aktivitas penghambatan ekstrak sirih … juga mengandung senyawa flavonoid yang diduga dapat...
TRANSCRIPT
AKTIVITAS PENGHAMBATAN EKSTRAK SIRIH MERAH (Piper
crocatum) TERHADAP PEMBENTUKAN MALONDIALDEHIDA
(MDA) DAN ENZIM TIROSINASE
MUSTIKA WENI
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Aktivitas
Penghambatan Ekstrak Sirih Merah (Piper crocatum) terhadap Pembentukan
Malondialdehida (MDA) dan Enzim Tirosinase adalah benar karya saya dengan
arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juli 2014
Mustika Weni
NIM G84100047
ABSTRAK
MUSTIKA WENI. Aktivitas Penghambatan Ekstrak Sirih Merah (Piper
crocatum) terhadap Pembentukan Malondialdehida (MDA) dan Enzim Tirosinase.
Dibimbing oleh MEGA SAFITHRI dan SYAEFUDIN.
Daun sirih merah (Piper crocatum) berkhasiat sebagai tanaman obat.
Tanaman tersebut memiliki kandungan senyawa yang berperan sebagai
antioksidan. Penelitian ini bertujuan menentukan aktivitas antioksidasi dan
penghambatan tirosinase ekstrak daun sirih merah. Proses ekstraksi dilakukan
secara terpisah menggunakan pelarut etanol dan n-heksana. Penentuan aktivitas
antioksidan menggunakan metode Thiobarbituric acid (TBA), sedangkan
penghambatan tirosinase menggunakan metode Microplate Reader. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol sirih merah konsentrasi 200 ppm
memiliki daya hambat pembentukan malondialdehid (MDA) sama besar (α>0.05)
dengan vitamin E, ekstrak n-heksana konsentrasi 200 ppm memiliki daya hambat
pembentukan malondialdehid (MDA) sama besar (α>0.05) dengan vitamin E.
Aktivitas penghambatan tirosinase menunjukkan bahwa ekstrak etanol sirih merah
memiliki nilai IC50 sebesar 1655 ppm sedangkan ekstrak n-heksana sirih merah
memiliki nilai IC50 sebesar 3090.56 ppm. Ekstrak etanol sirih merah memiliki
kemampuan menghambat MDA dan enzim tirosinase lebih tinggi dibandingkan
ekstrak n-heksana sirih merah.
Kata kunci : Aktivitas antioksidasi, Enzim tirosinase, Piper crocatum
ABSTRACT
MUSTIKA WENI. Inhibitory Activity of Piper crocatum Extract to
Malondialdehida Formation and Tyrosinase Activity. Supervised by MEGA
SAFITHRI and SYAEFUDIN.
Piper crocatum leave bark is a medicinal plant. It contains antioxidant
compounds. The objectives of this research was to determine the antioxidant
activity and inhibitory activity to tyrosinase of P. crocatum extract. Extraction
process of Piper crocatum was conducted separately by using the solvent ethanol
70% and n-hexane. Determination of antioxidant activity was conducted with
Thiobarbituric acid method (TBA) and for tyrosinase inhibitory activity using
microplate reader. The results showed that the ethanol extract at concentration of
200 ppm higher (α>0.05), inhibitory effects than vitamin E on the formation
malondialdehida. n-hexane extract at concentration of 200 ppm higher (α>0.05).
Tyrosinase inhibition activity test showed the ethanol extract has IC50 1655 ppm,
n-hexane extract has IC50 3090.56 ppm. Ethanol extract has inhibitory MDA and
enzyme tyrosinase than n-hexane extract.
Keywords : Antioxidative activity, Tyrosinase, Piper crocatum
AKTIVITAS PENGHAMBATAN EKSTRAK SIRIH MERAH (Piper
crocatum) TERHADAP PEMBENTUKAN MALONDIALDEHIDA (MDA)
DAN ENZIM TIROSINASE
MUSTIKA WENI
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
Pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2014
Judul Skripsi : Aktivitas Penghambatan Ekstrak Sirih Merah Piper crocatum
terhadap Pembentukan Malondialdehida (MDA) dan Enzim
Tirosinase
Nama : Mustika Weni
NIM : G84100047
Disetujui oleh
Tanggal Lulus:
Dr Mega Safithri,SSi MSi
Pembimbing I
Syaefudin, SSi MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Ketua Departemen
PRAKATA
Bismillahirrahmanirrahim
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari 2014 hingga April 2014 ini
adalah Aktivitas Penghambatan Ekstrak Sirih Merah (Piper crocatum) terhadap
Malondialdehida (MDA) dan Enzim Tirosinase.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr Mega Safithri, SSi MSi dan
Syaefudin, SSi MSi selaku pembimbing yang telah banyak memberikan
pengarahan dan saran. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada
Ibu Meri, Ibu Tini beserta seluruh staf Laboran Biokimia yang telah membantu
selama penelitian berlangsung. Terima kasih juga disampaikan kepada mba Leli
dan seluruh staf Pusat Studi Biofarmaka (PSB) yang telah banyak membantu
selama pengumpulan data penelitian. Ungkapan terima kasih juga disampaikan
kepada ayah, ibu, serta seluruh keluarga dan teman-teman Biokimia 47 untuk
segala doa, kasih sayang dan dukungannya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Mei 2014
Mustika Weni
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL vi
DAFTAR GAMBAR vi
DAFTAR LAMPIRAN vi
PENDAHULUAN 1
METODE 2
Bahan dan Alat 2
Prosedur Penelitian 3
Pengeringan Bahan Uji 3
Penetapan Kadar Air Metode Oven 4
Ekstraksi Serbuk Daun Sirih Merah (P. crocatum) 4
Rendemen 4
Analisis Fitokimia 4
Uji Aktifitas Antioksidan Metode TBA-MDA 5
Uji Inhibitor Tirosinase 6
HASIL 7
Kadar Air dan Rendemen Daun Sirih Merah 7
Kandungan Senyawa Metabolit Sekunder Daun Sirih Merah 7
Aktivitas Antioksidasi terhadap Penghambatan Malondialdehida (MDA) 7
Penentuan Penghambatan Enzim Tirosinase pada Ekstrak Etanol 70% dan n-
Heksana 8
PEMBAHASAN 9
Pembuatan Ekstrak Etanol 70% dan n-Heksana Daun Sirih Merah 9
Kandungan Senyawa Metabolit Sekunder Daun Sirih Merah 11
Potensi Antioksidan Ekstrak Etanol 70% dan n-Heksana Daun Sirih Merah
terhadap Penghambatan MDA 11
Penentuan Penghambatan (IC50) Ekstrak Etanol 70% dan Ekstrak n-Heksana
Sirih Merah terhadap Enzim Tirosinase 14
SIMPULAN DAN SARAN 15
Simpulan 15
Saran 15
DAFTAR PUSTAKA 15
LAMPIRAN 19
DAFTAR GAMBAR
1 Aktivitas antioksidan dengan metode TBA ekstrak daun sirih merah 8 2 Aktivitas penghambatan tirosinase ekstrak daun sirih merah 9 3 Kurva kadar MDA terhadap waktu 12
DAFTAR TABEL
1 Rendemen ekstrak etanol 70% dan n-heksana daun sirih merah 7 2 Metabolit sekunder ekstrak etanol 70% dan n-heksana daun sirih
merah 7
DAFTAR LAMPIRAN
1 Tahapan umum penelitian 20 2 Ekstraksi daun sirih merah 20 3 Pengujian fitokimia 20 4 Penentuan waktu inkubasi maksimum asam linoleat 20 5 Analisis aktivitas antioksidan dari metode TBA 21
6 Kadar air simplisia daun sirih merah 22 7 Rendemen simplisia daun sirih merah 22 8 Rendemen simplisia ekstrak etanol 70% dan n-heksana sirih merah 22 9 Grafik hubungan antara konsentrasi inhibitor ekstrak etanol 70% dan
ekstrak n-heksana terhadap persen inhibisi 22 10 Fitokimia ekstrak etanol 70% dan n-heksana sirih merah 23 11 Hasil absorbansi kurva standar 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP) 23 12 Kurva standar 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP) 24 13 Absorbansi inkubasi kadar MDA (µM) terhadap waktu 24 14 Aktivitas antoksidan ekstrak etanol 70% dan ekstrak n-heksana daun
sirih merah metode TBA 24
15 Analisis perhitungan IC50 difenolase ekstrak etanol 70% dan ekstrak
n-heksana daun sirih merah 25 16 Analisis stastistika terhadap penghambatan MDA 25
17 Analisis stastistika terhadap penghambatan enzim tirosinase 26
PENDAHULUAN
Kulit merupakan organ terbesar dan terluar tubuh manusia. Kulit langsung
terkena prooksida dari lingkungan, seperti radiasi ultraviolet (UV), obat-obatan
dan polusi udara. Selain pemicu eksternal serangan oksidatif, kulit juga harus
menghadapi endogen spesies oksigen reaktif (ROS) dan radikal bebas lainnya,
yang terus-menerus diproduksi selama metabolisme. Keseimbangan antara
oksidan dan antioksidan diperlukan untuk meminimalkan kerusakan jaringan.
Namun, jika keseimbangan ini terganggu stres oksidatif dapat terjadi dan hasilnya
adalah kerusakan oksidatif. Spesies oksigen reaktif (ROS) diketahui menyebabkan
modifikasi oksidatif DNA, protein dan lipid (Kang et al. 2005). Dalam mengatasi
bahaya yang timbul akibat radikal bebas, tubuh mengembangkan mekanisme
perlindungan untuk mencegah pembentukan radikal bebas dan peroksidasi lipid,
termasuk pada kulit. Berbagai kompartemen kulit (epidermis, dermis, subkutis)
dilengkapi dengan sistem antioksidan spesifik untuk mempertahankan
keseimbangan antara ROS dan antioksidan, sehingga dapat mencegah stres
oksidatif (Thiele dan Ekanayake-Mudiyanselage 2007).
