ALBA CENÉLIA MATOS DA SILVA

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TESE SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE

DOUTOR EM CIÊNCIAS

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

Universidade Federal do Rio de Janeiro

2010

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ii

ALBA CENÉLIA MATOS DA SILVA

EEEfffeeeiiitttooosss dddooosss eeesssttteeerrróóóiiidddeeesss gggooonnnaaadddaaaiiisss fffeeemmmiiinnniiinnnooosss eee dddooo

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TESE SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE

DOUTOR EM CIÊNCIAS

ORIENTADORA: Profª. Denise Pires de Carvalho CO-ORIENTADORA: Profª Andrea Claudia Freitas Ferreira

Rio de Janeiro 2010

iii

SILVA, ALBA CENÉLIA MATOS

Efeitos dos esteróides gonadais femininos e do fitoestrógeno Trifolium pratense sobre a massa corporal e função tireóidea de ratas Wistar ovariectomizadas

Rio de Janeiro, UFRJ, 2010 xviii: 121f Orientadora: Denise Pires de Carvalho Co-orientadora: Andrea Claudia Freitas Ferreira Tese de Doutorado para obtenção do Grau de Doutor em Ciências

Biológicas (Fisiologia) Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

1 – Trifolium pratense 2 – Função tireóidea 3 – Massa corporal 4 – Reposição hormonal

iv

Este trabalho foi realizado no Laboratório de Fisiologia Endócrina Doris Rosenthal, do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a orientação da professora Denise Pires de Carvalho, e co-orientação da professora Andrea Claudia Freitas Ferreira, com apoio financeiro das seguintes instituições: Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro; (FAPERJ); Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior; (CAPES); Programa de Apoio a Núcleos de Excelência; (PRONEX-MCT); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico. (CNPq).

v

Essa tese é dedicada às pessoas especiais que fazem parte de minha

vida: minhas filhas, meus pais e minhas irmãs.

vi

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por sempre guiar meus passos e colocar pessoas

especiais em meu caminho, tornando essa passagem muito agradável e

prazerosa.

Às vezes somos agraciados pela presença de anjos em nossas vidas sendo

a minha mãe um desses seres tão maravilhosos, pois sempre procurou do seu

modo me incentivar e ajudar na realização desse sonho.

Às minhas filhas, Maria Carolina e Ana Cristina, que são verdadeiras jóias

preciosas, por fazerem valer a pena os esforços para a realização de meus

projetos.

À minha família por estar sempre presente em minha vida compartilhando

todos os momentos alegres e também os tristes. Apoiando-me e dando força nos

momentos difíceis.

À amiga Tânia Lemos Mouço, por ser a pessoa que colocou o primeiro tijolo

na construção de meu futuro profissional; acreditando em meu potencial e se

comprometendo na realização desse meu projeto.

À minha amiga Rosangela de Fátima, outro anjo em minha vida, por

sempre ter as palavras certas em momentos tão difíceis.

À minha orientadora, Denise Pires de Carvalho, pessoa a quem muito

admiro e respeito pela forma com que nos guia em nosso caminho além do modo

como nos faz ver a pesquisa.

À professora Vânia Maria Corrêa da Costa, que colaborou com esta tese,

revisando-a com grande competência e sabedoria.

vii

À professora Doris Rosenthal, a pessoa que tornou possível a realização de

tantos sonhos, por sua coragem e espírito científico.

À amiga Andrea, por quem guardo imenso carinho, respeito e admiração

por sua determinação e empenho em tornar a pesquisa algo muito prazeroso.

À professora Tamar Frankenfeld, pelo apoio e idéias que ajudaram na

elaboração final do trabalho.

À amiga Michelle, que sempre procurou com palavras certas e conselhos

sábios, estimular-me na realização desse trabalho.

À amiga Daniele, por todo o carinho e apoio nos vários experimentos

realizados, sem demonstrar cansaço.

Ao amigo Rodrigo por tornar as idas ao laboratório tão agradáveis e

interessantes.

Ao amigo Alexandre Lopes Lourenço, pelo qual tenho enorme carinho e

admiração, e que surgiu no momento certo em minha vida fazendo grande

diferença no meu caminho.

Aos amigos de trabalho, Monique Leandro, Luciene Cardoso, Maria Glória

Ginabreda, Thiago Pantaleão, Renata Lopes, Bruno Moulin, Valmara Pereira,

Mônica Mühlbauer, Álvaro Padron, Elaine de Souza, Maria Carolina, William

Braga, Anna Lúcia Rocha, Carlos Frederico Gonçalves, Mariana Lopes, Felippe

Mousovich, Iracema Araujo que com grande alegria tornaram a realização dessa

tese uma tarefa muito agradável.

Aos técnicos Advaldo Nunes, Norma de Araújo e José Humberto, pelo

apoio nas várias atividades realizadas ao longo desses anos.

viii

Ao amigo Wagner Nunes, essa pessoa tão especial que faz a diferença na

vida de todos os componentes do Laboratório de Fisiologia Endócrina.

Aos funcionários Sandra Brito e Edna Souza, pelos serviços prestados que

contribuíram para a realização e finalização desse trabalho.

ix

LISTA DE FIGURAS E TABELAS Figura 1 – Representação esquemática de um folículo tireóideo. Esquema do arquivo do Laboratório de Fisiologia Endócrina Doris Rosenthal. Figura 2 – Esquema representativo do transporte ativo do iodeto do sangue para o interior da célula folicular (Adaptado de Kaminsky et al., 1994; Smanik et al., 1996). Figura 3 - Esquema representativo da biossíntese dos hormônios tireóideos. Tg: tireoglobulina, TPO: tireoperoxidase, DuOx: enzima oxidase dual; T4: tiroxina; T3: triiodotironina; TSH-R: receptor do hormônio tireotrófico; NIS: cotransportador de Na+ e I-, Na+/K+-ATPase: bomba sódio potássio ATPase (Esquema do arquivo do Laboratório de Fisiologia Endócrina Doris Rosenthal). Figura 4 – Esquema representativo da secreção dos hormônios tireoideanos. T4: tiroxina, T3: triiodotironina, TG: tireoglobulina, MIT: monoiodotirosina, DIT: diiodotirosina, NIS: cotransportador de Na+ e I- (Esquema do arquivo do Laboratório de Fisiologia Endócrina Doris Rosenthal). Figura 5 – Estrutura e vias de ativação e inativação das iodotironinas pelas enzimas desiodases (adaptado de Bianco et al., 2008). Figura 6 – Esquema representativo do eixo hipotálamo-hipófise-tireóide (Esquema do arquivo do Laboratório de Fisiologia Endócrina Doris Rosenthal). Figura 7 – Trifolium pratense. Figura 7A – Esfregaço vaginal de rata nas fases do ciclo estral. Figura 7B – Efeitos da administração de E2 e Tp associado ou não a E2 por 60 dias sobre o tecido vaginal de ratas ovariectomizadas por 74 dias. Figura 8A – Esquema representativo da metodologia experimental do estudo 1 por 23 dias de castração. Figura 8B – Esquema representativo da metodologia experimental do estudo 1 por 74 dias de castração. Figura 8C – Acompanhamento da massa corporal em experimento-piloto para a escolha dos melhores tempos de tratamento para o estudo 2. Figura 8D – Esquema representativo da metodologia experimental do estudo 2

x

Figura 9 – Efeitos da administração de E2 e TP associado ou não a E2 por 16 dias sobre o peso uterino absoluto de ratas ovariectomizadas por 23 dias. Figura 10 - Efeitos da administração de E2 e TP associado ou não a E2 por 60 dias sobre o peso uterino absoluto de ratas ovariectomizadas por 74 dias. Figura 11 - Efeitos da administração de E2 e Tp associado ou não a E2 por 16 dias sobre os níveis séricos de T4 de ratas ovariectomizadas por 23 dias. Figura 12 - Efeitos da administração de E2 e Tp associado ou não a E2 por 60 dias sobre os níveis séricos de T4 de ratas ovariectomizadas por 74 dias. Figura 13 - Efeitos da administração de E2 e Tp associado ou não a E2 por 16 dias sobre os níveis séricos de T3 de ratas ovariectomizadas por 23 dias. Figura 14 - Efeitos da administração de E2 e Tp associado ou não a E2 por 60 dias sobre os níveis séricos de T3 de ratas ovariectomizadas por 74 dias. Figura 15 - Efeitos da administração de E2 e Tp associado ou não a E2 por 16 dias sobre os níveis séricos de TSH de ratas ovariectomizadas por 23 dias. Figura 16 - Efeitos da administração de E2 e TP associado ou não a E2 por 60 dias sobre os níveis séricos de TSH de ratas ovariectomizadas por 74 dias. Figura 17 - Efeitos da administração de E2 e TP associado ou não a E2 por 16 dais sobre os níveis séricos de leptina de ratas ovariectomizadas por 23 dias. Figura 18 - Efeitos da administração de E2 e TP associado ou não a E2 por 60 dias sobre os níveis séricos de leptina de ratas ovariectomizadas por 74 dias. Figura 19 - Efeitos da administração de E2 e TP associado ou não a E2 por 16 dias sobre o conteúdo tireóideo de radioiodo após 15 minutos de sua administração a ratas ovariectomizadas por 23 dias. Figura 20 - Efeitos da administração de E2 e TP associado ou não a E2 por 60 dias sobre o conteúdo tireóideo de radioiodo após 2 horas de sua administração a ratas ovariectomizadas por 74 dias. Figura 21 - Efeitos da administração de E2 e TP associado ou não a E2 por 60 dias sobre a atividade tireoperoxidase de oxidação do iodeto em ratas ovariectomizadas por 74 dias. Figura 22 - Efeitos da administração de E2 e TP associado ou não a E2 por 16 dais sobre a atividade desiodase tipo 1 hipofisária em ratas ovariectomizadas por 23 dias.

xi

Figura 23 - Efeitos da administração de E2 e TP associado ou não a E2 por 16 dias sobre a atividade desiodase tipo 1 tireóidea em ratas ovariectomizadas por 23 dias. Figura 24 - Efeitos da administração de E2 e TP associado ou não a E2 por 16 dias sobre a atividade desiodase tipo 1 hepática em ratas ovariectomizadas por 23 dias. Figura 25 - Efeitos da administração de E2 e TP associado ou não a E2 por 16 dias sobre a atividade desiodase tipo 1 renal em ratas ovariectomizadas por 23 dias. Figura 26 - Efeitos da administração de E2 e TP associado ou não a E2 por 60 dias sobre a atividade desiodase tipo 1 hepática em ratas ovariectomizadas por 74 dias. Figura 27 - Efeitos da administração de E2 e TP associado ou não a E2 por 60 dias sobre a atividade desiodase tipo 1 hipofisária em ratas ovariectomizadas por 74 dias. Figura 28 - Efeitos da administração de E2 e TP associado ou não a E2 por 60 dias sobre a atividade desiodase tipo 1 tireóidea em ratas ovariectomizadas por 74 dias. Figura 29 - Efeitos da administração de E2, PG associado ou não a E2 sobre o ganho de massa corporal de ratas ovariectomizadas por 6, 9, 11, 13 e 15 dias. Figura 30 - Efeitos da ovariectomia sobre a massa uterina de ratas wístar em diferentes tempos de castração (6, 10, 11, 13 e 15 dias). Figura 31 - Efeitos da administração de E2, PG, associado ou não a E2 sobre os níveis séricos de leptina em ratas Ovx por 6 dias. Figura 32 - Efeitos da administração de E2, PG, associado ou não a E2 sobre os níveis séricos de leptina em ratas Ovx por 15 dias. Figura 33 - Efeitos da administração de E2, PG, associado ou não a E2 sobre os níveis séricos de estradiol em ratas Ovx por 15 dias. Figura 34 - Efeitos da administração de E2, PG, associado ou não a E2 sobre os níveis séricos de progesterona em ratas Ovx por 15 dias. Figura 35 - Efeitos da administração de E2, PG, associado ou não a E2 sobre os níveis séricos de T4 de ratas ovariectomizadas por 15 dias.

xii

Figura 36 - Efeitos da administração de E2, PG, associado ou não a E2 sobre os níveis séricos de T3 de ratas ovariectomizadas por 15 dias. Figura 37 - Efeitos da administração de E2, PG, associado ou não a E2 sobre a atividade desiodase tipo 2 no tecido adiposo marrom (BAT) em ratas Ovx por 6 dias. Figura 38 - Efeitos da administração de E2, PG, associado ou não a E2 sobre a atividade desiodase tipo 2 no tecido adiposo marrom (BAT) em ratas Ovx por 15 dias. Figura 39 - Efeitos da administração de E2, PG, associado ou não a E2 sobre a atividade desiodase tipo 2 na hipófise em ratas Ovx por 6 dias. Figura 40 - Efeitos da administração de E2, PG, associado ou não a E2 sobre a atividade desiodase tipo 2 na hipófise em ratas Ovx por 15 dias. Figura 41 - Efeitos da administração de E2, PG, associado ou não a E2 sobre a atividade desiodase tipo 2 no hipotálamo em ratas Ovx por 6 dias. Figura 42 - Efeitos da administração de E2, PG, associado ou não a E2 sobre a atividade desiodase tipo 2 no hipotálamo em ratas Ovx por 15 dias. Tabela 1: Ganho de massa corporal em ratas ovariectomizadas por 23 dias tratadas com E2, TP ou ambos. Os dados estão comparados ao grupo Sham. Tabela 2: Ganho de massa corporal de ratas ovariectomizadas por 74 dias tratadas com E2, TP ou ambos. Os dados estão comparados ao grupo Sham. Tabela 3: Peso absoluto da glândula tireóide em ratas ovariectomizadas por 23 dias tratadas com E2, TP ou ambos. Os dados estão comparados ao grupo Sham. Tabela 4: Peso absoluto da glândula tireóide em ratas ovariectomizadas por 74 dias tratadas com E2, TP ou ambos. Os dados estão comparados ao grupo Sham.

xiii

LLLIIISSSTTTAAA DDDEEE AAABBBRRREEEVVVIIIAAATTTUUURRRAAASSS

A - Absorbância

Ac - Anticorpo

AMPc- Adenosina monofosfato cíclico

BAT – Tecido adiposo marrom

BSA – Albumina bovina sérica

3,3’-T2 – 3,3’-diiodotironina

d - Dia

D1 – Iodotironina desiodase tipo I

D2 – Iodotironina desiodase tipo II

D3 – Iodotironina desiodase tipo III

DIT – Diiodotirosina

DTT – Ditiotreitol

DuOx – enzima oxidase dual

E2 - 17 β-estradiol

ER – Receptor de estrogênio

ERE – Elemento de resposta ao estrogênio

FRTL-5 – Linhagem celular imortalizada originária de tireóide de rato Fischer

FSH – Hormônio folículo estimulante

HT – Hormônio tireóideo

LH – Hormônio luteinizante

MCT – Transportador monocarboxilato

MCT-8 – Transportador monocarboxilato 8

MIT – Monoiodotirosina

Na+/K+-ATPase – Sódio potássio adenosina trifosfatase

NIS – Co-transportador Na+/I-

NTCP – Polipeptídeos co-transportadores de taurocolatos de Na+

OATP – Polipeptídeos transportadores de ânion orgânico

Ovx - Ovariectomizada

p.c - Peso corporal

xiv

PG - Progesterona

PRA – Receptores do tipo A de progesterona

PRB – Receptores do tipo B progesterona

PTU – Propiltiouracil

RIE – Radioimunoensaio

RNAm – ácido ribonucléico mensageiro

rT3 – 3,3’,5’ triiodotironina reversa (T3 reverso)

sc - Subcutâneo

SERMs – Moduladores seletivos do receptor de estrogênio

SNC – Sistema nervoso central

T3 – 3,5,3’triiodotironina

T4 – 3,5,3’,5’ tetraiodotironina ou tiroxina

TBG – Globulina ligadora de tiroxina

TCA – Ácido tricloroacético

Tg - Tireoglobulina

Tp – Trifolium pratense

TPO – Tireoperoxidase

TR – Receptor de hormônio tireóideo

TRE – Elemento responsivo a hormônio tireóideo

TRH – Hormônio liberador de tireotrofina

TSH – Hormônio estimulador da tireóide ou tireotrofina

TTR – transtiretina.

xv

RESUMO

A obesidade é um problema crescente de saúde pública, estando associada a diversas doenças cardiovasculares e ao diabetes mellitus. Uma vez que os hormônios gonadais e tireóideos são importantes reguladores do metabolismo energético, decidimos estudar o efeito dos hormônios gonadais e do fitoestrógeno Trifolium pratense (Tp) sobre a função tireóidea e o ganho de massa corporal em ratas ovariectomizadas. No 1º estudo, ratas Wistar foram dividas em cinco grupos: Sham (S), ovariectomizadas (Ovx) e ovariectomizadas tratadas por 16 ou 60 dias com E2 (5,0µg/100g pc, sc), Tp (500mg/kg pc, gavagem) ou Tp+E2. Após 7 e 14 dias da ovariectomia, os tratamentos acima foram iniciados, totalizando 23 e 74 dias de ovariectomia. No 2º estudo, as ratas foram dividas em: Sham (S), ovariectomizadas (Ovx) e ovariectomizadas tratadas por 6 e 15 dias com E2 (0,7µg/100g pc,sc), PG (250µg/100g pc,sc) ou PG+E2. O tratamento foi iniciado 24h após a ovariectomia. Ovariectomia por 23 ou 74 dias aumentou a massa corporal e leptina sérica. Reposição com E2, associada ou não ao Tp, reverteu o aumento do ganho de massa e da leptinemia. O tratamento com Tp a curto e longo prazo não evitou o ganho excessivo de massa corporal. A leptinemia desses grupos não difere do grupo S. O tratamento com E2 e Tp+E2 levou ao aumento do peso uterino em relação ao grupo Ovx nos dois períodos, o que não ocorreu nas ratas tratadas com Tp. Não detectamos alteração da função tireóidea (captação de radioiodo, atividade tireoperoxidase e T4 sérico) em quaisquer dos grupos, embora o T3 sérico esteja aumentado nos animais tratados com E2 e Tp+E2 a curto prazo e Tp+E2 a longo prazo. Encontramos redução do TSH sérico no grupo Tp+E2 a curto prazo, de acordo com T3 aumentado. Não houve alteração da atividade desiodase tipo 1 nos tecidos estudados, exceto da tireóide, que está aumentada no grupo Tp a longo prazo. No 2º estudo, aos 6 dias de ovariectomia, não há diferença no ganho de massa corporal e níveis séricos de leptina nos grupos. Houve aumento da massa corporal após 15 dias de castração, efeito revertido pelo tratamento com E2 e/ou PG, havendo redução da leptinemia. Observamos aumento significativo do estradiol sérico no grupo PG+E2 comparado ao grupo Ovx por 15 dias; houve diminuição significativa no T4 sérico do grupo E2 comparado ao grupo Ovx pelo tempo de 15 dias; no grupo Ovx e reposto com E2 observamos diminuição significativa na PG comparado ao grupo S por 15 dias, 4enquanto os níveis séricos de T3 (15 dias) e a atividade desiodase tipo 2 (D2) no BAT e hipófise não diferiram nos grupos castrados por 6 e 15 dias. Houve redução da D2 hipotalâmica no grupo PG+E2 após 6 dias de castração comparado ao grupo E2. Tratamento com TP, E2 e PG parece não interferir de forma significativa na função tireóidea, sugerindo que os hormônios tireóideos não estão envolvidos na gênese da obesidade após a ovariectomia.

