidiabetes .............................................
6. Reaksi Uji Mayer ..................................................................................
7. Reaksi Uji Dragendorff ........................................................................
8. Reaksi Terpenoid dengan Pereaksi Lieberman-Burchard ....................
9. Reaksi Tanin dan Gelatin .....................................................................
10. Reaksi Flavonoid dengan NaOH ..........................................................
11. Reaksi Fenol dengan FeCl3 ..................................................................
12. Reaksi Antara Polifenol dengan Pereaksi FeCl3 ...................................
13. Grafik Tes Toleransi Glukosa Oral .......................................................
14. Grafik Rata-rata Total AUC Tiap Kelompok Perlakuan ......................
15. Grafik pembacaan panjang gelombang Larutan Standar ( Bovine liver glycogen) yang Direaksikan dengan PHESUL (Phenol dan Asam
Sulfat Pekat) ..........................................................................................
16. Grafik Kurva Operating Time Larutan Standar ( Bovine liver glycogen) yang Direaksikan dengan PHESUL (Phenol dan Asam
Sulfat Pekat) .........................................................................................
17. Grafik Kurva Standar ( Bovine liver glycogen) yang Direaksikandengan PHESUL (Phenol dan Asam Sulfat Pekat) ..............................
18. Grafik Rata-rata Kadar Glikogen Hati pada Tiap Kelompok
perlakuan ...............................................................................................
19. Grafik Rata-rata Jumlah pulau langerhans pada Tiap Kelompok
perlakuan ...............................................................................................
20. Gambar preparat pankreas masing-masing kelompok ........................
4
7
12
14
23
32
32
33
34
35
36
38
43
45
48
49
50
51
54
57
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
13/125
xiii
xiii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran
1. Surat determinasi
2. Form Ethical clearance
3. Sertifikat aloksan
4. Sertifikat hewan uji
5. Proses ekstraksi daun gaharu
6. Perhitungan rendemen ekstrak etanol daun gaharu
7. Hasil pegujian skrining fitokimia ekstrak etanol daun gaharu
8. Hasil analisi kualitatif senyawa ekstrak daun gaharu dengan kromatografi
lapis tipis dengan reaksi penyemprot
9. Hasil orientasi dosis aloksan
10. Hasil orientasi dosis ekstrak
11. Pembuatan larutan pnginduksi
12. Pembuatan larutan stok ektrak kering daun gaharu 13. Skema pengujian aktivitas antidiabet
14. Dokumentasi uji aktivitas antidiabet
15. Pengamatan kadar glkosa darah pada TTGO
16. Hasil rata-rata ± SEM kadar glukosa daah pada TTGO
17. Persentase kadar glukosa darah pada TTGO
18. Hasil persentase rata-rata ± SEM kadar glukosa daah pada TTGO
19. AUC tiap kelompok
20. Hasil AUC total (rata-rata ± SEM) tiap kelompok
21. Contoh Perhitugan persentase kadar glukosa darah
22. Analisis statistik data rata-rata AUC total pada TTGO
23. Hasil uj post hoc LSD kadar glukosa darah TTGO pada tiap kelompok
perlakuan
24. Dokumentasi pembacaan glikogen hati
25. Hasil absorbansi pembacaan panjang gelombang
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
14/125
xiv
xiv
26. Hasil absorbansi operating time
27. Hasil absorbansi penetapan kurva standar
28. Hasil uji regresi kurva standar
29. Hasil absorbansi sampel hati tikus
30. Hasil kadar glikogen tikus (μ/mg) Mean ± SEM setiap kelompok
31. Contoh perhitungan penetapan kadar glikogen hati
32. Analisis statistik data kadar glikogen hati
33. Hasil uji Mann-Whitney kadar glikogen hati terhadap tiap kelompok
perlakuan
34. Dokumentasi pembuatan preparat pankreas
35. Hasil pembacaan jumlah pulau langerhas
36. Hasil pembacaan jumlah pulau langehans (Mean ± SEM) pada setiap
kelompok
37. Analisis statistik data jumlah pulau langerhans pada pankreas
38. Hasil uji Mann-Whitney jumlah pulau langerhans terhadap tiap kelompok
perlak
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
15/125
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Diabetes melitus didefinisikan sebagai suatu penyakit kelainan metabolik
kronis secara serius yang memiliki dampak signifikan terhadap kesehatan yang
ditandai dengan tingginya kadar gula dalam darah. Diabetes melitus dapat
disebabkan karena menurunnya hormon insulin yang diproduksi oleh sel beta pada
pulau Langerhans dalam kelenjar pankreas (Reinauer et al. 2002). Berdasarkan data
dari International Diabetes Federation (IDF) Diabetes Atlas, Indonesia termasuk
dalam daftar 10 negara dengan penderita diabetes terbanyak. Di Indonesia pada
tahun 2013 ada sebanyak 8,5 juta penduduk yang mengalami diabetes dan
diperkirakan pada tahun 2035 akan terjadi peningkatan jumlah penderita diabetes
menjadi 14,1 juta penduduk Indonesia (IDF, 2013). Terapi diabetes melitus dapat
dilakukan dengan terapi tanpa obat berupa diet, olahraga teratur dan penurunan berat
badan merupakan komponen penting dari pengobatan diabetes melitus. Apabila
penatalaksanaan terapi tanpa obat (pengaturan diet dan olahraga) belum berhasilmengendalikan kadar glukosa darah penderita, maka perlu dilakukan langkah
berikutnya berupa penatalaksanaan terapi dengan obat, baik dalam bentuk terapi obat
hipoglikemik oral, terapi insulin, atau kombinasi keduanya (Depkes RI, 2005).
Penggunaan obat herbal sebagai terapi alternatif beberapa penyakit semakin
berkembang luas dan populer. Salah satu tanaman yang dapat dimanfaatkan sebagai
terapi alternatif untuk penurun kadar glukosa dalam darah adalah daun gaharu. Daun
tanaman gaharu ( Aquilaria microcarpa Baill.) secara empiris digunakan sebagai
penurun kadar glukosa darah oleh masyarakat Tamiang Layang, dimana daun gaharu
tersebut diseduh dengan air hangat dan diminum. Dari hasil penelitian Prankhon et al
(2011) daun gaharu dengan spesies berbeda yaitu Aquilaria sinensis berpotensi
sebagai agen antidiabetes, dimana dapat menurunkan kadar glukosa darah puasa dan
meningkatkan penyerapan glukosa di jaringan adiposa. Berdasarkan penelitian yang
dilakukan oleh Mega & Swastini (2010) ekstrak metanol daun gaharu mengandung
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
16/125
2
2
senyawa metabolit sekunder flavonoid, terpenoid dan senyawa fenol.
Flavonoid merupakan agen antidiabetes yang bekerja dengan cara meningkatkan
pemanfaatan glukosa pada jaringan perifer, menstimulasi sel beta pankreas untuk
meningkatkan sekresi insulin dan bertindak sebagai inhibitor glukosidase (Jadhav &
Puchchakayala, 2012). Flavonoid sebagai salah satu kelompok senyawa fenolik yang
banyak terdapat pada jaringan tanaman dapat berperan sebagai antioksidan, dimana
berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Gomathi et al (2013) bahwa antioksidan
yang terdapat dalam ekstrak Evolvulus alsinoides L. dapat membantu regenerasi dari
pankreas pada tikus yang mengalami diabetes.
Pengujian aktivitas penurun glukosa darah dapat diamati dari beberapa
parameter yaitu kadar glukosa pada tes toleransi glukosa oral, glikogen hati dan
histopatologi pankreas. Parameter ini diambil karena menggambarkan proses
pengendalian kadar glukosa dalam darah. Pengamatan pada histopatologi pankreas
dilakukan dengan menghitung jumlah pulau Langerhans, dimana menurut Adeyemi
et al (2010) kerusakan pada pankreas menyebabkan penurunan jumlah pulau
Langerhans yang mengakibatkan penurunan sekresi insulin dan meningkatnya kadar
glukosa dalam darah. Kadar glukosa pada tes toleransi glukosa oral digunakan untukmengukur kemampuan tubuh dalam menggunakan gula jenis glukosa yang
merupakan sumber utama energi tubuh (Islam et al , 2009). Kadar glikogen dalam
hati digunakan untuk melihat penggunaan glukosa pada jaringan, dimana apabila
kadar glukosa darah meningkat (hiperglikemik) maka glukosa akan diubah dan
disimpan sebagai glikogen atau lemak. Glikogenesis (produksi glikogen) akan
menurunkan kadar glukosa darah dan proses ini distimulasi oleh insulin yang
disekresi oleh pankreas (James et al , 2002).
1.2. Rumusan Masalah
Masalah yang timbul berkaitan dengan judul penelitian ini dan menarik untuk
dipecahkan antara lain:
(1) Apakah ekstrak etanol daun gaharu memiliki aktivitas terhadap penurunan
kadar glukosa pada tes toleransi glukosa oral, peningkatan kadar glikogen
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
17/125
3
3
hati dan peningkatan jumlah pulau Langerhans pada histopatologi dari
pankreas tikus putih jantan yang diinduksi aloksan?
(2) Berapa besar dosis pemberian ekstrak etanol daun gaharu yang dapat
menurunkan kadar glukosa pada tes toleransi glukosa oral, meningkatkan
kadar glikogen hati dan meningkatkan jumlah pulau Langerhans pada
histopatologi dari pankreas tikus putih jantan yang diinduksi aloksan?