Melanin pada epidermis berfungsi sebagai kromofor endogen yang akan
menyerap sinar matahari sehingga dianggap sebagai pelindung dampak buruk dari
sinar matahari. Melanin akan menyerap sinar matahari kemudian terjadi proses
fotokimiawi yang merubah molekul-molekul yang stabil menjadi molekul yang
sangat reaktif. Hasil reaksi fotokimiawi dikenal sebagai photo product antara lain
ROS (reactive oxygen species) seperti oksigen singlet, anion superaktif dan
radikal hidroksil. ROS yang terbentuk ini akan memicu kerja tirosinase dan
berakhir dengan sintesis melanin. Produksi melanin secara berlebihan dapat
mengarah pada terjadinya penumpukan melanin di lapisan epidermal
(hiperpigmentasi) dan menyebabkan kulit menjadi lebih gelap. Tirosinase
merupakan enzim yang berfungsi mengatur biosintesis melanin. Enzim tirosinase
bekerja mengubah tirosin menjadi DOPA dan kemudian menjadi dopakuinon
yang selanjutnya melalui beberapa tahap transformasi dikonversi menjadi melanin
(Fitrie 2004). Fungsi antioksidan berperan sebagai ROS scavenger sehingga
mengurangi hiperpigmentasi (Momtaz et al. 2008). Antioksida seperti flavonoid
juga diduga berperan sebagai inhibitor kompetitif enzim tirosinase karena struktur
dari flavonoid yang mirip dengan DOPA sebagai substrat (Chang 2009).
Senyawa antioksidan yang berperan sebagai penghambat pembentukan
melanin dapat diperoleh dari senyawa sintetik ataupun dari bahan alam. Senyawa
yang sering ditemukan dalam bahan kosmetik sebagai pencegah terbentuknya
melanin antara lain asam askorbat, arbutin, asam kojat, merkuri dan hidrokuinon.
Asam kojat memiliki aktivitas inhibisi dan kestabilan paling besar dalam
menghambat pembentukan melanin, serta banyak digunakan dalam produk
kosmetik dibandingkan produk pemutih lain. Namun, Miyazawa (2007)
menyatakan bahwa asam kojat bersifat karsinogenik dan penggunaannya dalam
konsentrasi tinggi dapat merusak kulit.
Pencarian alternatif inhibitor tirosinase yang aman bagi kesehatan terus
dilakukan, misalnya dari bahan alam. Penggunaan tumbuhan sebagai obat telah
lama dikenal secara luas oleh masyarakat Indonesia yang disebut sebagai obat
tradisional. Penggunaan obat tradisional dewasa ini sangat popular dan semakin
2
disukai oleh masyarakat. Hal ini disebabkan obat tradisional sangat murah, mudah
didapat dan memiliki efek samping serta tingkat toksisitasnya jauh lebih rendah.
Sejauh ini ekstrak etanol sirih merah (Piper crocatum) mengandung
senyawa fitokimia dan ekstrak air rebusan daun sirih merah mengandung alkaloid,
flavonoid dan tanin (Safithri dan Fahma 2008). Penelitian lain menyatakan bahwa
ekstrak etanol daun sirih merah memiliki aktivitas antioksidasi, yaitu dapat
menghambat oksidasi asam lemak dengan daya hambat terbesar 80.40% dan
sebagai radical scavenger dengan nilai IC50 85.82 ppm. Ekstrak etanol daun sirih
merah juga memiliki aktivitas inhibisi terhadap enzim α-glukosidase sebesar
39.62% (Alfarabi 2010). Berdasarkan hasil penelitian Safithri et al. (2011) ekstrak
air rebusan daun sirih merah (P. crocatum) memiliki aktivitas antioksidasi
terhadap SOD dan katalase sebesar 3,41±0,04 U/ml dan 0,13± 0,02 mU/ml, dan
total fenol sebesar 532,6 ppm. Berdasarkan hasil penelitian pra klinis
menunjukkan bahwa ekstrak air rebusan formula daun sirih merah dan kayu manis
dengan perbandingan 3:2 (60.55%) konsentrasi 200 ppm memiliki daya hambat
yang sebanding dan tidak berbeda nyata dengan vitamin E konsentrasi 200 ppm
(61.40%) (Kartika 2012). Pengujian toksisitas akut air rebusan daun sirih merah
terhadap tikus percobaan Sprague dawley yang diberikan rebusan sirih merah
dengan berbagai dosis, menunjukkan bahwa selama 24 jam pertama sampai 7 hari
masa percobaan tidak ada hewan yang mati baik untuk kelompok dosis 0, 5, 10,
maupun 20 g/kg BB. Dengan tidak adanya kematian tikus putih pada semua dosis
yang diujikan, maka dapat dikatakan bahwa rebusan sirih merah tidak bersifat
toksik (Safithri et al. 2012). Menurut Pranakusumanagara (1998) rebusan daun
sirih merah digunakan untuk membasuh muka atau mandi. Kandungan karvakro
dan arekolin yang terkandung dalam sirih merah ini yang dipercaya meremajakan
kulit, memutihkan, menyegarkan dan membuat tampak lebih awet muda. Sirih
merah juga mengandung senyawa flavonoid yang diduga dapat menghambat kerja
enzim tirosinase (Chang 2009). Berdasarkan uraian diatas, untuk
mempertimbangkan kemungkinan aplikasi sirih merah sebagai pemutih alami
pada kosmetik kecantikan, maka diperlukan kajian mengenai aktivitas
inhibitornya terhadap enzim tirosinase dan aktivitas antioksidan.
Penelitian ini bertujuan menentukan aktivitas antioksidan ekstrak daun
sirih merah terhadap pembentukan malondialdehida (MDA) dan enzim tirosinase.
Parameter yang digunakan adalah pengujian antioksidasi daun sirih merah secara
in vitro menggunakan metode tiobarbiturat (TBA) dan pengujian aktivitasnya
dalam menghambat enzim tirosinase. Hasil penelitian ini diharapkan dapat
memberikan informasi ilmiah mengenai potensi antioksidasi dan penghambatan
terhadap enzim tirosinase daun sirih merah secara in vitro dan dapat dijadikan
dasar pengembangan produk fitofarmaka sirih merah sebagai antioksidan dan
sebagai pemutih wajah.
METODE
Bahan dan Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah neraca analitik
Ohaus GA 200, eksikator, oven memmert, pisau, blender, cawan porselin, sanstat
water bath, tabung reaksi, pipet tetes, pH meter, pipet mohr, kertas saring, labu
3
takar, erlenmeyer, spektrofotometer Genesys 10 UV (190-1100 nm), rotav eyela
n-1100, bulp, gelas ukur, sentrifus Hettich Universal (0-6000 rpm), corong
plastik, multi-well plate, ELISA reader epoch biotek dan mikropipet.
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah simplisia daun
sirih merah, etanol 70%, n-heksana, HCl 2 N, akuades, pereaksi Dragendorff,
pereaksi Mayer, pereaksi Wagner, metanol, etil asetat, metanol 30%, etanol 30%,
etanol 99.8%, amoniak, kloroform, eter, FeCl3, tirosinase, L-3, 4-
dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), larutan standar 1,1,3,3-tetrametoksipropana
(TMP) 6 M, natrium hidroksida (NaOH), asetat anhidrida, asam sulfat (H2SO4),
buffer fosfat pH 6.5, buffer fosfat 0.1 M pH 7, asam linoleat, Dimethyl sulfoxide
(DMSO), asam trikloroasetat (TCA) 20%, asam kojat sebagai kontrol positif dan
asam tiobarbiturat (TBA) 1%.
Prosedur Penelitian
Analisis daun sirih merah dibagi dalam 3 tahap penting, yaitu analisis
fitokimia dari ekstrak sirih merah, analisis antioksidan ekstrak sirih merah dengan
metode TBA dan analisis inhibitor ekstrak sirih merah terhadap enzim tirosinase.
Tahap awal, daun sirih merah dikeringkan dalam oven suhu 50°C selama ± 4 hari
dengan tujuan untuk mengurangi kadar air pada daun sirih merah. Daun sirih
merah yang sudah kering dihaluskan dengan ukuran 60 mesh. Kadar air daun sirih
merah diukur dengan tujuan untuk mengetahui kadar air dari sirih merah. Kadar
air tidak lebih dari 12% (b/b). Selanjutnya, daun sirih merah diekstrak dengan
metode maserasi menggunakan 2 pelarut, yaitu etanol 70% dan n-heksana. Dasar
pemilihan kedua pelarut ini adalah kandungan metabolit sekunder daun sirih
merah (flavonoid dan minyak atsiri) diharapkan dapat terlarut dalam kedua pelarut
yang digunakan. Kedua ekstrak sirih merah (etanol 70% dan n-heksana) dianalisis
fitokimia, yaitu uji alkaloid, flavonoid, tanin, saponin, steroid dan triterpenoid
dengan tujuan untuk mengetahui kandungan metabolit sekunder sirih merah pada
kedua ekstrak. Ekstrak etanol 70% dan n-heksana selanjutnya diuji aktivitas
antioksidan dengan metode TBA. Sebelum analisis ekstrak etanol 70% dan n-
heksana, asam linoleat diinkubasi dengan tujuan untuk menentukan waktu
inkubasi ekstrak dengan asam linoleat. Selanjutnya, dilakukan analisis
penghambatan ekstrak etanol 70% dan n-heksana sirih merah terhadap enzim
tirosinase dengan menggunakan metode microplate reader.
Pengeringan Bahan Uji (Safithri 2012)
Daun sirih merah yang digunakan dalam penelitian adalah daun sirih
merah tua yang diperoleh dari 3-5 helai dari pucuk tanaman dengan bentuk daun
yang sempurna yang diperoleh dari perumahan Bogor Raya Permai. Sampel daun
segar diambil sebanyak 2 kg. Daun sirih merah dicuci dengan air bersih dan
ditiriskan dalam wadah plastik dan dikeringkan dalam oven dengan suhu 50oC
selama 4-5 hari sampai diperoleh berat akhirnya yang konstan agar didapatkan
sampel kering dengan kadar air tidak lebih dari 12% (b/b). Daun sirih merah
kering dihaluskan dengan menggunakan blender hingga menjadi serbuk halus,
4
lalu diayak dengan saringan sehingga ukuran serbuk menjadi 60 mesh. Simplisia
dibungkus dengan plastik dan disimpan untuk pengujian selanjutnya.