Palavras-chave: fitoestrógenos, hormônios tireóideos, tireotropina, tireoperoxidase, desiodase tipo 1, tireóide e Trifolium pratense.

xvi

AAABBBSSSTTTRRRAAACCCTTT Effects of ovarian steroids and phytoestrogen Trifolium pratense on body

mass and thyroid function of ovariectomized Wistar rats

Obesity is a public health concern which is related to cardiovascular disease and diabetes mellitus. Since thyroid and gonadal hormones are important regulators of energy metabolism, we decided to study the effect of ovarian hormones and phytoestrogen Trifolium pratense (Tp) on thyroid function and body mass gain on ovariectomized rats. In the 1st study, female Wistar rats were divided into five groups: Sham (S), ovariectomized (Ovx) and ovariectomized treated for 16 or 60 days with E2 (5.0 µg/100g bw,sc), Tp (500mg/kg bw,gavage) or Tp+E2. The above treatments started 7 and 14 days after of ovariectomy totaling 23 and 74 days of ovariectomy. In the 2nd study, the rats were divided into: Sham (S), ovariectomized (Ovx) and ovariectomized treated for 6 and 14 days with E2 (0.7 µg/100g bw,sc), PG (250µg/100g bw,sc) or PG+E2. Treatment was initiated 24 hours after ovariectomy. Ovariectomy for 23 or 74 days led to increased body weight, with increased serum leptin. Replacement with E2, with or without Tp, reversed the increase in body mass gain and leptin serum levels. Short and long term treatment with Tp did not prevent the excessive weight gain. Nevertheless, leptin levels of these groups did not differ from group S. Treatment with E2 and Tp+E2 led to increased uterine weight comparing to the Ovx group in both periods, which did not occur in rats treated with Tp. We did not detect any alteration of thyroid function (uptake of radioiodine, thyroid peroxidase activity and serum T4) in all groups but the serum T3 was increased in animals treated with E2 and TP+E2 for short term and Tp+E2 for long term. Serum TSH was reduced in the Tp+E2 short term group which is in accordance with the increased T3 levels in this group. There was no change in the type 1 deiodinase activity in the tissues studied, except for the thyroid D1, which was increased in the long term Tp group. In the 2nd study, at 6 days of ovariectomy, there were no differences in body mass gain and serum levels of leptin among the groups. There was an increase in body mass after 15 days of castration, which was reversed by treatment with E2 and/or PG, and there was also a reduction of serum leptin in these groups. We observed a significant increase in serum estradiol in PG+E2 when compared to the Ovx group and a significant decrease in serum T4 in the E2 group when compared to the Ovx group. We observed significant decrease in PG levels in Ovx and E2 rats when compared to the S group, while serum levels of T3 and type 2 deiodinase activity (D2) in BAT and pituitary did not differ among groups ovariectomized for 6 and 15 days. There was a reduction in hypothalamic D2 in the group PG+E2 after 6 days of castration related to group E2. Treatment with Tp, E2 and PG does not seem to interfere significantly with thyroid function, suggesting that thyroid hormones are not involved in the genesis of obesity after ovariectomy.

Key-words: phytoestrogens, thyroid hormones, thyrotropin, thyroperoxidase, type 1

iodothyronine deiodinase, thyroid and Trifolium pratense.

xvii

SUMÁRIO Lista de figuras e tabelas ix

Lista de abreviaturas xiii

Resumo xv

Abstract xvi

Sumário xvii

1 - INTRODUÇÃO

1.1 – HORMÔNIOS DA TIREÓIDE

a – Aspectos anatômicos e histológicos da tireóide 1

b - Biossíntese dos hormônios tireóideos 2

c – Metabolismo dos hormônios tireóideos 9

d – Regulação da função tireóidea 15

1.2 - Influência dos estrógenos sobre a função tireóidea 19

1.3 - Efeitos dos fitoestrógenos sobre a função tireóidea e metabolismo

Corporal 23

1.4 - Efeitos do Estrogênio e da Progesterona na massa corporal 25

2 - OBJETIVOS

2.1 – Objetivo geral 34

2.2 – Objetivos específicos do 1º estudo 34

2.3 – Objetivos específicos do 2º estudo 35

3 – METODOLOGIA

3.1 – ESTUDO 1 – Efeito do tratamento crônico com o fitoestrógeno Tp 36

3.2 – ESTUDO 2 – Efeito da ovariectomia e da reposição hormonal

sobre o ganho de massa corporal 41

3.3 – Captação de Radioiodeto – Medida de Função do NIS 43

3.4 - Radioimunoensaio de TSH 43

3.5 - Radioimunoensaio de T3 e T4 44

xviii

3.6 - Extração da Tireoperoxidase Murina 44

3.7 - Atividade de Oxidação do Iodeto da Tireoperoxidase 44

3.8 - Atividade das Enzimas Iodotironinas Desiodases Tipo I (D1) e Tipo II (D2) 45

3.8.1 - Processamento dos tecidos 45

3.8.2 - Purificação do 125I-rT3 e 125I-T4 46

3.8.3 - Ensaio de atividade da D1 47

3.8.4 - Ensaio de atividade da D2 48

3.9 - Leptina, Estradiol e Progesterona séricos 48

4.0 – ANÁLISE ESTATÍSTICA 49

5 – RESULTADOS

5.1 – Estudo 1

5.1.1 – Massa corporal, tireóidea e uterina 50

5.1.2 – Concentração sérica hormonal 54

5.1.3 – Biossíntese hormonal tireóidea 59

5.1.4 – Desiodases 61

5.2 – Estudo 2

5.2.1 – Massa corporal e uterina 66

5.2.2 - Concentração sérica hormonal 67

5.2.3 – Desiodases 72

6 - DISCUSSÃO 76

7 - CONCLUSÃO 87

8 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 88

1

111 --- IIINNNTTTRRROOODDDUUUÇÇÇÃÃÃOOO

a) Aspectos Anatômicos e Histológicos da Tireóide

A glândula tireóide, situada imediatamente abaixo da cartilagem

cricóide, é composta por dois lobos unidos por um istmo, estando aderida à

traquéia (Larsen et al., 2002).

A unidade morfofuncional da tireóide é o folículo tireóideo, constituído

por uma única camada de células epiteliais, os tireócitos (ou células foliculares)

que envolvem o colóide, cuja composição majoritária é uma glicoproteína, a

tireoglobulina - Tg (Figura 1). A Tg contém os hormônios tireóideos (HT):

triiodotironina (T3) e tiroxina (T4), em sua molécula, sendo posteriormente

endocitada e hidrolisada para liberação destes hormônios (Capen, 1996; Griffin

& Ojeda, 2000).

A tireoglobulina, precursora do T4 e T3, é sintetizada no interior da

célula, e a seguir é direcionada para o lúmen onde é armazenada no colóide

extracelular. A Tg consiste em uma forma de armazenamento de T4 e T3 no

colóide (Bartalina, 1994; Daí et al., 1996; Vassart e Dumont, 1992).

Figura 1: Representação esquemática de um folículo tireóideo aberto. Esquema do arquivo do Laboratório de Fisiologia Endócrina Doris Rosenthal.

Membrana Basolateral

Célula folicular

Colóide

Membrana apical

2

Em condições normais, os tireócitos são cubóides, porém podem

apresentar-se na forma pavimentosa ou cilíndrica, sendo sua altura um

indicativo da intensidade do estímulo recebido pela glândula, pois células mais

altas são mais ativas em condições fisiológicas (Ross et al., 1993).

1.1 Hormônios tireóideos

b) Biossíntese dos hormônios tireóideos

Metabolismo do iodo

Os hormônios tireóideos são únicos pelo fato de requererem o elemento

iodo para sua síntese, havendo necessidade de uma concentração adequada

para que quantidades normais de hormônios tireóideos sejam sintetizadas. A

ingestão diária de iodo é bastante variável, dependendo do conteúdo de iodo

no solo e na água em diferentes regiões. Além de sua presença na água, o

iodo é encontrado em frutos do mar, vagem, agrião, além de estar sendo

adicionado ao sal de cozinha a fim de evitar a sua deficiência. O iodo ingerido

é absorvido a partir do trato gastrointestinal para o sangue sendo a maior parte

normalmente excretada pelos rins ou captada pelas células da glândula

tireóide (Larsen et al., 2002; Vassart e Dumont, 1992).

Transporte de iodeto

O transporte ativo do iodeto do sangue para o interior da célula folicular

constitui uma etapa importante na formação dos hormônios tireóideos (Figura

2). Da mesma forma que diversos outros tecidos epiteliais, incluindo a glândula

mamária, o córion, a glândula salivar e o estômago, a tireóide é capaz de

concentrar I- contra um forte gradiente eletroquímico, através da ação do co-

3

transportador Na+/I-, NIS (Spitzweg & Morris, 2002). A razão entre o iodeto da

tireóide e o do soro é um reflexo da presença deste transportador, cuja

atividade é controlada principalmente pelo TSH (Bartalina,1994; Vassart e

Dumont, 1992).

O co-transportador NIS, uma glicoproteína integral de membrana,

localiza-se na membrana basolateral das células foliculares tireóideas e acopla

o transporte de 2 íons Na+ a favor do seu gradiente eletroquímico ao transporte

de 1 íon I- contra o seu gradiente, ambos em direção ao interior da célula

folicular – Figura 2 (Kaminsky et al., 1994; Smanik et al., 1996). O gradiente de

sódio necessário ao transporte realizado pelo NIS é gerado pela bomba

Na+/K+-ATPase, tratando-se portanto de transporte ativo secundário (Larsen et

al., 2002).

Figura 2: Transporte ativo do iodeto do sangue para o interior da célula folicular.

NIS: co-transportador Na+/I-. Adaptado de Kaminsky et al., 1994; Smanik et al.,

1996.

I-Membrana basal

I-Na+ Na+

K+

ATPase

Na+

Colóide

NIS

I-Membrana basal

I-Na+ Na+

K+

ATPase

Na+

Colóide

NIS

4

Uma vez dentro da célula folicular, o iodeto é transportado através da

membrana apical para o colóide pela pendrina, que é um canal de

cloreto/iodeto, e possivelmente por outros canais iônicos já descritos, como o

CIC5 (Scott et al., 1999; Bidart et al., 2000; van den Hove et al., 2006; Devuyst

et al., 2005; Günther et al., 2003).

O TSH é capaz de aumentar o transporte de iodeto, efeito este que

ocorre via aumento da concentração intracelular de AMP cíclico (Dumont et al.,

1989; Carrasco, 1993). Após a clonagem do gene do co-transportador NIS,

vários estudos in vivo e in vitro mostraram que a exposição ao TSH estimula

sua atividade, bem como sua expressão gênica (Saito et al., 1997; Kogai et al.,

2000). O TSH não somente estimula a transcrição e a síntese de novo do NIS,

mas parece regular também sua distribuição subcelular após a transcrição,

uma vez que Riedel et al. (2001) mostraram uma redistribuição da membrana

plasmática para compartimentos intracelulares na ausência de TSH, o que leva

à perda de capacidade da célula em captar iodeto.

Além disso, o conteúdo de iodo no interior da glândula é capaz de

influenciar o transporte de iodeto. Assim, quando temos grande concentração

de iodo há menor atividade do transportador e este se torna menos sensível à

estimulação pelo TSH (Larsen et al., 2002; Ferreira et al., 2005).

Oxidação do iodeto, organificação do iodo e acoplamento entre

iodotirosinas

Os processos de oxidação e organificação do iodo iniciam a síntese dos

hormônios tireóideos. Esses processos são catalisados pela tireoperoxidase

(TPO), uma enzima que tem seu sítio catalítico voltado para o colóide e se

5

localiza na superfície apical da célula folicular. Essa proteína requer peróxido

de hidrogênio como agente oxidante. O H2O2 é produzido pela enzima oxidase

dual (DuOx), uma flavoproteína NADPH-dependente e que também tem sua

localização na membrana apical das células foliculares, local onde a síntese

hormonal ocorre (Michot et al., 1985; Virion et al., 1984; Dupuy et al., 1999).

A oxidação do iodeto ocorre de maneira muito rápida e o iodeto oxidado

é incorporado principalmente à Tg, processo denominado organificação do

iodo (Figura 3). A posição 3 do anel aromático da tirosina é iodada, formando

MIT, e a seguir, pode haver iodação na posição 5, formando DIT. Em seguida,

a TPO catalisa o acoplamento entre essas moléculas, formando tiroxina (ou

T4), se o acoplamento ocorrer entre duas moléculas de DIT ou triiodotironina

(ou T3), se ocorrer entre um MIT e um DIT. A formação de T3 é favorecida na

presença de quantidades maiores de MIT e de baixos níveis de iodo, enquanto

a síntese preferencial de T4 ocorrerá em situações nas quais haja mais DIT e

maior disponibilidade de iodo (Taurog, 2000).

Figura 3: Oxidação e organificação do iodo. Duox: enzima oxidase dual; TPO: tireoperoxidase; Tg: tireoglobulina; MIT: monoiodotirosina; DIT: diiodotirosina (Esquema do arquivo do Laboratório de Fisiologia Endócrina Doris Rosenthal).

ColóideColóide

CitoplasmaCitoplasma

TPOTPO

NADPHNADPH--OXIDASEOXIDASE

iodeto

TirTirTirTir

TirTir

TirTirDITDIT

MITMIT

TgTg

Membranaapical

HH 22OO 22

II--

OO 22

NADPHNADPH NADPNADP++

TgTg

tireoglobulina

TT33

TT 44

ColóideColóide

CitoplasmaCitoplasma

TPOTPO

NADPHNADPH--OXIDASEOXIDASE

iodeto

TirTirTirTir

TirTir

TirTirDITDIT

MITMIT

TgTg

Membranaapical

HH 22OO 22

II--

OO 22

NADPHNADPH NADPNADP++

TgTg

tireoglobulina

TT33

TT 44

DuOx

6

Secreção hormonal e transporte plasmático

Quando a glândula é estimulada pelo TSH, a Tg armazenada no colóide

entra na célula principalmente por um processo de pinocitose, ocorrendo então

a fusão de lisossomas às vesículas de endocitose; a seguir várias proteases

ácidas e peptidases hidrolisam a Tg, liberando MIT, DIT, T4 e T3, dentre outras

iodotironinas. As moléculas de MIT, DIT, T4 e T3 podem sofrer desiodação no

próprio tireócito. T4 e T3 alcançarão a corrente sangüínea pela membrana

basal da célula (Figura 4).

Figura 4: Secreção dos hormônios tireóideos. NIS: co-transportador Na+/I-; Tg: tireoglobulina; MIT: monoiodotirosina; DIT: diiodotirosina (Esquema do arquivo do Laboratório de Fisiologia Endócrina Doris Rosenthal).

NISNIS

exocitose

síntese

I-

glicose aminoácidos

I-

proteólise

endocitose

Membrana basal

TGTG

T3

MIT

DIT

T4

MIT

DIT

T4

T4T3

MIT DIT

33TT44 e Te T

T3

5’ desiodase

NISNIS

exocitose

síntese

I-

glicose aminoácidos

I-

proteólise

endocitose

Membrana basal

TGTG

T3T3

MIT

DIT

T4T4

MIT

DIT

T4T4

T4T3T4T3

MIT DIT MIT DIT

33TT44 e Te T

T3T3

5’ desiodase

7

Ao atingirem a corrente sanguínea, a maior parte do T4 e do T3

combinam-se imediatamente às proteínas plasmáticas: globulina ligadora de

tiroxina (TBG), transtiretina (TTR) e albumina, o que torna a depuração dos

HTs lenta, prolongando sua meia-vida e auxiliando na manutenção de

concentrações estáveis de T4 e T3 no plasma (Yen, 2001).

Existem três ou quatro moléculas de T4 em cada molécula de Tg, mas

apenas uma em cinco moléculas de Tg contém T3, por isso o principal HT

liberado é o T4, cuja concentração no soro é quarenta vezes maior que a do T3

sérico. Apenas 0,03% do T4 total sérico está livre, estando o restante ligado a

proteínas carreadoras como a globulina ligadora de tiroxina (TBG) (80%),

transtiretina (15%) e albumina (5%), em humanos. Aproximadamente 0,3% do

T3 sérico está livre, o restante está ligado a TBG (38%), albumina (35%) e

transtiretina (27%), em humanos. São os hormônios livres que entram nas

células-alvo, gerando repostas biológicas. O T3 é considerado o HT

metabolicamente ativo, pois o receptor nuclear tem afinidade de 10 a 15 vezes

maior para o T3 que para o T4 (Kimura, 2008; Yen, 2001).

Transporte através da membrana e mecanismo de ação dos hormônios

tireódeos

Os efeitos dos HTs em nível genômico são mediados por receptores

nucleares, intimamente associados com a cromatina: os HTs entram na célula,

o T4 é convertido a T3 pelas desiodases intracelulares, o T3 direciona-se ao

núcleo e se liga aos seus receptores (TRs), regulando positiva ou

negativamente a transcrição de genes-alvos e, consequentemente, a síntese

das proteínas por eles codificadas (Larsen et al., 2002).

8

Existem várias isoformas de TRs. O TRβ2 é abundante na hipófise

anterior e nos núcleos arqueado, paraventricular e ventromedial do hipotálamo.

Já o TRα1 é mais abundante no músculo cardíaco e esquelético, e no tecido

adiposo marrom, enquanto o TRα2 (que não liga T3) é muito expresso no

cérebro. O TRβ1 é mais homogeneamente distribuído, sendo mais elevado no

cérebro adulto, fígado e rim. A regulação do RNAm dos TRs depende da

isoforma e do tipo celular em que se encontra. Na hipófise murina, o T3 diminui

o RNAm do TRβ2, diminui modestamente o RNAm do TRα1, e aumenta

ligeiramente o RNAm do TRβ1 (Yen, 2001).

Existem atualmente vários estudos sobre os efeitos não-genômicos de

T3 e T4, que envolvem ação rápida (segundos a minutos) e ativação de vias de

sinalização intracelular, mas sua importância fisiológica ainda não é bem

entendida (Yen, 2001). Essas ações independentes do receptor nuclear têm

sido descritas na membrana plasmática, no citoplasma, no citoesqueleto e em

várias organelas (Davis & Davis, 1996).

O transporte de T3 através da membrana plasmática e nuclear tem sido

assunto de grande interesse nos últimos anos. O T3 é lipofílico, e é geralmente

dito que pode atravessar as membranas por difusão passiva; entretanto,

existem algumas evidências da existência de transportadores, havendo sítios

de alta afinidade para ligação do HT na membrana plasmática de células

diferentes. Este sistema de transporte para T3 e T4 é saturável e dependente

de energia, mas as duas iodotironinas não competem pela mesma “entrada”.

Parecem estar envolvidos neste transporte polipeptídios co-transportadores de

taurocolatos de Na+ (NTCP) e membros da família de polipeptídios

9

transportadores de ânion orgânico (OATP), que são capazes de transportar HT

para dentro do hepatócito (Friesema et al., 1999).

Um transportador para aminoácidos aromáticos já foi clonado e pertence

à família dos transportadores de monocarboxilatos (MCT). O transportador

monocarboxilato 8 (MCT8) foi caracterizado como um transportador de HT

muito ativo e específico, altamente expresso no fígado e cérebro, mas também

amplamente distribuído em outros tecidos (Friesema et al., 2003; Friesema et

al., 2005).

