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ALESSANDRA ROSA BLAUTH
AVALIAÇÃO DO EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO COM
ÁCIDOS GRAXOS ÔMEGA-3 EM TRATAMENTOS PRÉ E PÓS-
NATAL SOBRE PARÂMETROS DE METABOLISMO
ENERGÉTICO EM ANIMAIS SUBMETIDOS A UM MODELO
EXPERIMENTAL DE DOENÇA DA URINA DO XAROPE DE
BORDO
Dissertação de Mestrado
apresentada ao Programa de Pós
Graduação em Ciências da Saúde
para a obtenção do título de
Mestre.
Orientador: Prof. Dr. Emilio Luiz
Streck
CRICIÚMA
2016
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Bibliotecária Eliziane de Lucca Alosilla – CRB 14/1101
Biblioteca Central Prof. Eurico Back - UNESC
B645a Blauth, Alessandra Rosa.
Avaliação do efeito da suplementação com ácidos graxos
ômega-3 em tratamentos pré e pós-natal sobre parâmetros de
metabolismo energético em animais submetidos a um modelo
experimental de doença da Urina do Xarope de Bordo /
Alessandra Rosa Blauth ; orientador: Emilio Luiz Streck. –
Criciúma, SC : Ed. do Autor, 2016.
90 p. : il. ; 21 cm.
Dissertação (Mestrado) - Universidade do Extremo Sul
Catarinense, Programa de Pós-Graduação em Ciências da
Saúde, Criciúma, 2016.
1. Ácidos graxos ômega-3 – Uso terapêutico. 2. Doença da
Urina do Xarope do Bordo – Tratamento. 3. Aminoácidos de
cadeia ramificada. 4. Creatina quinase. 5. Transporte de
elétrons. I. Título.
CDD 22. ed. 615.1
FOLHA INFORMATIVA
A dissertação foi elaborada seguindo o estilo Vancouver e será
apresentada no formato tradicional. Este trabalho foi realizado nas
instalações do Laboratório de Bioenergética e do Laboratório de
Biologia Celular e Molecular do Programa de Pós-Graduação em
Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense.
Dedico este trabalho à minha família, por ter sido um alicerce
em minha vida e me empurrado à frente sempre que pensei em parar.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por me permitir vivenciar
grandes coisas.
Aos meus pais, por aguentarem os momentos de tensão. Aos meus amigos, que me apoiaram em todas as situações e que
cansaram de me ouvir dizer que tinha que terminar esse trabalho.
Ao meu orientador Dr. Emílio Luiz Streck, pelo apoio durante
toda essa caminhada.
Á professora Drª. Patrícia Fernanda Schuck, que se prontificou a me ajudar no desenvolvimento desse trabalho, quando necessário.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências da
Saúde, por todo o conhecimento que me proporcionaram. Ás “meninas do laboratório”, Meline, Milena, Lara e Fernanda,
por toda a paciência e auxílio durante essa trajetória.
RESUMO
A doença da Urina do Xarope de Bordo (DXB) é uma doença
hereditária associada a uma alteração no metabolismo dos aminoácidos
de cadeia ramificada, acarretando um acúmulo desses aminoácidos
(leucina, valina e isoleucina) e seus derivados, α-cetoisocaproico, α-
cetometilvalérico e α-cetoisovalérico. Esse acúmulo é prejudicial ao
desenvolvimento do tecido nervoso. A aparecimento da doença se dá,
normalmente, logo após o nascimento, sendo de difícil diagnóstico e
muitas vezes fatal. Os pacientes que sobrevivem, normalmente
apresentam danos no neurodesenvolvimento. O tratamento da DXB
consiste, basicamente, em uma dieta restritiva de aminoácidos de cadeia
ramificada, muitas vezes complementada com fórmulas dietéticas
pobres em ácidos graxos ômega-3. A suplementação do ácido graxo
ômega-3 vem sendo amplamente discutida de forma terapêutica, pois
minimizaria os danos neurológicos ao atuar no desenvolvimento e
manutenção do sistema nervoso central. O objetivo desse estudo foi
investigar os efeitos da suplementação com ômega-3 sobre a sobre a
atividade dos complexos da cadeia transportadora de elétrons e da
enzima creatina quinase (CK) em cérebro (córtex cerebral, estriado e
hipocampo) de animais submetidos a um modelo experimental de DXB,
mediante dois protocolos de administração. O primeiro protocolo
baseou-se na suplementação materna com ômega-3 (0,8 g/kg peso
corporal) durante o período pré-natal e seus efeitos sobre os ratos
infantes. No segundo protocolo, foi investigado a suplementação da
prole com ômega-3 (0,1 g/kg peso corporal) no período pós-natal. O
modelo crônico de DXB aplicado à prole foi induzido quimicamente
pelo pool de AACR (15,8 μL/g peso corporal). Os resultados mostraram
que a suplementação materna com ômega-3 durante o período pré-natal
não modificou de forma estatisticamente significativa as atividades dos
complexos da cadeia transportadora de elétrons e a atividade da enzima
creatina quinase (CK) no cérebro da prole com DXB. Além disso, a
suplementação dos ratos infantes, também não provocou alterações
significativas nas atividades dos complexos da cadeia de transporte de
elétrons nas estruturas cerebrais avaliadas. Entretanto, a suplementação
com ômega-3 nos ratos infantes apresentou alterações estatisticamente
significativas na atividade da CK no córtex cerebral dos animais. Esses
resultados reforçam a necessidade de estudos adicionais para se avaliar a
efetividade da suplementação com ácidos graxos ômega 3, nos períodos
pré e pós-natal e determinar sua eficácia sobre os complexos da cadeia
de transporte de elétrons e sobre a enzima CK.
Palavras chave: ácidos graxos ômega-3; aminoácidos de cadeia
ramificada; doença da urina do xarope do bordo; creatina quinase;
cadeia respiratória mitocondrial
ABSTRACT
Maple Syrup Urine Disease (MSUD) is a inherited disease associated
with an alteration in the metabolism of branched chain amino acids,
leading to an accumulation of these amino acids (leucine, valine and
isoleucine) and its derivatives, α-ketoisocaproic, α-ketometilvaleric and
α-ketoisovaleric. This accumulation is harmful to the nervous tissue
development. The onset of the disease occurs usually shortly after birth
and is difficult to diagnose and often fatal. Patients who survive usually
have damage to the neurodevelopment. MSUD treatment of basically
consists on a restricted diet of branched chain amino acids, often
supplemented with dietary formulas poor in omega 3 fatty acids.