Penetapan kadar air metode oven (AOAC 2006)
Prinsip penghitungan kadar air adalah bobot hilang pada pemanasan 105ºC
dianggap sebagai kadar air yang terdapat pada sirih merah, karena titik didih air
sebesar 100ºC. Cawan porselen dikeringkan di dalam oven bersuhu 105
°C selama
1 jam, kemudian didinginkan dalam eksikator selama 15 menit. Cawan porselen
ditimbang untuk menentukan bobot kosongnya. Cawan kosong ditimbang dan
dicatat bobotnya. Dua gram simplisia daun sirih merah dimasukkan ke dalam
cawan kemudian dicatat bobotnya, dikeringkan dalam oven pada suhu 105°C
selama 3 jam setelah itu didinginkan dalam eksikator. Cawan porselen ditimbang
kembali.
Kadar Air =
× 100 %
Keterangan:
a = bobot sampel sebelum dikeringkan (g)
b = bobot sampel setelah dikeringkan (g)
Ekstraksi Serbuk Daun Sirih Merah (P. crocatum) (BPOM RI 2004)
Sebanyak 5 gram serbuk simplisia daun sirih merah ditambahkan pelarut
dengan perbandingan 1:10 (b/v), lalu diletakkan pada shaker selama 24 jam,
kemudian disaring. Perlakuan maserasi (menggunakan sampel daun, bekas
maserasi sebelumnya) diulang sebanyak 3 kali. Maserat dipekatkan menggunakan
rotary evaporator pada suhu 50ºC untuk ekstrak etanol 70% dan 45
ºC untuk
ekstrak n-heksana. Residu yang diperoleh ditimbang dan ditentukan rendemennya.
Rendemen
Rendemen ekstrak etanol 70% dan ekstrak n-heksana daun sirih merah
dihitung dengan membandingkan bobot awal simplisia dengan bobot akhir ekstrak
yang dihasilkan
% Rendemen ekstrak =
x 100%
Analisis Fitokimia (Harbone 1987)
Uji alkaloid. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambahkan 10 mL kloroform
dan 3 tetes amoniak. Fraksi kloroform yang diperoleh dipisahkan dan diasamkan
dengan 2 tetes H2SO4 2 M. Fraksi asam dibagi menjadi 3 tabung dan masing-
masing tabung ditambahkan dengan pereaksi Dragendorf, Meyer dan Wagner
sebanyak 3 tetes. Sampel positif mengandung alkaloid ditandai dengan
terbentuknya endapan putih untuk perekasi Mayer, endapan merah untuk pereaksi
Dragendorf dan endapan coklat untuk pereaksi Wagner.
5
Uji flavonoid. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambahkan dengan 5 mL
metanol 30 %, kemudian dipanaskan selama 5 menit. Filtrat yang terbentuk
ditambahkan dengan 3 tetes H2SO4. Adanya flavonoid ditunjukkan dengan
terbentuknya endapan warna merah.
Uji saponin. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambahkan dengan 5 mL
akuades kemudian dipanaskan selama 5 menit. Sampel dikocok selama 5 menit.
Adanya saponin ditunjukkan dengan terbentuknya busa yang stabil setelah
didiamkan selama 10 menit.
Uji triterpenoid dan steroid. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambahkan
dengan 5 mL etanol 30 %, kemudian dipanaskan selama 5 menit. Sampel disaring,
filtrat yang diperoleh diuapkan hingga kering. Residu ditambah 0.5 mL eter dan
dipindahkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan dengan pereaksi
Liebermann Burchard (3 tetes asam asetat anhiridat dan 1 tetes H2SO4 pekat).
Adanya triterpenoid ditandai dengan terbentuknya warna merah atau ungu,
sedangkan adanya steroid ditunjukkan dengan warna hijau atau biru.
Uji tanin. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambahkan dengan 5 mL akuades,
kemudian didihkan selama 5 menit. Sampel selanjutnya disaring, filtrat yang
diperoleh ditambahkan dengan 5 tetes FeCl3 1% (b/v). Adanya warna biru tua atau
hitam yang terbentuk menunjukkan adanya tanin.
Uji Aktivitas Antioksidan Metode TBA-MDA (Kikuzaki dan Nakatani 1993)
Penentuan kurva standar larutan 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP).
Pembuatan kurva standar dilakukan dengan menggunakan larutan TMP dengan
konsentrasi 1, 5, 8, 10, 13, 15, 18, 20 µM. Tiap larutan dipipet 1 mL dan
ditambahkan 2 mL larutan TCA 20% dan 2 mL larutan TBA 1% dalam asam
asetat 50%. Campuran reaksi diletakkan dalam penangas air 100oC selama 10
menit. Setelah dingin larutan disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm (diameter
rotor sentrifus 130 mm) selama 15 menit. Kemudian serapannya diukur pada
panjang gelombang 532 nm. Larutan blanko menggunakan 1 mL akuades yang
diberi perlakuan seperti larutan konsentrasi TMP lainnya (konsentrasi 0 TMP).
Penentuan waktu inkubasi asam linoleat dengan Metode TBA.
Penentuan waktu inkubasi asam linoleat dengan menggunakan 6 mL bufer fosfat
0.1 M pH 7, kemudian ditambah 6 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8%,
dan 3 mL air bebas ion dicampurkan. Sebanyak 1 mL campuran ditempatkan di
botol gelap kemudian campuran diinkubasi pada suhu 40oC. Pengukuran
intensitas serapannya dilakukan dengan cara sebanyak 1 mL campuran asam
linoleat yang telah diinkubasi ditambahkan 2 mL larutan TCA 20% dan 2 mL
larutan TBA 1% dalam asam asetat 50%. Campuran reaksi diletakkan dalam
penangas air 100oC selama 10 menit. Setelah dingin larutan disentrifus dengan
kecepatan 3000 rpm (diameter rotor sentrifus 130 mm) selama 15 menit. Panjang
gelombangnya diukur pada panjang gelombang 532 nm. Pengukuran dilakukan
setiap hari hingga tercapai serapan maksimum. Larutan blanko digunakan 1 mL
6
campuran 3 mL etanol 99.8% dan 2 mL bufer fosfat 0.1 M pH 7, kemudian
ditambahkan 2 mL TCA 20% dan 2 mL TBA 1% dalam asetat 50%. Larutan
blanko tersebut diletakkan dalam penangas air 100oC selama 10 menit. Larutan
disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm (diameter rotor sentrifus 130 mm) selama
15 menit.
Analisis konsentrasi malondialdehida (MDA) dengan metode TBA.
Analisis antioksidan ekstrak daun sirih merah dibuat dalam konsentrasi 25, 50, 75,
100, dan 200 ppm. Masing-masing sampel diambil sebanyak 1 mL kemudian
ditambahkan 2 mL bufer fosfat 0.1 M pH 7 dan 2 mL asam linoleat 50 mM dalam
etanol 99.8%. Larutan kontrol positif digunakan 1 mL α-tokoferol (200 ppm), 2
mL bufer fosfat 0.1 M pH 7 dan 2 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8%.
Semua larutan ini kemudian dimasukkan dalam botol gelap dan diinkubasi di
penangas 40oC selama waktu inkubasi optimum dari metode TBA dengan
mengambil 1 mL dari setiap larutan, kemudian ditambahkan 2 mL larutan TCA
20% dan 2 mL larutan TBA 1% dalam asam asetat 50%. Campuran reaksi
diletakkan dalam penangas air 100oC selama 10 menit. Setelah dingin larutan
disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm (diameter rotor sentrifus 130 mm) selama
15 menit. Panjang gelombangnya diukur pada panjang gelombang 532 nm.
Larutan blanko digunakan 1 mL campuran 3 mL etanol 99.8% dan 2 mL bufer
fosfat 0.1 M pH 7, kemudian ditambahkan 2 mL TCA 20 % dan 2 mL TBA 1%
dalam asetat 50%. Larutan blanko tersebut diletakkan dalam penangas air 100oC
selama 10 menit. Larutan disentrifus dengan kecepatan 300 rpm (diameter rotor
sentrifus 130 mm) selama 15 menit.
Uji Inhibitor Tirosinase (Batubara et al. 2010)
Ekstrak dilarutkan dalam DMSO hingga konsentrasinya 10.000 ppm.
Larutan stok disiapkan dengan cara melarutkan ekstrak pekat kedalam bufer fosfat
50 mM (pH 6.5) hingga memperoleh konsentrasi 600 mg/mL. Ekstrak diuji
dengan konsentarsi 20, 200, 400, 800, 1600 dan 3200 ppm. Asam kojat sebagai
kontrol positif diuji pada konsentrasi 200 ppm ditambahkan 30 µL enzim tironase
(sigma, 333unit/mL dalam bufer fosfat) dan campuran diinkubasi selama 5 menit.
Setelah itu, sebanyak 110 µL substrat (L-DOPA 12 mM) ditambahkan dan
campurannya diinkubasi pada suhu 37°C selam 30 menit. Larutan pada masing-
masing sumur diukur nilai absorbansinya dengan menggunakan microplate reader
pada panjang gelombang 492 nm untuk menentukan persen inhibisi dan nilai
konsentrasi hambat 50% (IC50). Persen inhibisi dihitung dengan cara
membandingkan absorbansi sampel tanpa ekstrak (A) dengan penambahan ekstrak
(B) pada panjang gelombang 492 nm.
% Inhibisi =
× 100 %
Analisis data.
Analisis statistik terhadap aktivitas antioksidasi menggunakan rancangan
acak lengkap, yaitu dengan uji analysis of varian (ANOVA) pada tingkat
kepercayaan 95% dan taraf α=0.05. Data dianalisis dengan program perangkat
lunak Statistical Programme for Social Science (SPSS) PASW 18.0.