Proteínas que ligam T3 e T4 estão presentes no citosol e no núcleo da

célula e parecem ser importantes para prevenir um contínuo metabolismo

desiodativo e a ocupação total do receptor de T3. A concentração intracelular

de T3 livre pode ser estimada pela afinidade de ligação dessas proteínas, o

que sugere um gradiente de hormônio livre através da membrana plasmática

(50:1), bem mais baixo que a taxa nuclear/citosólica (250:1) no fígado, rim,

coração e cérebro (Ichikawa & Hashizume, 1991; Larsen et al., 2002).

Os processos que regulam o efluxo dos HTs das células são menos

entendidos, mas parecem envolver um mecanismo sensível a verapamil, sendo

então dependente de Ca2+ (Larsen et al., 2002).

c) Metabolismo dos hormônios tireóideos

O T4, principal produto secretado pela glândula tireóide, sofre alteração

metabólica nos tecidos periféricos dando origem ao T3, considerado até

recentemente o único hormônio tireóideo com atividade biológica; porém

estudos recentes têm demonstrado que outras iodotironinas, como é o caso do

T2 (3,5-diiodotironina) e do próprio T4, também parece exercer atividade

10

biológica (Horst et al, 1989; O’Reilly & Murphy, 1992; Goglia et al, 1994;

Moreno et al, 1997; Goglia, 2005).

A monodesiodação do T4, retirada de um átomo de iodo, pode ocorrer

no anel interno ou externo, dando origem a rT3 e T3, respectivamente. A

conversão do T4 a T3 é catalisada pelas enzimas D1 e D2 através da

desiodação do anel externo (5’-desiodação), sendo conhecida como via

bioativadora. A reação de inativação tanto do T4 como do T3 é catalisada

pelas enzimas D1 e D3 através da desiodação do anel interno (5-desiodação),

sendo considerada a via bioinativadora – Figura 5 (Kohrle, 1996; Visser, 1996;

Bianco et al, 2002).

11

Figura 5: Vias de ativação e inativação do T4 pelas enzimas desiodases (Gereben et al., 2008).

A D1 e a D2 catalisam a desiodação do anel externo das iodotironinas,

podendo ser diferenciadas pela sua sensibilidade ao propiltiouracil (PTU), pois

a D1 é inibida por este composto, enquanto a D2 não o é (Gereben et al.,

2008). As três desiodases constituem uma família de proteínas contendo

selenocisteína em seu sítio catalítico, e a presença da selenocisteína parece

ser crítica para a atividade enzimática, uma vez que a atividade D1 está

reduzida no fígado e rins quando há deficiência severa de selênio (Beckett et

al., 1987; Kohrle, 1996).

Outras formas de metabolismo do hormônio tireóideo incluem inativação

por desaminação ou descarboxilação. Glicuronidação e sulfatação hepáticas

resultam em uma molécula mais hidrofílica que é excretada na bile,

reabsorvida no intestino, desiodada no rim e excretada na urina como

conjugado (Visser, 1996).

CH2 - CH - COOH

NH2

3’5’ 5

3OHO

I

I

I

I

3,5,3`,5` - tetraiodotironina (tiroxina, T4)

CH2 - CH - COOH

NH2

5’OHO

I

I

I

CH2 - CH - COOH

NH2

5OHO

II

I

3,3`,5` - triiodotironina (T3 reverso)3,5,3` - triiodotironina (T3)

Ativação (D1), D2 Inativação(D1), D3

12

Iodotironina Desiodase Tipo 1 (D1)

A isoenzima D1 tanto catalisa a desiodação do anel externo quanto do

anel interno do T4, podendo gerar T3 ou rT3, respectivamente. O pH exerce

grande influência neste processo de desiodação, porém como demonstrado

por Bianco et al. (2002), a sulfatação das iodotironinas acarreta um aumento

na rapidez da desiodação e preferência pelo anel interno, o que demonstra a

importância da sulfatação na inativação desses compostos. A D1 é

responsável pela geração de uma fração significativa do T3 plasmático. A D1

está amplamente distribuída pelo corpo, sendo sua localização mais provável a

membrana plasmática, o que além de facilitar o acesso do T4 circulante à

enzima, facilitaria a passagem do T3 formado para o plasma.

Em humanos, a D1 está presente no fígado, rins, tireóide e hipófise,

sendo a atividade no fígado e rins aparentemente de grande importância para

a geração de T3 sérico em humanos. Em ratos, a D1 é expressa no fígado,

rins, SNC, hipófise, intestino, tireóide e placenta.

Dentre as inúmeras substâncias que estimulam a síntese de D1, os

hormônios tireóideos se mostraram os mais potentes, estando bem

estabelecido um aumento na atividade e/ou no RNAm para D1 em ratos,

camundongos e humanos sob sua influência. A D1 tireóidea parece ter uma

modulação diferente, uma vez que neste tecido é o TSH o principal estímulo

para a atividade desta enzima. Os hormônios estrogênio, testosterona e os

glicocorticóides se mostraram capazes de aumentar a síntese e/ou atividade

da D1, enquanto o jejum induz diminuição na expressão de mRNA para D1

(Gereben et al., 2008).

13

Iodotironina Desiodase Tipo 2 (D2)

Essa isoforma catalisa apenas a remoção do iodo do anel externo do

hormônio tireóideo, podendo converter T4 a T3, T3 a 3,5-T2 e rT3 a 3,3’-T2.

Está localizada no retículo endoplasmático, o que explicaria o rápido acesso ao

núcleo do T3 gerado pela D2 a partir do T4. Estudos comprovam a presença

de D2 em hipófise, cérebro, coração e tecido adiposo marrom de ratos e na

tireóide, coração, cérebro, músculo esquelético, placenta, rins e pâncreas

humano (Gereben et al., 2008).

Supõe-se que a principal contribuição fisiológica da D2 é regular os

níveis intracelulares de T3 nos tecidos onde a deficiência deste hormônio seria

mais crítica. Em tecidos que expressam D2, como o sistema nervoso central, o

tecido adiposo marrom e a adeno-hipófise, a atividade desta enzima está

aumentada no hipotireoidismo. Isso leva ao aumento da conversão local de T4

para T3, o que pode ser visto como um mecanismo adaptativo desses tecidos

em resposta à queda dos níveis circulantes dos hormônios tireóideos (Gereben

et al., 2008).

Iodotironina Desiodase Tipo 3 (D3)

Esta é uma enzima inativadora de T4 e T3, formando, a partir destes,

rT3 e 3,3’-T2, respectivamente. Acredita-se que ambos sejam biologicamente

inativos (Gereben et al., 2008). Essa enzima contribui para a homeostase dos

hormônios tireóideos, por proteger os tecidos do excesso desses hormônios.

Sua localização subcelular ainda não está bem definida, mas parece

estar associada à fração microssomal. A D3 está presente na pele, cérebro e

14

placenta de ratos adultos e pode ser encontrada no músculo esquelético,

fígado e intestino de ratos neonatos (Gereben et al., 2008).

O T3 é fundamental para o desenvolvimento fetal normal. Entretanto,

níveis elevados desse hormônio são prejudiciais para o feto, podendo levar a

malformações e morte. Assim, é necessário que durante o desenvolvimento os

níveis séricos e intracelulares de T3 sejam mantidos dentro de um limite

estreito (Carvalho, 2003). Durante este período, a D2 e a D3 exercem um

papel fundamental no controle do T3 sérico, enquanto a D1 parece ser mais

importante posteriormente (Gereben et al., 2008; Croteau et al., 1995).

15

d) Regulação da Função Tireóidea

Eixo Hipotálamo-Hipófise-Tireóide

A tireotrofina ou hormônio estimulador da tireóide (TSH) é um hormônio

glicoprotéico sintetizado e secretado por células denominadas tireotrofos,

localizadas na adeno-hipófise. O TSH é o principal regulador da função

tireóidea. Sua estrutura consiste das subunidades α e β ligadas não-

covalentemente. A subunidade α é comum a outros hormônios glicoprotéicos

como hormônio luteinizante (LH), hormônio folículo estimulante (FSH) e

gonadotrofina coriônica. A subunidade β tem uma sequência específica de

aminoácidos, que está relacionada à ligação do TSH com seu receptor e à

atividade hormonal, sendo as duas subunidades necessárias para a ação

hormonal (Wondisford et al., 1996).

O receptor do TSH pertence à superfamília dos receptores acoplados à

proteína G: Gs e Gq (Duprez et al., 1998). Assim, quando o TSH se liga ao seu

receptor na membrana das células foliculares, uma série de modificações no

metabolismo da célula folicular levam ao estímulo da produção hormonal e

também ao crescimento da glândula. Os passos da formação dos hormônios

tireóideos estimulados pelo TSH incluem a estimulação do transportador de

iodeto (Kaminsky et al., 1994), da síntese de tireoperoxidase (Chazenbalk et

al., 1987), de tireoglobulina (Larsen et al., 2002) e da geração intracelular de

H2O2 (Carvalho et al., 1996). A endocitose do colóide e a secreção dos

hormônios tireóideos também são estimuladas pelo TSH.

16

O que se observa em indivíduos normais é que um eventual aumento

nas concentrações séricas de hormônios tireóideos tem como consequência a

inibição da produção de TSH, um padrão clássico de retroalimentação

negativa. Na situação oposta, quando há diminuição nas concentrações

circulantes de hormônios tireóideos, a inibição da produção de TSH diminui,

com consequente aumento na síntese e secreção deste hormônio e estímulo à

produção hormonal pela tireóide. Assim, as concentrações de T3 e T4 são

restauradas e diminui o estímulo para a liberação de TSH (Larsen et al., 2002).

Existem três hormônios de grande importância no controle da síntese e

secreção do TSH: o T3, que têm ação inibitória, o TRH (hormônio liberador de

tireotrofina), que apresenta efeito estimulatório, e a somatostatina, que tem

ação inibitória. O TRH é um tripeptídeo produzido no hipotálamo. Quando o

TRH se liga ao seu receptor nos tireotrofos da adeno-hipófise ocorre estímulo

da síntese de ambas as subunidades do TSH, assim como do seu

processamento pós-traducional. Estes efeitos parecem ser mediados por cálcio

e GMPc (Larsen et al., 2002).

Os hormônios tireóideos têm efeito inibitório sobre a produção de TSH

de duas maneiras: uma direta, inibindo a síntese e a secreção deste hormônio

na hipófise e uma indireta em que a produção hipotalâmica do TRH é inibida

(Figura 6). Comparando-se a adeno-hipófise com outros tecidos, há um

predomínio relativo nesta glândula da ligação nuclear do T3 gerado localmente

por desiodação do T4 (Wondisford et al., 1996).

17

Figura 6: Eixo hipotálamo-hipófise-tireóide. TRH: hormônio liberador de

tireotrofina; TSH: hormônio estimulador da tireóide. A somatostatina é um peptídeo inicialmente isolado no hipotálamo mas

que também é encontrado em outros tecidos e é capaz de inibir a secreção de

TSH diretamente, agindo sobre os tireotrofos, e indiretamente, inibindo a

liberação de TRH em nível hipotalâmico (Patel et al., 1986). A ligação da

somatostatina ao seu receptor leva à diminuição das concentrações

intracelulares de AMPc e de cálcio livre. Os hormônios tireóideos aumentam a

secreção de somatostatina e assim reduzem a de TSH (Wass, 1995).

Hipotálamo

T4 T3

Tireóide

Hipófise

TT44 TT33

T4

T3

TRH +

TSH +

Hipotálamo

T4 T3

Tireóide

Hipófise

TT44 TT33

T4

T3

TRH +

TSH +

18

Autorregulação pelo iodo

A função da glândula tireóide é regulada também de acordo com a

concentração de iodo disponível. Esta característica adaptativa da tireóide é

denominada autorregulação (Pisarev, 1985).

Se forem administradas doses crescentes de iodeto a um indivíduo

normal, inicialmente ocorrerá um aumento da formação de hormônios

tireóideos. Entretanto, dando-se prosseguimento ao tratamento, poderá ser

observada diminuição da síntese hormonal. Isto ocorre devido ao bloqueio

relativo da organificação do iodo (efeito Wolff-Chaikoff), em conseqüência dos

altos níveis de iodo intra-glandular.

O efeito Wolff-Chaikoff, entretanto, possui uma limitação. Uma vez que,

dentre as etapas envolvidas na síntese hormonal que são inibidas está o

transporte de iodeto, a concentração intra-tireóidea de iodeto tende a diminuir,

retornando aos níveis normais, insuficientes para inibir a organificação. Assim,

a inibição da síntese será revertida e a glândula voltará a produzir as mesmas

quantidades de hormônios tireóideos que produzia antes do tratamento. Este

fenômeno é denominado escape do efeito Wolff-Chaikoff (Larsen et al., 2002).

Parte dos efeitos do iodo sobre a glândula tireóide pode ser revertida por

drogas que inibem a sua organificação. Isto sugere que o iodo precise primeiro

ser organificado para, só então, apresentar efeito inibitório. Entretanto, nem

todos os efeitos são via iodo organificado. A inibição da secreção hormonal e a

diminuição do bócio são exemplos de efeitos que continuam ocorrendo mesmo

quando se administra bloqueadores da organificação do iodo. Estas ações

podem, portanto, ser atribuídas ao próprio iodeto. Isto demonstra que o efeito

inibitório do iodo provavelmente não se dá por um mecanismo único e que

19

várias etapas da síntese e secreção hormonal são afetadas de maneira

diferente pelo iodo (Pisarev, 1985).

1.2 – Influência dos estrógenos sobre a função tireóidea

O eixo hipotálamo-hipófise-tireóide parece sofrer modulação pelo

estrogênio, uma vez que alguns estudos têm demonstrado a possibilidade

tanto de efeitos diretos quanto indiretos. Furlanetto et al. (1999) demonstraram

a presença de ERα em cultura de células FRTL-5, o que sugere que o

estrogênio pode ter efeitos diretos sobre o tireócito, tendo sido demonstradas

ações tanto sobre o aumento do crescimento celular tireóideo como na função

tireóidea. A maior prevalência de bócio em mulheres, quando comparada a

homens, pode estar relacionada à presença de maiores concentrações de

estrogênio. Fukuda et al. (1975) demonstraram que o estrogênio administrado

a ratas ovariectomizadas e hipofisectomizadas estimula a captação de

radioiodo pela tireóide. Além disso, estudos de nosso laboratório

demonstraram alteração do peso relativo da glândula tireóide, da atividade

tireoperoxidase e da captação de radioiodo com a administração de estradiol,

apesar de não haver alteração do TSH sérico desses animais (Lima et al.

2006).

Ficou também constatada a presença de ER na adeno-hipófise

(Stefaneanu et al., 1994) o que reforça a hipótese de modulação da secreção

de TSH pelos estrogênios. Farbota et al.,(1987), e Chen & Walfish (1978a e

1978b), não observaram alterações do TSH em ratas castradas por 4 e 2

semanas, respectivamente. Christianson et al. (1981) demonstraram que o

tratamento de ratas castradas com Eb (benzoato de estradiol) não afetou as

20

concentrações séricas de TSH. Moreira et al., (1997) observaram diminuição

da liberação basal de TSH in vitro em hipófises isoladas de ratas

ovariectomizadas; que não foi revertida pela reposição com Eb na dose de 0,7

µg/100g p.c., enquanto uma dose muito elevada de Eb (14 µg/100g p.c.)

reduziu a liberação de TSH basal e a estimulada por TRH, o que sugere um

efeito inibitório de doses supra-fisiológicas de estrogênio. Um efeito bifásico do

estradiol também foi visto por Fisher & D'angelo (1971). Diferentemente, Lisbôa

et al., (1997) demonstraram que a ovariectomia das ratas e a reposição com

Eb na dose de 0,7 µg/100g p.c., destes animais não modificaram o TSH sérico

in vivo, mas com dose suprafisiológica (14 µg/100g p.c.) houve elevação do

TSH sérico.

Christianson et al., (1981) e Lisbôa et al., (1997) não detectaram

alterações no T3 e T4 séricos em ratas castradas tratadas ou não com Eb;

entretanto, Lisbôa et al., (1997) observaram, nas ovariectomizadas, uma

tendência à diminuição do T3 livre. Chen & Walfish (1978a, 1978b) não

observaram diferenças nos HTs séricos frente à ovariectomia, mas a reposição

com Eb aumentou o T3 e diminuiu o T4, totais e livres.

No estudo de Sosic-Jurjevic et al. (2006) nenhuma diferença

significativa foi encontrada nos níveis séricos de TSH e T4 30 dias após

ovariectomia, bem como no grupo tratado com dipropionato de estradiol na

dose de 0.625 mg/kg p.c. Porém, a concentração sérica total de T3 diminuiu

21% nos animais tratados com doses fisiológicas de estradiol comparado ao

grupo ovariectomizado. Dados de nosso laboratório, mostraram que 21 dias de

ovariectomia não alterou o TSH e o T4 séricos (Marassi et al., 2007), mas

houve diminuição significativa no T3 plasmático, portanto o mesmo perfil

21

observado por Lima et al. (2006). Quando a reposição com estradiol nas doses

de 0,7 e 14 µg/100g de peso corporal foi feita, os níveis plasmáticos de TSH

não se alteraram, os níveis de T3 se normalizaram e os de T4 diminuíram

(Marassi et al., 2007). No estudo de Lima et al. (2006) doses fisiológicas e

suprafisiológicas de 0,7 e 14 µg/100g de peso corporal, respectivamente, não

alteraram o T4 e o TSH séricos, porém restauraram os níveis plasmáticos de

T3.

Miyashita et al.,(1995) relataram que a ovariectomia ou o tratamento

com 17β-estradiol não alteraram o RNAm e nem a atividade D1 hepática. Em

contrapartida, Lisbôa et al., (2001) verificaram que a castração de ratas por 3

semanas diminuiu a atividade D1 hepática e hipofisária, e a reposição com Eb

aumentou essas atividades para valores similares ao do controle, além de ter

causado aumento da D1 na tireóide, e não ter alterado a D2 hipofisária.

Observaram, ainda, que a administração de progesterona a ratas castradas

diminuiu a atividade D1 hepática, sem afetar a hipofisária, porém reduziu o

efeito do estrogênio em ambos os tecidos.

Com relação à metabolização periférica dos hormônios tireóideos, no

estudo de Marassi et al. (2007), a ovariectomia não alterou a atividade da D1

renal, hepática, tireóidea e hipofisária. O tratamento com estradiol nas doses

de 0,7 e 14 µg/100g de peso corporal aumentou a atividade da D1 hepática,

renal (altas doses) e tireóidea (ambas as doses), somente a D1 hipofisária não

sofreu alterações com ambas as doses.

Logo, segundo Marassi et al. (2007), a ovariectomia parece não

promover qualquer mudança significativa na D1 hepática, renal, tireóidea e

hipofisária das fêmeas e o estrogênio parece modular positivamente a

22

atividade da D1 hepática, renal e tireóidea. Estes autores propuseram que o

aumento da D1 tireóidea pelo estrogênio possa ter contribuído para o aumento

da relação sérica de T3/T4.