Omega-3 fatty acid supplementation has been widely discussed as a
therapeutic strategy because would minimize neurological damage by
acting in the development and maintenance of the central nervous
system. The aim of this study was to investigate the effects of omega-3
supplementation on the activity of the electron transport chain complex
and the enzyme creatine kinase (CK) in the brain (cerebral cortex,
striatum and hippocampus) of animals submitted to an experimental
model of MUD, by two administration protocols. The first protocol was
based on maternal supplementation with omega 3 (0.8 g / kg body
weight) during the prenatal period and its effects on infant rats. In the
second protocol, it was investigated the offspring supplementation with
omega 3 (0.1 g / kg body weight) in the postnatal period. The chronic
MSUD model applied to offspring was chemically induced by the
BCAA pool (15.8 μL/g body weight). The results showed that maternal
supplementation with omega-3 during the prenatal period did not change
statistically significantly the activities of the electron transport chain
complexes and activity of the enzyme creatine kinase (CK) in the
offspring brain with MSUD. In addition, supplementation of infants rats
also did not cause significant changes in the activities of the complexes
of the electron transport chain in the assessed brain structures. However,
supplementation with omega-3 in mice infants showed statistically
significant changes in CK activity in the cerebral cortex of the animals.
These results reinforce the need for further studies to evaluate the
effectiveness of supplementation with omega-3 fatty acids, pre and
postnatal and determine its effectiveness on the complexes of the
electron transport chain and the CK enzyme.
Keywords: omega-3 fatty acids; branched-chain amino acids; maple
syrup urine disease; creatine kinase; mitochondrial respiratory chain.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Metabolismo dos aminoácidos de cadeia ramificada na doença
da urina do xarope do bordo. O número 1 na via metabólica identifica a
aminotransferase dos ácidos graxos de cadeia ramificada. O X identifica
o bloqueio na via metabólica. Adaptado de Chuang e Shih (2001). ..... 38 Figura 2: Representação esquemática da administração de ômega-3 em
ratas gestantes e indução do modelo da doença da urina do xarope do
bordo (DXB) na prole. Ratas gestantes (n=3 animais por grupo)
receberam ômega-3 ou água por gavagem durante o período gestacional.
Na sequência, a prole recebeu administração subcutânea do pool de
aminoácidos de cadeia ramificada (AACR) (7º ao 28º dia de vida) para
indução de DXB .................................................................................... 57 Figura 3: Representação esquemática do modelo da doença da urina do
xarope do bordo (DXB) em ratos infantes e tratamento pós-natal com
ômega-3. A figura mostra a administração do pool de aminoácidos de
cadeia ramificada (AACR) para indução de DXB ou salina (controle)
por 21 dias (7° ao 28° dia) em ratos Wistar e tratamento com ômega-3
ou água por via orogástrica também por 21 dias (n= 6 animais por
grupo). ................................................................................................... 58 Figura 4 - Efeito da suplementação materna com ômega-3 durante o
período gestacional (pré-natal) sobre o dano as atividades dos
complexos I (A), complexo II (B), complexo II-III (C) e complexo IV
(D), em estruturas cerebrais da prole com doença da urina do xarope do
bordo (DXB). Método Estatístico Empregado: Teste t de Student para
amostras independentes expressos por média±DP. Não houve diferença
significativa entre os grupos (p>0,05). .................................................. 63 Figura 5 - Efeito da suplementação materna com ômega-3 durante o
período gestacional (pré-natal) sobre a atividade da Creatina Quinase
(CK) em estruturas cerebrais da prole com doença da urina do xarope do
bordo (DXB). Método Estatístico Empregado: Teste t de Student para
amostras independentes expressos por média±DP. Não houve diferença
significativa entre os grupos (p>0,05). .................................................. 64 Figura 6 - Efeito da suplementação do ômega-3 no período puerperal
(pós-natal) sobre o dano a atividade dos complexos I (A), complexo II
(B), complexo II-III (C) e complexo IV (D), em estruturas cerebrais da
prole com doença da urina do xarope do bordo (DXB). Método Estatístico Empregado: Teste One Way Anova para amostras
emparelhadas expressos por média±DP. Não houve diferença
significativa entre os grupos (p>0,05). .................................................. 65
Figura 7 - Efeito da suplementação do ômega-3 no período puerperal
(pós-natal) sobre o dano a atividade da Creatina Quinase (CK) em
estruturas cerebrais da prole com doença da urina do xarope do bordo
(DXB). Método Estatístico Empregado: Teste One Way Anova para
amostras emparelhadas expressos por média±DP. Houve diferença
significativa entre os grupos (p<0,05). .................................................. 66
LISTA DE TABELA
Tabela 1 - Manifestações clínicas de cada fenótipo clínico.. ................ 42
LISTA DE ABREVIATURAS
AA – Ácido Araquidônico
AACR – Aminoácido de cadeia ramificada
αCGDH – α-cetoglutarato desidrogenase
ADP – Difosfato de adenosina (do inglês adenosine diphosphate).
ATP – Trifosfato de adenosina (do inglês adenosine triphosphate).
ATACR – Aminotransferase de aminoácidos de cadeia ramificada
Bad – do inglês Bcl-2-associated death promoter
Bax – do inglês Bcl-2 associated X protein
Bcl-2 – do inglês B-cell lymphoma 2
Bcl-x – do inglês B-cell lymphoma-extra-large
CDCCR – Complexo α-cetoácido desidrogenase de cadeia ramificada
CEUA – Comissão de ética no uso de animais
CIC – Ácido -cetoisocapróico
CIV – Ácido-cetoisovalérico.
CK – Creatina quinase (do inglês creatine kinase).
CMV – Ácido-ceto-metilvalérico
CoA – Coenzima A
CoQ – Coenzima Q
Cr – Creatina
DHA – Ácido docosahexaenóico (do inglês docosahexaenoic acid)
DPA – Ácido docosapentaenóico (do inglês docosapentaenoic acid)
DXB – Doença da urina do xarope de bordo
E1 – αcetoácido descarboxilase de cadeia ramificada.
E2 – Dihidrolipoil transacetilase.
E3 – Dihidrolipoamida desidrogenase.
EPA – Ácido eicosapentaenoico (do inglês eicosapentaenoic acid)
EROs – Espécies reativas de oxigênio
FAD – Dinucleótido de adenina e flavina, (do inglês flavin adenine
dinucleotide.)