1.3. Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan sebagai berikut:
(1) Membuktikan aktivitas ekstrak etanol daun gaharu terhadap penurunan kadar
glukosa pada tes toleransi glukosa oral, peningkatan kadar glikogen hati dan
peningkatan jumlah pulau Langerhans pada histopatologi dari pankreas tikus
putih jantan yang diinduksi aloksan.
(2) Menentukan dosis pemberian ekstrak etanol daun gaharu yang dapat
menurunkan kadar glukosa pada tes toleransi glukosa oral, meningkatkan
kadar glikogen hati dan meningkatkan jumlah pulau Langerhans pada
histopatologi dari pankreas tikus putih jantan yang diinduksi aloksan.
1.4. Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat menambah data penelitian dalam usaha
pemanfaatan tumbuhan gaharu sebagai salah satu bahan alam untuk penurun kadar
glukosa darah pada manusia.
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
18/125
4
4
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Gaharu
3.5.1 Morfologi
Daun, bunga dan buah tanaman gaharu mempunyai ciri yaitu; daun lonjong
memanjang dengan panjang 5 – 8 cm, lebar 3 – 4 cm, berujung runcing, dan berwarna
hijau mengkilat. Bunga berada di ujung ranting atau ketiak atas dan bawah daun.
Buah berada dalam polong berbentuk bulat telur atau lonjong, berukuran panjang
sekitar 5 cm dan lebar 3 cm (Sumarna, 2002). Tumbuhan gaharu dapat dilihat pada
gambar 1. Menurut Tarigan (2004) secara taksonomi tanaman gaharu dapat
diklasifikasikan sebagai berikut :
Kingdom : Plantae
Divisio : Spermatophyta
Subdivisi : Angiospermae
Kelas : Dicotyledonae
Sub kelas : Dialypetale
Ordo : MyrtalesBangsa : Thymeleaceae
Genus : Aquilaria
Species : Aquilaria microcarpa Baill.
(a) (b)
Gambar 1. Tumbuhan Gaharu ( Aquilaria microcarpa Baill.) (a) batang pohon; (b) daun
(koleksi pribadi)
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
19/125
5
5
2.1.2 Kandungan Kimia
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh Mega & Swastini (2010)
menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun gaharu (Gyrinops versteegii)
mengandung metabolit sekunder seperti senyawa fenol, flavonoid dan terpenoid
Ketiga senyawa metabolit sekunder tersebut diketahui mempunyai sifat sebagai
senyawa antioksidan atau sebagai agen antikanker. Menurut hasil penelitian yang
telah dilakukan Santosa et al (2013) yang menyatakan bahwa golongan senyawa dari
ekstrak metanol daun gaharu mengandung senyawa triterpen yang mempunyai gugus
fungsi seperti -OH, CH alifatik, C=O, dan C=C alifatik .
2.1.3 Kegunaan Tumbuhan Gaharu
Gaharu mempunyai banyak khasiat seperti anti asmatik, obat sakit perut,
kanker, hepatitis, sirosis dan sebagainya (Santosa et al , 2013). Secara tradisional
tanaman gaharu dipergunakan sebagai obat : penghilang stress, gangguan ginjal,
hepatitis, sirosis, pembengkakan hati dan ginjal, bahan antibiotik untuk TBC,
reumatik, kanker, malaria dan tukak lambung, anti asmatik, antimikroba, stimulant
kerja syaraf, sakit perut, afrodisiak , penghilang rasa sakit, diare, ginjal, tumor dan
paru-paru (Mega & Swastini, 2010).
2.2 Diabetes Melitus
Kata diabetes berasal dari bahasa Yunani yang memiliki arti mengalir,
sedangkan melitus berasal dari bahasa latin yang berarti madu atau manis (Fitriani,
2011). Diabetes melitus (DM) merupakan suatu kelainan metabolik kronis serius
yang memiliki dampak signifikan terhadap kesehatan seseorang atau suatu kondisi
konsentrasi glukosa dalam darah secara kronis lebih tinggi daripada nilai normal
(hiperglikemia) akibat tubuh kekurangan insulin atau fungsi insulin tidak efektif.
(Subroto, 2006). Setelah makan makanan tinggi karbohidrat, kadar glukosa darah
meningkat dari kadar puasa sekitar 80-100 mg/dL ke kadar sekitar 120-140 mg/dL
dalam periode 30 menit sampai 1 jam. Konsentrasi glukosa darah kemudian mulai
menurun kembali ke kadar puasa dalam waktu sekitar 2 jam setelah makan (Marks et
al , 2000). Gejala tipikal yang sering dirasakan penderita diabetes antara lain poliuria
(sering buang air kecil), polidipsia (sering haus), dan polifagia (banyak makan atau
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
20/125
6
6
mudah lapar), penglihatan kabur, koordinasi gerak anggota tubuh terganggu,
kesemutan pada tangan atau kaki, timbul gatal-gatal yang seringkali sangat
mengganggu (pruritus), dan berat badan menurun tanpa sebab yang jelas (Depkes
RI, 2005). Penyakit diabetes melitus dapat disebabkan oleh beberapa faktor
diantaranya pola makan, obesitas, faktor genetik, bahan kimia dan obat-obatan, serta
infeksi pada pankreas (Wijayakusuma, 2004).
Menurut Subroto (2006) klasifikasi diabetes melitus adalah sebagai berikut:
(1) Diabetes melitus Tipe I (Diabetes Melitus tergantung Insulin)
Tipe ini disebabkan oleh kerusakan sel beta pankreas sehingga kekurangan
insulin absolut. Faktor keturunan juga merupakan salah satu penyebab. Penderita
Diabetes melitus Tipe I tergantung pada terapi insulin dan tidak dianjurkan
mengonsumsi obat antidiabetik oral. Penderita Diabetes melitus Tipe I tidak dapat
disembuhkan dan tergantung pada injeksi insulin selama hidupnya.
(2) Diabetes melitus Tipe II (Diabetes Melitus tidak tergantung Insulin)
Tipe ini disebabkan oleh gangguan sekresi insulin yang progresif karena
resistensi insulin. Diabetes melitus Tipe II dipicu oleh pola hidup yang kurang sehat.
(3) Diabetes Melitus KehamilanDiabetes tipe ini hanya diderita oleh wanita selama kehamilannya dan
umumnya akan kembali normal sesudah hamil. Walaupun demikian, beberapa kasus
yang tidak terkontrol dapat berkembang lebih lanjut pasca-kelahiran. Penanganan
yang kurang baik terhadap penderita akan berakibat buruk pada janin seperti
kelainan bawaan, gangguan pernapasan pada bayi bahkan kematian janin.
(4) Diabetes melitus tipe lain
Diabetes tipe ini disebabkan oleh keadaan atau sindrom tertentu seperti
penyakit pankreas, penyakit hormonal, keadaan yang disebabkan oleh obat atau zat
kimia, gangguan reseptor insulin, dan sindrom genetik tertentu.
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
21/125
7
7
Gambar 2. Perbedaan Diabetes melitus tipe I dan Tipe II (Baradero et al , 2005)
Reaksi biokimia dalam tubuh selalu berubah untuk mengatur dan
mempertahankan nilai kadar glukosa darah. Tujuan mengatur metabolisme
karbohidrat adalah untuk mempertahankan homeostatis dan mengubah reaksi
biokimia sesuai yang dibutuhkan oleh tubuh (Gropper et al , 2005). Kadar glukosa
darah dipertahankan melalui dua reaksi utama, yaitu penambahan glukosa dari
simpanan glukosa hati dan mengambil kelebihan glukosa untuk dibawa ke hati dan
otot (Sizer & Whitney, 2006). Menurut Almatsier (2001) ada beberapa hormon yang
berhubungan dengan pengaturan kadar glukosa darah, yaitu :
(1) Hormon insulin
Hormon ini dihasilkan oleh sel-sel beta pulau Langerhans pankreas. Hormon
ini berfungsi menurunkan kadar glukosa darah. Mekanisme penurunan kadar glukosa
darah oleh insulin meliputi peningkatan laju penggunaan glukosa melalui oksidasi,
glikogenesis, dan lipogenesis. Efek lain yang ditimbulkan insulin adalah peningkatan
difusi fasilitatif glukosa kedalam sel-sel otot dan sel lemak. Pengeluaran insulin
dirangsang oleh hormon glukagon dan hormon-hormon saluran cerna.
(2) Hormon glukagon
Hormon ini diproduksi oleh sel alfa pulau Langerhans pankreas dan
mempunyai sifat kebalikan dari hormon insulin. Glukagon meningkatkan glukosa
darah melalui peningkatan glikogenolisis dan glukoneogenesis.
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
22/125
8
8
(3) Hormon epinefrin
Hormon ini diproduksi oleh medula kelenjar adrenal dan mempunyai efek
menaikan kadar glukosa darah melalui peningkatan glikogenolisis dan menurunkan
pengeluaran insulin dari pankreas.
(4) Hormon Glukokortikoid
Hormon ini diproduksi korteks adrenal yang berfungsi untuk menaikkan
glukosa darah dengan merangsang glukoneogenesis.
(5) Hormon Tiroksin
Peningkatan produksi hormon ini akan meningkatkan laju absorbsi heksosa
dari usus kecil, glikogenolisis dan glukoneogenesis dalam hati.
(6) Hormon pertumbuhan
Hormon ini meningkatkan pengambilan asam amino dan sintesis protein oleh
semua sel sehingga menurunkan pengambilan glukosa sel dan meningkatkan
mobilisasi lemak untuk energi.