Assim, o estrogênio poderia, in vivo, modular diretamente a expressão

de genes que codificam proteínas essenciais para a biossíntese dos hormônios

tireóideos. No entanto, a ação do estrogênio pode variar segundo a dose, o

tipo de receptor e ainda segundo o número de seus receptores no tecido. Em

ratas castradas e tratadas com benzoato de estradiol, observou-se aumento do

número de receptores de estrogênio no útero (Tsai et al., 1998). Em outro

estudo de Lima et al. (2006), com administração de doses altas de estrogênio

(14µg/100g de peso corporal), foi observado aumento da captação tireóidea

após 15 minutos de administração de radioiodo, bem como da atividade da

TPO. Os autores atribuíram a isso uma possível regulação positiva dos ERs na

tireóide de ratas ovariectomizadas. Embora não haja qualquer referência sobre

a regulação de receptores de estrogênio na tireóide, estes resultados sugerem

a possibilidade de ter havido aumento da ação do estrogênio na tireóide após a

ovariectomia. Apesar desses resultados, não houve diferenças na

concentração sérica de T4 total entre os grupos de ratas Ovx tratadas ou não

com Eb por 10 dias (Lima et al., 2006).

Dessa forma, podemos dizer que os estudos sobre os efeitos dos

estrógenos sobre a função tireóidea e níveis hormonais, ainda são muito

controversos, o que poderia ser devido aos diferentes protocolos utilizados.

Em humanos, o estrogênio aumenta as concentrações de TBG

(globulina ligadora de tiroxina) devido à diminuição da depuração e também à

maior produção desta proteína pelo fígado. Como conseqüência, há um

23

aumento das concentrações séricas de T4 total enquanto as concentrações de

T4 livre permanecem normais (Marqusee et al., 2000). Na gravidez, devido à

alta concentração de estrogênio, ocorre um aumento da concentração de TBG,

ocasionando elevação de T4 ligado, o que leva ao aumento da reserva de T4

extra-tireóideo (Burrow, 1993).

Na pós-menopausa, período em que ocorre diminuição significativa dos

níveis de estrogênio e progesterona é muito alta a incidência de doenças da

tireóide, sendo possível também observarmos diminuição dos níveis de TSH

com o envelhecimento (Urban, 1992). Ainda há muita divergência a respeito

dos efeitos do estrogênio sobre a tireóide, no entanto, os hormônios sexuais

parecem exercer grande influência sobre o funcionamento do eixo hipotálamo-

hipófise-tireóide dada a maior incidência de desordens tireoideanas em

mulheres.

1.3 - Efeitos dos fitoestrógenos sobre a função tireóidea

Flavonóides são compostos polihidroxifenólicos e estão universalmente

presentes em plantas vasculares sendo constituintes importantes de grande

variedade de vegetais consumidos na alimentação. (Gaitan, 1996). Dados da

literatura mostram diversos efeitos relevantes deste compostos, como ação

anti-inflamatória (Yuan et al., 2006), anti-oxidante (Aviram et al., 2005) e

protetora do sistema cardiovascular (Clair e Anthony, 2005), dentre outros.

Além disso, alguns isoflavonóides como genisteína, daidzeína e glicetina, que

são encontradas em grandes quantidades nos grãos de soja, são compostos

não-estrogênicos que se ligam com baixa afinidade aos receptores de

estrogênio (menos de 1% da afinidade de ligação do estradiol) e exibem ação

24

seletiva, podendo agir como agonistas ou antagonistas (Nahas et al., 2004).

Devido a essa característica, esses compostos têm sido utilizados para aliviar

os sintomas da menopausa (Beck et al., 2003).

As mudanças hormonais que ocorrem na menopausa podem causar

uma grande variedade de sinais e sintomas que diminuem a qualidade de vida,

como fogachos (caracterizados por ondas de calor), sensações de dispnéia,

irritabilidade, fadiga, ansiedade, diminuição da força e da calcificação dos

ossos em todo o corpo, bem como aumento do risco de desenvolver doença

coronariana e câncer de mama (Borrelli et al., 2003; Kronenberg & Fugh-

Berman, 2002).

A fim de aliviar os sintomas e combater as doenças associadas à

diminuição dos níveis de estrogênio e progesterona que ocorrem na

menopausa recomenda-se a Terapia de Reposição Hormonal. Contudo,

estudos demonstraram que a Terapia de Reposição Hormonal se mostrou

menos efetiva do que se pensava na diminuição de algumas das condições

associadas à menopausa e pode estar ligada ao aumento do risco de

desenvolvimento de câncer e eventos tromboembólicos. Esses efeitos têm

levado as mulheres a optarem por outras formas de tratamento, como os

fitoestrógenos (Nahas et al., 2004).

Dados de nosso laboratório mostram que extratos de plantas ricas em

flavonóides são capazes de inibir a atividade tireoperoxidase in vitro, enzima

chave na síntese dos hormônios tireóideos, T3 e T4 (Ferreira et al., 2000;

Ferreira et al., 2006). Além disso, devido à ação anti-oxidante dos flavonóides

contidos nestes vegetais, seus extratos parecem ser capazes de captar parte

do H2O2 adicionado ao meio reacional. O H2O2 é cofator essencial à atividade

25

tireoperoxidase. Assim, tais compostos parecem inibir a síntese de hormônios

tireóideos direta e indiretamente, podendo levar a bócio e hipotireoidismo,

especialmente em áreas com carência de iodo.

A genisteína é a isoflavona da soja de maior interesse. Apesar de sua

similaridade ao E2, ela se liga ao receptor com afinidade bem menor. As

isoflavonas se ligam ao ERβ com maior afinidade que ao ERα e esta maior

afinidade para ERβ torna os fitoestrógenos os candidatos preferenciais como

alternativa para a Terapia de Reposição Hormonal, uma vez que o ERα é a

forma predominante no útero e mama, sendo possível então evitar o

crescimento endometrial e o aumento do risco de desenvolvimento de câncer

de mama relatada na Terapia de Reposição Hormonal convencional

(Fitzpatrick, 2003; Beck et al., 2003; Adlercreutz, 2002).

Flavonóides também parecem interferir com a metabolização dos

hormônios tireóideos. Em 2002 mostramos que diversos flavonóides isolados

são capazes de inibir a atividade desiodase tipo 1 tireóidea in vitro (Ferreira et

al., 2002). A atividade da D1 é responsável pela conversão de T4, pró-

hormônio, ao T3, hormônio biologicamente ativo. Assim, a ingestão frequente

de grandes quantidades de plantas ricas em flavonóides pode interferir com a

biossíntese dos hormônios tireóideos e também com sua metabolização.

1.4 - Efeitos do Estrogênio e da Progesterona na massa

corporal

Os hormônios esteróides gonadais estrogênio e progesterona, derivados

do colesterol, são moléculas sinalizadoras com uma grande variedade de

funções biológicas, e muitas dessas ações não parecem estar relacionadas à

26

sua função principal, que é a reprodutiva (Asarian & Geary, 2006; Gustafsson,

1999).

Os seres humanos produzem basicamente três estrógenos, o estradiol

(E2), a estrona (E1) e o estriol (E3) (Dubey et al., 2004). O estradiol (E2) é a

forma predominante no organismo humano durante a fase reprodutiva da

mulher, sendo importante para o desenvolvimento da glândula mamária e do

útero, para a manutenção da gravidez e densidade óssea, para proteção

contra doenças cardiovasculares. O estradiol é sintetizado principalmente no

ovário, porém pode também ser produzido perifericamente por ação da enzima

aromatase no tecido adiposo, pele, endométrio, mucosa vaginal, mama, fígado,

vasos sangüíneos e coração (Dubey e Jackson, 2001;Vaya e Tamir, 2004).

Os estrógenos parecem exercer seus efeitos em praticamente todas as

células do organismo, através de mecanismos moleculares e celulares

variados. Suas ações podem ser iniciadas tanto a nível nuclear quanto

extranuclear. Os mecanismos nucleares são atribuídos aos receptores de

estrogênio (ER), subtipos ERα e ERβ, uma vez que eles agem como fatores

transcricionais ao se ligarem ao elemento de resposta ao estrogênio e dessa

forma regulam a transcrição gênica. Uma pequena porcentagem (2-3%) dos

receptores de estrogênio podem estar localizados na membrana celular, citosol

ou mesmo na mitocôndria, e contribuem para os efeitos rápidos do estrogênio

em diversos tecidos, também chamados de via alternativa (Xu et al., 2003;

Chen et al., 2004; Razandi et al., 1999; Kelly &Levin, 2001; Nadal et al., 2001;

Pedram et al., 2006).

A presença de um anel fenólico e de um segundo grupamento capaz de

formar pontes de hidrogênio são características estruturais necessárias para a

27

ligação dos estrógenos aos receptores ERα e ERβ. Deste modo, qualquer

composto que induza a dimerização do receptor e subsequente ligação ao

ERE (elemento de resposta ao estrogênio), pode apresentar efeito estrógeno

(Setchell e Cassidy, 1999; Limer e Speirs, 2004; Cornwell et al., 2004).

Pode-se observar diferenças na distribuição dos subtipos de receptor

bem como na afinidade do ligante a esses subtipos. Alguns tecidos, como

útero, tecido mamário, vagina, rins e núcleo arqueado hipotalâmico expressam

predominantemente ERα, enquanto pulmão, ossos, trato urogenital, sistema

cardiovascular, próstata, ovário, células da granulosa e núcleo paraventricular

hipotalâmico expressam predominantemente ERβ. Outros tecidos como

tireóide e hipófise expressam ambos ERβ e ERα (Cornwell et al., 2004; Limer e

Speirs, 2004; Tanaka et al., 2003).

Os ERs são expressos tanto em tecidos com função reprodutora quanto

não-reprodutora. A principal função da sinalização via ER em fêmeas está

relacionada ao funcionamento normal do trato reprodutivo, como o crescimento

uterino, características sexuais secundárias e comportamento reprodutivo

(Muramatsu & Inoue, 2000). Em homens, a sinalização via ER é necessária no

desenvolvimento normal e fisiológico dos órgãos reprodutivos (Eddy et al.,

1996). A deficiência de estrogênio parece estar envolvida em muitos processos

patológicos, como aterosclerose, osteoporose e processos de degeneração do

sistema nervoso, enquanto que elevados níveis de estrogênio parecem estar

ligados ao desenvolvimento de tumores mamários e uterinos (Diel, 2002;

Tanaka et al., 2003).

O mecanismo de ação dos estrógenos nos diferentes tecidos ainda não

está completamente elucidado. Estudos recentes têm mostrado a

28

complexidade dos mecanismos celulares envolvidos na ação estrogênica.

Dentre as importantes descobertas podemos citar as de Onate et al. (1995) e

Lavinsky et al., (1998) que descobriram através de estudos in vitro os co-

ativadores e co-repressores associados aos receptores de estrogênio, sendo

estes envolvidos na iniciação e regulação da transcrição gênica pelos ERs

(Diel, 2002).

São dois os principais receptores de progesterona atualmente descritos:

receptor do tipo B de progesterona (PR-B) e receptor do tipo A de

progesterona (PR-A). A progesterona, além de servir como um intermediário na

biossíntese de androgênios e estrógenos, exerce influência importante no

comportamento sexual, secreção de gonadotrofinas e em órgãos reprodutivos

e não-reprodutivos (Jamnongjit & Hammes, 2006).

Muitas das ações dos hormônios esteróides gonadais podem afetar a

massa corporal e a deposição de tecido adiposo, independente da ingestão,

incluindo efeitos que afetam o dispêndio energético, função gastrointestinal,

metabolismo, crescimento e composição corporal (Butera, 2009).

Em ratos, a liberação, tanto de estrogênio quanto de progesterona, a

partir do ovário, varia de forma cíclica, em um período que dura de 4 a 5 dias e,

juntamente com eventos neuroendócrinos no hipotálamo e adeno-hipófise,

compreendem o ciclo estral. Além de alterações no comportamento durante o

ciclo estral, a ingestão de alimento também varia de acordo com o ciclo

(Butera, 2009). A ovariectomia aumenta a ingestão de alimento e a

administração de estradiol após a ovariectomia é suficiente para normalizar a

ingestão basal de alimento (Geary & Asarian, 1999; Asarian & Geary, 2002). A

reposição com progesterona não produziu nenhum desses efeitos e não

29

impediu a normalização da ingestão de alimento causada pelo estradiol (Geary

et al., 1994).

Ratas adultas ovariectomizadas apresentaram aumento na ingestão de

ração com aumento concomitante da massa corporal (Asarian & Geary, 2002).

Também é observado o aumento da prevalência de obesidade em mulheres na

pós-menopausa comparadas com controles de mesma idade (Svendsen et al.,

1995) e a terapia de reposição com estrogênio parece evitar o aumento no

peso corporal e na adiposidade (Tchernof et al., 2000). Dessa forma, podemos

dizer que tanto os estudos com animais como os realizados em humanos

demonstraram que a redução do estradiol pela ovariectomia ou menopausa

leva ao aumento do peso corporal e da deposição de tecido adiposo. Ainda

não se sabe se os efeitos da terapia de reposição hormonal sobre o ganho de

peso corporal em mulheres na pós-menopausa resulta da diminuição na

ingestão de comida, um efeito direto sobre o tecido adiposo, ou ambos.

Em estudos realizados com o tratamento de ratas ovariectomizadas e

cobaias utilizando doses fisiológicas de estradiol observou-se diminuição da

ingestão de alimento e da massa corporal desses animais (Asarian & Geary,

2002; Czaja et al., 1983). Também foram observados efeitos similares em

relação à reposição com estradiol em macacas rhesus ovariectomizadas

(Czaja & Goy, 1975). A redução da ingestão alimentar causada pelo estradiol

em ratas ovariectomizadas parece ser mediada pela antecipação da sensação

de saciedade, levando à ingestão de porcentual menor de ração, mecanismo

este envolvendo possivelmente peptídeos anorexigênicos, como

colecistocinina, e orexigênicos como neuropeptídeo Y and ghrelina (Butera,

2009).

30

O mecanismo exato pelo qual os estrógenos afetam a adiposidade e sua

distribuição ainda não está claro. O estrogênio parece regular a atividade da

lipoproteína lipase e também o número de adipócitos bem como a massa

adiposa tanto por mecanismos diretos quanto indiretos. Uma outra forma pela

qual o estrogênio afetaria a adiposidade seria através da modulação de

adipocinas pelo tecido adiposo, principalmente pelo aumento da liberação de

leptina. A leptina parece exercer um importante papel como mediador na alça

de feedback regulatório entre tecido adiposo e hipotálamo. A leptina parece

atuar via receptores hipotalâmicos para inibir a ingestão de alimento e

aumentar a termogênese, o que resultaria na diminuição do peso corporal.

Poderíamos então identificar uma alça de feedback regulatório, incluindo a

leptina, o hipotálamo e o sistema efetor; a leptina (produzida pelos adipócitos)

atuaria como um sensor monitorando a reserva energética, através do

tamanho da massa adiposa; o hipotálamo receberia e integraria o sinal enviado

pela leptina e regularia os sistemas efetores, incluindo o sistema nervoso

autônomo simpático, controlando os dois principais determinantes do balanço

energético – a ingestão e o gasto (Jéquier, 2002). Os estrógenos aumentam a

concentração de leptina, o que parece estar correlacionado à distribuição e

tamanho dos adipócitos em mulheres (Geer e Shen, 2008).

Diferentemente do estrogênio, a administração de progesterona sozinha

parece não exercer efeito significativo sobre o comportamento alimentar em

ratas ou macacas rhesus ovariectomizadas, embora doses farmacológicas de

progesterona tenham demonstrado antagonismo nos efeitos do estradiol sobre

a ingestão de alimento (Butera, 2009).

31

A prevalência de obesidade vem aumentando muito nos últimos tempos

e este distúrbio está associado a problemas graves como hipertensão,

diabetes mellitus e doenças cardiovasculares (Stepp, 2006). Dados da

literatura mostram que mulheres após a menopausa tendem a ganhar massa

adiposa (Augoulea et al., 2005), o mesmo ocorrendo em ratas

ovariectomizadas (Meli et al., 2004). Entretanto, o mecanismo que leva ao

ganho de peso em decorrência do decréscimo dos níveis séricos de estrogênio

não é bem compreendido. Sabe-se que os hormônios tireóideos têm

importantes efeitos sobre o metabolismo energético. Pretendemos, portanto,

avaliar diversos parâmetros da função tireóidea de ratas logo após a

ovariectomia, de modo a verificar se os hormônios tireóideos podem contribuir

para o ganho de peso associado à ovariectomia.

Trifolium pratense (Figura 7), popularmente conhecido como trevo

vermelho, é uma planta medicinal utilizada no alívio dos sintomas da

menopausa. O Trifolium pratense é rico em isoflavonóides com ação

estrogênica (Beck et al., 2003), que parecem ser responsáveis pelo alívio dos

sintomas da menopausa decorrentes do consumo de tal fitoestrógeno (Chen et

al., 2002). Entretanto, não há dados conclusivos na literatura que mostre se

esses fitoestrógenos são capazes de reverter o ganho de peso associado à

menopausa e tampouco sobre o efeito dessas plantas sobre a função tireóidea.

Sabe-se que a tireóide expressa o receptor para estrogênio (Furlanetto et al.,

1999) e, portanto, é possível que tais fitoestrógenos modulem a função

tireóidea. Assim, pretendemos também avaliar o efeito do tratamento de ratas

ovariectomizadas com o fitoestrógeno Trifolium pratense sobre o ganho de

32

peso associado à ovariectomia e também sobre diversos parâmetros da função

tireóidea.

Figura 7: Trifolium pratense

Tendo em vista a possibilidade dos fitoestrógenos interferirem no

controle do peso corporal, seja por ação nos receptores estrogênicos ou

indiretamente por influenciarem a síntese dos hormônios tireóideos,

importantes reguladores do metabolismo energético, objetivamos neste estudo

avaliar a ação do fitoestrógeno Tp sobre a ação tireóidea e também sobre o

peso corporal de ratas ovariectomizadas.

A influência dos esteróides gonadais na regulação da massa corporal já

está bem descrita na literatura, porém pouco se sabe sobre a relação entre os

hormônios gonadais e a função tireóidea durante a gênese da obesidade. Uma

vez que os hormônios tireóideos regulam o metabolismo energético,

poderíamos supor que alguma alteração da função tireóidea pudesse levar as

33

ratas ovariectomizadas à obesidade. Dessa forma desenvolvemos um modelo

para estudo de alterações em curto intervalo de tempo, 6 e 15 dias de

tratamento, com reposição de E2, PG e PG+E2 a ratas ovariectomizadas

visando um melhor entendimento sobre as alterações que precedem o ganho

de massa corporal.

34

2 - OOOBBBJJJEEETTTIIIVVVOOOSSS

2.1 - Objetivo geral

Investigar as ações da reposição com estrógenos, progestágenos e

fitoestrógeno Trifolium pratense sobre a função tireóidea e massa corporal de

ratas Wístar castradas.

2.2 - Objetivos específicos do 1º estudo

Em ratas Wistar castradas a longo prazo e tratadas com E2, Tp ou ambos,

pretendemos:

1) Avaliar o ganho de massa corporal dos animais e a massa da glândula

tireóide;

2) Analisar as concentrações séricas de T3, T4, TSH e leptina;

3) Analisar a captação de iodeto pelo tireócito nos grupos de animais

estudados, com o objetivo de verificar se o tratamento com Tp modula a

função do co-transportador Na+ / I-;

4) Verificar a atividade tireoperoxidase, enzima chave para a biossíntese dos

hormônios tireóideos;

35

5) Medir a atividade da enzima D1 na hipófise, fígado, rins e tireóide.