FADH2 - Dinucleótido de adenina e flavina reduzido (do inglês flavin adenine dinucleotide reduced)
Fe2+ - Ferro
HUFA – Ácidos graxos altamente insaturados
IDH – Isocitrato desidrogenase
Ileu – Isoleucina
Leu – Leucina
MDH – Malato desidrogenase
Na+ - Sódio
NAD+ – Nicotinamida adenina dinucleotideo oxidado (do inglês
nicotinamide adenine dinucleotide)
NADH – Nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida (do inglês
nicotinamide adenine dinucleotide reduced)
NPD-1 - Neuroprotetina D1
OMIM – Herança Mendeliana do Homem Online (do inglês online mendelian inheritance in man)
PCr – Fosfocreatina
Pi – Fosfato Inorgânico
PUFA – Ácidos graxos poli-insaturados
SDH – Succinato desidrogenase
SSPS – Pacote estatístico para as ciências sociais (do inglês Statistical
Package for the Social Sciences)
TPP – Tiamina Pirofosfato (do inglês thiamine pyrophosphate) Val – Valina
ω-3 – Ácido graxo ômega 3
ω-6 – Ácido graxo ômega 6
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................ 33 1.1 AMINOÁCIDOS DE CADEIA RAMIFICADA (AACR) ............. 33 1.2 METABOLISMO DOS AMINOÁCIDOS DE CADEIA
RAMIFICADA ..................................................................................... 33 1.2.1 Regulação do complexo α-cetoácido desidrogenase de cadeia
ramificada ............................................................................................. 35 1.3 DOENÇA DA URINA DO XAROPE DE BORDO ....................... 37 1.3.1 Histórico da Doença ................................................................... 38 1.3.2 Epidemiologia ............................................................................. 39 1.3.3 Etiologia ...................................................................................... 39 1.3.4 Fenótipos Clínicos ...................................................................... 40 1.3.5 Manifestações Clínicas ............................................................... 41 1.3.6 Diagnóstico .................................................................................. 42 1.3.7 Tratamento ................................................................................. 43 1.3.8 Fisiopatologia .............................................................................. 43 1.4 ÁCIDOS GRAXOS ÔMEGA-3 (Ω-3) ............................................ 45 1.4.1 Metabolismo dos ácidos graxos ômega-3 (EPA, DPA e DHA) 47 1.5 METABOLISMO ENERGÉTICO CEREBRAL ............................ 48 1.5.1. Ciclo do ácido cítrico (Krebs) ................................................... 48 1.5.2 Cadeia transportadora de elétrons ........................................... 49 1.6 CREATINA QUINASE (CK) ......................................................... 51 2 JUSTIFICATIVA ............................................................................. 53 3 OBJETIVOS ..................................................................................... 54 3.1 OBJETIVO GERAL ....................................................................... 54 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................... 54 4 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................ 55 4.1 ANIMAIS ........................................................................................ 55 4.2 POOL DE AMINOÁCIDOS DE CADEIA RAMIFICADA .......... 55 4.3 ÁCIDOS GRAXOS ÔMEGA-3 ...................................................... 55 4.4 DESENHO EXPERIMENTAL ....................................................... 56 4.4.1 Protocolo Pré-natal - Administração crônica do pool de
aminoácidos de cadeia ramificada e tratamento com ácidos graxos
ômega-3 no período pré-natal. ........................................................... 56 4.4.2 Protocolo Pós-natal - Administração crônica do pool de
aminoácidos de cadeia ramificada e tratamento com ácidos graxos
ômega-3 no período pós-natal. ........................................................... 57 4.5 PREPARO DA AMOSTRA ............................................................ 58
4.6 Determinação da Atividade dos Complexos da Cadeia
Respiratória............................................................................................59
4.6.1 Determinação da atividade do Complexo I (NADH
desidrogenase) ..................................................................................... 59 4.6.2 Determinação da atividade do Complexo II
(succinato:ubiquinona oxirredutase) ................................................. 59 4.6.3 Determinação da atividade do Complexo II+CoQ+III
(succinato: citocromo c oxirredutase) ................................................ 59 4.6.4 Determinação da atividade do Complexo IV (citocromo c
oxidase) ................................................................................................. 60 4.7 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA ENZIMA CREATINA
QUINASE (CK) .................................................................................... 60 4.8 DOSAGEM DE PROTEÍNAS ........................................................ 60 4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA.............................................................. 60 5 RESULTADOS ................................................................................. 62 5.1 1º EXPERIMENTO – PRÉ-NATAL .............................................. 62 5.2 2º EXPERIMENTO – PÓS-NATAL .............................................. 64 6 DISCUSSÃO ..................................................................................... 67 7 CONCLUSÃO .................................................................................. 72 REFERÊNCIAS .................................................................................. 73 ANEXO A – PARECER DA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE
ANIMAIS ............................................................................................. 90
33
1 INTRODUÇÃO
1.1 AMINOÁCIDOS DE CADEIA RAMIFICADA (AACR)
Os aminoácidos essenciais leucina, isoleucina e valina são
classificados como aminoácidos de cadeia ramificada (AACR) e
constituem aproximadamente 35% dos aminoácidos essenciais nos
músculos e 40% dos aminoácidos pré-formados necessários por
mamíferos (Chuang e Shih, 2001). Os AACR não podem ser
sintetizados no corpo e devem, portanto, ser obtidos na dieta, para a
síntese de proteínas (Harris et al., 2005). Os AACR são poderosos
sinais metabólicos com consequências graves na privação e acumulação
(Zinnanti et al., 2012).
Foi observado que após a ingestão de proteínas, os AACR
contribuem com mais de 60% do aumento da concentração de
aminoácidos no sangue humano (Chuang & Shih, 2001). A leucina é de
especial interesse, pois promove a síntese proteica, inibe a degradação
de proteínas e estimula a liberação de insulina. Como resultado dessas
ações da leucina, os AACR têm potencial terapêutico, por que poupam a
massa corporal magra durante a perda de peso, promovem a cicatrização
de feridas e diminuem a perda muscular com a idade (Harris et al.,
2005). Esses AACR participam direta e indiretamente de uma variedade
de funções bioquímicas importantes no cérebro, que incluem a síntese
proteica, produção de ATP, compartimentalização de glutamato e
síntese de neurotransmissores, como a serotonina e as catecolaminas
(Fernstrom, 2005).
Mas seus efeitos positivos são auto limitantes, pois os AACR
promovem a sua própria eliminação pela degradação oxidativa. Isso é
necessário porque o excesso de AACR é tóxico. As células corporais
não armazenam moléculas para controlar as concentrações de AACR.
Os aminoácidos não são conhecidos por ser convertidos em proteínas
para posterior uso e, portanto, as vias catabólicas fornecem o único
caminho para lidar com os excessos de AACR (Harris et al., 2005).
1.2 METABOLISMO DOS AMINOÁCIDOS DE CADEIA
RAMIFICADA
Os 3 AACR apresentam vias biossintéticas complexas e
interconectadas e são catabolizados como combustível primariamente no
músculo, coração, tecido adiposo, rins e tecido nervoso, além do fígado
(Murray et al., 2006; Nelson e Cox, 2013). Os tecidos extrahepáticos
34
contém aminotranferase, ausente no fígado, que age sobre os AACR
para produzir seu α-cetoácidos correspondentes (Nelson e Cox, 2013).