Berdasarkan Depkes RI (2005) penggolongan obat hipoglikemik oral dapat
dilihat pada tabel 1.
Tabel 1. Penggolongan Obat Hipoglikemik OralPenggolongan Obat Hipoglikemik Oral
Golongan Contoh Senyawa Mekanisme Kerja
Sulfonilurea Gliburida atau Glibenklamida
Glipizida
Glikazida
Glimepirida
Glikuidon
Merangsang sekresi insulin di kelenjar
pankreas, sehingga hanya efektif pada
penderita diabetes yang sel-sel β
pankreasnya masih berfungsi dengan baik.
Meglitinida Repaglinid Merangsang sekresi insulin di
kelenjar pankreas.
Turunan
fenilalanin
Nateglinid Meningkatkan kecepatan sintesis insulin
oleh pankreas.
Biguanida Metformin Bekerja langsung pada hati (hepar),
menurunkan produksi glukosa hati. Tidak
merangsang sekresi insulin oleh kelenjar
pankreas.
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
23/125
9
9
Lanjutan tabel 1. Penggolongan Obat Hipoglikemik Oral
Penggolongan Obat Hipoglikemik Oral
Golongan Contoh Senyawa Mekanisme Kerja
Tiazolidindion Rosiglitazon
Troglitazon
Pioglitazon
Meningkatkan kepekaan tubuh
terhadap insulin. Berikatan dengan PPARγ
( Peroxisome Proliferator Activated
Receptor-gamma) di otot, jaringan lemak,
dan hati untuk menurunkan resistensi
insulin
Inhibitor α-
glukosidase
Acarbose
Miglitol
Menghambat kerja enzim-enzim pencenaan
yang mencerna karbohidrat, sehingga
memperlambat absorpsi glukosa ke dalam
darah.
2.3 Ekstraksi
Ekstraksi adalah proses penarikan komponen/zat aktif suatu simplisia dengan
menggunakan pelarut tertentu. Prinsip ekstraksi adalah melarutkan senyawa polar
dalam pelarut polar dan senyawa non polar dalam pelarut non polar (Robinson,
1995). Parameter dasar yang mempengaruhi kualitas ekstrak
yaitu, bagian tanaman yang digunakan sebagai bahan awal, pelarut yang digunakan
untuk ekstraksi dan prosedur ekstraksi. Variasi dalam metode ekstraksi yang
berbeda yang akan mempengaruhi komposisi kuantitas dan metabolit sekunder dari
ekstrak tergantung pada jenis ekstraksi, waktu ekstraksi, suhu, sifat pelarut,
konsentrasi pelarut dan polaritas (Pandey & Tripathi, 2014).
Berdasarkan Depkes RI (2000), ekstraksi dengan menggunakan pelarut dapat
dilakukan dengan beberapa cara yaitu :
(1) Cara dingin
a. Maserasi
Maserasi adalah proses penyarian simplisia dengan menggunakan pelarut
dengan beberapa kali pengadukan pada temperatur ruangan.
b. Perkolasi
Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut sampai sempurna (exhaustive
extraction) yang umumnya dilakukan pada temperatur ruangan. Proses
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
24/125
10
10
terdiri dari tahapan pengembangan bahan, tahap maserasi antara, tahap
perkolasi sebenarnya (penetesan atau penampungan ekstrak).
(2) Cara Panas
a. Refluks
Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya,
selama waktu tertentu dan jumlah pelarut yang relatif konstan dengan adanya
pendingin balik.
b. Soxhlet
Soxhlet adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang umumnya dilakukan
dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinu dengan jumlah pelarut
relatif konstan dengan adanya pendingin balik.
c. Infus
Infus adalah sediaan cair yang dibuat dengan menyari simplisia nabati
dengan air pada suhu 90°C selama 15 menit.
2.4 Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi lapis tipis didasarkan pada distribusi fase cair-padat. Sebagai
fase diam atau absorbennya berupa lapisan tipis alumina atau silika gel yang
menempel pada permukaan kaca plastik, sedangkan sebagai fase gerak adalah eluen
yang digunakan untuk membawa zat yang dianalisis bergerak melalui fase diam
padat. Fase diam harus mempunyai sifat tidak larut dalam fase gerak maupun dalam
komponen sampel. Fase diam dalam KLT yang biasa digunakan sebagai pelapis plat
adalah silika gel (siO2), selulosa, alumina (Al2O3) dan kieselgur (tanah diatom)
(Gritter et al , 1991). Prinsip KLT adalah adanya adsorbsi dan partisi, yang
ditentukan oleh fase diam (adsorben) dan fase gerak (eluen). Komponen kimia akan
bergerak naik mengikuti fase gerak karena daya serap adsorben terhadap komponen-
komponen kimia tidak sama sehingga komponen kimia dapat bergerak dengan
kecepatan yang berbeda berdasarkan tingkat kepolarannya. Hal inilah yang
menyebabkan terjadinya pemisahan (Gandjar & Rohman, 2007). Pelarut sebagai fase
gerak atau eluen merupakan faktor yang menentukan gerakan komponen-komponen
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
25/125
11
11
dalam campuran. Pemilihan pelarut tergantung pada sifat kelarutan komponen
tersebut terhadap pelarut yang digunakan (Sastrohamidjojo, 1992).
2.5 Spektroskopi UV-Vis
Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari
spektrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan
panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas yang
ditransmisikan atau yang diabsorpsi. Jadi spektrofotometer digunakan untuk
mengukur energi cahaya secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan,
direflaksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang. Kelebihanspektrofotometer dibandingkan fotometer adalah panjang gelombang sinar dapat
lebih terseleksi. Hal ini karena sebelumnya sinar diurai dengan alat pengurai seperti
prisma, kisi (grating) ataupun celah optik. Pada fotometer, sinar dengan panjang
gelombang yang diinginkan diperoleh dengan menggunakan filter dari berbagai
warna, yang mempunyai spesifikasi panjang gelombang tertentu. Pada fotometer
filter, tidak mungkin diperoleh panjang gelombang yang benar-benar monokromatis,
melainkan suatu trayek dengan panjang gelombang 30-40 nm. Sedangkan pada
spektrofotometer panjang gelombang yang benar-benar terseleksi dapat diperoleh
dengan bantuan alat pengurai cahaya seperti prisma. Suatu spektrofotometer tersusun
dari sumber spektrum sinar tampak yang sinambung, dan monokromatis. Sel
pengabsorbsi untuk mengukur perbedaan absorbsi antara cuplikan dengan blanko
ataupun pembanding (Prasetyo, 2006).
Prinsip dasar spektrofotometri UV-Vis adalah analisis yang didasarkan pada
pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu laju larutan berwarna pada
panjang gelombang spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi
difraksi dengan detector fototube (Setiono & Avriliana, 2013). Metode
spektrofotometri UV-Vis banyak diterapkan untuk penetapan senyawa-senyawa
organik yang umumnya dipergunakan untuk penentuan senyawa dalam jumlah yang
sangat kecil. Analisis ini berdasarkan interaksi antara radiasi elektromagnetik ultra
violet dekat (190-380 nm) dan sinar tampak (380-780 nm) dengan memakai
instrumen spektrofotometer dengan suatu materi (senyawa). Metode ini berdasarkan
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
26/125
12
12
penyerapan sinar ultraviolet maupun sinar tampak yang menyebabkan terjadinya
transisi elektron (perpindahan elektron dari tingkat energi yang rendah ketingkat
energi yang lebih tinggi) (Octaviani et al , 2014).
2.6 Aloksan
Gambar 3. Struktur Aloksan (Szkudelski, 2001)
Aloksan merupakan diabetogenik bila diberikan secara intravena,
intraperitoneal atau subkutan. Dosis aloksan diperlukan untuk menginduksi diabetes
tergantung pada spesies hewan, rute pemberian dan status gizi. Dosis (intravena)
aloksan yang paling sering digunakan untuk menginduksi diabetes pada tikus adalah
65 mg/kgBB, k etika aloksan diberikan secara intraperitoneal atau subkutan dosis
efektif harus 2-3 kali lebih tinggi (Szkudelski, 2001). Pemberian aloksan
menyebabkan nekrosa spesifik pada pulau-pulau Langerhans, memiliki efek
sitotoksik pada sel beta pankreas. Saat sel beta dirusak oleh aloksan, sekresi insulin
pun menurun mengakibatkan tubuh tidak dapat menggunakan glukosa. Glukosa
terakumulasi dalam darah (hiperglikemia) hal itu disebut kondisi diabetes. Keadaan
ini ditunjukan oleh meningkatnya kadar glukosa darah tikus kontrol positif. Aloksan
dalam darah berikatan dengan GLUT-2 (Glucose Transport ) yang memfasilitasi
masuknya aloksan ke dalam sitoplasma sel beta pankreas (Wibawa et al , 2013).
Aloksan dapat meningkatkan konsentrasi ion kalsium bebas sitosolik pada sel
β Langerhans pankreas. Efek tersebut diikuti oleh beberapa kejadian yaitu influks
kalsium dari cairan ekstraseluler, mobilisasi kalsium dari simpanannya secara
berlebihan, dan eliminasinya yang terbatas dari sitoplasma. Influks kalsium akibat
aloksan tersebut mengakibatkan depolarisasi sel β Langerhans, lebih lanjut membuka
kanal kalsium tergantung voltase dan semakin menambah masuknya ion kalsium ke
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
27/125
13
13
sel. Pada kondisi tersebut, konsentrasi insulin meningkat sangat cepat, dan secara
signifikan mengakibatkan gangguan pada sensitivitas insulin perifer dalam waktu
singkat. Selain kedua faktor tersebut di atas, aloksan juga diduga berperan dalam
penghambatan glukokinase dalam proses metabolisme energi (Szkudelski, 2001).