2.3 - Objetivos específicos do 2º estudo

Durante a gênese do sobrepeso, em ratas Wistar castradas tratadas com E2,

PG ou ambos, pretendemos:

1) Analisar as concentrações séricas de T3, T4, leptina, progesterona e

estrogênio;

2) Estudar os efeitos da reposição hormonal sobre o ganho de massa corporal

dos animais;

3) Medir a atividade da enzima D2 na hipófise, hipotálamo e BAT.

36

3 - METODOLOGIA

3.1 – 1º ESTUDO

Efeito do tratamento com fitoestrógeno Trifolium pratense

Animais

Ratas Wistar fêmeas, adultas, pesando entre 200 e 300 g foram

mantidas em gaiolas coletivas, num máximo de seis animais por gaiola, sob

condições controladas de temperatura (22 a 24ºC) e luz (12h de luz, iniciando

às 7:00 da manhã) e todos os experimentos foram realizados de acordo com

os padrões de cuidados com os animais, definidos pelo Comitê de ética para o

uso de animais (C.E.U.A.) - (www.biof.ufrj.br/cauap.doc). Todos os animais

tiveram água e ração oferecidos ad libitum.

Os animais foram divididos em cinco grupos:

► Sham (S)

► Ovariectomizadas (Ovx)

► Ovx repostas com 17-β estradiol (E2) na dose de 5,0 µg/100g p.c. (Burdette

et al., 2002)

► Ovx tratadas com Trifolium pratense (Tp) na dose de 500 mg/kg/pc (Nestel

et al., 1999)

► Ovx + Tp + E2

Citologia Vaginal

37

Este procedimento, no qual é possível observarmos as variações

cíclicas que ocorrem durante o ciclo estral, através de esfregaço vaginal com

NaCl 0,9%, foi realizado por um período de 2 semanas em todos os animais.

Somente foram incluídas no estudo as ratas que apresentavam ciclo estral

regular de 4 a 5 dias.

Figura 7A: Esfregaço vaginal de rata nas fases do ciclo estral.

Dietro I – O esfregaço vaginal consiste de mesmas proporções entre

leucócitos, células cornificadas e células epiteliais nucleadas.

Diestro II – O esfregaço vaginal consiste predominantemente de leucócitos.

Proestro – Tem-se predominantemente a presença de células epiteliais

nucleadas.

Estro – o esfregaço consiste principalmente de células cornificadas

anucleadas.

Ovariectomia

Realizamos a castração das fêmeas, sob anestesia com Xylazina (5

mg/mL) e Cetamina (50 mg/mL), fazendo remoção bilateral dos ovários. Os

Diestro I Diestro II Proestro Estro

38

grupos controle sofreram estresse cirúrgico. Os animais sofreram eutanásia

após 23 e 74 dias de ovariectomia.

Administração de 17ββββ-Estradiol às Ratas Ovariectomizadas

As ratas ovariectomizadas receberam 17-β estradiol (Sigma) por via

subcutânea em propileno glicol durante 16 ou 60 dias após a primeira e

segunda semanas de castração, respectivamente, na dose de 5,0 µg/100g p.c.

(Burdette et al., 2002). Tanto os animais sham quanto o grupo Ovx receberam

injeção de veículo (propileno glicol). O tempo de 16 dias de tratamento foi

escolhido de acordo com trabalho prévio de Burdette et al, 2002. O tempo de

60 dias de tratamento foi escolhido por ser o mínimo tempo para caracterizar o

tratamento crônico em animais aceito pela ANVISA (Agência Nacional de

Vigilância Sanitária).

Administração do Fitoestrógeno Trifolium pratense às Ratas

Ovariectomizadas

Os animais ovariectomizados receberam o extrato seco padronizado 8%

de Trifolium pratense na dose de 500 mg/kg/d (Nestel et al., 1999; Burdette et

al., 2002), através de gavagem por 16 ou 60 dias de tratamento, que forneceu

40mg/Kg/dia de isoflavonas (genisteína, daidzeína, biochanina A e

formononetina), equivalente a dose diária dos principais produtos

comercializados contendo Tp. O extrato foi fornecido pela empresa Galena

Química e Farmacêutica LTDA; os produtos foram recebidos acompanhados

do respectivo laudo de análise, atestando o teor de ativos, no caso de extratos

e o grau de pureza no caso das demais substâncias.

39

A dose do Tp foi escolhida baseada na dose administrada a humanos na

prática clínica (Nestel et al., 1999).

Estímulo estrogênico ao tecido vaginal

A fim de avaliar o efeito estrogênico do extrato utilizado, e portanto sua

eficácia, fizemos uma comparação do esfregaço vaginal das ratas

ovariectomizadas, que foram tratadas com E2, Tp ou ambos.

Estímulo Estrogênico ao Tecido Vaginal

0 5 10 15

1

2

3

55 60

E2

TP

TP+E2

Dias após iniciado o tratamento

Méd

ia d

e P

on

tos

( V

alo

res

atri

bu

ído

s 1,

2 o

u 3

)

Figura 7B: Avaliação da resposta do tecido vaginal ao estímulo estrogênico nas ratas ovariectomizadas dos grupos que receberam tratamento com E2, n= 18, Tp, n=18 e Tp+E2, n= 18. É apresentado a média ± SE da pontuação atribuída a cada grupo. Foi atribuída pontuação 1 aos animais que apresentaram esfregaço vaginal atrófico, com grande número de leucócitos; pontuação 2 aos animais com esfregaço vaginal apresentando redução do número de leucócitos com aparecimento de células nucleadas intermediárias e pontuação 3 aos animais cujo esfregaço vaginal apresentou ausência de leucócitos com células totalmente queratinizadas ou com núcleos picnóticos. A resposta do tecido vaginal durante o tempo foi idêntica nos grupos E2 e Tp+E2 e após o 13º dia de tratamento não houve diferença estatística entre os 3 grupos. *(p<0.05).

*

40

Figura 8A : Esquema representativo da metodologia experimental do estudo 1 por 23 dias.

Figura 8B : Esquema representativo da metodologia experimental do estudo 1 – por 74 dias

Ovariectom

ia

Início d

o

tratam

ento

Eutanásia

7 dias 16 diasCitologia

vagin

al

15 dias

Ratas WistarAdultas

Tp + E2

17β-Estradiol (E2)

5,0 µg/100g pc, sc

Trifolium

pratense (Tp)

(500 mg/100g pc) gavagem

Ovariectomizadas(Ovx)

Propileno glicol, sc

Sham

(S)

Ovariectom

ia

Início d

o

tratam

ento

Eutanásia

7 dias 16 diasCitologia

vagin

al

15 dias

Ratas WistarAdultas

Tp + E2

17β-Estradiol (E2)

5,0 µg/100g pc, sc

Trifolium

pratense (Tp)

(500 mg/100g pc) gavagem

Ovariectomizadas(Ovx)

Propileno glicol, sc

Sham

(S)

Ovariectom

ia

Início d

o

tratam

ento

Eutanásia

14 dias 60 diasCitologia

vagin

al

15 dias

Ratas WistarAdultas

Tp + E2

17β-Estradiol (E2)

5,0 µg/100g pc, sc

Trifolium

pratense (Tp)

(500 mg/100g pc) gavagem

Ovariectomizadas(Ovx)

Propileno glicol, sc

Sham

(S)

Ovariectom

ia

Início d

o

tratam

ento

Eutanásia

14 dias 60 diasCitologia

vagin

al

15 dias

Ratas WistarAdultas

Tp + E2

17β-Estradiol (E2)

5,0 µg/100g pc, sc

Trifolium

pratense (Tp)

(500 mg/100g pc) gavagem

Ovariectomizadas(Ovx)

Propileno glicol, sc

Sham

(S)

41

3.2 - ESTUDO 2

Efeito da ovariectomia e reposição hormonal sobre o ganho de

massa corporal

Animais

Ratas Wístar fêmeas, adultas, pesando entre 200 e 300 g foram

mantidas em gaiolas individuais, sob condições controladas de temperatura (24

± 1ºC) e luz (12h de luz, iniciando às 7:00 da manhã) e todos os experimentos

foram realizados de acordo com os padrões de cuidados com os animais,

definidos pelo Comitê de Ética para Uso de Animais (C.E.U.A.)

(www.biof.ufrj.br/cauap.doc). Todos os animais tiveram água e ração ad

libitum. Escolhemos os tempos de 6 e 15 dias, pois aos 6 dias ainda não havia

sido estabelecido o sobrepeso e aos 15 dias já havia diferenças estatística

significativa na massa corporal entre o grupo Sham e o Ovx (Figura 7C).

Os animais foram divididos em cinco grupos:

► Sham

► Ovariectomizadas (Ovx)

► Ovx com reposição de 17-β estradiol (E2) na dose de 0,7 µg/100g p.c. (Lima

et al., 2006)

► Ovx com administração de progesterona (PG) na dose de 250µg/100g/pc

(Lisbôa et al., 2001)

► Ovx + E2 + PG

42

Figura 8C: Acompanhamento da massa corporal em experimento-piloto para a escolha dos melhores tempos de tratamento. Ratas castradas e Sham operadas tiveram sua massa corporal aferida 3, 6, 9, 11, 13 e 15 dias após a cirurgia. A massa obtida foi dividida pela massa corporal no dia da cirurgia (dia zero). O resultado foi expresso como média ± EPM. * p < 0,05 vs Sham.

Figura 8D: Esquema representativo da metodologia experimental do estudo 2.

Experimento 15 dias somado com anteriores

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 160.85

0.90

0.95

1.00

1.05

1.10

1.15

1.20

1.25ShamOvx

Dias

Mas

sa c

orp

ora

l rel

ativ

a

*

*

* *

Ovariectomia

Início do tratamento

Eutanásia

15 diasCitologia

vagin

al

15 dias

Ratas WistarAdultas

PG + E2

17β-Estradiol (E2)

0,7 µg/100g pc, sc

Progesterona (PG)

(250 µg/100g pc, sc)

Ovariectomizadas (Ovx)

Propileno glicol, sc

Sham

(S)

Eutanásia

6 diasOvariectomia

Início do tratamento

Eutanásia

15 diasCitologia

vagin

al

15 dias

Ratas WistarAdultas

PG + E2

17β-Estradiol (E2)

0,7 µg/100g pc, sc

Progesterona (PG)

(250 µg/100g pc, sc)

Ovariectomizadas (Ovx)

Propileno glicol, sc

Sham

(S)

Eutanásia

6 dias

43

3.3 - Captação de Radioiodeto – Medida de Função do NIS

À metade dos animais administrou-se, 125I (37000 Bq, i.p., Amersham,

Buckinghamshire, Inglaterra) 15 minutos ou 2 horas antes de serem

sacrificados. As tireóides removidas foram limpas e pesadas. A radioatividade

das glândulas foi medida usando um contador gama automático de fase sólida

(Wallac WizardTM 1470 automatic gamma counter) e expressa como o

percentual da dose de I125 administrada por mg de tireóide (Ferreira et al.,

2005).

3.4 - Radioimunoensaio de TSH

A determinação dos níveis séricos de TSH foi realizada através de

radioimunoensaio específico, utilizando TSH murino purificado para a

preparação da curva padrão (0,625 a 25 ng/mL), TSH murino purificado para

ser iodado e anticorpos de coelho anti-TSH murino (1° Ac) fornecidos pelo

“National Institute of Diabetes, Digestive and Kidney Diseases” (NIDDK -

Bethesda, USA).

A iodação da molécula do TSH com 125I foi realizada em nosso

laboratório, pelo método da cloramina T e a molécula marcada foi purificada

em uma coluna (Biogel – P60 fino da Bio-rad, EUA). O RIE foi realizado pelo

método do anticorpo duplo, com adição de 6% de polietilenoglicol (Ortiga,

1992).

44

3.5 - Radioimunoensaio de T3 e T4

As concentrações séricas de T3 e T4 foram determinadas através de Kit

comercial para RIE de T3 (DLS – 3100 Active, TX, EUA) e T4 (DLS – 3200,

Active, TX EUA) totais, contendo anticorpos específicos aderidos à parede

dos tubos de polipropileno e com T3 e T4 ligados ao radiotraçador (125I) com

atividade específica de 5 µCi (185 KBq). As curvas padrão foram realizadas

com T3 e T4 diluídos em soro de rato livre de iodotironinas (soro zero) nas

concentrações de 25 a 1000 ng/dl e 1 a 50 µg/dl, respectivamente. Todo o

procedimento foi realizado seguindo-se as recomendações do fornecedor.

3.6 - Extração da Tireoperoxidase Murina

Cada glândula armazenada a -20°C em tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,2,

contendo iodeto de potássio 1 mM foi homogeneizada em 500 µl do mesmo

tampão, utilizando-se homogeneizador elétrico (Ultraturrax T-25, Ika-

Labortechnik). Os homogenatos foram centrifugados (100.000g, 35 min, 4°C) e

o precipitado foi ressuspenso em 0,5 mL de digitonina (1%) e mantido a 4°C

em câmara fria por 24 horas. A seguir, foi realizada nova centrifugação nas

mesmas condições. O sobrenadante contendo TPO pseudo-solubilizada foi

utilizado nos ensaios de medida da atividade TPO. A concentração de proteína

da amostra foi medido através do método de Bradford (1976).

3.7 – Atividade de Oxidação do Iodeto da Tireoperoxidase

A atividade da enzima tireoperoxidase foi medida através da geração de

tri-iodeto in vitro, como descrito anteriormente (Moura et al., 1989; Carvalho et

al., 1994). Para tal, quantidades crescentes da preparação contendo TPO

45

foram adicionadas a uma cubeta contendo iodeto de potássio 24mM, glicose

11mM e tampão fosfato de sódio 50mM, pH 7,4, em volume final de 2ml. A

seguir, adicionou-se 10 µl de glicose oxidase 0,1% (Boehringer Grade I) para

iniciar a reação. A absorbância (A) foi então medida em um espectrofotômetro

Hitachi U-3300, no comprimento de onda de 353nm durante 4 minutos. O

∆A353nm/min foi determinado a partir da porção linear da curva de reação e

relacionado com a concentração de proteína da amostra. O resultado é

expresso em U/g de proteína.

3.8 - Atividade das Enzimas Iodotironinas Desiodases Tipo I

(D1) e Tipo II (D2)

Foram determinadas as atividades da desiodase tipo I (no fígado, rim,

glândula tireóide e hipófise) e da desiodase tipo II (na hipófise, tecido adiposo

marrom e hipotálamo) pelo método previamente publicado por Berry et al.

(1991) e adaptado por Antonio Carlos Bianco e Paul Reed Larsen

(comunicação pessoal).

3.8.1 PROCESSAMENTO DOS TECIDOS

Para a mensuração da atividade da D1, as amostras de fígado e rim,

foram pesadas em balança digital (Precision advanced) e homogeneizadas em

solução tampão fosfato -sucrose-DTT (0,25 M de sucrose e 10 mM de DTT em

100mM de fosfato de sódio com 1mM de EDTA, pH 6,9) (25 mg de tecido em

1mL). Para as amostras de tireóide e hipófise, cada glândula foi processada

em 500µL do mesmo tampão. Para a mensuração da atividade da D2, a

46

glândula hipófise, ou o BAT ou hipotálamo foram processados em 500µL de

tampão. Os tecidos foram homogeneizados, em gelo, em Ultra-turrax T25 (Ika-

Labortechnik) e, após essa etapa, foram colocados em tubos eppendorf e

armazenados a -70°C até o dia do ensaio. Alíquotas de 20µL foram guardadas

separadamente, a -20°C, para dosagem de proteínas pelo método de Bradford

(1976). As amostras foram solubilizadas com NaOH 2,5N pelo menos 30

minutos antes da dosagem (em duplicata) e a albumina bovina sérica (BSA –

SIGMA, MO, EUA) foi utilizada para a construção de uma curva padrão.

3.8.2 PURIFICAÇÃO DO 125I-rT3 E 125I-T4

Antes da dosagem da atividade da D1 e da D2 foi necessário purificar o

traçador radioativo em virtude do decaimento radioativo e da desiodação das

iodotironinas marcadas, mesmo na ausência das enzimas. Esta etapa minimiza

possíveis interferências de desiodação inespecífica. Para isso, utilizamos uma

coluna de 2,5mL de SephadexTM LH-20 (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) (4

mL de H2O/ g de gel seco) para purificar tanto o 125I-rT3 (Perkin Elmer Life and

Analytical Sciences, Inc., Boston, MA) para o ensaio da atividade da D1,

quanto o 125I-T4 (Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Inc., Boston, MA)

para o ensaio da atividade da D2. Uma alíquota de 70µL da 3,3’,5’-

triiodotironina reversa marcada, com atividade de 1210µCi/ µg (44,8MBq/ µg)

para o ensaio de atividade da D1 ou da tiroxina marcada, com atividade

específica de 1250µCi/ µg (46,3MBq/ µg) para o ensaio de atividade da D2 foi

diluída em 12mL de H2O Milli Q e adicionada à coluna. Desprezou-se o eluato,

pois o rT3 ou o T4 radioativo ficam retidos na trama da coluna. Após essa

etapa, a coluna foi lavada com 6mL de H2O Milli Q e posteriormente, as

47

iodotironinas foram eluídas com 9 alíquotas de 500µL de etanol 70%. Alíquotas

de 5µL foram retiradas para contagem da radioatividade em contador gama

automático (Wallac WizardTM 1470 automatic gamma counter), sendo

selecionadas as amostras com máxima radioatividade para o ensaio de

atividade das desiodases.

3.8.3 ENSAIO DE ATIVIDADE DA D1

Para a dosagem da atividade da D1, foram adicionados a tubos

eppendorf novos, na seguinte ordem: tampão (100Mm fosfato de sódio, 1mM

EDTA, pH 6,9) em volume calculado para um volume total de reação de 300µL,

10 mM de ditiotreitol (DTT, cofator da enzima) (USB), 1µM de rT3 frio e, por

último, foi adicionado o volume de homogeneizado contendo 30µg de proteína

para fígado, rim e tireóide, e 150µg para hipófise. A reação foi iniciada com a

adição de 50µL do 125I-rT3 purificado, contendo 50000 cpm, seguindo-se de

incubação por uma hora a 37 °C. Decorrido o tempo de incubação, os tubos

foram colocados no gelo para parar a reação e foram, então, adicionados

200µL de soro fetal bovino (Cultilab, BR) e 100µL de ácido tri-cloro acético

(TCA) 50% para a precipitação das proteínas. Em seguida, os tubos foram

agitados vigorosamente no vórtex por 2 minutos e então centrifugados a

8000xg por 3 minutos. Após a centrifugação, transferiu-se 360µL do

sobrenadante de cada tubo para tubos de polipropileno e a emissão de

partículas γ foi medida no contador gama automático de fase sólida (Wallac

WizardTM 1470 automatic gamma counter). A atividade da enzima foi expressa

em pmoles de rT3.min-1. mg-1 de proteína (Marassi et al., 2007).