Esses AACR possuem uma rota metabólica oxidativa em comum e o
sistema enzimático mais eficiente para sua oxidação está localizado no
músculo esquelético (Rogero e Tirapegui, 2008). O metabolismo dos
AACR começa com o transporte desses para as células através do um
sistema transportador L independente de Na+, presente na membrana
plasmática. Na célula, os AACR sofrem 3 passos iniciais em comum:
transaminação, descarboxilação oxidativa e desidrogenação (Chuang e
Shih, 2001). A primeira etapa do catabolismo dos AACR é uma
transaminação reversa desencadeada pela aminotransferase de
aminoácidos de cadeia ramificada (ATACR; EC 2.6.1.42), que é
citosólica ou mitocondrial (Chuang e Shih, 2001). A remoção dos
grupos amino de todos os três aminoácidos e a transferência desse para
o α-cetoglutarato, produz os α-cetoácidos correspondentes, ácido α-
cetoisocaproico (CIC), ácido α-ceto-β-metilvalérico (CMV) e ácido α-
cetoisovalérico (CIV), derivados da leucina, isoleucina e valina,
respectivamente (Chuang e Shih, 2001; Champe et al., 2012; Frazier et
al., 2014; Rogero e Tirapegui, 2008). Concomitantemente, verifica-se
que na reação catalisada pela ATACR há a conversão de α-cetoglutarato
– aceptor de nitrogênio oriundo dos AACR – em glutamato (Rogero e
Tirapegui, 2008). A reação é reversível e, portanto, não compromete a
degradação dos AACR, pois os α-cetoácidos correspondentes podem
substituir os seus AACR na dieta (Harris et al., 2005; Murray et al.,
2006).
Os α-cetoácidos de cadeia ramificada são translocados para
dentro da mitocôndria por um transportador específico, onde sofrem a
descaboxilação oxidativa, catalisada pelo complexo α-cetoácido
desidrogenase de cadeia ramificada (CDCCR; E.C. 1.2.4.4), produzindo
os respectivos acil-CoAs de cadeia ramificada ao liberar o grupo
carboxila como CO2. (Harris et al., 2005; Nelson e Cox, 2013).
O nível mais alto de atividade dessa desidrogenase (CDCCR) é
encontrado também no tecido muscular (Smith et al., 2007). Esta reação
é irreversível e portanto, encaminha os AACR para a degradação.
Acredita-se que este seja o sítio mais importante de regulação, sendo
considerada a etapa controladora do fluxo do catabolismo desses
aminoácidos pois a CDCCR é a principal enzima regulatória na via
catabólica dos AACR (Harris et al., 2005; Rogero e Tirapegui, 2008). A
CDCCR dos mamíferos pertence a uma família de complexos α-
cetoácido desidrogenase mitocondriais altamente conservados (Voet et
al., 2014; Yeaman, 1989). As suas subunidades são uma α-cetoácido
35
descarboxilase, uma transciclase e uma dihidroprolil desidrogenase
(Murray et al., 2006). É similar em estrutura e divide o mesmo
mecanismo de reação com o complexo piruvato desidrogenase e o
complexo α-cetoglutarato desidrogenase (Nelson e Cox, 2013). Os 3
complexos multienzimáticos têm a subunidade E3 (diidrolipoamina-
desidrogenase) em comum e empregam as coenzimas TPP, lipoamina e
FAD, além do NAD+ como agente oxidante terminal (Voet et al., 2014).
A partir da descarboxilação oxidativa, as vias para a degradação
dos 3 AACRs divergem em passos catalisadas por diferentes enzimas,
que eventualmente levam para o ciclo do ácido cítrico. Ocorre uma
bifurcação, e cada AACR segue por uma via própria até os seus
intermediários anfibólicos, cujas estruturas determinam que a Valina é
glicogênica, a Leucina é cetogênica e a Isoleucina é tanto glicogênica
quanto cetogênica (Murray et al., 2006). Leucina e valina possuem rotas
complexas, onde seus esqueletos carbonados são degradados por vias
que produzem propionil-CoA, que é convertida em succinil CoA por
uma série de reações (Harris et al., 2005; Nelson e Cox, 2013; Voet et
al., 2014). O carbono proveniente de leucina entra como acetil-CoA para
a eliminação completa como CO2 (Harris et al., 2005). A isovaleril CoA
derivada da leucina é desidrogenada, gerando β-metil crotonil CoA,
catalisada pela isovaleril CoA desidrogenase (EC 1.3.99.10). Forma-se
então β-metil glutaconil CoA pela carboxilação da β-metil crotonil CoA
à custa da hidrólise de uma molécula de ATP. A β-metil glutaconil CoA
é então hidratada, formando 3-hidroxi-3-metil glutaril CoA, que é
clivada a acetil-CoA e acetoacetato (Berg et al., 2011). Após a
isoleucina sofrer transaminação e descarboxilação oxidativa, seu
esqueleto restante, de cinco carbonos, é ainda mais oxidado, produzindo
acetil-CoA e propionil-CoA. Na degradação da valina, que contém um
carbono a menos que a isoleucina, após a transaminação e
descarboxilação oxidativa, seguem-se uma série de reações de oxidação
que convertem os quatro carbonos restantes em CO2 e propionol-CoA,
que é, então, convertido em succinil-CoA (Nelson e Cox, 2013; Voet et
al., 2014).
1.2.1 Regulação do complexo α-cetoácido desidrogenase de cadeia
ramificada
O complexo CDCCR é um membro de complexos α-cetoácido
desidrogenase altamente conservados, que compreendem o complexo
piruvato desidrogenase, o complexo a-cetoglutarato desidrogenase e o
próprio CDCCR, com estrutura e função semelhantes (Chuang & Shih,
36
2001). Cada complexo consiste de múltiplas cópias de 3 enzimas,
denominadas E1, E2 e E3 (Yeaman, 1989). A atividade do CDCCR é
regulada pela inibição do produto final (NADH e ésteres de acil-CoA de
cadeia ramificada), modificações covalentes por fosforilação, e a
expressão alterada dos montantes das suas enzimas componentes
(Shimomura et al., 2001). O CDCCR é regulado por uma modificação
covalente em resposta ao conteúdo de AACR na dieta. Com pouca ou
ingestão normal de AACR, o complexo enzimático é fosforilado e assim
inativado por uma proteína quinase. O excesso de AACR resulta na
desfosforilação e consequente ativação da enzima (Nelson e Cox, 2013).
O complexo CDCCR consiste de 3 componentes catalíticos: uma
descaboxilase de αcetoácidos de cadeia ramificada dependente de
tiamina pirofosfato (TPP) ou E1, consistindo de duas subunidades α e
duas subunidades β; uma di-hidrolipoamina transiclase compreendendo
24 subunidades de ácido lipóico (E2) que facilita a transferência do
grupo acil de cadeia ramificada de E1 para a CoA para formar acil-CoA
de cadeia ramificada; e uma di-hidrolipoamina-desidrogenase, que é
uma flavoproteína homodimérica (E3), que redefine a porção lipoil à
forma oxidada ativa, com NAD+ como o último aceptor de elétrons
(Chuang et al., 1995; Chuang, 1998; Harris et al., 2005; Murray et al.,
2014). O complexo enzimático também contém duas enzimas
reguladoras, uma quinase e uma fosfatase específicas, que regulam a
atividade de E1 através de um ciclo de fosforilação (inativação) /
desfosforilação (ativação) (Chuang et al., 1995).