2.7 Parameter
2.7.1 Pengukuran Tes Toleransi Glukosa Oral (TTGO)
Tes toleransi glukosa oral (TTGO) digunakan untuk mengukur kemampuan
tubuh dalam menggunakan gula jenis glukosa, yang merupakan sumber utama energi
tubuh (Islam et al , 2009). Hasil TTGO dapat dipengaruhi oleh masuknya karbohidratdan durasi puasa sebelum dilakukan tes. TTGO biasanya dijadwalkan pada pagi hari
dan berlangsung selama 2 jam (Phillips, 2012). Tes ini dianggap sebagai tes yang
paling fisiologis, karena melalui rute oral. Glukosa yang masuk kedalam saluran
cerna akan diserap pada saluran usus dan masuk sirkulasi splanknik setelah itu
menuju ke sirkulasi sistemik. Konsentrasi glukosa darah yang meningkat akan
merangsang sel beta pankreas untuk melepaskan insulin, yang akan merangsang
penyerapan glukosa oleh jaringan perifer (Pacini et al , 2013).
2.7.2 Glikogen dalam Hati
Insulin dan glukagon mengatur metabolisme glikogen hati dengan mengubah
status fosforilasi glikogen dalam jalur degradatif dan glikogen sintase dalam jalur
biosintetik. Glikogen hati merupakan cadangan pertama untuk menunjang kadar
glukosa darah, dan defisiensi glikogen fosforilase atau enzim lain pada jalur
degradasi glikogen hati (Marks et al , 2000). Kelebihan glukosa akan disimpan
sebagai glikogen pada manusia dan hewan. Sekitar sepertiga cadangan glikogen
tubuh terdapat pada hati dan dua pertiga pada otot. Hati berperan penting dalam
mempertahankan kadar glukosa darah. Jika kadar glukosa darah meningkat
(hiperglikemik) maka glukosa akan diubah dan disimpan sebagai glikogen atau
lemak. Glikogenesis (produksi glikogen) akan menurunkan kadar glukosa darah dan
proses ini distimulasi oleh insulin yang disekresi oleh pankreas (James et al , 2002).
Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Suarsana et al (2010), dimana
penurunan aktivitas enzim yang terlibat dalam sintesis glikogen pada keadaan
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
28/125
14
14
diabetes berhubungan dengan resistensi insulin pada berbagai jaringan. Peningkatan
kadar glikogen hati dan otot diduga melalui mekanisme stimulasi sel beta pankreas
meningkatkan sekresi insulin.
2.7.3 Histopatologi Pankreas
Pankreas adalah kelenjar lunak kekuningan dengan panjang 12-15 cm yang
terletak di bawah kulvatura mayor lambung. Pada bagian endokrin sel pankreas
terdiri dari kelompok sel khusus yang disebut pulau Langerhans yang tersebar di
seluruh pankreas. Di dalam pulau ini terdapat sel alfa yang mengeluarkan hormon
glukagon dan sel beta yang mengeluarkan hormon insulin. Glukagon dan insulin
adalah hormon utama yang berperan dalam mengatur glukosa darah (Brooker, 2009).
Kerusakan pada pankreas menyebabkan penurunan jumlah pulau Langerhans yang
mengakibatkan penurunan sekresi insulin dan meningkatnya kadar glukosa dalam
darah (Adeyemi et al , 2010). Pemeriksaan pankreas pada seorang pasien diabetes
secara histologik mengungkapkan adanya hialinasi atau fibrosis dari pulau
Langerhans, dengan destruksi sebagian besar sel beta nya (Bloom & Fawcett, 2002).
Berdasarkan penelitian Kumar et al (2011) histologi pankreas tikus yang
normal, mengalami diabetes serta setelah pemberian ekstrak Dillenia indica dapat
dilihat seperti gambar di bawah ini:
Gambar 4. (A) kontrol normal (B) Kontrol Diabetes (C) DIME ( Dillenia indicamethanolic leaves) 500 mg / kg (Kumar et al, 2011).
Histologi pankreas (Gambar 3) menunjukkan asinus normal (panah merah) dan
normal seluler di pulau Langerhans (panah kuning) di pankreas pada kontrol normal
(A). Pada hewan kontrol diabetes terjadi kerusakan yang luas untuk pulau
Langerhans dan mengurangi dimensi pulau diamati pada tikus diabetes (B). Pada
hewan yang diberikan DIME 500 mg / kg terlihat ukuran populasi sel pulau
kembalinya menjadi normal (C).
A
B
C
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
29/125
15
15
2.8 Hipotesis
Hipotesis untuk penelitian ini yaitu ekstrak etanol daun gaharu dapat
memberikan pengaruh terhadap penurunan kadar glukosa pada tes toleransi glukosa
oral, peningkatan kadar glikogen hati dan peningkatan jumlah pulau Langerhans
pada histopatologi dari pankreas tikus putih jantan yang diinduksi aloksan.
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
30/125
16
16
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Jenis Penelitian
Jenis penelitian yang dilakukan yaitu penelitian eksperimental dengan
menggunakan rancangan acak lengkap (RAL). Penelitian ini untuk membuktikan
aktivitas ekstrak etanol daun gaharu terhadap penurunan kadar gula darah pada tes
toleransi glukosa oral, peningkatan kadar glikogen hati dan peningkatan jumlah
pulau Langerhans pada histopatologi pankreas pada tikus putih jantan galur wistar
yang diinduksi aloksan.
3.2 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini akan dilaksanakan selama bulan Januari – Juli 2015 di
Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Laboratorium Farmakologi-Toksikologi,
Laboratorium Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas
Lambung Mangkurat Banjarbaru.
3.3 Alat dan Bahan
3.3.1 Alat
Alat yang digunakan adalah alat pemotong daun, timbangan gram kasar,
blender, ayakan, perkolator, waterbath (Smic®), vacum rotary ovaporator
(Heidolph®), hot plate (Stuart CB 302®), neraca analitik (IND GF-3000®),
desikator, sendok tanduk, penjepit kayu, pipa kapiler, rak tabung reaksi, magnetic
stirrer , chamber , alat-alat kaca (Pyrex®), spuit injeksi (Onemed®), timbangan tikus
(Precise®), sonde oral, baskom besar, kandang tikus, glukometer (GlucoDr ®), plat
silika GF254, chamber , spektrofotometer UV-Vis, sentrifuge (Clements GS 150®),
lampu UV 254 nm dan 366 nm, oven (Vinco Inc®), lemari pendingin, mikroskop
(Olympus CX21®), alat bedah ( Pinset, Gunting dan skapel), mortir dan stamper,
flotation bath (Civilab®) kaca objek, kaca penutup, corong kaca (Pyrex®), pipet
tetes, pipet volume (Pyrex®), spektrofotometer UV-Vis, vortex mixer (Jeio Tech®),
dan Mikrotom (Microtec®).
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
31/125
17
17
3.3.2 Bahan
Bahan yang digunakan daun gaharu, akuades, etanol 70% (Biomed®), FeCl3
1% (teknis) , FeCl3 10% (teknis), kloroform (teknis), ammonia (teknis), H2SO4 (p.a),
pereaksi Meyer (p.a), pereaksi Dragendorff (p.a), pereaksi Leibermen-Buchard (p.a),
NaOH (teknis), HCl encer (teknis), larutan klorida (teknis), larutan timbal asetat
(teknis), gelatin (teknis), silika gel F254, asam asetat glasia (teknis), butanol (teknis),
etil asetat (teknis), n-heksana (teknis), asam formiat (teknis), anisaldehid asam sulfat
(teknis), NaCl 0,9% (Otsuka®), NaCMC 0,5% , KOH 30% (p.a), etanol (95%) (p.a),
glukosa monohidrat (teknis), reagen fenol 5 % (p.a) , standar glikogen (Sigma®),formalin 10% (teknis), paraffin , pewarna hematoxylin-eosin (HE), larutan haupt,
aloksan (C4H2 N2O4) (Sigma®), glibenklamid (Indofarma®), standar pellet, alkohol
96% (Biomed®) , alkohol absolut dan xylol (p.a).
3.4 Hewan Uji
Hewan uji yang digunakan yaitu tikus jantan galur Wistar dengan berat 200-
260 gram berumur 4-6 bulan. Pembagian jumlah tikus untuk pengujian tiap
kelompok (n = 4) dihitung berdasarkan rumus Federer :
(n-1)(t-1) > 15
Keterangan :
t = jumlah kelompok perlakuan
n = jumlah ulangan dari tiap perlakuan
Rumus Federer untuk Metode Induksi Aloksan
(n-1) (t-1) ≥ 15
(n-1) (6-1) ≥ 15
n ≥ 4
berdasarkan perhitungan tersebut, maka jumlah pengulangan yang dilakukan untuk
setiap perlakuan n ≥ 4. Pengulangan yang dibutuhkan pada setiap kelompok
sebanyak 4 kali atau 4 ekor tikus sehingga jumlah total tikus yang digunakan
sebanyak 24 ekor tikus putih.