48

3.8.4 ENSAIO DE ATIVIDADE DA D2

Para a dosagem da atividade da D2 hipofisária foram adicionados, a

tubos eppendorfs novos, na seguinte ordem: tampão (100Mm fosfato de sódio,

1mM EDTA, pH 6,9) em volume calculado para um volume total de reação de

300µL, ditiotreitol 20mM (DTT), T4 frio 1nM, PTU 10 mM (para inibição da D1)

e por último foi adicionado o volume de homogeneizado do tecido contendo

150 µg de proteína para hipófise, BAT e hipotálamo. A reação foi iniciada com

a adição de 100 µL do 125I-T4, contendo 100.000 cpm, e posterior incubação a

37 °C por 3 horas. Decorrido o tempo de incubação, os tubos foram colocados

no gelo para parar a reação. Foram adicionados 200µL de soro fetal bovino

(Cultilab, BR) e 100µL de ácido tri-cloro acético (TCA) 50% para a precipitação

das proteínas. Em seguida, os tubos foram agitados vigorosamente no vórtex

por 2 minutos e então centrifugados a 8000xg por 3 minutos. Após a

centrifugação, 360µL do sobrenadante foram transferidos para tubos de

polipropileno e a emissão de partículas γ foi medida no contador gama

automático de fase sólida (Wallac WizardTM 1470 automatic gamma counter). A

atividade da enzima foi expressa em fmoles de T4. min-1. mg-1 de proteína.

Tubos contendo excesso de T4 frio (100 µM) foram utilizados como controle da

reação, pois a atividade D1 residual não bloqueada por PTU foi subtraida da

atividade D2 final.

3.8.5 - LEPTINA, ESTRADIOL E PROGESTERONA SÉRICOS

As dosagens séricas de leptina foram feitas por RIE específico,

empregando um kit fornecido pela Linco Research, Inc. (Rat Leptin RIA Kit –

49

RL-83K) Para a realização do RIE utilizamos o protocolo fornecido pelo

fabricante. O resultado foi expresso em ng/mL.

As concentrações séricas de estradiol e progesterona foram

determinadas através de Kit comercial para RIE Coat-a-count (Siemens) de

leptina, estradiol e progesterona totais, contendo anticorpos específicos

aderidos à parede dos tubos de polipropileno. Todo o procedimento foi

realizado seguindo-se as recomendações do fornecedor.

4.0 - ANÁLISE ESTATÍSTICA

Todos os dados foram expressos como média ± erro padrão da média

(S.E.M.), tendo sido realizado no mínimo três experimentos diferentes, com

pelo menos dois animais por grupo, totalizando pelo menos 6 animais por

grupo experimental. As análises foram realizadas utilizando o software

GraphPad Prism 5. Para a análise estatística dos resultados do TSH, TPO,

estradiol e captação de radioiodo, utilizamos teste não-paramétrico de Kruskal-

Wallis, seguido de comparação múltipla de Dunn. Para a análise estatística dos

demais resultados, utilizamos a análise de variância univariada, seguida de

teste Bonferroni. As diferenças foram consideradas significativas quando

p<0,05.

50

5 - RESULTADOS

5.1 - 1º ESTUDO

5.1.1 – Massa corporal

Os valores referentes à massa corporal e ganho de massa dos animais

encontram-se na tabela e gráficos demonstrados a seguir. Houve aumento

significativo do ganho de massa corporal nos animais Ovx comparados ao

grupo Sham, sendo que o tratamento com Tp não conseguiu reverter

completamente os efeitos da ovariectomia, tanto no tratamento de 16, quanto

de 60 dias.

Tabela 1. Massa corporal de ratas Ovx por 23 dias tratadas com E2, Tp ou

ambos por 16 dias.

Grupos Massa Corporal (g)

Inicial Final

Sham 191 ± 6,2 221 ± 4,7ª

(n=24) (n=24)

Ovx 180 ± 12,0 261 ± 7,8 b

(n=22) (n=22)

E2 179 ± 7,2 221 ± 5,6 a

(n=19) (n=19)

Tp 187 ± 6,1 231 ± 3,9 a,b

(n=24) (n=24)

Tp + E2 191 ± 6,4 222 ± 4,5 a

(n=26) (n=26)

Os valores estão expressos como médias ± EPM; n = número de ratos. Letras iguais correspodem a valores estatisticamente semelhantes. Nível de significância p<0,05 Doses: E2 (5 µg/100g/p.c./dia sc) e Tp (500 mg/kg/pc, gavagem)

51

Tabela 2. Massa corporal de ratas 74 dias após a ovariectomia tratadas

com E2, Tp ou ambos por 60 dias.

Grupos Massa Corporal (g)

Inicial Final

Sham 204 ± 4,6 243 ± 6,0 a

(n=25) (n=25)

Ovx 213 ± 4,2 271 ± 5,4 b

(n=25) (n=25)

E2 217 ± 3,7 250 ± 4,8 a

(n=23) (n=24)

Tp 206 ± 4,5 262 ± 5,9 a,b

(n=24) (n=24)

Tp + E2 211 ± 6,6 243 ± 5,0 a

(n=21) (n=21)

Os valores estão expressos como médias ± EPM; n = número de ratos. Letras iguais correspodem a valores estatisticamente semelhantes Nível de significância p<0,05 Doses: E2 (5 µg/100g/p.c./dia sc) e Tp (500 mg/kg/pc, gavagem)

52

���� Peso absoluto glândula tireóide Não houve alteração significativa no peso absoluto da glândula tireóide

entre os diferentes grupos experimentais seja no período de 23 ou 74 dias

após castração (tabelas 3 e 4).

Tabela 3. Peso da glândula tireóide em animais após 23 dias de

ovariectomia que receberam Tp associado ou não a E2 por 16 dias.

Grupos Absoluto (mg)

Sham (n = 14)

16 ± 1,2

Ovx (n = 14) 16 ± 0,8

E2 (n = 15) 15 ± 0,7

Tp (n = 15) 13 ± 1,0

Tp + E2 (n = 15) 14 ± 0,7

Os valores foram expressos como média ± EPM; n = número de ratos. Doses: E2 (5 µg/100g/p.c./dia sc) e Tp (500 mg/kg/pc, gavagem)

Tabela 4. Peso da glândula tireóide em animais após 74 dias de

ovariectomia que receberam Tp associado ou não a E2 por 60 dias.

Grupos Absoluto (mg)

Sham (n = 25) 15 ± 0,8

Ovx (n = 25) 16 ± 0,8

E2 (n = 24) 17 ± 0,9

Tp (n = 24) 17 ± 1,0

Tp + E2 (n = 21) 17 ± 1,0

Os valores foram expressos como média ± EPM; n = número de ratos. E2 (5 µg/100g/p.c./dia sc) e Tp (500 mg/kg/pc, gavagem)

53

���� Peso uterino absoluto

Houve diminuição do peso uterino nas ratas castradas após 23 dias

(0,08±0,005) e 74 dias (0,21 ± 0,31), comparado ao grupo Sham de 16 dias

(0,36 ± 0,021) e 74 dias (0,42 ± 0,043) sendo que a reposição com E2

(0,19±0,011) ou a associação Tp+E2 (0,20 ± 0,013) por 16 dias (Figura 9) não

foi suficiente para reverter esse efeito. Com 60 dias (Figura 10) houve grande

estímulo do E2 (0,60 ± 0,035) e também da associação Tp+E2 (0,56 ± 0,033)

para o crescimento uterino, mostrando efeito tempo-dependente. O tratamento

com Tp (0,18 ± 0,020) não alterou o peso uterino em nenhum dos tempos

testados.

S Ovx E2 Tp Tp+E20.0

0.2

0.4

0.6

0.8

a

bc

b

c

Ovx

Pes

o U

teri

no

(g

)

Figura 9: Efeitos da administração de E2 (5 µg/100g/p.c./dia sc) e Tp (500 mg/kg/pc) ou ambos por 16 dias sobre o peso absoluto uterino de ratas ovariectomizadas 23 dias antes do sacrifício [Sham (n=14), Ovx (n=15), E2 (n=18), Tp (n=16), Tp+E2 (n=19)].

54

S Ovx E2 Tp Tp+E20.0

0.2

0.4

0.6

0.8

a

b

c

b

a,c

Ovx

Pes

o u

teri

no

(g

)

Figura 10: Efeitos da administração de E2 (5 µg/100g/p.c./dia sc) e Tp (500 mg/kg/pc) ou ambos por 60 dias sobre o peso absoluto uterino de ratas ovariectomizadas 74 dias antes do sacrifício [Sham (n=16), Ovx (n=15), E2 (n=15), Tp (n=14), Tp+E2 (n=12)].

5.1.2 – Concentrações séricas de T4, T3, TSH e leptina

A fim de determinarmos a influência do tratamento administrado aos

animais sobre a massa corporal e o eixo hipófise-tireóide, procedemos à

dosagem das concentrações séricas dos hormônios produzidos pela tireóide,

T4 e T3, além do hormônio tireoestimulante, TSH, responsável por estimular

todas as etapas da síntese hormonal tireóidea e também da leptina produzida

principalmente pelos adipócitos, que sinaliza o status de reserva lipídica.

���� Dosagem de Tiroxina - T4

As concentrações séricas de tiroxina (T4) total no tempo de 16 [Sham

(2,70 ± 0,416), Ovx (2,94 ± 0,325), E2 (3,40 ± 0,377), Tp (2,67 ± 0,238), Tp+E2

(3,77±0,269)] ou 60 dias [Sham (3,78 ± 0,263), Ovx (3,48 ± 0,331), E2

(4,63±0,291), Tp (3,68 ± 0,345), Tp+E2 (4,48 ± 0,340)] de tratamento,

representadas nas Figuras 11 e 12, não apresentaram diferenças significativas

entre os grupos experimentais.

55

S Ovx E 2 Tp Tp + E 20

2

4

6

Ovx

T4

( µµ µµg

/dL

)

Figura 11: Efeitos da administração de E2 (5 µg/100g/p.c./dia sc) e Tp (500 mg/kg/pc) associado ou não a E2 por 16 dias sobre os níveis séricos de T4 em ratas ovariectomizadas por 23 dias [Sham (n=15), Ovx (n=15), E2 (n=18), Tp (n=15), Tp+E2 (n=19)].

S Ovx E2 Tp Tp+E2

0

2

4

6

Ovx

T4 (

µµ µµg

/dL

)

Figura 12: Efeitos da administração de E2 (5 µg/100g/p.c./dia sc) e Tp (500 mg/kg/pc) associado ou não a E2 por 60 dias sobre os níveis séricos de T4 em ratas ovariectomizadas por 74 dias [Sham (n=14), Ovx (n=13), E2 (n=14), Tp (n=14), Tp+E2 (n=13)].

���� Dosagem sérica de Triiodotironina - T3

Nos animais após 23 dias de castração houve aumento das

concentrações séricas de T3 nos grupos tratados com E2 105,4 ± 7,71 em

relação aos grupo Sham (73,3 ± 5,17) e Tp (71,2 ± 6,21), porém não houve

diferença significativa entre os grupos Tp+E2 (98,6 ± 6,20) e Ovx (93,7 ± 7,56)

comparados aos demais grupos (Figura 13).

56

S Ovx E2 Tp Tp + E2

0

50

100

150

aa,b

b

a

a,b

Ovx

T3

(ng

/dL

)

Figura 13: Concentrações séricas de T3 em ratas castradas por 23 d tratadas por 16 dias com E2 (5 µg/100g/p.c./dia sc) e Tp (500 mg/kg/pc) associado ou não a E2 [S (n=13), Ovx (n=14), E2 (n=18), Tp (n=17), Tp+E2 (n=19)]. Letras iguais correspondem a valores estatisticamente semelhantes. E2 vs Sham, Tp (p<0,05).

Nos animais após 74 dias da castração houve aumento das

concentrações séricas de T3 no grupo Tp+E2 (112,1 ± 15,60) em comparação

ao grupo Ovx (56,6 ± 5,65) não havendo diferença significativa em comparação

aos outros grupos [S (69,1 ± 6,91) E2 (85,7 ± 5,25), Tp (80,5 ± 14,23)] (Figura

14).

S Ovx E2 Tp Tp+E20

50

100

150

Ovx

a,ba,ba,b

a

b

T3

(ng

/dL

)

Figura 14: Concentrações séricas de T3 em ratas castradas por 74 d tratadas por 60 dias com E2 (5 µg/100g/p.c./dia sc) e Tp (500 mg/kg/pc) associado ou não a E2 [S (n=14), Ovx (n=13), E2 (n=14), Tp (n=14), Tp+E2 (n=12)]. Letras iguais correspondem a valores estatisticamente semelhantes. Ovx vs Tp + E2 (p<0,05).

57

���� Dosagem sérica do Hormônio Tireotrófico - TSH

Nas ratas castradas há 23 dias, observamos uma diminuição

significativa no TSH sérico do grupo tratado com Tp+E2 (1,00 ± 0,043) em

relação ao grupo Ovx (1,49 ± 0,128) não havendo diferença significativa entre

os demais grupos [S (1.19 ± 0.084), E2 (1,33 ± 0,112), Tp (1,15 ± 0,066)] -

Figura 15. Porém, nos animais castrados há 74 dias não houve diferença

significativa entre os grupos [S (0,93 ± 0,186), Ovx (1,15 ± 0,187), E2

(1,45±0,142), Tp (1,39 ± 0,260), Tp+E2 (1,14 ± 0,093)]. - Figura 16.

S Ovx E2 Tp Tp+E2

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

a,b

aa,b

a,bb

Ovx

TS

H (

ng

/mL

)

Figura 15: Efeitos da administração de E2 (5 µg/100g/p.c./dia sc) e Tp (500 mg/kg/pc) associado ou não a E2 por 16 dias sobre os níveis séricos de TSH em ratas castradas por 23 dias [S (n=14), Ovx (n=15); E2 (n=17); Tp (n=17); Tp+E2 (n=18)]. Significativamente diferente: Tp+E2 vs Ovx (p<0,05).

S Ovx E2 Tp Tp+E2

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Ovx

TS

H (

ng

/mL

)

Figura 16: Efeitos da administração de E2 (5 µg/100g/p.c./dia sc) e Tp (500 mg/kg/pc) associado ou não a E2 por 60 dias sobre os níveis séricos de TSH em ratas Ovx por 74 dias [S (n=11), Ovx (n=12); E2 (n=12); Tp (n=11); Tp+E2 (n=8)].

58

���� Dosagem sérica da leptina

Houve aumento da leptina sérica no grupo Ovx (2,99 ± 0,660) há 23 dias

comparado aos grupos S (1,84 ± 0,303), E2 (1,68 ± 0,286) e Tp+E2

(1,62±0,181), não sendo detectada diferença significativa em relação ao grupo

Tp (2,33 ± 0,448). Nos grupos castrados há 74 dias houve aumento

significativo no grupo Ovx (9,15 ± 0,995) em comparação aos demais grupos

[S (4,21±0,879), E2 (5,42 ± 0,645), Tp (4,38 ± 0,814), Tp+E2 (3,90 ± 0,877)].

S Ovx E2 TP TP + E20

1

2

3

4

a a

b

a,b

a

Ovx

Lep

tin

a (n

g/m

l)

Figura 17: Efeitos da administração de E2 (5 µg/100g/p.c./dia sc) e Tp (500 mg/kg/pc) associado ou não a E2 por 16 dias sobre os níveis séricos de leptina em ratas Ovx por 23 dias [S (n=7), Ovx (n=6); E2 (n=6); Tp (,n=6); Tp+E2 (n=7)]. Letras iguais correspondem a valores estatisticamente semelhantes. Ovx vs Sham, E2 e Tp + E2 (p<0,05).

S Ovx E2 TP TP + E20

5

10

15

Ovx

Lep

tin

a (n

g/m

l)

a

b

aaa

Figura 18: Efeitos da administração de E2 (5 µg/100g/p.c./dia sc) e Tp (500 mg/kg/pc) associado ou não a E2 por 60 dias sobre os níveis séricos de leptina em ratas Ovx por 74 dias [S (n=5), Ovx (n=6); E2 (n=6); Tp (n=8); Tp+E2 (n=7)]. Letras iguais correspondem a valores estatisticamente semelhantes. Tp+E2 vs Ovx (p<0,001).

59

5.1.3 – Avaliação da Captação de Radioiodo pela Tireóide

A captação de radioiodo 15 minutos antes do sacrifício diminuiu, embora

não significativamente, no grupo ovariectomizado (0,02 ± 0,002) em relação ao

grupo Sham (0,03 ± 0,003) não havendo diferença significativa entre os demais

grupos [E2(0,03±0,003), Tp(0,03±0,003), Tp+E2(0,03±0,003)]. O fitoestrógeno

Tp parece não interferir com a captação de radioiodo, uma vez que os valores

estavam próximos aos do grupo Sham e também ao do ovariectomizado.

S Ovx E2 Tp Tp+E2

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

Ovx

%1

25I/m

g ti

reói

de

Figura 19: Conteúdo tireóideo de radioiodo após 15 minutos de sua administração (3700 Bq i.p.) a ratas fêmeas de 2 meses de idade ovariectomizadas (23 dias) que receberam Tp (500 mg/kg/pc) e foram repostas ou não com E2 (5 µg/100g/p.c./dia sc) durante 16 dias. A radioatividade foi medida em um contador gama e expressa como percentual do %125I injetado/mg de tireóide [S(n=7), Ovx(n=6), E2(n=9), Tp(n=9), Tp+E2(n=10)].

Uma vez que não foi observada alteração significativa na captação de

radioiodo de 15 minutos, que expressa a atividade da proteína transportadora

NIS foi avaliado o conteúdo de radioiodo após 2 horas, que reflete não só o

transporte de iodeto, mas também sua organificação. Não houve alteração no

contéudo de radioiodo após 2 horas [S(0,13 ± 0,015), Ovx(0,15 ± 0,022),

E2(0,11 ± 0,019), Tp(0,12 ± 0,013), Tp+E2(0,12 ± 0,017)], sugerindo que o Tp

parece não interferir de forma direta na biossíntese hormonal.

60

S Ovx E2 Tp Tp+E2

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

Ovx

%12

5 I/mg

tire

óide

Figura 20: Conteúdo tireóideo de radioiodo após 2 horas de sua administração (3700 Bq i.p.) a ratas fêmeas de 2 meses de idade ovariectomizadas (74 dias) que receberam Tp (500 mg/kg/pc) e foram repostas ou não com E2 (5 µg/100g/p.c./dia sc) durante 60 dias. A radioatividade foi medida em um contador gama e expressa como percentual do %125I injetado/mg de tireóide [S(n=9), Ovx( n=10), E2(n=9), Tp(n=9); Tp+E2(n=8)].

���� Atividade da Enzima Tireoperoxidase

Não foram observadas diferenças significativas da atividade

tireoperoxidase nos grupos tratados [Sham (6,3 ± 0,91), Ovx (3,7 ± 0,49), E2

(5,3 ± 1,07), Tp (4,4 ± 0,85), Tp + E2 (4,0 ± 0,57)], embora haja tendência à

diminuição da atividade TPO assim como função do NIS no grupo Ovx.

S Ovx E2 Tp Tp+E20

2

4

6

8

Ovx

Ati

vid

ade

TP

O (

U/m

g)

Figura 21: Efeito da administração de E2 (5 µg/100g/p.c./dia sc) e Tp (500 mg/kg/pc) em associação ou não a E2 sobre a atividade TPO em ratas Ovx (74 dias), tratadas por 60 dias. Os resultados foram expressos em U/mg de proteína [Sham (n=9), Ovx (n=12), E2 (n=12), Tp (n=13), Tp + E2 (n=14)]. Os resultados foram expressos como média ± EPM de cada grupo.