O componente E2 dos respectivos complexos é a chave de sua
estrutura e função. Três domínios de E2 estão ligados por regiões
articulares flexíveis que são sensíveis à digestão de protease (Chuang,
1998; Yeaman, 1989). Ele apresenta 3 funções principais: forma um
núcleo central simétrico em volta do qual estão arranjados múltiplas
cópias dos componentes E1 e E3; é uma aciltransferase, catalisando a
formação de acil-CoA; fornece o local de ligação para o cofator ácido
lipóico que interage com os diferentes locais ativos nos complexos
(Yeaman, 1989). Os componentes E1 e E2 são específicos do complexo
CDCCR, enquanto E3 é comum entre o 3 complexos α-cetoácido
desidrogenase (Chuang & Shih, 2001). Uma deficiência nos
componentes E1 e E2 pode causar a Doença da Urina do Xarope de
Bordo (DXB) (Couce et al., 2015).
37
1.3 DOENÇA DA URINA DO XAROPE DE BORDO
A doença da urina do xarope do bordo (DXB; OMIM # 248600) é
uma doença genética de herança autossômica recessiva causada pela
deficiência da atividade do CDCCR (Chuang et al., 2001; Strauss e
Morton, 2003; Frazier et al., 2014; Herber et al., 2014). A deficiência
desse complexo resulta em um acúmulo de leucina, isoleucina e valina e
seus α-cetoácidos correspondentes (Figura 2) (Chuang e Shih, 2001;
Frazier et al., 2014). No plasma, há elevações nos níveis desses
aminoácidos 5 a 10 vezes acima do normal. A presença de aloisoleucina
no plasma é patognomónica da doença (Strauss e Morton, 2003). A
leucina e seu α-cetoácido correspondente (CIC) são consideradas as
substâncias neurotóxicas mais importantes na DXB, mas o mecanismo
do dano cerebral nessa doença ainda é pouco conhecido (Chuang e Shih,
2001).
Dentro de 48 horas após o parto, os bebês não tratados
desenvolvem cetonuria, tornam-se irritados e se alimentam mal. Em 4 a
5 dias, os sinais neurológicos progridem para letargia, apnéia
intermitente, distonia, e movimentos estereotipados, como “andar de
bicicleta" e logo após aparece o odor de xarope de bordo na urina
(Strauss e Morton, 2003). A DXB, quando não tratada, resulta em
desenvolvimento cerebral anormal, retardo mental e morte precoce na
infância. Crianças sobreviventes normalmente apresentam graus
variáveis de dano cerebral, caracterizado por retardo mental,
dificuldades neurológicas para caminhar e falar, e convulsões (Chuang e
Shih, 2001).
38
Figura 1. Metabolismo dos aminoácidos de cadeia ramificada na doença da
urina do xarope do bordo. O número 1 na via metabólica identifica a
aminotransferase dos ácidos graxos de cadeia ramificada. O X identifica o
bloqueio na via metabólica. Adaptado de Chuang e Shih (2001).
1.3.1 Histórico da Doença
A primeira descrição da doença aconteceu em 1954, quando
Menkes, Hurst e Craig descreveram 4 crianças com doença degenerativa
cerebral de uma família de seis crianças. Das quatro crianças afetadas,
uma sobreviveu por 3 meses e as outras morreram dentro de 14 dias
(Dent e Westall, 1960). Esses pacientes apresentavam edema cerebral,
convulsões, espasticidade, e irregularidades levando à parada
respiratória (Chuang, 1998). A urina desses pacientes apresentava um
odor adocicado, que lembrava xarope de bordo, o que resultou no nome
da doença (Chung e Shih, 2001).
Em um estudo subsequente, realizados por Westall et al., em
1957, outro paciente apresentou níveis elevados de aminoácidos de
cadeia ramificada (AACR), leucina (Leu), isoleucina (Ileu) e valina
(Val) (Dent e Westall, 1960). Na mesma época, amostras de plasma e
urina de um paciente que morreu aos 20 meses, com a mesma
característica de odor de xarope de bordo na urina foram recolhidos e
39
analisados. Os resultados apresentavam elevações nos aminoácidos
leucina, isoleucina e valina, indicando fortemente um bloqueio no
metabolismo destes aminoácidos. Nesse mesmo estudo, a atividade da
transaminase para os aminoácidos de cadeia ramificada foi demonstrada
nos tecidos de pacientes obtidos na necropsia, indicando que o bloqueio
estava em algum lugar abaixo do nível de formação dos respectivos
cetoácidos (Dancis et al., 1959).
1.3.2 Epidemiologia
A DXB é considerada uma doença metabólica rara, com uma
incidência entre 1:185.000 nascidos vivos (Murray et al., 2006; Strauss e
Morton, 2003) e 1:200.000 nascidos vivos (Trintinalia et al., 2014). Na
Alemanha, a incidência é estimada em 1:133.000 nascidos vivos e, em
algumas comunidades Menonitas e alemãs nos Estados Unidos, pode ser
de até 1:200 nascidos vivos (Morton et al., 2002; Simon et al., 2006).
No Brasil, considera-se uma incidência média de 1:100.000 (Herber et
al., 2015).
1.3.3 Etiologia
A leucina e seu α-cetoácido correspondente, ácido α-
cetoisocapróico (CIC), são consideradas as substâncias neurotóxicas
mais importantes na DXB, mas o mecanismo do dano cerebral nessa
doença ainda é pouco conhecido (Chuang e Shih, 2001). Os genes que
codificam as várias subunidade/componentes catalíticos da doença
foram mapeados nos cromossomos 19q13.1–13.2; 6q14; 1p31; 7q31–32,
16p11.2 e 4q22.1 (Chuang et al., 2004). A DXB também é
geneticamente heterogênea como mostrado pelas mutações nos
diferentes loci, que são denominados fenótipos moleculares (Chuang et
al., 1995).
A hiperleucinemia inibe o transporte de tirosina, triptofano e
outros aminoácidos essenciais através da barreira hematoencefálica,
limitando a disponibilidade de substrato para as catecolaminas cerebrais,
serotonina e síntese proteica (Muelly et al., 2013). Se os níveis de α-
cetoisocapróico estiverem altos, como na DXB, há um aumento do
consumo de glutamato e da formação de leucina e α-cetoglutarato.
(Yudkoff et al., 2005). In vitro, concentrações levemente elevadas do
ácido α-cetoisocapróico (0,5 mM) desacoplam a mitocôndria e maiores
concentrações (2 mM) inibem a α-cetoglutarato desidrogenase e a
piruvato desidrogenase (Jackson e Singer, 1983).
40
1.3.4 Fenótipos Clínicos
Os pacientes com DXB podem ser divididos em cinco fenótipos
clínicos e bioquímicos: clássica, intermediária, intermitente, responsiva
à tiamina e por deficiência de di-hidrolipoil desidrogenase (E3; EC
1.8.1.4)) (Chuang e Shih, 2001).
A DXB na forma clássica tem início neonatal de encefalopatia e
representa a forma mais severa e mais comum, apresentando um
acúmulo tanto do amino quanto do α-cetoácido em até uma semana do
nascimento (Axler e Holmquist, 2014; Chuang e Shih, 2001).