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
32/125
18
18
3.5 Variabel Penelitian
3.5.1 Variabel BebasVariabel bebas dari penelitian ini adalah dosis pemberian ekstrak etanol daun
gaharu.
3.5.2 Variabel Terikat
Variabel terikat dari penelitian ini adalah kadar glukosa darah pada tes
toleransi glukosa oral, glikogen hati dan jumlah pulau Langerhanss pada
histopatologi pankreas dari tikus putih yang telah diinduksi dengan aloksan.
3.6 Prosedur Penelitian
3.6.1 Pengumpulan Sampel
Sampel daun gaharu diambil dari daerah Tamiang Layang, Kalimantan
Tengah. Pengambilan dilakukan pada bulan Januari 2015 pada pagi hari. Tanaman
gaharu yang digunakan telah berusia diatas 5 tahun (cukup dewasa) agar didapatkan
kandungan senyawa metabolit sekunder yang maksimal.
3.6.2 Pengolahan BahanDaun gaharu yang telah dikumpulkan, dilakukan sortasi basah dan pencucian untuk
memisahkan pengotor dan bagian tanaman lain yang tidak dibutuhkan. Kemudian
dilakukan perajangan agar tanaman mudah dikeringkan. Kemudian dilanjutkan
dengan pengeringan daun gaharu. Pengeringan dilakukan dengan oven suhu 400 C
selama 72 jam hingga diperoleh sampel kering (Ibrahim et al , 2014). Setelah sampel
kering kemudian dilakukan sortasi kering untuk memisahkan bagian tanaman yang
rusak karena pemanasan. Lalu sampel diserbukkan dengan menggunakan blender
hingga terbentuk sampel serbuk dan diayak dengan pengayak no. 30 (Matthew et al ,
2013).
3.6.3 Ekstraksi
Serbuk daun gaharu ditimbang sebanyak 100 gram, kemudian dimasukkan
dalam alat perkolator. Sampel ditambahkan pelarut etanol 70%, kemudian direndam
selama 24 jam (Jamshidi et al , 2014). Kecepatan tetesan alat perkolator diatur 45
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
33/125
19
19
tetes setiap menit dan ditambahkan pelarut secara bertahap. Proses ekstraksi sampel
dengan pelarut etanol 70% menggunakan perbandingan 1,5:10 (Nobre et al , 2005).
Filtrat yang diperoleh dipisahkan dari residu dengan menggunakan kertas Whatman
nomor 1. Ekstrak cair yang diperoleh, dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator
dengan suhu 450 C hingga diperoleh ekstrak kental (Chaisawangwong &
Gritsanapan, 2009).
3.6.4 Uji Kandungan Senyawa Daun Gaharu
3.6.4.1 Pengujian Skrining Fitokimia
a. Senyawa Flavonoid
Ekstrak ditetesi dengan larutan NaOH maka akan terbentuk warna kuning
yang intens, dan apabila ditambahkan asam encer maka warnanya akan menghilang,
menunjukkan adanya flavonoid (Tiwari et al , 2011).
b. Senyawa Alkaloid
Ekstrak dilarutkan dalam HCL encer dan disaring untuk mendapatkan
filtratnya. Filtrat ditetesi dengan reagen Mayer apabila terbentuk endapan berwarna
kuning menunjukkan adanya alkaloid. Filtrat ditetesi dengan reagen Dragendroff
apabila terbentuk endapan merah menunjukkan adanya alkaloid (Tiwari et al , 2011).
c. Senyawa Tanin
Ekstrak ditambahkan dengan larutan gelatin 1% mengandung natrium
klorida, apabila terbentuk endapan putih menunjukkan adanya tanin (Tiwari et al ,
2011).
d. Senyawa Terpenoid
Ekstrak kental daun gaharu ditambahkan pereaksi Leibermen-Buchard, jika
terbentuk cincin coklat maka ekstrak positif mengandung terpenoid (Setyowati et al,
2014).
e. Senyawa Fenolik
Ekstrak ditetesi dengan 3-4 tetes larutan FeCl3 apabila terbentuk warna hitam
kebiruan menunjukkan adanya fenol (Tiwari et al , 2011).
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
34/125
20
20
3.6.4.1 Analisis Kualitatif Senyawa Ekstrak Etanol Daun Gaharu dengan
Kromatografi Lapis Tipis
Fase diam yang digunakan dalam skrining ini adalah Silika gel F254 ukuran
20x20 cm2 yang kemudian dipotong sesuai kebutuhan, sedangkan fase gerak dan
penampak noda yang digunakan sebagai berikut:
a. Senyawa Golongan Flavonoid
Fase Gerak : Butanol – Asam asetat glasial – Air (4 :1:5) Fase gerak ini
biasa disebut BAW (Butanol, Acetic acid, Water ) dan
lapisan atas diambil dan dipakai sebagai fase gerak.
Dengan pereaksi : Uap Amonia (Positif mengandung flavonoid jika timbul
warna kuning atau kuning-coklat setelah pemberian uap
amoniak).
Tanpa pereaksi : Bila tanpa pereaksi kimia, di bawah lampu UV 365 nm,
flavonoid akan berfluoresens biru, kuning atau hijau,
tergantung dari strukturnya.
(Marliana, 2007).
b. Senyawa Golongan Alkaloid
Fase Gerak : Etil asetat – Metanol – Air (6:4:2)
Dengan pereaksi : Pereaksi Dragendorff (Positif mengandung alkaloid jika
timbul warna coklat atau jingga setelah penyemprotan
pereaksi Dragendorff.
(Marliana, 2007).
c. Senyawa Golongan Terpenoid
Fase Gerak : n-heksan – Etil asetat (4:1)
Dengan pereaksi : Anisaldehid Asam Sulfat (Positif mengandung terpenoid
jika timbul warna ungu-merah atau ungu setelah
penyemprotan pereaksi anisaldehid asam sulfat.
(Wagner et al , 1996).
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
35/125
21
21
d. Senyawa Golongan Tanin
Fase Gerak : Air – Metanol – Kloroform (10:35:65)
Dengan pereaksi : FeCl3 1% (Positif mengandung tanin jika timbul warna
biru tua atau hijau kehitaman setelah penyemprotan
pereaksi FeCl3 1%.
(Prameswari & Widjanarko, 2014).
e. Senyawa Golongan Polifenol
Fase gerak : Kloroform - etil asetat - asam formiat (0,5 : 9 : 0,5)
Dengan pereaksi : FeCl3 10% (Positif mengandung polifenol jika timbulwarna hitam setelah penyemprotan pereaksi FeCl3 10%.
(Marliana, 2007).
3.6.5 Uji Pendahuluan Orientasi Dosis Aloksan
Pengujian pendahuluan orientasi dosis aloksan menggunakan hewan uji yang
dibagi menjadi 7 kelompok, dimana perlakuan yang diberikan adalah :
Tabel 2. Perlakuan Orientasi Dosis Aloksan
Hewan Uji Perlakuan Induksi
Normal NaCl 0,9% sebanyak 5 mL/kg BB
Induksi 1 Aloksan dosis 100 mg/kg BB
Induksi 2 Aloksan dosis 120 mg/kg BB
Induksi 3 Aloksan dosis 130 mg/kg BB
Induksi 4 Aloksan dosis 140 mg/kg BB
Induksi 5 Aloksan dosis 150 mg/kg BB
Induksi 6 Aloksan dosis 160 mg/kg BB
Pemberian induksi dilakukan secara intraperitoneal. Kemudian diadaptasi selama 7
hari. Setelah adaptasi, tikus dipuasakan selama 12 jam dengan tetap diberikan air
minum. Kadar glukosa darah puasa ditentukan pada hewan uji. Ditentukan dosis
efektif aloksan yang dapat menyebabkan keadaan hiperglikemia, namun tidak
menyebabkan kematian (Fitriani, 2011).
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
36/125
22
22
3.6.6 Penginduksian Aloksan
Hewan uji sebanyak 30 tikus jantan galur wistar sebelum diberi perlakuan
diadaptasikan selama satu minggu sebelum pengujian, setelah itu hewan uji dibagi
menjadi 6 kelompok, dimana masing-masing kelompok terdiri dari 4 tikus. Sebanyak
5 kelompok dipuasakan selama 12 jam kemudian diinduksi dengan senyawa aloksan
secara intraperitonial. Tikus diadaptasikan selama 1 minggu dengan pemberian
standar pellet dan air yang selalu tersedia. Kadar glukosa darah puasa hewan uji
diukur, jika kadar glukosa antara 470 - 530 mg/dL dilakukan pemberian perlakuan
pada hewan uji (Maniyar et al , 2012).
3.6.7 Uji Pendahuluan Orientasi Dosis Pemberian Ekstrak Daun Gaharu
Hewan uji sebanyak 8 ekor yang telah diinduksi aloksan digunakan untuk uji
pendahuluan orientasi dosis ekstrak daun gaharu. Masing-masing hewan uji
diberikan dosis ekstrak daun gaharu yang berbeda secara oral yaitu:
Tabel 3. Perlakuan Orientasi Dosis Pemberian Ekstrak Daun Gaharu
Hewan uji Perlakuan
Hewan Uji 1
Hewan Uji 2
Glibenklamid 2,5 mg/kg BB
Diberikan ekstrak gaharu 10 mg/ kg BB
Hewan Uji 3 Diberikan ekstrak gaharu 100 mg/ kg BB
Hewan Uji 4 Diberikan ekstrak gaharu 1000 mg/kg BB
Pemberian perlakuan dilakukan selama 7 hari, pada hari ketujuh dilakukan pengukuran
kadar glukosa darah puasa untuk mengetahui dosis yang efektif dalam penurunan
glukosa darah puasa namun tidak menyebabkan keadaan hipoglikemik.