7
HASIL
Kadar Air dan Rendemen Daun Sirih Merah
Daun sirih merah dianalisis kadar air terlebih dahulu sebelum digunakan
untuk ekstraksi. Hasil analisis kadar air menunjukkan bahwa proses pengeringan
dengan oven suhu 50°C selama 4 hari mampu menurunkan kadar air hingga
dibawah 10%, kadar air simplisia yang diperoleh sebesar 7.75%. Rendemen
tertinggi hasil Rotary evaporator diperoleh ekstrak etanol 70% daun sirih merah
sebesar 17.84%, sedangkan ekstrak n-heksana sebesar 4.88% (Tabel 1).
Tabel 1 Rendemen ekstrak etanol 70% dan n-heksana daun sirih merah
Jenis ekstrak %Rendemen ekstrak
Etanol 17.84% ± 0.66
n-heksana 4.88% ± 4.80 n = 2 kali ulangan
Kandungan Senyawa Metabolit Sekunder Daun Sirih Merah
Hasil uji fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak etanol 70% sirih merah
mengandung alkaloid, flavonoid, saponin, tanin dan steroid. Ekstrak n-heksana
sirih merah mengandung saponin dan steroid (Tabel 2).
Tabel 2 Uji fitokimia ekstrak etanol 70% dan n-heksana sirih merah
Senyawa Ekstrak
Etanol 70% n-heksana
Alkaloid
Flavonoid
Saponin
Tanin
Steroid dan Triterpenoid
+ -
+
+
+
+
-
+
-
+ Ket : (+) terdeteksi; (-) tidak terdeteksi
Aktivitas Antioksidasi terhadap Pembentukan Malondialdehida (MDA)
Berdasarkan hasil yang diperlihatkan pada Gambar 1, peningkatan daya
hambat ekstrak etanol 70% terhadap pembentukan MDA tidak berbanding lurus
dengan konsentrasi. Vitamin E konsentrasi 200 ppm digunakan sebagai kontrol
positif. Penghambatan tertinggi ekstrak etanol 70% terdapat pada konsentrasi 200
ppm sebesar 52.13%. Analisis statistik menunjukkan bahwa ekstrak etanol 70%
pada konsentrasi 50 ppm tidak berbeda nyata (P<0.05) dengan konsentrasi 25 ppm
dan 100 ppm tetapi berbeda nyata (P<0.05) dengan konsnetrasi 200 ppm. Ekstrak
etanol 70% konsentrasi 200 ppm (52.13%) memiliki daya hambat yang tidak
berbeda nyata (P<0.05) dengan vitamin E konsentrasi 200 ppm (36.42%).
Peningkatan daya hambat ekstrak n-heksana terhadap pembentukan MDA
tidak berbanding lurus dengan konsentrasi (Gambar 1). Penghambatan tertinggi
ekstrak n-heksana terdapat pada konsentrasi 200 ppm sebesar 40.13%. Analisis
statistik menunjukkan bahwa ekstrak n-heksana pada konsentrasi 100 ppm tidak
berbeda nyata (P<0.05) dengan konsnetrasi 25 ppm dan 50 ppm tetapi berbeda
8
nyata (P<0.05) dengan konsnetrasi 200 ppm. Ekstrak n-heksana konsentrasi 200
ppm (40.13%) memiliki daya hambat yang tidak berbeda nyata (P<0.05) dengan
vitamin E konsentrasi 200 ppm (36.42%).
Gambar 1 Aktivitas antioksidan ekstrak daun sirih merah dengan metode TBA.
ekstrak etanol 70% dan ekstrak n-heksana
Penentuan Penghambatan Enzim Tirosinase pada Ekstrak Etanol 70% dan
n-Heksana
Ekstrak etanol 70% sirih merah terjadi peningkatan daya hambat terhadap
aktivitas enzim tirosinase yang berbanding lurus dengan peningkatan konsentrasi
(Gambar 2). Asam kojat konsentrasi 200 ppm digunakan sebagai kontrol positif.
Penghambatan tertinggi terdapat pada ekstrak etanol 70% dengan konsentrasi
3200 ppm sebesar 76.457%. Analisis statistik menunjukkan bahwa ekstrak etanol
70% pada masing-masing konsentrasi (20 ppm, 200 ppm, 800 ppm, 1600 ppm,
2400 dan 3200 ppm) berbeda nyata (P<0.05). Ekstrak etanol 70% konsentrasi 200
ppm (12.78%) memiliki daya hambat yang berbeda nyata (P<0.05) dengan asam
kojat konsentrasi 200 ppm (91.82%). Nilai IC50 dari ekstrak etanol 70% sebesar
1655 ppm.
Ekstrak n-heksana sirih merah terjadi peningkatan daya hambat terhadap
aktivitas enzim tirosinase yang berbanding lurus dengan peningkatan konsentrasi
(Gambar 2). Penghambatan tertinggi ekstrak n-heksana terdapat pada konsentrasi
3200 ppm sebesar 54.260%. Analisis statistik menunjukkan bahwa persen
penghambatan ekstrak n-heksana sirih merah pada masing-masing konsentrasi (20
ppm, 200 ppm, 800 ppm, 1600 ppm, 2400 dan 3200 ppm) berbeda nyata (P<0.05).
Ekstrak n-heksana konsentrasi 200 ppm (1.23%) memiliki daya hambat yang
36
.42
± 5
.01
ab
19
.95
± 1
2.9
5b
c
25
.58
± 1
3.5
5b
37
.82
± 4
.38
ab
52
.13±
9.3
4a
36
,42
± 5
.01
a
26
.65
± 8
.09
ab
30
.86
± 1
0.6
5ab
17
.47
± 1
.95b
40
.13
± 5
.34
a
0
10
20
30
40
50
60
vitamin E (200) 25 50 100 200
% I
nh
ibis
i
Konsentrasi (ppm)
9
berbeda nyata (P<0.05) dengan asam kojat konsentrasi 200 ppm (91.82%). Nilai
IC50 ekstrak n-heksana sebesar 3090.56 ppm.
Gambar 2 Aktivitas penghambatan tirosinase ekstrak daun sirih merah. ekstrak
etanol 70% dan ekstrak n-heksana
PEMBAHASAN
Pembuatan Ekstrak Etanol 70% dan n-Heksana Daun Sirih Merah
Daun sirih merah diekstraksi dengan proses maserasi. Ekstraksi adalah
metode suatu cara untuk menarik satu atau lebih zat dari bahan asal dengan
menggunakan pelarut (Syamsuni 2006). Zat aktif yang terdapat dalam simplisia
tersebut dapat digolongkan ke dalam golongan minyak atsiri, alkaloid, flavonoid
dan lain-lain (Depkes 2000). Tujuan utama ekstraksi ini adalah untuk
mendapatkan atau memisahkan sebanyak mungkin zat-zat yang memiliki khasiat
pengobatan (Syamsuni 2006). Penelitian ini menggunakan metode ekstraksi
maserasi, karena metode ini prosedur dan peralatannya sederhana (Agoes 2007).
Maserasi adalah penarikan cara penarikan simplisia dengan merendam simplisia
tersebut dalam cairan penyari (Syamsuni 2006) dengan beberapa kali pengocokan
atau pengadukan pada temperatur kamar, sedangkan remaserasi merupakan
pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan maserat pertama
dan seterusnya (Depkes 2000). Sebelum diekstraksi, terlebih dahulu simplisia
daun sirih merah dikeringkan. Proses pengeringan simplisia daun sirih merah
dilakukan untuk mengurangi kadar air dan mempermudah penggerusan atau
pembuatan serbuk (Katno et al. 2008). Bahan dikeringkan dengan menggunakan
91
.82
± 0
.41
a
5.4
9 ±
0.7
8g
12
.78
± 2
.3f
45
.18
± 1
.53
e
53
.03
± 0
.61
d
69
.51
± 1
.04
c
76
.46
± 0
.33
b
91
.82 ±
0.4
1a
-4.2
6 ±
1.9
3g
1,2
3 ±
0.9
1f
6.2
8 ±
0.8
3e
18
.61
± 2
.95
d
40
.02
± 1
.14
c
54
.26
± 2
.05
b
-20
0
20
40
60
80
100
asam kojat 20 200 800 1600 2400 3200
% i
nh
ibis
i
Konsentrasi (ppm)
10
oven selama 4 hari pada suhu 50ºC. Pengeringan dengan menggunakan oven
dipilih karena suhu dan kecepatan proses pengeringan dapat diatur, tidak
dipengaruhi oleh cuaca, sanitasi dan higienis dapat dikendalikan. Standar kadar air
maksimum simplisia adalah 10% (Depkes 2008), karena kandungan air yang
tinggi dalam suatu bahan dapat mendorong terjadinya reaksi enzimatik yang
mengakibatkan terjadinya perubahan kimia. Jumlah air dalam bahan pangan
disebut sebagai aktivitas air (water activity = aw). Bakteri membutuhkan aw =
0.91. Oleh karena itu sebagian bakteri tidak dapat tumbuh pada aw = 0.90 atau
dibawahnya, maka untuk membuat makanan tahan lama selama penyimpanan
selain kadar air makanan dibuat 10% juga aw makanan harus di bawah 0.90 untuk
mencegah timbulnya bakteri (Winarno 1980). Hasil pengukuran kadar air dari
kedua simplisia didapatkan di bawah 10%, sehingga simplisia dapat disimpan
dalam jangka waktu lama tanpa adanya kerusakan oleh mikroba (Suharmiati dan
Maryani 2003).
Berdasarkan uji fitokimia pada penelitian sebelumnya, bahwa daun sirih
merah mengandung senyawa flavonoid, alkaloid dan tannin (Safithri dan Fahma
2005), maka senyawa-senyawa tersebut bersifat polar terutama flavonoid.
Berbagai kandungan yang terdapat dalam daun sirih merah yang diperkirakan
sebagai penghambat enzim tirosinase adalah flavonoid (Chang 2009).