Aproximadamente 75% dos pacientes com DXB apresentam a forma
clássica, com pouca ou nenhuma atividade detectável do complexo α-
cetoácido desidrogenase de cadeia ramificada (CDCCR), cerca de (2%)
(Chuang et al., 1995; Champe et al., 2012; Axler e Holmquist, 2014).
Dados recentes sugerem que as formas mais leves de DXB pode
representar até 50% dos casos diagnosticados (Fingerhut et al., 2008).
Os sintomas clínicos são causados, principalmente pela leucina, que é
rapidamente transportada através da barreira hematoencefálica e é
neurotóxica em altas concentrações e 50% ou mais dos α-cetoácidos de
cadeia ramificada também são derivados da leucina (Chuang e Shih,
2001; Yudkoff et al., 2005). Muitos pacientes morrem durante a
descompensação metabólica causada por infecção ou estresse (Chuang
et al., 1995).
Pacientes com a forma intermediária de DXB apresentam
elevações persistentes de AACR e comprometimento neurológico
(Axler e Holmquist, 2014). Entretanto, não apresentam a doença com
gravidade no período neonatal. Muitos não apresentam episódios de
descompensação metabólica aguda (Chuang e Shih, 2001).
Na forma intermitente de DXB, os pacientes apresentam
desenvolvimento normal, com crescimento e inteligência normal (Axler
e Holmquist, 2014). Apresenta início tardio de cetoacidose associado ao
estresse e apresentam risco de descompensação metabólica aguda
durante situações de estresse metabólico (Axler e Holmquist, 2014;
Chuang et al., 1995). Enquanto assintomáticos, seus dados laboratoriais,
incluindo níveis de AACR plasmáticos, são normais (Chuang e Shih,
2001). Os sintomas normalmente aparecem entre os cinco meses e dois
anos, quando uma infecção trivial como otite ou gastroenterite viral
desencadeiam o catabolismo de proteína muscular (Axler e Holmquist,
2014). Esses pacientes apresentam níveis mais elevados de atividade
enzimática (Champe et al., 2012). Deve-se suspeitar de DXB
intermitente em casos de infecções comuns com um curso clínico
41
atípico, especialmente em crianças que demonstram ataxia ou
sonolência acentuada (Axler e Holmquist, 2014).
Os pacientes com o fenótipo responsivo à tiamina se parecem
com o fenótipo intermediário, mas mostram uma considerável resposta a
doses farmacológicas de tiamina. O mecanismo da resposta de tiamina
não é clara (Chuang et al., 1995). Em geral, esses pacientes não
apresentavam doença aguda neonatal, e seu curso clínico inicial é
semelhante aos de DXB intermediária (Chuang e Shih, 2001). Nenhum
paciente com DXB responsivo à tiamina foi tratado apenas com tiamina
e sim, com uma combinação de tiamina (doses que variam de 10 a 1000
mg por dia) e de restrição dietética de AACR, o que torna a contribuição
in vivo de tiamina impossível de discernir (Chuang et al., 2004).
A DXB por deficiência de di-hidrolipoil desidrogenase é um
fenótipo raro, com menos de 20 pacientes descritos na literatura. O
fenótipo clínico é similar à DXB intermediária, mas acompanhado por
acidose láctica grave (Chuang e Shih, 2001). É a forma com
manifestações clínicas mais graves dentre os fenótipos de DXB (Chuang
et al., 2006). Esses pacientes apresentam uma deficiência combinada de
complexo α-cetoácido desidrogenase de cadeia ramificada (CDCCR),
piruvato e complexos α-cetoglutarato desidrogenase (Chuang e Shih,
2001). A morte ocorre durante a infância como resultado das ceto-
acidoses e acidose láctica (Chuang et al., 1995).
1.3.5 Manifestações Clínicas
Ainda que o recém-nascido afetado pareça inicialmente normal,
os sinais característicos da doença são evidentes no final da primeira
semana de vida extrauterina. Além das anomalias bioquímicas já citas,
os lactentes apresentam dificuldades de se alimentar e vomitam, além de
um grau significante de letargia (Murray et al., 2006). As manifestações
clínicas incluem início precoce da cetoacidose grave, convulsões e
retardo mental. (Chuang et al., 1995). Podem ser desencadeadas por
alterações do estado catabólico (febre, infecções virais ou ingestão
alimentar reduzida) (Schwartz, 2008). As manifestações clínicas de cada
fenótipo clínico apresentam algumas variações, conforme a tabela 1
abaixo.
42
Tabela 1 - Manifestações clínicas de cada fenótipo clínico. Adaptada de Chuang
e Shih, 2001.
1.3.6 Diagnóstico
O desenvolvimento de métodos diagnósticos mais sofisticados e
sensíveis, muitas vezes incorporados a programas de triagem neonatal,
tem permitido diagnósticos mais precoces e mais precisos, muitas vezes
antes da manifestação dos sintomas da doença (Schwartz et al., 2008). O
diagnóstico da DXB, antes da primeira semana de vida, é possível
somente por análise enzimática (Murray et al., 2006). Quando o paciente
apresenta os sintomas clássicos, esse diagnóstico pode ser facilmente
feito por análise de aminoácidos. Os AACR são aumentados no sangue,
fluido cerebroespinhal e urina (Chuang e Shih, 2001). Hoje em dia, os
níveis de AACR plasmático elevados na DXB podem ser prontamente
detectados por espectrometria de massa automatizado (Chuang et al.,
2006). Esse método quantifica as proporções sanguineas de leucina para
alanina, fenilalanina, e isoleucina para atingir uma sensibilidade muito
alta de detecção e especificidade em amostras obtidas em 24 horas de
vida (Naylor e Guthrie, 1978).
É importante o diagnóstico precoce, pois muitas vezes a
ocorrência de dano neurológico está relacionada ao tempo e ao período
de exposição ao metabolito toxico. Uma intervenção adequada e
imediatamente após o diagnóstico é, em muitos casos, fundamental para
definir o prognostico dessas situações (Schwartz et al., 2008).
43
1.3.7 Tratamento
O princípio do tratamento da DXB está na manutenção das
concentrações plasmáticas dos AACR normais, no propósito de
minimizar os efeitos tóxicos dos metabólitos acumulados. O tratamento
ocasiona um controle rígido na dieta, limitando a ingestão de leucina,
valina e isoleucina ao mínimo necessário para permitir o crescimento
normal (Nelson e Cox, 2013). Quando os níveis plasmáticos desses
aminoácidos caem para o normal, são restituídos pela ingestão de leite e
outros alimentos, numa quantidade que nunca exceda a demanda
metabólica (Murray et al., 2006). Na fase aguda, o tratamento imediato e
agressivo para reduzir os níveis de leucina é necessário, e deve consistir
de alta taxa de infusão de glicose para estimular a secreção de insulina e
suprimir o catabolismo de proteína. (Herber et al., 2014). O tratamento
de manutenção recomendado é através da dieta restritiva de AACR,
prevenindo assim resultados neurológicos e morte (Mazer e Singh,
2010). Com a restrição de AACR, ocorre também a suplementação com
tiamina e fórmulas livres de AACR (Schwartz et al., 2008). O
transplante de fígado também é uma alternativa estudada (Herber et al.,
2014). O tratamento, iniciado na primeira semana de vida previne a
evolução da doença e suas graves consequências ou até mesmo reverte
um quadro clínico (Murray et al., 2006; Amâncio et al., 2007).