61

5.1.4 – Atividade da Enzima Desiodase Tipo I

Como a desiodação periférica do T4 é de grande importância para a

disponibilidade do T3 para os diferentes tecidos, mensuramos a atividade da D1

na hipófise, tireóide, fígado e rins.

Não houve alteração significativa na atividade desiodase tipo 1 na

hipófise [Sham (1,2 ± 0,31), Ovx (0,7 ± 0,09), E2 (1,0 ± 0,17), Tp (1,0 ± 0,17),

Tp+E2 (1,2 ± 0,18)] - Figura 22, tireóide [Sham (49,6 ± 4,32), Ovx (66,5 ± 7,55),

E2 (51,3 ± 6,15), Tp (45,6 ± 3,54), Tp+E2 (63,4 ± 5,39)] - Figura 23, fígado -

[Sham (28,8 ± 2,76), Ovx (30,2 ± 4,08), E2 (34,7 ± 3,26), Tp (26,4 ± 3,19),

Tp+E2 (32,6 ± 4,16)] Figura 24 e rim [Sham (47,1 ± 4,40), Ovx (44,9 ± 5,86), E2

(49,9 ± 4,91), Tp (43,9 ± 4,24), Tp+E2 (52,3 ± 3,24)] - Figura 25, no período de

ovariectomia de 23 dias e também não observamos alterações significativas na

atividade desiodase tipo 1 hepática [Sham (18,3 ± 1,87), Ovx (20,8 ± 1,66), E2

(19,1 ± 2,12), Tp (15,9 ± 2,23), Tp+E2 (23,3 ± 2,33)] - Figura 26 e hipofisária

[Sham (1,2 ± 0,32), Ovx (0,4 ± 0,12), E2 (1,2 ± 0,25), Tp (0,6 ± 0,12), Tp+E2

(0,9 ± 0,30)] - Figura 27 após 74 dias de castração, porém houve aumento na

atividade desiodase tipo 1 tireóidea - Figura 28 no grupo Tp (66,9 ± 7,18)

comparado ao Ovx (35,7 ± 3,68) não sendo detectada alteração significativa

entre os demais grupos [Sham (53,3 ± 5,91), E2 (58,5 ± 7,45), Tp+E2 (57,1 ±

7,41)].

62

S Ovx E2 Tp Tp + E2

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Ovx

pm

ole

s.rT

3/ m

in. m

g P

rote

ína

Figura 22: Atividade da desiodase tipo 1 hipofisária em animais Ovx (23 dias) que receberam ou não E2 (5 µg/100g/p.c./dia sc) ou Tp (500 mg/kg/pc) associado ou não a E2 por 16 dias [Sham (n=6), Ovx (n=6), E2 (n=9), Tp (n=9), Tp+E2 (n=10)].

S Ovx E2 Tp Tp + E2

0

20

40

60

80

Ovx

pm

ole

s.rT

3/ m

in. m

g P

rote

ína

Figura 23: Atividade da desiodase tipo 1 tireóidea em animais Ovx (23 dias) que receberam E2 (5 µg/100g/p.c./dia sc) ou Tp (500 mg/kg/pc) em associação ou não a E2 .por 16 dias [Sham (n=10), Ovx (n=10), E2 (n=11),Tp (n=10), Tp+E2 (n=12)]

63

S Ovx E2 Tp Tp + E2

0

10

20

30

40

Ovx

pm

ole

s.rT

3/ m

in. m

g P

rote

ína

Figura 24: Atividade da desiodase tipo 1 hepática em animais Ovx (23 dias) que receberam ou não E2 (5 µg/100g/p.c./dia sc) ou Tp (500 mg/kg/pc) em associação ou não a E2 por 16 dias [Sham (n=13), Ovx (n=14); E2 (n=17); Tp (n=16); Tp+E2 ( n=18)].

S Ovx E2 Tp Tp + E2

0

20

40

60

Ovx

pm

ole

s.rT

3/ m

in. m

g P

rote

ína

Figura 25: Atividade da desiodase tipo 1 renal em animais Ovx (23 dias) que receberam ou não E2 (5 µg/100g/p.c./dia sc) ou Tp (500 mg/kg/pc) em associação ou não a E2 por 16 dias. [Sham (n=14), Ovx (n=13), E2 (n=18), Tp (n=17), Tp+E2 (n=18)].

64

S Ovx E2 Tp Tp+E2

0

10

20

30

Ovx

pm

ole

s.rT

3/ m

in. m

g P

tn

Figura 26: Atividade da desiodase tipo 1 hepática em animais Ovx (74 dias) que receberam ou não E2 (5 µg/100g/p.c./dia sc) ou Tp (500 mg/kg/pc) em associação ou não a E2 por 60 dias [Sham (n=14), Ovx (n=13), E2 (n=13), Tp (n=13), Tp+E2 (n=12)].

S Ovx E2 Tp Tp+E2

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Ovx

pm

ole

s.rT

3/ m

in. m

g P

tn

Figura 27: Atividade da desiodase tipo 1 hipofisária em animais Ovx (74 dias) que receberam ou não E2 (5 µg/100g/p.c./dia sc) ou Tp (500 mg/kg/pc) em associação ou não a E2 por 60 dias [Sham (n=9), Ovx (n=7), E2 (n=7), Tp (n=3), Tp+E2 (n=3)].

65

S Ovx E2 Tp Tp+E2

0

20

40

60

80

a,b

a

a,bb

a,b

Ovx

pm

ole

s.rT

3/ m

in. m

g P

tn

Figura 28: Atividade da desiodase tipo 1 tireóidea em animais Ovx (74 dias) que receberam ou não E2 (5 µg/100g/p.c./dia sc) ou Tp (500 mg/kg/pc) em associação ou não a E2 por 60 dias [Sham (n=14), Ovx (n=12), E2 (n=13), Tp (n=12), Tp+E2 (n=11)].

66

2º ESTUDO

5.2.1 – Massa corporal

Para melhor caracterizar a interação hormônios gonadais/hormônios

tireoidianos na gênese da obesidade procedemos a avaliação da massa

corporal, dosagem sérica hormonal e atividade desiodase tipo 2 nos animais

em dois períodos: 6 e 15 dias. Como observado na figura 29, houve aumento

do ganho de massa corporal nos animais ovariectomizados em relação aos

demais grupos, o que foi significativo a partir do 9º dia após ovariectomia. Os

dados são demonstrados a seguir.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 160.85

0.90

0.95

1.00

1.05

1.10

1.15

1.20

1.25Sham

OvxE2PGPG+E2

*

**

*

Dias

Per

cen

tual

mas

sa c

orp

ora

l

Figura 29: Efeitos dos hormônios gonadais sobre o ganho de massa corporal de ratas ovariectomizadas por 6, 11, 13 e 15 dias. Os animais foram tratados com E2 (0,7 µg/100g/p.c./dia sc) e/ou PG (250 µg/100g/pc sc) [Sham (n=18), Ovx (n=9), E2 (n=10), PG (n=9), PG+E2 (n=9)]. * p<0,05 vs demais grupos.

67

���� Massa uterina em diferentes tempos de castração

Acompanhamos o peso uterino dos animais por diferentes tempos,

demonstrando o efeito esperado da castração ao longo dos tempos avaliados

Houve diminuição significativa do peso uterino nos animais castrados por 6

dias (0,22 ± 0,015), 10 dias (0,19 ± 0,019), 11 dias (0,17 ± 0,010), 13 dias

(0,17±0,003) e 15 dias (0,13 ± 0,017) em relação ao grupo Sham (0,41±0,016).

S 6d 10d 11d 13d 15d0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Ovx

b

bbb

b

Pes

o U

teri

no

Ab

solu

to (

g) a

Figura 30: Efeitos da ovariectomia sobre a massa uterina de ratas Wistar em diferentes tempos de castração (6, 10, 11, 13 e 15 dias). [Sham (n=39), Ovx 6d (n=3), Ovx 10d (n=3), Ovx 11d (n=3), Ovx 13d (n=4) Ovx 15d (n=4)]. Letras iguais correspondem a valores estatisticamente semelhantes. Sham vs Ovx em diferentes tempos (p<0,05).

5.2.2 - Concentrações séricas de leptina, estradiol, progesterona, T4

e T3.

A fim de determinarmos a influência do tratamento administrado aos

animais sobre a massa corporal e o eixo hipófise-tireóide, procedemos à

dosagem das concentrações séricas dos hormônios produzidos pela tireóide,

T4 e T3, leptina sérica produzida principalmente pelos adipócitos, que sinaliza o

status de reserva lipídica, além dos níveis séricos dos hormônios gonadais

68

estradiol e progesterona, que parecem exercer algum papel sobre a função

tireóidea além de influenciarem a massa corporal.

���� LEPTINA SÉRICA

Não houve alteração da leptina sérica nos animais do período de 6 dias

[S (5,4 ± 1,33), Ovx (4,5 ± 1,51), E2 (4,2 ± 1,90), PG (3,2 ± 0,84), PG+E2 (4,7 ± 1,07)] -

Figura 31, porém no tratamento por 15 dias (Figura 32) observamos diminuição

significativa nos animais repostos com E2 (4,7 ± 0,56) e PG (3,9±0,36)

isoladamente quando comparados ao grupo Ovx e também há diferença entre

o grupo PG+E2 (2,9 ± 0,23) comparado ao Sham (6,2 ± 0,58) e ao Ovx(6,9 ±

0,92).

S O E2 PG PG+E20.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

Ovx

Lep

tin

a (n

g/m

L)

Figura 31: Efeitos da administração de E2 (0,7 µg/100g/p.c./dia sc) e PG (250 µg/100g/pc sc) associado ou não a E2 sobre os níveis séricos de leptina em ratas Ovx por 6 dias [S (n=6), Ovx (n=4), E2 (n=3), PG (n=3), PG+E2 (n=4)].

69

S O E2 PG PG+E20.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

a,ba

b,cb,c

c

Ovx

Lep

tin

a (n

g/m

L)

Figura 32: Efeitos da administração de E2 (0,7 µg/100g/p.c./dia sc) e PG (250 µg/100g/pc sc) associado ou não a E2 sobre os níveis séricos de leptina em ratas Ovx por 15 dias [S (n=16), Ovx (n=9); E2 (n=10); PG (n=9); PG+E2 (n=9)].

���� ESTRADIOL SÉRICO

Houve aumento do estradiol sérico no grupo PG+E2 (29,1 ± 48,17)

comparado ao grupo Ovx (109,5 ± 24,37) no período de 15 dias de castração,

não sendo detectada alteração significativa entre os demais grupos [S (152,7 ±

15,79), E2 (166,1 ± 45,08), PG (149,5 ± 13,61)].

S Ovx E2 PG PG+E20

100

200

300

400

a,ba

a,ba,b

b

Ovx

E s

trad

iol p

g/m

L

Figura 33: Efeitos da administração de E2 (0,7 µg/100g/p.c./dia sc) e PG (250 µg/100g/pc sc) associado ou não a E2 sobre os níveis séricos de estradiol em ratas Ovx por 15 dias [S (n=16), Ovx (n=5), E2 (n=5), PG (n=4), PG+E2 (n=4)].

70

���� PROGESTERONA SÉRICA

Houve diminuição significativa da concentração sérica de progesterona

nos grupos Ovx (9,8 ± 2,16) e resposto com E2 (6,6 ± 9,90), PG (8,4 ± 1,53) ou

ambos (7,1 ± 1,25) comparado ao grupo Sham (31,7 ± 2,91).

15 DIAS

Sham Ovx Eb PG PG+Eb0

10

20

30

40 a

bb b b

Pro

ges

tero

na

(ng

/mL

)

Figura 34: Efeitos da administração de E2 (0,7 µg/100g/p.c./dia sc) e PG (250 µg/100g/pc sc) associado ou não a E2 sobre os níveis séricos de progesterona em ratas Ovx por 15 dias [S (n=5), Ovx (n=5), E2 (n=3), PG (n=4), PG+E2 (n=4)]. Letras iguais correspondem a valores estatisticamente semelhantes. S vs Ovx, E2 (p<0,05).

���� Dosagem de Tiroxina - T4

Houve diminuição significativa nas concentrações séricas de T4 no

grupo E2 (2,86 ± 0,235) comparado ao Ovx (4,56 ± 0,437) não havendo

diferença significativa entre os demais grupos [Sham (4,15±0,296), PG

(3,03±0,336), PG+E2 (3,56±0,415)]. - Figura 35.

71

S Ovx E2 PG PG+E20

2

4

6

a,bb

a a,ba,b

Ovx

T4

( µµ µµg

/dL

)

Figura 35: Efeitos da administração de E2 (0.7 µg/100g/p.c./dia sc) e PG (250 µg/100g/pc sc) associado ou não a E2 sobre os níveis séricos de T4 em ratas ovariectomizadas por 15 dias [Sham (n=18), Ovx (n=9), E2 (n=8), PG (n=9), PG+E2 (n=9)]. Letras iguais correspondem a valores estatisticamente semelhantes. Ovx vs E2 (p=0,0083).

���� Dosagem sérica de Triiodotironina - T3

Nos animais castrados há 15 dias, não houve diferença significativa do

T3 sérico entre os grupos experimentais [Sham (58,24 ± 2,727), Ovx (49,06 ±

2,921); E2 (50,46 ± 2,042); PG (51,77 ± 2,110); PG+E2 (59,42 ± 4,160)] - Figura

36.

S Ovx E2 PG PG+E20

20

40

60

80

Ovx

T3

(ng/

dL)

Figura 36: Efeitos da administração de E2 (0.7 µg/100g/p.c./dia sc) e PG (250 µg/100g/pc sc) associado ou não a E2 sobre os níveis séricos de T3 em ratas ovariectomizadas por 15 dias [Sham (n=18), Ovx (n=9), E2 (n=10), PG (n=9), PG+E2 (n=9)].

72

5.2.3 - Atividade da Enzima Desiodase Tipo 2

Como a desiodação periférica do T4 é de grande importância para a

disponibilidade do T3 para os diferentes tecidos, mensuramos a atividade da

enzima no BAT (tecido adiposo marrom), hipófise e hipotálamo.

Não houve alteração significativa na atividade desiodase tipo 2 no BAT

[Sham (0,41 ± 0,041), Ovx (0,35 ± 0,038), E2 (0,39 ± 0,024), PG (0,36 ± 0,040),

PG+E2 (0,31 ± 0,024)] - Figura 37 e hipófise [Sham (0,66 ± 0,086), Ovx (0,51 ±

0,081), E2 (0,85 ± 0,117), PG (0,60 ± 0,056), PG+E2 (0,56 ± 0,057)] - Figura 39,

porém houve diminuição significativa na atividade desiodase tipo 2 no

hipotálamo - no grupo PG+E2 (0,56 ± 0,057) comparado ao grupo E2 (0,85 ±

0,117) no experimento de 6 dias não havendo diferença significativa entre os

demais grupos [Sham (0,66 ± 0,086), Ovx (0,51 ± 0,081), PG (0,60 ± 0,056)] -

Figura 41.

Não houve alteração significativa na atividade desiodase tipo 2 no BAT

[Sham (0,96 ± 0,135), Ovx (0,74 ± 0,166); E2 (0,59 ± 0,086); PG (0,85 ± 0,142);

PG+E2 (0,79 ± 0,141)] - Figura 38, hipófise [Sham (3,13 ± 0,364), Ovx (2,56 ±

0,248), E2 (3,47 ± 0,371), PG (2,77 ± 0,270), PG+E2 (3,50 ± 0,370)] - Figura 40

e hipotálamo - [Sham (0,63 ± 0,250), Ovx (0,83 ± 0,18), E2 (1,04 ± 0,260), PG

(1,00 ± 0,073), PG+E2 (0,81 ± 0,071)] - Figura 42 no período de ovariectomia

de 15 dias.

73

Sham Ovx E2 PG PG+E20.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Ovx

fmol

es T

4/m

in.m

g.p

tn

Figura 37: Atividade da desiodase tipo 2 no tecido adiposo marrom (BAT) em animais Ovx (6 dias) que receberam ou não E2 (0.7 µg/100g/p.c./dia sc) ou PG (250 µg/100g/pc sc) associado ou não a E2 [Sham (n=9), Ovx (n=5), E2 (n=5), PG (n=4), PG+E2 (n=4)].

Sham Ovx E2 PG PG+E20.0

0.5

1.0

1.5

Ovx

fmo

les

T4/

min

.mg

.ptn

Figura 38: Atividade da desiodase tipo 2 no tecido adiposo marrom (BAT) em animais Ovx (15 dias) que receberam ou não E2 (0.7 µg/100g/p.c./dia sc) ou PG (250 µg/100g/pc sc) associado ou não a E2 [Sham (n=14), Ovx (n=9), E2 (n=9), PG (n=8), PG+E2 (n=7)].

74

Sham Ovx E2 PG PG+E20.0

0.5

1.0

1.5

Ovx

fmol

es T

4/m

in.m

g.p

tn

Figura 39: Atividade da desiodase tipo 2 hipofisária em animais Ovx (6 dias) que receberam ou não E2 (0.7 µg/100g/p.c./dia sc) ou PG (250 µg/100g/pc sc) associado ou não a E2 [Sham (n=9), Ovx (n=5), E2 (n=5), PG (n=4), PG+E2 (n=4)].

Sham Ovx E2 PG PG+E20

1

2

3

4

5

Ovx

fmo

les

T4/

min

.mg

.ptn

Figura 40: Atividade da desiodase tipo 2 hipofisária em animais Ovx (15 dias) que receberam ou não E2 (0.7 µg/100g/p.c./dia sc) ou PG (250 µg/100g/pc sc) associado ou não a E2 [Sham (n=13), Ovx (n=9), E2 (n=10), PG (n=9), PG+E2 (n=8)].

75

Sham Ovx E2 PG PG+E20.0

0.2

0.4

0.6 a,b a,b a,ba

b

Ovx

fmo

les

T4/

min

.mg

.ptn

Figura 41: Atividade da desiodase tipo 2 hipotalâmica em animais Ovx (6 dias) que receberam ou não E2 (0.7 µg/100g/p.c./dia sc) ou PG (250 µg/100g/pc sc) associado ou não a E2 [Sham (n=9), Ovx (n=5), E2 (n=5), PG (n=4), PG+E2 (n=4)]. Letras iguais correspondem a valores estatisticamente semelhantes. E2 vs PG+E2 (p<0,0149).

Sham Ovx E2 PG PG+E20.0

0.5

1.0

1.5

Ovx

fmo

les

T4/

min

.mg

.ptn

Figura 42: Atividade da desiodase tipo 2 hipotalâmica em animais Ovx (15 dias) que receberam ou não E2 (0.7 µg/100g/p.c./dia sc) ou PG (250 µg/100g/pc sc) associado ou não a E2 [Sham (n=4), Ovx (n=4), E2 (n=3), PG (n=3), PG+E2 (n=3)].