Berdasarkan sifat flavonoid tersebut, maka untuk ekstraksi dapat digunakan etanol
70% sebagai bahan penyarinya, karena etanol 70% bersifat semi polar yang dapat
melarutkan senyawa yang bersifat polar maupun non-polar. Etanol 70% tidak
menyebabkan pembengkakan membran sel dan memperbaiki stabilitas bahan obat
terlarut (Harborne 1987) dan relatif lebih aman digunakan. Selain itu etil p-
metoksi sinamat, salah saru turunan asam sinamat merupakan salah satu golongan
minyak atsiri memiliki berbagai aktivitas biologis salah satunya adalah sebagai
penghambat enzim tirosinase (Rudyanto dan Hartanti 2008). Selain menggunakan
etanol 70%, digunakan n-heksana sebagai pelarut karena minyak atsiri merupakan
senyawa non polar sehingga dapat larut dalam senyawa non polar.
Ekstraksi dengan metode maserasi yang dilakukan dalam penelitian ini
menggunakan daun sirih merah segar yang telah dihaluskan direndam dengan
larutan etanol 70% dan n-heksana selama 24 jam. Penggunaan daun yang segar
bertujuan mencegah terjadinya perubahan kimia terhadap senyawa-senyawa yang
terdapat di daun sehingga tidak merusak senyawa yang diinginkan. Simplisia
dihaluskan dengan ukuran 60 mesh bertujuan memperbesar peluang terlarutnya
senyawa-senyawa yang ingin diekstrak dengan etanol 70% dan n-heksana karena
dengan dihaluskan akan memudahkan etanol 70% dan n-heksana berinteraksi
dengan senyawa-senyawa yang ingin diekstrak. Larutan tersebut dipekatkan
dengan rotary evaporator, bertujuan menguapkan pelarut sehingga didapat
ekstrak cairan (liquid) (Nugroho et al. 2000). Suhu yang digunakan yaitu 50oC,
karena meminimalisir kerusakan komponen bioaktif yang terdapat pada ekstrak
(Kuswardahani 2007). Ekstrak yang didapat dalam penelitian ini berbentuk serbuk
kering dengan nilai rerata rendemen dari ekstrak etanol 70% sebesar 17.81%,
sedangkan ekstrak n-heksana memiliki rendemen rata-rata sebesar 4.88% (Tabel
2). Hasil rendemen ini menunjukkan bahwa kadar rendemen ekstrak etanol 70%
lebih tinggi daripada ekstrak n-heksana sebab etanol 70% dapat melarutkan
senyawa polar dan nonpolar. Penentuan rendemen berfungsi untuk mengetahui
11
kadar metabolit sekunder yang terbawa oleh pelarut tersebut namun tidak dapat
menentukan jenis senyawa yang terbawa tersebut.
Sampel dalam bentuk ekstrak memiliki kelebihan antara lain, banyaknya
senyawa bioaktif yang terlarut karena semua senyawa tersebut dalam tanaman
masih dalam bentuk konsentrat serta masih dalam bentuk alami. Komposisi alami
memungkinkan semakin kecil efek samping dan perubahan aktivitas senyawa
bioaktif serta mempermudah standarisasi sampel (Sinambela 2003).
Kandungan Senyawa Metabolit Sekunder Daun Sirih Merah
Sampel yang digunakan adalah ekstrak etanol 70% dan ekstrak n-heksana
daun sirih merah. Uji fitokimia bertujuan untuk mengetahui adanya senyawa
metabolit yang diharapkan dapat berperan sebagai antioksidan dan penghambat
enzim tirosinase.
Hasil uji fitokimia ekstrak etanol 70% daun sirih merah (tabel 2) ini tidak
jauh berbeda dengan hasil penelitian Salim (2006) yang menggunakan rebusan
daun sirih merah yang terbukti mengandung alkaloid, flavonoid dan tanin.
Kesesuaian hasil uji fitokimia antara ekstrak air rebusan dan etanol 70%
membuktikan bahwa etanol 70% menarik senyawa kimia yang relatif sama
dengan air. Dari ketiga senyawa tersebut (alkaloid, flavonoid dan tanin), senyawa
flavonoid dilaporkan dapat menghambat enzim tirosinase (Chang 2009). Senyawa
flavonoid juga berperan sebagai antioksidan seperti yang telah dilaporkan oleh
(Gheldof et al. 2002). Selain senyawa flavonoid, senyawa tanin juga berfungsi
sebagai antioksidan karena kemampuannya dalam menangkap radikal bebas,
menghambat radikal bebas dan tumor (Dangles et al. 2000). Aktivitas antioksidan
dari suatu tumbuhan sangat dipengaruhi oleh keberadaan senyawa metabolit
sekunder yang terkandung.
Potensi Antioksidan Ekstrak Etanol 70% dan n-Heksana Daun Sirih Merah
terhadap Penghambatan MDA
Salah satu target dari serangan radikal bebas dalam sel makhluk hidup
adalah lipid pada membran sel. Peroksidasi lipid merupakan reaksi tidak
terkendali dari radikal bebas terhadap komponen sel seperti asam lemak tak jenuh
ganda (polyunsaturated fatty acid, PUFA) pada membran sel yang sedikitnya
mengandung tiga ikatan rangkap, sehingga terbentuk radikal bebas baru yang
sangat peka terhadap oksigen (radikal peroksi lipid) (Hasanah 2008). Reaksi ini
berlanjut hingga membentuk produk sekunder yaitu malondialdehida (MDA).
Penelitian ini menggunakan asam linoleat yang merupakan asam lemak tak
jenuh, karena dapat dengan mudah diserang oleh radikal bebas pada ikatan
rangkapnya sehingga menghasilkan lipid peroksida. Asam lemak dapat rusak
akibat teroksidasi oleh beberapa faktor seperti suhu, cahaya, ion-ion logam dan
oksigen (Raharjo 2004). Oleh karena itu laju oksidasi asam linoleat dipercepat
dengan mengatur suhu tetap pada 40oC, dan disimpan pada botol gelap berulir
bertujuan menghindari faktor lain selain suhu dan oksigen.
Sebelum uji potensi antioksidasi dengan metode TBA, dilakukan
pengukuran hidroperoksida yang merupakan produk primer oksidasi asam linoleat
dengan metode diena terkonjugasi. Pengukuran hidroperoksida bertujuan
menentukan waktu inkubasi maksimum. Hasil pengukuran hidroperoksida
digunakan untuk menentukan lama inkubasi asam linoleat sebelum analisa MDA.
12
Gambar 3 Kurva kadar MDA terhadap waktu (Kartika 2013)
Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan Kartika (2013) absorbansi
terbesar terjadi pada hari ke-6 (Gambar 3), hasil yang sama juga ditunjukkan oleh
penelitian Alfarabi (2010). Pengukuran potensi antioksidasi dilakukan dua hari
setelah hidroperoksida terbentuk maksimum yaitu pada hari ke-8, dengan asumsi
semua hidroperoksida yang telah terbentuk terdekomposisi menjadi MDA
(Kikuzaki dan Nakatani 1993).
Keberadaan MDA ini dapat dicegah apabila reaksi oksidasi asam linoleat
dihambat. Senyawa antioksidan dapat menghambat proses oksidasi berlanjut
tersebut dengan melengkapi elektron ke senyawa asam linoleat radikal. Senyawa
antioksidan sirih merah (tanin, alkaloid dan flavonoid) didalam larutan inkubasi
asam linoleat dapat dengan mudah melengkapi elektron ke senyawa radikal, oleh
sebab itu senyawa MDA tidak terbentuk atau terbentuk dalam jumlah yang kecil
karena proses oksidasi asam linoleat terhambat dengan adanya antioksidan.
Konsentrasi ekstrak sirih merah yang digunakan untuk mengukur MDA adalah
25, 50, 75, 100, dan 200 ppm. Pemilihan kelima konsentrasi ekstrak yang
digunakan berdasarkan pada batas maksimum kandungan antioksidan dalam
makanan yaitu 200 ppm (Hernani dan Rahardjo 2005). Kontrol positif pada
penelitian ini digunakan vitamin E 200 ppm.
Inkubasi dalam percobaan dilakukan selama 8 hari, setelah itu kadar MDA
diukur dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang 532 nm. Kurva
standar yang digunakan adalah larutan 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP) dengan
berbagai konsentrasi. TMP merupakan senyawa turunan MDA yang cukup stabil.
Persamaan garis linear yang didapat adalah y=0.086x+0.006 dengan nilai R2=
99.8%. Nilai pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 532 nm tidak
berbanding lurus dengan jumlah MDA yang terbentuk.
Hasil pengujian aktivitas antioksidan dengan MDA-TBA menunjukkan
bahwa setiap ekstrak daun sirih merah mempunyai kemampuan menghambat
radikal bebas MDA. Hal ini terjadi karena nilai absorbansi setiap ekstrak daun
sirih merah lebih kecil dibandingkan dengan kontrol negatif. Kelima konsentrasi
menunjukkan hasil yang tidak linear antara konsentrasi dengan persen
penghambatannya baik pada ekstrak etanol 70%, maupun ekstrak n-heksana. Hal
ini disebabkan ekstrak yang digunakan masih ekstrak kasar, sehingga masih ada
kemungkinan senyawa murni yang dikandung memiliki aktivitas peredam radikal
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ka
da
r M
DA
(µ
M)
Waktu Inkubasi (Hari)
13
bebas lebih kuat dibandingkan ekstraknya. Ekstrak kasar masih mengandung
senyawa-senyawa yang dapat menghambat peredaman radikal bebas terhadap
antioksidan, seperti karbohidrat, protein dan lemak yang menyebabkan aktivitas
antioksidan ekstrak kasar lebih rendah dibandingkan senyawa murni.