1.3.8 Fisiopatologia
Apesar dos mecanismos tóxicos da DXB ainda não estarem bem
esclarecidos, diversos estudos demonstraram associação entre o aumento
nas concentrações plasmáticas de leucina e CIC com o aparecimento dos
sintomas neurológicos (Chuang e Shih, 2001). O aumento de leucina e
CIC pode causar encefalopatia metabolica aguda e edema cerebral
grave, enquanto o desequilibrio crônico nos níveis plasmáticos de
AACRs ou restrição proteica podem levar a captação cerebral anormal
de aminoácidos, com subsequente diminução de mielinização e sintese
de neurotransmisores, causando ainda mais danos cerebrais que se
manifestam como encefalopatia crônica (Strauss et al., 1993).
O estresse oxidativo está associado com um grande número de
doenças neurodegenerativas, incluindo a DXB (Barchak et al., 2008b).
Estudos sugerem um aumento na produção de espécies reativas de
oxigênio e uma diminuição da atividade antioxidante em pacientes com
DXB, com inibição das enzimas mitocondriais e da cadeia respiratória
44
em modelos animais (Barchak et al., 2008b; Bridi et al., 2003; Bridi et
al., 2005; Jackson et al.,1983; Wajner et al., 2007; Zinnanti et al., 2009).
Dentre os α-cetoácidos, o CIC é considerado o mais tóxico, pois
provoca a inibição do consumo de oxigênio em cérebro de ratos e a
oxidação do 3-hidroxibutirato, além de provocar deficiência na
formação de mielina no cerebelo de ratos (Gibson e Blass, 1976). Seu
acúmulo também favorece a síntese de leucina na reação de
transaminação bidirecional, pois reverte o fluxo de nitrogênio e diminui
as concentrações de glutamato cerebral (Hutson et al., 1998; Hutson et
al., 2001; Muelly et al., 2013). O CIC também apresenta outro efeito
tóxico adicional sobre o metabolismo cerebral, pois concentrações
elevadas de CIC inibem as enzimas α-cetoglutarato desidrogenase (EC
1.2.4.2) e piruvato desidrogenase (E.C. 1.2.4.1) (Jackson et al.,1983),
resultando em disfunção do ciclo de Krebs. Também foi demonstrado
que os α-cetoácidos que se acumulam na DXB reduzem a atividade do
ciclo de Krebs e aumentam a glicólise anaeróbica, o que indica uma
alteração no metabolismo energético em córtex cerebral de ratos
(Sgaravatti et al., 2003). Esse acúmulo também pode inibir o transporte
de malato/aspartato e resultar em um aumento na relação NADH/NAD+
e comprometer a conversão de lactato em piruvato (McKenna et al.,
1998).
O aumento da concentração de leucina interfere com o transporte
de tirosina, triptofano e outros aminoácidos essenciais, como metionina,
fenilalanina, histidina, valina e treonina através da barreira
hematoencefálica, limitando a disponibilidade de substrato para síntese
das catecolaminas cerebrais e serotonina, além da síntese proteica
(Strauss et al., 1993; Araújo et al., 2001; Muelly et al., 2013). O
acúmulo de leucina e CIC no tecido cerebral é acompanhada pela
depleção de glutamato, GABA, piruvato e dopamina e pelo aumento α-
cetoglutarato, alanina e lactato (Zinnanti et al., 2009). O aumento das
concentrações de AACR também provocam alterações na cadeia de
transporte de elétrons na mitocôndria. O acúmulo desses aminoácidos
reduz significativamente a produção de CO2 a partir de acetato e citrato,
no ciclo de Krebs, entre 20 a 55%. O aumento de leucina inibi
significativamente a atividade do complexo IV da cadeia respiratória e o
excesso de valina e isoleucina, os complexos II-III, III e IV em até 40%
(Ribeiro et al., 2008). A deficiência do complexo α-cetoácido
desidrogenase de cadeia ramificada (CDCCR) compromete a produção
de corpos cetônicos de leucina, que são essenciais para a síntese de
mielina e isso, combinado com a síntese debilitada de proteína, leva a
uma severa desmielinização (Schönberger et al., 2004).
45
Também foi demonstrado que os AACR inibem a atividade da
enzima creatina quinase (CK; EC 2.7.3.2) em cérebro de ratos,
indicando que esse acúmulo pode ser neurotóxico, alterando a
homeostase energética (Pilla et al., 2003a). Também prejudicam o
metabolismo energético do cérebro, possivelmente devido à inibição do
complexo I da cadeia respiratória (Sgaravatti et al., 2003). Além disso,
tem sido postulado que a desmielinização, a alteração em
neurotransmissores, a reduzida absorção cerebral de aminoácidos
essenciais, a indução do stress oxidativo, apoptose e déficit energético
pode estar relacionada com as lesões na DXB (Ribeiro, 2008).
1.4 ÁCIDOS GRAXOS ÔMEGA-3 (Ω-3)
Dois tipos de ácidos graxos, os ácidos graxos ômega-3 (ω-3) e
ácidos graxos ômega-6 (ω-6) são necessários para a síntese de
eicosanoides (ácidos graxos C-20), precursores de moléculas
importantes como prostaglandinas, tromboxanos e leucotrienos (Baynes
e Dominiczak, 2015). No ômega-3, a primeira ligação dupla na
molécula está localizada no terceiro átomo de carbono a partir da
extremidade metila; no ômega-6, no sexto átomo de carbono a partir da
extremidade metila (Kantha, 1987). Esses ácidos graxos também são
importantes nutrientes e componentes principais das membranas
celulares neuronais (Nemeth et al., 2014). Em função dessas
características, as famílias dos ácidos graxos insaturados ω-6 e ω-3 na
dieta são de interesse clínico (Kantha, 1987). Os ácidos graxos ω-3 e ω-
6 e/ou seus precursores devem ser fornecidos através da alimentação.
São obtidos pelo consumo de óleos vegetais que contêm o ácido graxo
ômega-6, o ácido linoleico, que é um precursor do ácido araquidônico
(AA); e o ácido graxo ômega-3, o ácido α-linolênico, precursor de
outros ácidos ômega-3 importantes para o crescimento e o
desenvolvimento, como o ácido eicosapentaenoico (EPA) e o ácido
docosahexaenóico (DHA) (Baynes e Dominiczak, 2015; Champe et al.,
2012; Smith et al., 2007).