3.6.8 Pengujian AktivitasKelompok uji diberikan ekstrak daun gaharu dengan dosis pemberian yang berbeda.
Pemberian perlakuan dilakukan selama 28 hari (4 minggu), dimana setiap hari
kelompok uji diberikan perlakuan (Kumar et al , 2014). Glibenklamid dan ekstrak
terlebih dahulu disuspensi dengan NaCMC 0,5% sebelum diberikan pada hewan uji.
Perlakuan yang diberikan pada hewan uji sebagai berikut :
Hewan Uji kelompok 1 : NaCMC 0,5% pada kelompok normal
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
37/125
23
23
Dilakukan pemisahan glikogen dari hati
Diukur absorbansinya dengan
spektrofotometer pada panjang
gelombang 490 nm
Diukur kadar glikogen
Hewan Uji kelompok 2 : Glibenklamid 2,5 mg/kgBB pada kontrol positif
Hewan Uji kelompok 3 : NaCMC 0,5% pada kontrol negatif
Hewan Uji kelompok 4 : diberikan ekstrak gaharu dosis 50 mg/kgBB
Hewan Uji kelompok 5 : diberikan ekstrak gaharu dosis 100 mg/kgBB
Hewan Uji kelompok 6 : diberikan ekstrak gaharu dosis 200 mg/kgBB
Tahapan pengujian aktivitas pada penelitian disajikan pada Gambar 5 berikut ini:
\
Diberikan perlakuan dari hari ke 0 – 28 hari
Pada hari yang ke 23 dilakukan tes toleransi
glukosa oral
Pada hari ke-28 diambil organ dalamnya
Diambil preparat pankreas
Dilakukan pewarnaan HE
Diamati di bawah mikroskop
Gambar 5. Skema Pengujian Aktivitas Antidiabetes
Hewan Uji
Tidak Induksi AloksanInduksi Aloksan
Kelompok
Normal
KelompokKontrol
Positif
Kelompok
Kontrol
Negatif
Kelompok Uji Kelompok UjiKelompok Uji
Glibenklamid
2,5 mg/kg BB
NaCMC
0,5%
Ekstrak Daun
Gaharu dosis
50 mg/kgBB
Ekstrak Daun
Gaharu dosis
200 mg/kgBB
Ekstrak Daun
Gaharu dosis100 mg/kgBB
NaCMC 0,5%
Pankreas Hati
Hasil
Hasil
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
38/125
24
24
3.6.9 Pengukuran Tes Toleransi Glukosa Oral (TTGO)
Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Ridwan et al (2012) pengukuran
tes toleransi glukosa oral (TTGO) dilakukan pada hari ke-23 dan dipuasakan selama
± 18 jam. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Kumar et al (2014) tikus
diberi larutan glukosa 2 g/kg BB secara oral 30 menit setelah diberi perlakuan.
Pemberian larutan glukosa dilakukan menggunakan alat sonde. Selanjutnya, setelah
pemberian glukosa kadar glukosa darah diukur dengan menggunakan alat
glukometer, dimana darah diambil pada vena ekor pada masing-masing kelompok
setelah 0, 30, 60, 90, 120, dan 150 menit. kelompok perlakuan sebagai berikut:
Hewan Uji kelompok 1 : NaCMC 0,5% pada kelompok normal
Hewan Uji kelompok 2 : Glibenklamid 2,5 mg/kg BB pada kontrol positif
Hewan Uji kelompok 3 : NaCMC 0,5% pada kontrol negatif
Hewan Uji kelompok 4 : diberikan ekstrak gaharu dosis 50 mg/kgBB
Hewan Uji kelompok 5 : diberikan ekstrak gaharu dosis 100 mg/kgBB
Hewan Uji kelompok 6 : diberikan ekstrak gaharu dosis 200 mg/kgBB
3.6.10 Analisis Kadar Glikogen Dalam Hati
Metode pengukuran menurut Peungvicha et al (1998) dalam Suarsana et al
(2010), dimana sampel sebanyak 1 g organ hati diambil lalu dikeringkan dalam oven
pada suhu 50ºC selama satu malam, dilanjutkan dengan penggerusan sampai menjadi
tepung. Masing-masing sampel diambil 25 mg diekstraksi dengan 1 mL larutan KOH
30% dan diinkubasi dalam penangas air mendidih selama 20 menit, diletakkan pada
suhu ruang sampai dingin. Tambahkan 1,5 mL etanol (95%) dingin ke dalam tabung
sampel dan disimpan dalam suhu 4ºC selama 30 menit. Untuk memisahkan endapan
glikogen dalam sampel dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 2500 rpm selama 20
menit. Menurut Jung et al (2011) masing-masing sampel dan standar ( Bovine liver
glycogen) ditambahkan akuadest 0,2 mL reagen fenol 5 %, dan 1 ml H 2SO4,
kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang
490 nm.
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
39/125
25
25
3.6.11 Histopatologi Pankreas
Menurut penelitian yang dilakukan oleh Yunita (2014) untuk melihat
histologi dari pankreas tikus maka dilakukan langkah-langkah sebagai berikut :
a. Pengambilan Organ Pankreas
Pada akhir perlakuan semua tikus dilakukan pembedahan dengan penyayatan
pada kulit dan otot abdominal hingga rongga perut terbuka. Selanjutnya dilakukan
pengambilan organ pankreas. Pankreas yang telah dipisahkan dari tubuh hewan
dibersihkan dengan larutan NaCl 0,9% lalu difiksasi dengan formalin 10% sampai
tahap pembuatan blok parafin.
b. Pembuatan Preparat Histologi
Pembuatan preparat histopatologi pada organ pankreas dilakukan dengan
prosedur sebagai berikut;
i. Fiksasi
Sediaan organ pankreas direndam dengan formalin 10%.
ii. Dehidrasi
Pankreas yang sudah difiksasi dengan formalin dipindahkan kedalam larutan
alkohol bertingkat (60%, 70%, 80%, 90%, 96%, alkohol absolut) masing-masingselama 2 jam.
iii. Penjernihan
Setelah itu organ dimasukkan ke dalam larutan alkohol absolut yang
dicampur xilol (1:1) selama 10 menit. Kemudian organ dipindahkan ke dalam xilol
murni selama 15 menit.
iv. Penanaman
Organ yang sudah jernih dipindahkan kedalam campuran xilol parafin lunak
(1:1) lalu dimasukan kedalam oven bersuhu 480C selama 30 menit. Setelah itu
dipindahkan kedalam parafin lunak murni lalu dimasukan kembali kedalam oven
480C selama 1 jam. Lalu di pindahkan lagi kedalam parafin keras dan dimasukan
kedalam oven 580C selama 1,5 jam. Setelah itu dilakukan embedding (penanaman
organ blok) dengan ukuran blok 2x1.
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
40/125
26
26
v. Penyayatan
Setelah pembuatan blok selesai diamkan blok parafin sampai keras dan siap
disayat. Setelah itu masing-masing blok disayat dengan ketebalan 4 (empat) mikron
dengan alat mikrotom, lalu lembaran-lembaran atau pita parafin hasil penyayatan
diletakan diatas object glass yang sudah diberi larutan Haupt dan akuades dan dapat
dilakukan pewarnaan.
c. Pewarnaan Hemotoksilin Eosin (HE)
Tahapan yang dilakukan dalam pewarnaan HE dimulai dengan proses
deparafinasi, yaitu penghilangan parafin dengan memasukan preparat kedalam serilarutan xilol III, xilol II, dan xilol I. Proses kemudian dilanjutkan dengan rehidrasi,
yaitu dengan memasukan preparat ke dalam seri larutan alkohol sampai alkohol 70
% secara berurutan. Preparat diwarnai dengan pewarnaan hemotoksilin dilanjutkan
dengan pencucian dalam akuades. Setelah itu preparat diwarnai dengan eosin lalu
preparat dimasukan kedalam alkohol bertingkat mulai alkohol 70% sampai alkohol
absolut setelah itu dilakukan penjernihan dengan xilol murni. Sediaan ditutup dengan
cover glass dan siap untuk dilakukan pengamatan di bawah mikroskop.
d. Pengamatan
Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Masjedir et al (2013) untuk
analisis kuantitatif pada histopatologi pankreas dapat dilakukan dengan menghitung
jumlah pulau Langerhans, dimana perhitungan jumlah pulau Langerhans dilakukan
dengan menggunakan mikroskop dan dilakukan pada sepuluh lapang pandang
dengan perbesaran 100x.
3.7 Analisis Data
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental. Data yang didapat pada
uji Tes Toleransi Glukosa Oral (TTGO), kadar glikogen hati dan histopatologi
pankreas dilakukan pengujian normalitas distribusi data dengan metode Shapiro-
Wilk dan uji homogenitas varians data dengan metode Levene’s Test , jika data
terdistribusi normal dan homogen maka dianalisis secara statistik dengan
menggunakan uji ANOVA pada selang kepercayaan 95% dan jika perlakuan berbeda
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
41/125
27
27
nyata (P< 0,05) dilanjutkan dengan Post-Hoc test LSD. Tetapi jika data tidak
terdistribusi normal maka dilanjutkan dengan Kruskal-Wallis test dan jika perlakuan
berbeda nyata (P< 0,05) dilanjutkan dengan uji Mann-Whitney.