Penghambatan tertinggi ekstrak etanol 70% maupun ekstrak n-heksana terdapat
pada konsentrasi 200 ppm. Konsentrasi 200 ppm ekstrak etanol 70% dan ekstrak
n-heksana memiliki daya hambat yang tidak berbeda nyata (P<0.05) dengan
vitamin E konsentrasi 200 ppm (36.42%). Nilai vitamin E 200 ppm pada
penelitian ini mampu memberikan daya hambat terhadap pembentukan MDA
sebesar 36.42%. Nilai tersebut lebih rendah dibandingkan dengan penelitian lain
yang dilakukan dengan menggunakan vitamin E sebagai kontrol positif pada
konsentrasi 200 ppm. Satria (2005) melaporkan bahwa pada konsentrasi 200 ppm,
vitamin E mampu menghambat pembentukan MDA sebesar 93.00%, Kartika
(2012) melaporkan bahwa pada konsentrasi 200 ppm, vitamin E mampu
menghambat pembentukan MDA sebesar 49.82%, Martsolich (2007) melaporkan
bahwa pada konsentrasi 200 ppm, vitamin E mampu menghambat pembentukan
MDA sebesar 55.18%, sedangkan Sufriadi (2006) menyebutkan nilai sebesar
84.01% pada konsentrasi yang sama. Hasil yang berbeda ini terjadi karena ada
faktor yang ikut mempengaruhi nilai potensi antioksidasi vitamin E sebagai
kontrol positif. Walupun vitamin E yang dipakai adalah berasal dari stok yang
sama, namun tidak dengan bahan-bahan lainnya. Hal ini memungkinkan adanya
perbedaan kemurnian dan kualitas bahan-bahan tersebut yang dapat
mempengaruhi hasil yang diperoleh. Selain itu metode yang berbeda juga ikut
mempengaruhi lamanya waktu yang digunakan untuk inkubasi asam linoleat.
Pada penelitian Satria (2005) dan Sufriadi (2006), digunakan metode tiosianat,
sedangkan dalam penelitian ini digunakan metode TBA, sehingga perbedaan
waktu inkubasi ini ikut mempengaruhi nilai potensi antioksidasi yang diperoleh.
Selain itu vitamin E mudah teroksidasi, sehingga hal tersebut yang membuat
kemampuan vitamin E sebagai antioksidan berkurang. Seperti yang diungkapkan
Winarno 1998 bahwa vitamin E merupakan vitamin yang larut dalam lemak,
tahan terhadap suhu tinggi tetapi karena bersifat antioksidan vitamin E teroksidasi
terutama apabila ada lemak yang tengik, timah, garam besi dan mudah rusak oleh
sinar matahari.
Selain dengan vitamin E, aktivitas antioksidasi ekstrak daun sirih merah ini
dapat dibandingkan dengan tumbuhan lainnya yang memiliki aktivitas
antioksidasi, contohnya dengan mengkudu dan Physalis peruviana. Kemampuan
antioksidasi ekstrak daun sirih merah dengan pelarut etanol dan n-heksana ini
lebih baik karena di setiap konsentrasinya tidak menunjukkan efek prooksidan
bila dibandingkan dengan buah mengkudu (Morinda citrifolia L.) yang diekstrak
dengan pelarut metanol (Zin et al. 2001). Namun aktivitas antioksidasinya lebih
rendah bila dibandingkan dengan ekstrak etanol 95 % Physalis peruviana
konsentrasi 100 μg/mL (100 ppm) yang sudah memiliki daya hambat
pembentukkan lipid peroksida sebesar 82.3 % (Wu et al. 2005). Jika dibandingkan
dengan pelarut lain, contohnya pelarut air. Ekstrak etanol 70% dan ekstrak n-
heksana daun sirih merah memiliki aktivitas antioksidan yang lebih rendah.
Menurut Alfarabi (2008) pembentukan MDA dapat dihambat sebesar 81.78%
pada konsentrasi 200 mg/10mL dengan menggunakan pelarut air, sementara itu
pada konsentrasi yang sama ekstrak etanol dan ekstrak n-heksana hanya mampu
14
menghambat masing-masing sebesar 52.13% dan 44.13%. Adanya potensi
sebagai antioksidan didasarkan pada senyawa-senyawa yang berfungsi sebagai
antioksidan alami yang terdapat pada daun sirih merah antara lain flavonoid,
saponin, alkaloid, tanin dan steroid. Berdasarkan hasil fitokimia, tiga senyawa
falvonoid, tanin dan alkaloid merupakan senyawa yang dominan terdapat pada
ekstrak etanol 70%. Ketiga senyawa ini yang dominan ada pada ekstrak etanol
70% diduga sebagai penyebab tingginya aktivitas antioksidan ekstrak etanol 70%
dan air dibandingkan ekstrak n-heksana. Kandungan senyawa yang berfungsi
sebagai antioksidan pada ekstrak etanol 70% dan ekstrak air relatif sama, namun
aktifitas antioksidan ekstrak air lebih tinggi dibandingkan ekstrak etanol 70%
diduga karena jumlah senyawa antioksidan pada kedua ekstrak berbeda.
Penentuan Penghambatan (IC50) Ekstrak Etanol 70% dan Ekstrak n-
Heksana Sirih Merah terhadap Enzim Tirosinase
Hasil pengujian penghambatan enzim tirosinase dengan ekstrak etanol 70%
dan ekstrak n-heksana, peningkatan konsentrasi berbanding lurus dengan
peningkatan nilai penghambatan enzim tirosinase. Ekstrak etanol 70% memiliki
nilai penghambatan yang lebih tinggi dibandingkan ekstrak n-heksana, hal ini
menunjukkan bahwa ekstrak etanol 70% memiliki aktivitas yang lebih baik
terhadap penghambatan enzim tirosinase dibandingkan dengan ekstrak n-heksana.
Nilai penghambatan ekstrak etanol 70% konsentrasi 200 ppm (12.78%) dan
ekstrak n-heksana konsentrasi 200 ppm (1.23%) lebih rendah dibandingkan
dengan asam kojat 200 ppm sebesar (91.82%). Dibandingkan dengan hasil
penelitian yang dilakukan (Putri et al. 2010), nilai penghambatan Artocharpus
heterophyllus pada konsentrasi 150 ppm ekstrak metanol Artocharpus
heterophyllus sudah mampu menghambat enzim tirosinase sebesar 125.001%,
sedangkan ekstrak etanol 70% sirih merah pada konsentrasi 1600 ppm baru
mampu menghambat enzim tirosinase sebesar 53.027%. Untuk ekstrak n-heksana
pada konsentrasi 3200 ppm baru dapat menghambat enzim tirosinase sebesar
54.260%. Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas penghambatan enzim tirosinase
dari ekstrak sirih merah rendah. Hal ini disebabkan karena adanya perbedaan jenis
senyawa bioaktif yang terkandung atau jumlah senyawa bioaktif yang dapat
terekstrak oleh masing-masing pelarut.
Ekstrak etanol 70% dan ekstrak n-heksana diuji nilai IC50. Hasil penelitian
IC50 enzim tirosinase menunjukkan bahwa ekstrak etanol 70% daun sirih merah
memiliki nilai IC50 paling rendah (1655 ppm) dibandingkan dengan nilai IC50
ekstrak n-heksana (>2000 ppm). Hasil ini sama seperti yang dilaporkan Thankam
et al. (2012) bahwa ekstrak curcumin yang memiliki nilai IC50 sebesar 31.25 ppm
lebih tinggi aktivitas penghambatannya dibandingkan dengan ekstrak curcumin
yang memiliki nilai IC50 sebesar 56.47 ppm. Hal ini diduga karena kandungan
senyawa flavonoid yang terdapat pada ekstrak etanol 70% lebih berpotensi
sebagai penghambat enzim tirosinase dibandingkan minyak atsiri pada ekstrak n-
heksana. Hal ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan Fransiska (2012) yang
menyatakan bahwa ekstrak kasar etil asetat bunga D. Rosea Cav yang diduga
mengandung flavanoid merupakan penghambatan enzim tirosinase teraktif
dibandingkan dengan ekstrak dan minyak atsiri spesies Asteraceae lain yang
diujikan.
15
Senyawa yang diduga memiliki penghambatan terhadap enzim tirosinase
adalah senyawa flavonoid, di antaranya kuersetin (golongan flavonol),
streppogenin (golongan flavanon), dihidromorin (golongan flavanol), calycosin
(golongan isoflavon), 2,4,2,4-tetrahidrokalkon dan likokalkon (golongan kalkon),
kloroporin (golongan stilben) (Chang 2009). Golongan senyawa flavonoid yang
terdapat pada daun sirih merah yaitu golongan flavonoid flavonol, flavanon,
isoflavon dan auron (Arishandy 2010). Senyawa tersebut memiliki kemiripan
struktur dengan substrat L-Tirosin dan L-DOPA sehingga mengarah kepada
inhibitor kompetitif. Selain itu, minyak atsiri juga memiliki potensi penghambat
aktivitas enzim tirosinase. Minyak atsiri yang terkandung dalam daun sirih merah
adalah golongan monoterpen (α-pinen, α-tuyan, sabinen, ß-mirsen, kamfen) dan
golongan seskuiterpen (trans-kariofilen) (Ngaisah 2010). Kadar minyak atsiri
yang terkandung di dalam daun sirih merah sebesar 0.727% (b/v) (Ngaisah 2010).
Senyawa tersebut diharapkan dapat menghambat secara kompetitif aktivitas enzim
tirosnase. Senyawa golongan flavonoid tersebut dapat terekstrak dalam pelarut
etanol 70%, karena sifat flavonoid yang semi polar sehingga dapat tertarik pada
pelarut semi polar (etanol 70%). Senyawa minyak atsiri dapat larut dalam
senyawa yang kepolararannya rendah, yaitu n-heksana.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Dari uji fitokimia, ekstrak etanol mengandung alkaloid, flavonoid, steroid,
saponin dan tanin sedangkan ekstrak n-heksana mengandung tanin dan saponin.
Ekstrak sirih merah berpotensi sebagai antioksidan dan penghambatan tirosinase
dengan nilai penghambatan pembentukan MDA sebesar 52.13% dan nilai
penghambatan tirosinase dengan IC50 1655 ppm untuk ekstrak etanol, sedangkan
untuk ekstrak n-heksana sebesar 40.13% dan tidak berpotensi sebagai penghambat
tirosinase. Ekstrak etanol memiliki kemampuan menghambat pembentukan
malondialdehida dan enzim tirosinase lebih tinggi dibanding ekstrak n-heksana.