76

666...000 --- DDDIIISSSCCCUUUSSSSSSÃÃÃOOO

A partir da perimenopausa, há diminuição dos níveis de estrogênio

circulante (Burdette, 2002; Wuttke et al., 2003) o que leva as mulheres a

experimentarem sintomas que implicam em perda da qualidade de vida (Liu et

al.,2001; Horn-Ross, 2002; Beck et al., 2005). Além disso, com o declínio na

produção do estrogênio endógeno podemos constatar alterações metabólicas

que levam a mudanças na quantidade e distribuição de tecido adiposo (Kannel

et al., 1991; Zamboni et al., 1992; Zamboni et al., 1996). Essa alteração em

relação à deposição de tecido adiposo é reversível, uma vez que estudos

realizados por Gambacciani et al. (1997) e Sites (1998) mostram que a

obesidade abdominal foi reduzida pela terapia de reposição hormonal em

mulheres na menopausa. A Terapia de Reposição Hormonal (TRH), utilizando

estrógenos em associação ou não a progestágenos, tem ajudado a amenizar

os inúmeros sintomas da menopausa. Estudos demonstraram aumento no

risco de desenvolvimento de câncer de mama e câncer endometrial em

pacientes que fazem uso da TRH (Rossouw et al., 2002; Beck et al., 2003;

Goldstein & Sites, 2002; Wuttke et al., 2003). Dessa forma, muitas mulheres

descontinuaram a TRH convencional e passaram a procurar alternativas para

tratar os sintomas da menopausa, preferindo os chamados fitoestrógenos.

Fitoestrógenos são um grupo de compostos naturais policíclicos que

exercem atividades estrogênicas e estão sendo usados para o tratamento das

doenças decorrentes da menopausa (Beck et al., 2003 e 2005; Wuttke et al.,

2003; ).

Dados epidemiológicos e estudos experimentais mostram que uma dieta

rica em fitoestrógenos reduz os fogachos e a incidência de câncer de mama

77

em mulheres orientais (Piersen, 2003; Adlercreutz, 2002), além de reduzir o

risco de desenvolver osteoporose (Nikander, 2004). Dentre os benefícios da

utilização de fitoestrógenos podemos citar: diminuição do colesterol sérico

(Sirtori et al., 1995; Carroll & Kurowska, 1995) e prevenção de doenças

cardiovasculares (Knight et al., 1996; Sirtori et al., 1995). Dentre as plantas

mais utilizadas, podemos citar o red clover [Trifolium pratense (Tp)] (Liu et al.,

2001; Beck et al., 2003). O Tp possui concentração significativa das

isoflavonas biochanina A e formononetina, além de genisteína e daidzeína, que

se acredita serem os responsáveis por seus efeitos biológicos (Beck et al.,

2003; Burdette et al., 2002).

Apesar dos vários efeitos benéficos atribuídos aos isoflavonóides, são

atribuídos também possíveis efeitos colaterais sobre a função tireóidea, como:

inibição da atividade tireoperoxidase (Divi et al., 1997; Doerge & Chang 2002)

e inibição da atividade das iodotironinas desiodases (Gaitan, 1996, Ferreira et

al., 2002) detectadas in vitro, então poderia haver alteração na biossíntese

hormonal e no metabolismo periférico dos hormônios tireóideos in vivo. Os

isoflavonóides também afetam as proteínas ligadoras dos hormônios tireóideos

e consequentemente a regulação do TSH (Gaitan, 1996). Midleton et al. (2000)

demonstraram que a genisteína possui ação inibidora sobre as enzimas

tirosina cinases.

Nesse estudo, foi avaliado o efeito do tratamento com o fitoestrógeno Tp

sobre a função tireóidea e massa corporal in vivo por curto e médio intervalo de

tratamento, uma vez que dados na literatura são ainda muito limitados. Em

geral, os estudos sobre a influência desses compostos sobre a função tireóidea

78

têm sido feitos in vitro. Além disso, foi avaliada a relação entre hormônios

gonadais e função tireóidea na gênese da obesidade.

Conforme anteriormente descrito (Wu et al., 2004; Burdette et al., 2002),

as fêmeas ovariectomizados apresentaram ganho de massa corporal após a

castração e este efeito foi revertido pela administração de E2, o que está de

acordo com dados da literatura (Wu et al.,2004; Mohamed et al., 2000), porém

a administração de Tp não conseguiu reverter completamente tal efeito seja no

período de 23 ou 74 dias após a castração, o que é contraditório com o

trabalho de Burdette et al. (2002), no qual o tratamento com Tp no período de

23 dias de castração, levou à reversão do ganho de massa corporal, o que

pode ser atribuído à diferente linhagem dos animais (Sprague-Dawley) ou

mesmo à quantidade de animais por gaiola. Trabalhos com camundongos

Knock-out para REα (αERKO) ou camundongos com deficiência na síntese de

estrogênio devido à deleção do gene da aromatase ou do gene para o receptor

de FSH tiveram aumento de mais de 100% da gordura corporal, confirmando o

efeito do estrogênio sobre a regulação de massa adiposa (Heine et al., 2000;

Jones et al., 2000; Danilovich et al., 2000). Esses resultados sugerem que o

ganho de massa corporal nos animais Ovx é principalmente causado pela

diminuição dos níveis de estrógenos e os dados obtidos nesse trabalho

mostram que o tratamento com o fitoestrógeno Tp não parece exercer efeito

estrogênico significativo em relação ao ganho de massa corporal.

Tendo em vista que a obesidade é um grave problema de saúde pública,

uma vez que predispõe a diversas doenças, e considerando-se que há

aumento da incidência deste distúrbio após a menopausa, é de fundamental

79

importância um melhor entendimento sobre os fenômenos que acompanham o

desenvolvimento da obesidade.

A influência dos esteróides gonadais na regulação da massa corporal já

está bem descrita na literatura (Geary e Asarian, 1999; McElroy e Wade, 1987;

Laudenslager et al., 1980), porém pouco se sabe sobre a relação entre os

hormônios gonadais e a função tireóidea durante a gênese da obesidade. Uma

vez que os hormônios tireóideos regulam o metabolismo energético,

poderíamos supor que alguma alteração da função tireóidea pudesse levar as

ratas ovariectomizadas à obesidade. Dessa forma foi desenvolvido um modelo

para estudo de alterações em curto intervalo de tempo, 6 e 15 dias de

tratamento, com reposição de E2 (17-βestradiol), PG (progesterona) e PG+E2 a

ratas ovariectomizadas, visando um melhor entendimento sobre as alterações

que precedem o ganho de peso corporal. A melhor compreensão dos

mecanismos envolvidos na gênese do sobrepeso e da obesidade poderá

contribuir para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para o

tratamento deste importante problema que vem se acentuando com a adoção

de uma vida mais sedentária pela maioria da população.

Foi observado aumento significativo no percentual de massa corporal a

partir do 9º dia de castração, sendo esse ganho revertido tanto pela

administração de E2 quanto de progesterona na dose utilizada, o que está de

acordo com trabalhos prévios desenvolvidos no laboratório (Marassi et al.,

2007).

A leptina sérica não estava significativamente alterada no protocolo de 6

dias entre os diferentes grupos, porém foi observada diminuição significativa

nas concentrações de leptina nos grupos E2, PG e PG+E2 em comparação aos

80

animais ovariectomizados no protocolo de 15 dias de castração. Houve

aumento significativo da leptina sérica nos animais 23 dias após ovariectomia

quando comparados ao grupo sham, o que já era esperado uma vez que vários

trabalhos têm demonstrado interações entre estrógenos e leptina. Além disso,

esses animais estavam com sobrepeso, e sabe-se que quanto maior a massa

adiposa maior a produção de leptina. Kimura et al. (2002) demonstraram

diminuição do receptor de leptina no cérebro de ratas ovariectomizadas o que

dificultaria a sinalização sobre a adiposidade do animal, levando ao aumento

de ganho de massa corporal.

Nos animais castrados há 74 dias houve aumento significativo da leptina

quando comparado aos demais grupos. A influência dos estrógenos e da

terapia de reposição hormonal sobre a secreção de leptina e sua concentração

sérica é incerta, uma vez que alguns autores demonstraram que os estrógenos

influenciam a secreção de leptina enquanto outros não conseguiram

demonstrar tal influência (Hadji et al., 2000; Lambrinoudaki et al., 2003; Douchi

et al., 2002; Ayub et al., 2006).

Em trabalho recente de Shin et al. (2007) foi demonstrada a existência

de correlação entre a expressão dos subtipos de receptor de estrogênio

(ERα/ERβ) no tecido adiposo omental e a obesidade, assim como do mRNA de

leptina neste tecido, o que não foi observado em relação ao tecido adiposo

subcutâneo. Nesse trabalho o grupo de mulheres com maior expressão de

ERβ que ERα, no tecido adiposo omental, apresentou maior grau de

adiposidade (maior índice de massa corporal [BMI] e circunferência abdominal)

comparado ao grupo com maior expressão de ERα que ERβ, além de maior

leptinemia. A hipótese desses autores é que o aumento na expressão de ERβ

81

poderia bloquear os efeitos benéficos do ERα (como regulação negativa da

lipase lipoprotéica). Uma vez que o estrogênio parece exercer seus efeitos

metabólicos predominantemente via ERα em camundongos, uma maior

expressão de ERβ bloquearia seus efeitos.

Demonstrando a eficácia do modelo experimental de castração utilizado

nesse trabalho, foi avaliado o peso absoluto do útero nos animais em

diferentes tempos de castração; o peso absoluto do útero foi significativamente

menor nas ratas ovariectomizadas a partir do 6º dia de castração. Essa

diminuição significativa do peso uterino nos animais ovariectomizados é

secundário à deficiência de estrogênio. A dose de E2 utilizada não foi suficiente

para reverter os efeitos da ovariectomia em 23 dias após a castração, o que

mostrou ser tempo-dependente, uma vez que com o período maior de

tratamento a mesma dose de E2 aumentou significativamente o peso uterino

dos animais. Não foi observado efeito de Tp sobre o peso uterino, o que já era

esperado, uma vez que, como dito anteriormente, os fitoestrógenos agem

principalmente via ERβ e no útero, há predominância do ERα. Isso pode ser

considerado de grande importância, pois esse fitoestrógeno não causaria no

útero, os efeitos indesejáveis atribuídos à TRH convencional, como o aumento

na predisposição ao câncer de colo de útero (Dew et al., 1998; Hedblad et al.,

2002).

Não foi observada alteração significativa no peso absoluto da tireóide

nos dois períodos de castração, o que corrobora os achados de Madej et al.

(2002) e Lima et al. (2006), embora houvesse ligeira diminuição nas ratas

tratadas com Tp nos animais castrados após 23 dias. Tal dado pode indicar um

possível efeito antagonista neste tecido, uma vez que o estrogênio exerce

82

efeito proliferativo sobre a tireóide in vitro (Furlanetto et al., 1999), apesar de

não haver relatos sobre que tipo de ER estaria envolvido com esse efeito em

tireócitos.

No período de castração de 23 dias, foi demonstrado que o conteúdo de

radioiodo após 15 minutos de sua administração não foi significativamente

alterado entre os grupos tratados, embora tenha havido diminuição não

significativa no grupo Ovx, o que é condizente com os resultados anteriormente

obtidos por nosso grupo (Lima et al., 2006). Outros fatores parecem estar

modulando a captação de iodeto pelo NIS nas ratas Ovx, pois o TSH sérico

neste grupo estava normal. A administração de E2 estimulou, embora de

maneira não significativa, a captação de radioiodo pela glândula, sugerindo um

efeito direto do E2 sobre a tireóide, pois o TSH deste grupo encontra-se dentro

da faixa da normalidade.

Para analisarmos a capacidade de síntese hormonal no grupo após 74

dias de castração, foi avaliado o conteúdo de radioiodo após 2 horas de sua

administração; não foi observada alteração significativa entre os grupos

tratados. Com relação à atividade tireoperoxidase, não foi observada alteração

significativa na atividade desta enzima nos animais após 74 dias de castração

tratados com Tp in vivo, embora tanto Divi et al., (1997) quanto Doerge et al.,

(2002) tenham demonstrado inibição da atividade TPO por isoflavonóides in

vitro.

Pode-se supor então que, ao durante o processamento da TPO, os

isoflavonóides poderiam se dissociar da enzima, pois estariam ligados

reversivelmente a esta, sendo que o mesmo ocorre com os anti-tireóideos

clássicos que são potentes inibidores da TPO, como PTU e MMI. Além disso,

83

dados na literatura sugerem que o iodo exerce efeito protetor sobre a ação dos

isoflavonóides (Ikeda, 2000) deste modo, talvez pelo fato dos animais

receberem níveis suficientes de iodo na dieta, essa inibição seja impedida in

vivo. Um outro fator que deve ser considerado é que a dose ou o tempo de

tratamento não tenha sido suficiente para bloquear a biossíntese hormonal.

Outra hipótese é que não cheguem quantidades suficientes de isoflavonóides

na tireóide devido à limitada absorção intestinal e/ou ao efeito de primeira

passagem.

Esses dados mostram que, caso as isoflavonas inibam a TPO in vivo,

sua ação é muito menos potente que a do PTU e MMI, pois esses causam

inibição da biossíntese hormonal em menos de sete dias. O fato do Tp não

levar à redução de T3 e T4 séricos também reforça a hipótese de não haver

inibição da TPO in vivo.

Não houve alteração significativa nas concentrações séricas de T3 entre

os grupos experimentais no período de 15 dias de castração, porém houve

diminuição significativa nas concentrações séricas de T4 no grupo E2

comparado ao grupo Ovx, como já demonstrado anteriormente (Chen &

Walfish 1978 a e b, Harris et al., 1979). Isso poderia estar correlacionado ao

possível aumento da atividade desiodase tipo 1 hepática e/ou renal induzida

pelo tratamento com E2 por 15 dias, não avaliado no presente estudo.

Os animais castrados há 23 ou 74 dias não apresentaram diferenças

significativas nas concentrações séricas de T4, o que está de acordo com os

trabalhos de Lisbôa et al., 2001, Christianson et al., 1981 e Lima et al., 2006,

embora haja tendência ao aumento de sua concentração nas ratas que

receberam reposição com E2. Já os níveis de T3 estão aumentados nos

84

animais castrados há 23 dias tratados tanto com E2 quanto com Tp+E2 em

comparação ao grupo Sham; já nos animais castrados há 74 dias houve

aumento significativo do T3 no grupo Tp+E2 comparado ao grupo Ovx, o que

pode ser devido à modificação na metabolização periférica do T4. No período

de castração de 23 dias, mas não no de 74 dias, o grupo tratado com Tp+E2

apresentou diminuição significativa dos níveis séricos de TSH em relação ao

grupo ovariectomizado, o que parece ser consequência dos níveis elevados de

T3 sérico. Uma vez que foi observado aumento do T3 sérico no grupo Tp+E2

quando comparado ao grupo Sham isso poderia sinalizar um possível efeito

colateral do fitoestrógeno sobre a função tireóidea de mulheres ainda em

período reprodutivo.

A atividade da enzima D1 hipofisária, tireóidea, hepática e renal não

sofreu alteração nos animais castrados há 23 dias, tratados ou não com E2

e/ou Tp, com as doses utilizadas. Não foi observada alteração significativa na

atividade D1 hipofisária e hepática nos animais ovariectomizados há 74 dias,

porém houve aumento significativo da D1 tireóidea do grupo Tp comparado ao

grupo Ovx, embora não haja alteração nas concentrações séricas de T3 nesse

grupo.

Dada a necessidade de melhor caracterizar o perfil metabólico/hormonal

foi feita a dosagem da atividade desiodase tipo 2 (D2) no tecido adiposo

marrom (BAT), hipófise e hipotálamo dos animais. Não foram observadas

alterações significativas na atividade desiodase tipo 2 (D2) no BAT e hipófise

dos animais castrados por 6 dias, porém houve diminuição significativa na

atividade desiodase tipo 2 hipotalâmica no grupo PG+E2 comparado ao grupo

E2. Essa diminuição poderia explicar o menor ganho de massa corporal nos

85

animais tratados com a associação PG+E2, pois em trabalho de Kong et al.

(2004) foi demonstrado que o T3 produzido no hipotálamo por ação da enzima

D2, leva ao aumento da ingestão alimentar. Esse efeito parece ser mediado

pela liberação de neuropeptídeo Y estimulada pelo T3 produzido localmente

(Coppola et al., 2007).

Não foram observadas alterações significativas na atividade D2 no BAT,

hipófise e hipotálamo no período de ovariectomia de 15 dias, como também

não foi observada alteração significativa na atividade D2 hipofisária no trabalho

de Lisbôa et al. (1997, 2001).

Avaliando as concentrações séricas de estradiol em maior período de

castração (15 dias) foi detectado aumento significativo do estradiol sérico nos

animais tratados com PG+E2 comparado ao grupo ovariectomizado. Em

relação às concentrações séricas de progesterona por um período de

castração de 15 dias houve diminuição significativa da concentração desse

hormônio no grupo Ovx e E2 comparado ao grupo Sham.

Considerando os resultados do presente estudo, pode-se dizer que

doses contínuas de Tp não alterariam de forma significativa o padrão hormonal

tireóideo. Uma possível redução da atividade tireoperoxidase in vivo poderia

levar à diminuição do conteúdo de iodo organificado, promovendo então o

aumento da sensibilidade da glândula ao TSH, o que poderia explicar a síntese

normal dos hormônios tireóideos apesar dos baixos níveis de TSH. Contudo, é

possível que o tratamento crônico com fitoestrógeno Tp (além de 60 dias)

possa bloquear a biossíntese hormonal; porém, é muito provável que os efeitos

do fitoestrógeno Tp sobre a biossíntese hormonal seja dependente de baixa

ingestão de iodo. Além disso, em mulheres na pré-menopausa que façam

86

ingestão de elevados níveis de fitoestrógenos poderíamos observar aumento

do T3 sérico, caracterizando um possível efeito colateral desses compostos, o

que pode ser espécie-específica.

Baseados nesses resultados, supõe-se que não há alterações

significativas nos parâmetros de função tireóidea envolvidos na gênese da

obesidade após a ovariectomia, porém mais estudos são necessários para

melhor esclarecimento sobre a função de outras moléculas sinalizadoras e sua

interação com os hormônios tireóideos para caracterizar as alterações que

acompanham o desenvolvimento da obesidade.

87

777...000 --- CCCOOONNNCCCLLLUUUSSSÃÃÃOOO

A castração dos animais diminuiu o peso uterino e aumentou o ganho de

massa corporal, sendo esse efeito revertido pela reposição com E2, mas não

com a administração do fitoestrógeno Tp, apesar do Tp ter apresentado efeito

trófico sobre o tecido vaginal, sem promover efeitos significativos no tecido

uterino. Apesar de alguns trabalhos demonstrarem efeitos dos fitoestrógenos

sobre a função tireóidea in vitro, seu efeito in vivo não parece alterar de forma

significativa o perfil hormonal tireóideo, pois não foi constatada alteração

significativa nas concentrações séricas de T4, T3 e TSH, na função da proteína

transportadora NIS, da atividade tireoperoxidase ou atividades desiodases.

Observamos ganho de massa corporal a partir do 9º dia de castração,

sendo esse efeito revertido tanto por E2 quanto PG nas doses utilizadas. A

leptina sérica já estava aumentada nos animais no período de 15 dias após a

castração sendo a reposição com E2, PG e Tp suficiente para reverter esse

perfil, possivelmente pelo fato do animal não ter aumentado o ganho de massa

corporal. Porém, não observamos alterações significativas nas concentrações

séricas hormonais e atividade desiodase que nos permitisse caracterizar a

participação dos hormônios tireóideos na gênese da obesidade.

88

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