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
42/125
28
28
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Pengolahan Ekstrak
4.1.1 Penyiapan Bahan untuk ekstraksi
Pada penelitian ini bahan uji yang digunakan adalah daun dari tanaman
gaharu ( Aquillaria microcarpa Baill.) yang diperoleh dari daerah Tamiang Layang,
Kecamatan Dusun Timur, Kabupaten Barito Timur, Kalimantan Tengah. Tanaman
yang digunakan diuji determinasi terlebih dahulu untuk memastikan bahwa bahan uji
yang diambil sesuai dengan yang diinginkan. Determinasi tanaman dilakukan di
Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Cibinong, Bogor. Hasil determinasi
dapat dilihat pada lampiran 4 yang menunjukan bahwa tanaman yang digunakan
dalam penelitian ini adalah Aquillaria microcarpa Baill. dengan suku Thymeleaceae.
Daun gaharu dikumpulkan dengan cara dipetik, menurut Salisbury & Rose
(1995) pengambilan daun dilakukan pada daun yang tidak terlalu muda dan tidak
terlalu tua. Daun muda umumnya mempunyai kemampuan fotosintesis yang masih
rendah, sedangkan daun yang sudah tua mulai mengalami kerusakan klorofil yang
ditandai dengan perubahan warna menjadi kuning. Rusaknya klorofil akan
menurunkan kemampuan fotosintesis. Apabila kemampuan fotosintesis menurun
maka metabolit sekunder yang dihasilkan pun akan menurun juga. Selanjutnya
dilakukan sortasi basah pada daun gaharu yang bertujuan untuk memilih daun yang
tidak rusak dan memisahkan dengan senyawa pengotor.
Daun gaharu yang sudah disortasi dicuci dengan air mengalir untuk
menghilangkan kotoran yang menempel. Daun yang sudah bersih tadi dikeringkan,
proses pengeringan pada daun bertujuan untuk menghentikan reaksi enzimatik,
dimana enzim akan menjadi tidak aktif sehingga tidak terjadinya penguraian bahan
kimia (Krisyanella et al , 2012). Proses pengeringan juga bertujuan untuk mengurangi
kadar air di dalam daun yang menyebabkan berkurangnya aktivitas mikroba
sehingga komponen kimia dalam daun tidak akan rusak. Proses pengeringan
dilakukan dengan oven pada suhu 400C, menurut Hernani & Nurdjanah (2009)
pengeringan dilakukan harus sesuai dengan bahan tanaman yang akan dikeringkan.
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
43/125
29
29
Apabila suhu dan metode pengeringan tidak benar maka akan mengurangi kadar zat
berkhasiat dalam sampel. Daun sendiri dapat dikeringkan dengan kisaran suhu 20-
400C dan untuk sampel yang mengandung metabolit sekunder (flavonoid)
dikeringkan dengan oven pada suhu 400C karena suhu oven bersifat stabil sehingga
sampel dapat kering dengan merata. Daun gaharu yang sudah kering dihaluskan
dengan menggunakan blender dan kemudian diayak menggunakan pengayak dengan
nomor mesh 30. Penghalusan daun dilakukan untuk mempermudah proses ekstraksi.
Ukuran partikel yang lebih kecil merupakan ukuran yang ideal untuk proses
ekstraksi. Semakin kecil ukuran partikel, luas permukaan semakin besar dan lebih
mudah melepas komponen bioaktif (Syed & Rizvi, 2010).
4.1.2 Ekstraksi
Metode ekstraksi yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstraksi dingin
dengan perkolasi, proses ekstraksi dapat dilihat pada lampiran 5. Perkolasi
merupakan prosedur yang paling sering digunakan untuk ekstraksi bahan aktif dalam
tingtur dan ekstrak cairan. Sebuah perkolat (sempit, kerucut berbentuk kapal terbuka
di kedua ujungnya) umumnya digunakan. Bahan padat yang dibasahi dengan jumlah
penyari yang tepat dan didiamkan dalam wadah tertutup dengan baik, dimana larutan
penyari ditambahkan untuk membentuk lapisan dangkal di atas sampel dan
campuran dibiarkan dalam perkolator tertutup selama 24 jam. Perkolator dibuka dan
cairan yang terkandung di dalamnya dibiarkan menetes perlahan. Penyari
ditambahkan sesuai dengan yang diperlukan (Pandey & Tripathi, 2014). Keuntungan
dari metode ekstraksi perkolasi ini adalah rendemen yang didapatkan lebih banyak
(Perwita, 2011), serta berdasarkan penelitian oleh Sumitra et al (2012) bahwa
metode ini lebih baik untuk menarik senyawa flavonoid dan fenolik dibandingkan
dekokta dan metode maserasi.
Etanol 70% dapat melarutkan senyawa fitokimia lebih maksimal karena
etanol 70% masih mengandung air yang cukup banyak (30%) yang membantu proses
ekstraksi sehingga sebagian senyawa tersebut ada yang tertarik dalam etanol dan ada
pula yang tertarik ke dalam air. Beberapa senyawa fitokimia seperti alkaloid,
flavonoid, glikosida flavonoid serta klorofil terlarut dalam pelarut polar sehingga
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
44/125
30
30
senyawa yang terlarut dalam pelarut etanol 70% cukup banyak (Sani et al , 2014).
Pelarut etanol 70% digunakan berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Bimakr et
al (2011) bahwa pelarut etanol 70% lebih banyak menyari senyawa flavonoid
(katekin, epikatekin, rutin dan apigenin) dibandingkan dengan etanol 99,5%.
Senyawa flavonoid itu sendiri berperan sebagai antidiabetes dimana mekanismenya
bekerja dengan cara meningkatkan pemanfaatan glukosa pada jaringan perifer,
menstimulasi sel beta pankreas untuk meningkatkan sekresi insulin dan bertindak
sebagai inhibitor glukosidase (Jadhav & Puchakayala, 2012).
Ekstrak yang telah diperoleh kemudian dipekatkan menggunakan rotary
vacum evaporator pada suhu 450C dan dihentikan setelah diperoleh ekstrak yang
hampir kental. Pemekatan dengan rotary vacum evaporator merupakan tehnik
pemekatan ekstrak tanpa merusak senyawa yang diisolasi dari ekstrak karena
rangkaian alat ini menggunakan pompa vacum sehingga di dalam evaporator terjadi
pengurangan tekanan yang menyebabkan pelarut dapat menguap di bawah titik
didihnya (Siadi, 2012). Rendemen adalah perbandingan antara ekstrak yang
diperoleh dengan simplisia awal (Depkes RI, 2000). Rendemen dihitung untuk
mengetahui persentasi bagian yang dapat diekstrak dari bahan mentah (Malangngi etal , 2012). Ekstraksi dengan perkolasi dilakukan sebanyak 4 kali proses ekstraksi, 100
g serbuk dari sampel digunakan pada sekali proses ekstraksi. Dari 400 g serbuk
didapatkan persen rendemen sebesar 9,0295 % (b/b). Sedangkan pada proses
ekstraksi daun gaharu (Gyrinops versteegii) yang dilakukan oleh Mega & Swastini
(2010) dengan menggunakan metode ekstraksi maserasi hanya mendapatkan persen
rendemen sebesar 4%. Hal ini dikarenakan perbedaan proses ekstraksi yang
dilakukan. Besar kecilnya nilai rendemen menunjukan keefektifan proses ekstraksi.
Efektivitas proses ekstraksi dipengaruhi oleh jenis pelarut yang digunakan sebagai
penyari, konsentrasi pelarut, suhu ekstraksi, metode dan waktu ekstraksi (Tiwari et
al , 2011).
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
45/125
31
31
4.2 Uji kandungan Senyawa pada Ekstrak
4.2.1 Pengujian Skrining Fitokimia
Tanaman obat mengandung beberapa senyawa metabolit sekunder,
diantaranya tanin, alkaloid, karbohidrat, terpenoid, sterol dan flavonoid. Senyawa ini
disintesis berlebih oleh organisme hidup melalui metabolisme primer atau sekunder.
Analisis fitokimia yang dilakukan pada ekstrak tanaman untuk mengidentifikasi
adanya konstituen yang dikenal untuk pengobatan serta aktivitas fisiologisnya
(Yadaf & Munin, 2011). Hasil pengujian skrining fitokimia dari ekstrak etanol daun
gaharu ditunjukan pada tabel 4.
Tabel 4. Hasil Pengujian Skreening Fitokimia Ekstrak Etanol Daun Gaharu
No Uji Hasil Ket.
1. avonoid (+) arna larutan kuning intens dan warnanya akan
hilang apabila ditambahkan asam encer
2. kaloid
- reagen Mayer
- reagen Dragendroff
(-)
(-)
rdapat endapan kuning
rdapat endapan coklat kemerahan
3. nin (+) rbentuk endapan putih
4. rpenoid (-) rbentuk cincin coklat
5. nolik (+) arna larutan hitam kebiruan
Prosedur dan hasil skrining fitokimia dapat dilihat pada lampiran 7. Hasil
skrining fitokimia menunjukan bahwa ekstrak etanol daun gaharu positif
mengandung flavonoid, tanin dan fenolik. Menurut hasil penelitian yang dilakukan
oleh Khalil et al (2013) pada tanaman gaharu dengan spesies yang berbeda Aquilaria
malaccensis, hasil skrining fitokimia menunjukan bahwa daun gaharu mengandung
alkaloid, saponin dan senyawa fenolik (flavonoid, terpenoid dan tanin). Sedangkan
pada penelitian yang dilakukan oleh Mega & Swastini (2010) pada tanaman gaharu
(Gyrinops versteegii) dengan spesies yang berbeda juga menunjukan hasil yang
negatif pada skrining fitokimia untuk alkaloid.