Saran
Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk mengetahui senyawa bioaktif
dari daun sirih merah yang berperan sebagai antioksidan dan inhibitor enzim
tirosinase. Selain itu, perlu dilakukan analisis potensi penghambat enzim
tirosinase daun sirih merah secara in vivo.
DAFTAR PUSTAKA
Agoes G. 2007. Teknologi Bahan Alam. Bandung (ID) : ITB Pr
Alfarabi M. 2010. Kajian antidiabetogenik ekstrak daun sirih merah (Piper
crocatum) in vitro [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
16
Arishandy DNAT. 2010. Isolasi dan identifikasi senyawa flavonoid dari daun sirih
merah (Piper betle L. var Rubrum) [skripsi]. Malang (ID) : Universitas
Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim Malang
[AOAC] The Association of Official Analytical Chemists. 2006. Official Methods
of Analysis. Ed ke-18. Washington DC (US): Association of Official
Analytical Chemist Publisher.
Batubara I, Darusman LK, Mitsunaga T, Rahminiwati M, Djauhari E. 2010.
Potency of indonesia medicinal plants as tyrosinase inhibitor and
antioxidant agent. J.Biol.Sci. 10:138-144.
[BPOM RI] Badan Pengawasan Obat dan Makanan Republik Indonesia. 2004.
Ekstrak Tumbuhan Indonsia Vol.2. Jakarta (ID):BPOM.
Chang TS. 2009. An updated review of tyrosinase inhibitor. J Mol Sci. 10:2440-
2475.
Dangles O, Fargeix G, Dufour C. 2000. Antioxidant properties of anthocyanins
and tannins: a mechanistic investigation with catechin and the 3’,4’,7-
trihydroxyflavylium ion. Journal Royal Society of Chemistry. 2:1653-1663.
[Depkes] Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2008. Farmakope Herbal
Indonesia Edisi 1. Jakarta (ID) : Departemen Kesehatan Republik Indonesia.
[Depkes] Departemen Kesehatan RI. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak
Tumbuhan Obat. CetakanPertama. Jakarta : Depkes RI. Hal. 10-11
Fitrie AA. 2004. Histologi dari melanosit.e-USU Repository Universitas Sumatera
Utara 5:16.
Fransiska MA. 2012. Penapisan Inhibitor Tirosinase pada Empat Spesies famili
Asteraceae Chrysantemum morifolium R, Gerbera jamesonil A, Dahlia
rosea Cav dan Tagetes erecta. 1(1) 36-42
Gheldof N, Wang Xiao-Hong, Engeseth NJ. 2002. Identification and
quantification of antioxidant components of honeys from various floral
sources. Journal of Agriculturaland Food Chemistry. 50 : 5870-5877
Guenther E. 1987. Minyak Atsiri. Jilid 1. Jakarta (ID) : UI Press
Hans, W Heldt. 2005. Plant Biochemistry. Elsevier Inc. California.
Harborne. 1987. Metode Fitokimia. Padmawinata K, penerjemah; Bandung (ID) :
Penerbit ITB
Hartanti L, Setiawan HK. 2009. Inhibitory potential of some synthetic cinnamic
acid derivatives towards tyrosinase enzyme. Indo J Chem. 9:158-168.
Hasanah SNR. 2008. Aktivitas ekstrak etil asetat daun dewandaru (Eugenia
unifloria L.) sebagai agen pengkelat logam Fe dan penangkap
malonaldehida (MDA) [skripsi]. Surakarta (ID) : Fakultas Farmasi
Universitas Muhammadiyah Surakarta.
Hernani, Rahardjo M. 2005. Tanaman Berkhasiat Antioksidasi. Jakarta (ID) :
Penebar Swadaya.
Kang KA, Lee KH, Chae SW, Zhang R, Jung, MS, Lee YK. 2005. Eckol isolated
from Ecklonia cava attenuates oxidative stress induced cell damage in lung
fibroblast cells. FEBS Lett. 579: 6295-6304.
Kartika Y. 2013. Aktivitas antioksidan campuran ekstrak daun sirih merah dan
kulit kayu manis [skripsi]. Bogor (ID) : Institut Pertanian Bogor
Katno, Kusumadewi AP, Sutjipto. 2008. Pengaruh waktu pengeringan terhadap
kadar tanin daun jati belanda (Guazoma ulmifolia Lamk.). The Journal of
Indonesian Medicinal Plant. 1(1) : 38-46
17
Kikuzaki H, Nakatani K. 1993. Antioxidant effect of some ginger constituents. J
Food Sci. 58: 1407-1410.
Kuswardhani DS. 2007. Mempelajari proses pemekatan karotenoid dari minyak
sawit kasar dengan metode fraksinasi bertahap [skripsi]. Bogor (ID) :
Institut Pertanian Bogor.
Marlina PWN. 2008. Konsentrasi flavonoid dan lethal concentration 50 (LC50)
ekstrak daun sirih merah (Piper crocatum) [skripsi]. Bogor (ID) : Institut
Pertanian Bogor.
Martsolich KA. 2007. Potensi antioksidasi ekstrak air dan ekstrak etanol 70 %
daun jati belanda (Guazuma ulmifoliaLamk.) [skripsi]. Bogor (ID):
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor.
Miyazawa M. 2007. Inhibitory compound of tyrosinase activity from the sprout of
Polygonium hydropiper L.(Benitade). Biology Pharmaceutical Bulletin.
.30: 595-597.
Murray, Robert K, Granner DK, Mayes, PA, Rodwell VW. 2003. Biokimia
Harper Edisi 25. Alih Bahasa Andry Hartono. Jakarta : EGC
Ngaisah S. 2010. Identifikasi dan uji aktifitas antibakteri minyak atsiri daun sirih
merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) asal magelang [skripsi]. Surakarta (ID)
: Universitas Sebelas Maret
Nugroho BW, Dadang, Prijono D. 2000. Pengembangan dan Pengembangan
Insektisida Alami. Bogor (ID) : Pusat Kajian Pengendalian Hama Terpadu
IPB.
Pranakusumanagara. 1998. Rahasia dibalik sirih merah dan ritual kecantikan
mojang parahiangan [internet]. [diunduh 2014 Juni 10]. Tersedia pada :
http://www.mojangjajaka. files.wordpress.com
Raharjo S. 2004. Oksidasi Lemak Pada Makanan : Implikasinya Pada Mutu
Makanan dan Kesehatan [skripsi]. Yogyakarta (ID) : Universitas Gadjah
Mada press.
Rudyanto M, Hartanti L. 2008. Sintesis beberapa turunan asam sinamat: pengaruh
gugus yang terikat pada cincin aromatik terhadap kereaktifan benzaldehida.
Indo. J. Chem. 8 (2): 226230
Safithri M, Fahma F. 2005. Potensi rebusan daun sirih merah (Piper crocatum)
sebagai senyawa antihiperglikemia pada tikus putih galur Sprague Dawley.
Laporan penelitian. Bogor: LPPM IPB
Safithri M et al. 2012. Analisis Proksimat dan toksisitas akut ekstrak daun sirih
merah yang berpotensi sebagai antidiabetes. J. Gizi dan Pangan. 7(1) 43-
48.
Safithri M. 2012. Kajian mekanisme antihiperglikemik campuran ekstrak daun
sirih merah dan kulit kayu manis yang berpotensi sebagai minuman
fungsional [disertasi]. Bogor (ID) : Institut Pertanian Bogor.
Salim A. 2006. Potensi rebusan daun sirih merah (Piper crocatum) sebagai
senyawa antihiperglikemia pada tikus galur sparague-dawley. [skripsi].
Bogor (ID) : Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut
Pertanian Bogor.
Satria E. 2005. Potensi antioksidan dari daging buah muda dan daging buah tua
mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.). [skripsi]. Bogor
(ID) : Program Studi Biokimia FMIPA IPB.
18
Sufriadi A. 2006. Manfaat daun kayu manis (Cinnamomum burmanni) terhadap
khasiat antioksidasi mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.)
selama penyimpanan. [skripsi]. Bogor (ID) : Program Studi Biokimia
FMIPA IPB.
Suharmiati, Maryani. 2003. Daun dewa dan sambung nyawa. Jakarta : Agromedia
Pustaka
Supriyanti FMT. 2012. Studi inhibisi metanol kulit batang Artocarpus sp dalam
mencegah hiperpigmentasi kulit. Jurnal Pendidikian Kimia FPMIPA UPI
Syamsuni HA. 2006. Ilmu Resep. Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.
Hal166-171
Thiele JJ, Ekanayake-Mudiyanselage S. 2007. Vitamin E in human skin: Organ-
specific physilology and considerations for its use in dermatology. Mol
Aspects Med. 28: 646-667
Winarno FG. 1997. Kimia Pangan dan gizi. PT. Gramedia : Jakarta.
Winarno FG. 1980. Pengantar Teknologi Pangan. Jakarta: Gramedia
Wu JS, Ng LT, Huang YM, Lin DL, Wang SS, Huang S. 2005. Antioxidant
activities of Physalis peruviana. Biol. Pharm. Bull. 28(6) : 963-966.
Zin MZ, Hamid AA, Osman A. 2002. Antioxidative activity of extracts from
mengkudu (Morinda citrifoliaL.) root, fruit, and leaf. Food Chemistry.
78:227-231.
20
Lampiran 1 Tahapan umum penelitian
Lampiran 2 Ekstraksi daun sirih merah
Lampiran 3 Pengujian fitokimia
Lampiran 4 Penentuan waktu inkubasi maksimum asam linoleat
Daun sirih merah
Ekstraksi daun sirih merah dengan
etanol 70% dan n-heksan
Analisis Fitokimia Analisis aktivitas
antioksidan metode
TBA
Analisis inhibitor
tirosinase
30 gram daun sirih merah
ditambahkan etanol 70% untuk
ekstraksi etanol dan n-heksan untuk
ekstrak n-heksan sebanyak 300 mL
Dimaserasi 24
jam suhu ruang Rotavapor
50°C
6 mL asam linoleat dalam etanol 99,8%
6 mL buffer fosfat
3 mL akuades
Campuran dipipet kedalam
botol gelap, diinkubasi 40ºC
Ekstrak etanol 70% dan n-heksan
Alkaloid Flavonoid Tanin Saponin Steroid dan
triterpenoid
21
Lampiran 5 Analisis aktivitas antioksidan dari metode TBA
2 mL buffer fosfat 0,1 M pH 7
20 mL asam linoleat 50 mM
Diinkubasi 8 hari
2 mL TCA 20%
2 mL TBA 1% dalam asam asetat 50%
Diinkubasi 100ºC selama 10
Menit, didinginkan
1 mL diambil setiap 24 jam, ditambahkan
2 mL TCA 20% dan 2 mL TBA 1%
dalam asam asetat 50%
Sampel diinkubasi 100°C selama 10
menit kemudian didinginkan
Disentrifus 3000 rpm
selama 15 menit
Diukur serapannya pada
panjang gelombang 532 nm
1 mL ekstrak etanol dan n-heksan daun sirih merah (25 ppm, 50 ppm,
75 ppm, 100 ppm, 200 ppm), vitamin E 200 ppm dan akuades
Diinkubasi 40ºC
Masing-masing diambil 1 mL
Larutan
Disentrifus 3000 rpm selama 15
menit, diukur panjang gelombang 532
nm
22
Lampiran 6 Kadar air simplisia daun sirih merah Ulangan BobotCawan
Kosong (g)
Bobot
Sampel (g)
Bobot Cawan +
Sampel akhir (g)
Kadar Air
(%)
Rerata
Kadar Air
(%)
1 35.96 2.00 37.80 8.0
2 33.28 2.00 33.13 7.5 7.75 ± 0.35
%Bobot kering (BK) =
x 100%
=
x 100%
= 92% % Kadar air = 100 - %BK
= 100 - 92% = 8%
Lampiran 7 Rendemen simplisia daun sirih merah Jenis sampel Bobot basah (g) Bobot kering (g) %Bobot basah/bobot kering
Daun sirih merah 873.03 187.41 21.47
% rendemen simplisia = Bobot kering (g) x 100 % Bobot basah (g)
= 187.41 x 100% = 21.47 % 873.03
Lampiran 8 Rendemen simplisia ekstrak etanol 70% dan n-heksan sirih merah Ekstrak ulangan Bobot
sampel
(g)
Bobot
terkoreksi
(g)
Bobot ekstrak (g) %Rendemen ekstrak
Etanol 1 30 27.675 4.80 17.344
Etanol 2 30 27.675 5.06 18.284
n-heksan 1 30 27.675 2.29 8.275
n-heksan 2 30 27.675 0.41 1.482
Bobot terkoreksi = (bobot sampel) – (bobot sampel x kadar air) = 30 – (30 x 7.75%) = 30 – 2.325 = 27.675 gram % rendemen = Bobot ekstrak (g) x 100 % Bobot terkoreksi (g)
= 4.80 x 100% = 17.344 % 27.675
Lampiran 9 Grafik hubungan antara konsentrasi inhibitor ekstrak etanol 70%
dan ekstrak n-heksana terhadap persen inhibisi
y = 0.022x + 13.593 R² = 0.9104
-50
0
50
100
0 1000 2000 3000 4000
% in
hib
isi
Konsentrasi (ppm)
inhibisi
Inhibisi
Linear (inhibisi)
Linear (Inhibisi)
23
Lampiran 10 Fitokimia ekstrak etanol 70% dan n-heksana sirih merah Golongan
senyawa
Hasil ekstrak Keterangan Gambar
Etanol n-heksana
70% Etanol n-heksana
70%
Flavonoid + - endapan hijau
Alkaloid + - Meyer : putih
Dragendroff : merah
Wagner : coklat
Saponin + + Gelembung
Tanin + - Hijau kehitaman
Steroid dan + + Endapan hijau
Triterpenoid
Ket : (+) mengandung senyawa; (-) tidak mengandung senyawa
Lampiran 11 Hasil absorban kurva standar 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP)
[TMP] (µM) A1 A2 Rerata ± SD 0 0 0 0
0.5 0.05 0.044 0.05 ± 0.000
1 0.098 0.083 0.09 ± 0.000
2 0.196 0.177 0.19 ± 0.012
4 0.369 0.343 0.36 ± 0.000
5 0.457 0.394 0.43 ± 0.008
6 0.522 0.498 0.51 ± 0.001
8 0.722 0.673 0.70 ± 0.002
24
Lampiran 12 Kurva standar 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP)
Lampiran 13 Absorban inkubasi kadar MDA (µM) terhadap waktu (λ = 532 nm) Hari A1 A2 A3 [MDA]1 [MDA]2 [MDA]3 Rerata ± SD
0 0.130 0.133 0.122 -3.758 -3.667 -4.000 -3.808 ± 0.172
1 0.220 0.226 0.210 -1.030 -0.848 -1,333 -1.070 ± 0.245
2 0.307 0.309 0.323 1.606 1,667 2.091 1.788 ± 0.264
3 0.405 0.411 0.418 4.576 4.758 4.970 4.768 ± 0.197
4 0.569 0.573 0.577 9.545 9.667 9.788 9.667 ± 0.122
5 0.625 0.633 0.620 11.242 11.485 11.091 11.273 ± 0.199
6 0.844 0.853 0.839 17.879 18.152 17.727 17.919 ± 0.215
7 0.510 0.515 0.521 7.758 7.909 8.091 7.919 ± 0.167
8 0.430 0.444 0.410 5.333 5.758 4.727 5.273 ± 0.518
9 0.305 0.311 0.310 1.545 1.727 1.697 1.656 ± 0.098
(Yayuk 2013)
Kadar MDA hari ke-0 (A1) y = 0.254 + 0.033x 0.130 = 0.254 + 0.033x x = -3.758
Lampiran 14 Aktivitas antioksidasi ekstrak etanol 70% dan ekstrak n-heksana
daun sirih merah metode TBA (λ = 532 nm) Ekstrak Konsentrasi (ppm) [%Inhibisi]1 [%inhibisi]2 Daya hambat (%)
K (-) 0.000 0.000 0.00 ± 0.00c
Vit E (200) 18.62 27.85 36.42 ± 5.01ab
25 10.80 29.11 19.95 ± 12.95bc
Etanol 70% 50 37.61 13.55 25.58 ± 13.55b
100 40.92 34.72 37.82 ± 4.38ab
200 45.52 58.73 52.13 ± 9.34a
K (-) 0.000 0.000 0.00 ± 0.00c
Vit E (200) 32.950 27.832 36.42 ± 5.01a
n-heksana 25 20.901 32.247 26.65 ± 8.09ab
50 2.391 51.447 30.86 ± 10.65ab
100 18.739 16.015 17.47 ± 1.95b
200 43.941 36.265 40.13 ± 5.34a
Daya hambat (%) K(+) =
x 100%
=
x 100% = 27.832%
y = 0.086x + 0.0065 R² = 0.9988
0
0.2
0.4
0.6
0.8
0 5 10 Ab
sorb
ansi
(5
32
nm
)
Konsentrasi 1,1,3,3 tetrametoksipropana (µM)
absorbansi
Linear (absorbansi)
25
Lampiran 15 Analisis perhitungan IC50 difenolase ekstrak etanol 70% dan
ekstrak n-heksana daun sirih merah Ekstrak Konsentrasi A1 A2 Rata-rata % Inhibisi IC50
Absorbansi (ppm)
Etanol 70% K (-) 0.873 0.912 0.892 -
Asam kojat (200) 0.074 0.072 0.073 91.816%a
20 0.830 0.857 0.843 5.493%g
200 0.776 0.781 0.778 12.780%f
800 0.487 0.492 0.489 45.179%e 1655
1600 0.406 0.432 0.419 53.027%d
2400 0.260 0.285 0.272 69.507%c
3200 0.208 0.213 0.210 76.457%b
n-Heksana K (-) 0.873 0.912 0.892 -
Asam kojat (200) 0.074 0.072 0.073 91.816 %a
20 0.923 0.937 0.930 - 4.260 %g
200 0.856 0.906 0.881 1.233 %f
800 0.813 0.860 0.836 6.278 %e 3090.5
1600 0.692 0.761 0.726 18.609%d
2400 0.531 0.540 0.535 40.022%c
3200 0.412 0.404 0.408 54.260%b
Persamaan Garis
y = 0.022 x + 13.59, R2 = 0.910 (ekstrak etanol)
y = 0.018 x – 5.630, R2 = 0.918 (ekstrak n-heksana)
% Inhibisi =
× 100 %
=
× 100 %
= 91.816%
Lampiran 16 Analisis statistika terhadap penghambatan MDA
27
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Cirebon pada tanggal 26November 1992 dari pasangan
Bapak Iwan Gunawan dan Ibu Eli.Penulis merupakan anak pertama dari dua
bersaudara.Riwayat pendidikan penulis dimulai dari SD Kartika III/5/6 Cirebon
tahun 1998-2004, melanjutkan pendidikan ke SMPN 5 Cirebon tahun 2004-2007,
dan menyelesaikan pendidikan menengah atas di SMAN 2 Cirebontahun
2010.Pada tahun yang sama, penulis meneruskan pendidikan di Departemen
Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB melalui jalur
SNMPTN undangan.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis mengikuti organisasi kampus
sebagai anggota divisi biro foundrising CREBs (Community of Research and
Education in Biochemistry) tahun 2012-2014.Penulispernah mengikuti berbagai
kepanitiaan seperti Lomba Karya Ilmiah Populer (LKIP) tahun2013, Seminar
Kesehatan tahun 2012,Masa Pengenalan Departemen tahun 2013, dan
Biochemistry Champion League tahun 2013. Penulis juga pernah menjadi asisten
praktikum Biokimia Umum, Pengantar Penelitian Biokimia dan Struktur dan
Fungsi Subselular pada tahun ajaran 2013/2014. Pada tahun 2013, penulis
melaksanakan praktik lapangan di Laboratorium Pengujian, Balai Besar Penelitian
dan Pengembangan Pascapanen Bogor dengan judul Pembuatan dan Pengujian
Sifat Fisiko-Kimia Kitosan dari Limbah Kulit Udang.