Alkaloid adalah senyawa organik yang terdapat dalam tumbuh-tumbuhan,
bersifat basa, dan struktur kimia mempunyai sistem lingkar heterosiklik dengan
nitrogen sebagai hetero atomnya. Unsur-unsur penyusun alkaloid adalah karbon,
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
46/125
32
32
hidrogen, nitrogen dan oksigen (Sumardjo, 2009). Pada identifikasi alkaloid akan
terbentuk endapan pada uji mayer dan dragendorff berarti menandakan positif
mengandung alkaloid. Pada uji alkaloid dengan pereaksi mayer, nitrogen pada
alkaloid akan bereaksi dengan ion logam K + dari kalium tetraiodomerkurat(II)
membentuk kompleks kalium-alkaloid yang mengendap (Setyowati et al , 2014). Uji
alkaloid dengan reagen mayer yang dilakukan pada ekstrak daun gaharu memberikan
hasil negatif, dimana tidak adanya terbentuk endapan. Hal ini terjadi karena komplek
kalium-alkaloid tidak terbentuk. Reaksi dari uji alkaloid dengan reagen mayer dapat
dilihat pada Gambar 6.
HgCl2 + 2KI HgI2 + 2KCl
HgI2 + 2KI k 2 HgI4Kalium tetraiodomerkurat (II)
N
+
N
K
Kalium Alkaloidendapan
+ K 2 HgI4K 2 HgI4
Gambar 6. Reaksi Uji Mayer (Marliana et al , 2005)
Hasil positif alkaloid pada uji dragendorff ditandai dengan terbentuknya
endapan coklat muda sampai kuning. Pada uji alkaloid dengan pereaksi dragendorff,
nitrogen digunakan untuk membentuk ikatan kovalen koordinat dengan K + yang
merupakan ion logam (Marliana et al , 2005). Uji alkaloid dengan reagen dragendorff
yang dilakukan pada ekstrak daun gaharu memberikan hasil negatif, dimana tidak
adanya terbentuk endapan. Hal ini terjadi karena tidak terbentuknya ikatan kovalen
koordinat antara nitrogen dan K +. Reaksi dari uji alkaloid dengan reagen dragendorff
dapat dilihat pada Gambar 7.
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
47/125
33
33
Bi (NO3)3 + 3KI BiI3 + 3KNO3coklat
BiI3 + KI K BiI4kalium tetraiodobismutat
N
+ K BiI4
N
K
+ BiI4
kalium-alkaloid
endapan
Gambar 7. Reaksi Uji Dragendorff (Marliana et al , 2005)
Terpenoid merupakan turunan-turunan terpena atau senyawa-senyawa yang
strukturnya mirip terpena. Molekul terpenoid dapat mengandung gugus karboksil,
hidroksil, formil, atau gugus yang lainnya (Sumardjo, 2009). Identifikasi terpenoid
menggunakan uji Lieberman-Burchard akan memberikan hasil positif jika
terbentuknya cincin coklat pada batas larutan saat ditambahkan dengan H2SO4.
Perubahan warna disebabkan karena terjadinya oksidasi pada golongan senyawa
terpenoid melalui pembentukan ikatan rangkap terkonjugasi. Reaksi ini diawali
dengan proses asetilasi gugus hidroksil menggunakan asam asetat anhidrat. Gugus
asetil yang merupakan gugus pergi yang baik akan lepas. Sehingga terbentuknya
ikatan rangkap. Selanjutnya terjadi pembentukan gugus hidrogen beserta
elektronnya, mengakibatkan ikatan rangkap berpindah. Senyawa ini mengalami
resonansi yang bertindak sebagai elektrofil atau karbokation. Serangan karbokation
menyebabkan adisi elektrofilik, diikuti dengan pelepasan hidrogen beserta
elektronnya dilepas akibatnya senyawa mengalami perpanjangan konjugasi yang
memperlihatkan munculnya cincin coklat (Setyowati et al , 2014). Uji terpenoid
dengan pereaksi Lieberman-Burchard yang dilakukan pada ekstrak daun gaharu
memberikan hasil negatif, dimana tidak adanya terbentuk cincin coklat. Hal ini
terjadi karena tidak terjadinya oksidasi pada golongan senyawa terpenoid melalui
pembentukan ikatan rangkap terkonjugasi sehingga tidak terlihatnya cincin coklat.
Gambar reaksi terpenoid dengan pereaksi Lieberman-Burchard dapat dilihat pada
Gambar 8.
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
48/125
34
34
OH
-HOAc
O
O
H
-HOAc
H
- HA B
+
H
Ac2O H
H
adisi elektrofilik
- H
- H
- H
i
Gambar 8. Reaksi Terpenoid dengan Pereaksi Lieberman-Burchard (Setyowati et
al , 2014)
Tanin merupakan suatu senyawa fenol yang memiliki berat molekul besar
yang terdiri dari gugus hidroksi dan beberapa gugus yang bersangkutan seperti
karboksil untuk membentuk kompleks kuat yang efektif dengan protein dan beberapa
makromolekul. Tanin terdiri dari dua jenis yaitu tanin terkondensasi dan tanin
terhidrolisis. Kedua jenis tanin ini terdapat dalam tumbuhan, tetapi yang paling
dominan terdapat dalam tanaman adalah tanin terkondensasi (Hayati et al , 2010).
Hasil positif pada identifikasi tanin dengan menggunakan larutan gelatin 1% yang
mengandung natrium klorida akan menunjukan terbentuknya endapan putih (Tiwari
et al , 2011). Pada uji tanin yang dilakukan pada ekstrak daun gaharu diperoleh
hasil positif, adanya tanin akan mengendapkan protein pada gelatin. Tanin
bereaksi dengan gelatin membentuk kopolimer mantap yang tidak larut dalam
air. Reaksi ini lebih sensitif dengan penambahan NaCl untuk mempertinggi
penggaraman dari tanin-gelatin (Marliana et al , 2005). Gambar reaksi tanin dan
gelatin dapat dilihat pada Gambar 9.
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
49/125
35
35
OHO
OH
OH
OH
Tanin
+ CH
O
C
O
CH2 NHC
O
N
N
C
O
CH
CH2
CH2
C
O
O
C
O
CH2 NHC
O
CH
CH2
CH2
C
NH2
NH2
NH
NHC
O
NC
O
CH2 NHC
O
CH NH
CH3
Gelatin
CH
O
C
O
CH2 NHC
O
N
N
C
O
CH
CH2
CH2
C
O
O
C
O
CH2 NH
C
O
CH
CH2
CH2
C
NH2
NH2
NH
NC
O
NC
O
CH2 NC
O
CH NH
CH3
HO
O
OH
HO OH
HO
O
OH
HO OH
H
HO
O
OHHO
OH
Gambar 9. Reaksi Tanin dan Gelatin (Sa’adah, 2010)
Golongan flavonoid dapat digambarkan sebagai deretan senyawa C6- C3-C6.
Artinya kerangka karbonnya terdiri atas dua gugus C6 (cincin benzene tersubstitusi)
yang disambungkan oleh rantai alifatik tiga-karbon. Flavonoid mencakup banyak
pigmen yang paling umum dan terdapat pada seluruh dunia tumbuhan mulai dari
fungus sampai angiospermae. Pada tumbuhan tingkat tinggi, flavonoid terdapat baik
dalam bagian vegetatif maupun dalam bunga. Flavonoid terutama berupa senyawa
yang larut dalam air. Bahan aktif tersebut dapat diektraksi dengan etanol 70%
(Yunita et al , 2009). Pada uji flavonoid yang dilakukan pada ekstrak daun gaharu
diperoleh hasil positif, dimana terjadinya perubahan warna larutan menjadi kuning
intensif setelah ditambahkan larutan NaOH dan warna kuning akan menghilang jika
ditambahkan asam encer. Flavonoid yang bereaksi dengan NaOH akan membentuk
senyawa kuinoid sehingga terjadi perubahan warna menjadi kuning. Warna kuning
tersebut disebabkan karena pembentukan struktur kinoid yang mengandung ikatan
rangkap terkonjugasi yang lebih panjang dan planar sehingga dapat berfluorosensi
(Alfian & Susanti, 2012). Gambar reaksi flavonoid dan NaOH dapat dilihat pada
Gambar 10.
-
8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…
50/125
36
36
O
O
OH
NaOH
O
O
O Kinoid
Gambar 10. Reaksi Flavonoid dengan NaOH (Mulyani & Laksana, 2011)
Fenol adalah senyawa dengan gugus OH yang terikat pada cincin aromatik
(Fessenden & Fessenden, 1986). Fenol sederhana berupa zat padat tanpa warna,
mudah teroksidasi dan warnanya berubah menjadi gelap. Bersifat asam lemah karena
adanya gugus hidroksi (OH) sekurangnya satu gugus hidroksi (Robinson, 1995).
Pada uji fenol yang dilakukan pada ekstrak daun gaharu diperoleh hasil positif,
dimana terjadinya perubahan warna larutan menjadi hitam kebiruan setelah
ditambahkan dengan pereaksi FeCl3. Gambar reaksi fenol dengan FeCl3 dapat dilihat