Os dados de países em desenvolvimento tem mostrado que uma
ingestão maior de ácido graxo ômega-3 maior na gravidez e no início da
vida afetam o crescimento e desempenho cognitivo tardio na infância. O
desenvolvimento cerebral durante o terceiro trimestre de gravidez e
primeiro ano de vida acontece rapidamente e um fornecimento adequado
de ambos estes ácidos graxos parece ser essencial para o
desenvolvimento ideal (Huffman et al., 2011). Os ácidos linoleico
(ômega-6) e α-linolênico (ômega-3) são os ácidos graxos poli-
46
insaturados mais abundantes na dieta ocidental (Adam et al.,1986).
Esses ácidos graxos podem auxiliar processos fisiológicos e de
desenvolvimento importantes. Além disso, podem formar eicosanoides,
podem ser esterificados e hidrolizados para e a partir de glicerolipídios
teciduais, e podem ser metabolicamente alongados e desaturados a uma
variedade de ácidos graxos altamente insaturados (Lands, 1992).
Existem evidências emergentes de que a ingestão de ácidos
graxos ômega 3 (ômega -3) na gravidez e no início da vida pode
desempenhar um papel na prevenção de doenças mediadas por
eicosanóides (Huffman et al., 2011). Em 1960, pesquisadores
demonstraram que o metabolismo dos ácidos graxos poli-insaturados
(PUFA) de 18 carbonos, entre eles o ácido graxo α-linolênico levam a
formação e acumulação de ácidos graxos altamente insaturados (HUFA)
de 20 e 22 carbonos em tecidos de ratos e humanos (Lands, 2014). Os
ácidos graxos ômega-3 apresentam propriedades neuroprotetoras e
representam um tratamento potencial para uma variedade de doenças
neurodegenerativas e neurológicas (Dyall, 2015). Eles estão
incorporados nas membranas celulares e apresentam potentes atividades
anti-inflamatória, antitrombótica, antiarrítmica e de diminuição dos
níveis de triacilgliceróis (Schmidt et al., 2015).
No organismo, o ácido linoleico (ômega-6) pode ser convertido a
ácido araquidônico (AA), utilizado para a síntese da principal classe de
prostaglandinas humanas e outros eicosanoides (Figura 2) (Smith et al.,
2007; Baynes e Dominiczak, 2015). Os eicosanoides são compostos
fisiológicos e farmacologicamente ativos, conhecidos como: as
prostaglandinas, os tromboxanos, os leucotrienos e as lipoxinas e são
potentes reguladores autócrinos e parácrinos de numerosas funções das
células e dos tecidos, incluindo a agregação de trombócitos, reações
inflamatórias e funções dos leucócitos, vasoconstrição e vasodilatação,
pressão sanguínea, constrição dos brônquios e a contração uterina
(Weber et al., 1986, Murray et al., 2006).
O ácido graxo ômega-3 (α-linolênico) produz o ácido
eicosapentaenoico (EPA), que é precursor de uma classe diferente de
eicosanoides (Smith et al., 2007; Baynes e Dominiczak, 2015), e o ácido
docosahexaenoico (DHA) (Figura 2). Em humanos, eicosanoides
formados a partir de EPA são menos trombogênicos e menos pró-
inflamatórios do que aqueles derivados do ácido araquidônico (Schacky
e Weber, 1985). O DHA é um componente de lipídios complexos nas
membranas e participa na isolação nos nervos, bem como um precursor
para a sinalização molecular, incluindo as prostaglandinas (Li et al.,
2008). O DHA é, quantitativamente, o mais importante ácido graxo
47
ômega-3 no cérebro (Dyall, 2015). A disponibilidade de ácidos graxos
poli-insaturados de cadeia longa (incluindo o DHA) além de modular o
metabolismo eicosanoide, também modula a mielinização durante o pico
de crescimento cerebral (Koletzo e Rodriguez-Palermo, 1999). As
influências benéficas da dieta com DHA sobre o desenvolvimento
cerebral são atualmente interpretadas como modificações da estrutura da
membrana e as funções de proteínas associadas à membrana (Fleith e
Clandinin, 2005). O aumento de EPA e DHA nas membranas celulares
altera as propriedades físicas da membrana, tais como a sua fluidez, o
que pode ter impacto sobre a migração do receptor e o acúmulo lipídico
e alteram as vias de sinalização de células que por sua vez influenciam
respostas de células tecidos ligadas ao metabolismo, sensibilidade
hormonal e função imunológica (Calder, 2012). Acredita-se que a
modulação da micro-organização das membranas e a regulação da
expressão gênica são os mecanismos chave pelos quais os ácidos graxos
ômega-3 medeiam suas funções. Essa regulação da expressão gênica via
receptores nucleares e os fatores de transcrição gênica habilita os ácidos
graxos ômega-3 e seus metabólitos bioativos a afetar uma miríade de
vias moleculares (Mozaffarian e Wu, 2011). O DHA pode afetar a
função de múltiplos alvos, que variam de canais iônicos, receptores
nucleares e segundos mensageiros (Begum et al., 2013).
Crianças e adultos com DXB têm profundas deficiências de
ácidos docosahexaenóico (DHA) e eicosapentanóico (EPA) nas
membranas de glóbulos vermelhos e uma elevação na proporção de
ômega-6/ ômega-3 de membrana (Strauss e Morton, 2003). A
deficiência cerebral de DHA pode levar a deficiência do sistema visual,
disfunção sináptica, dinâmica de neurotransmissores anormais,
excitabilidade patológica, a expressão genética cerebral alterada e
distúrbios comportamentais (Strauss e Morton, 2003).
1.4.1 Metabolismo dos ácidos graxos ômega-3 (EPA, DPA e DHA)
Os mesmos sistemas enzimáticos que transformam o ácido
linoleico em ácido araquidônico (AA) também transformam o ácido α-
linolênico em ácido eicosapentaenóico (EPA) por etapas metabólicas
idênticas de dessaturação e alongamento da cadeia (Adam et al., 1986).
A via metabólica começa com a dessaturação do ácido α-linolênico em
ácido estearidônico pela Δ6 desaturase, que é um passo limitante (Dyall,
2015). O ácido α-linolênico, pode ser convertido para ácidos graxos de
cadeia longa (PUFA) mais biologicamente ativos como o EPA e DHA;
este processo ocorre por uma série de reações de dessaturação e
48
alongamento, com ácido estearidônico sendo um intermediário na via
(Calder, 2012). Isso é seguido pelo alongamento para ácido
eicocosatetraonico, que é dessaturado pela Δ5 desaturase, produzindo
EPA, o qual é então alongado pela elongase-2, primeiro em DPA e
depois em ácido tetracosapentóico (Dyall, 2015). O ácido α-linolenico é
um substrato pobre para as enzimas e, in vitro, deprime a formação de
ácido araquidónico, pela inibição da enzima de dessaturação, e a sua
conversão em prostaglandinas, por inibição da ciclooxigenase. Ambos
os efeitos podem contribuir para uma biosíntese deprimida de
prostaglandinas durante uma dieta desse ácido (Adam et al., 1986). O
ácido tetracosapentóico sofre uma segunda dessaturação Δ6 para
produzir o ácido tetracosahexanóico. Esses passos iniciais ocorrem no
retículo endoplasmático; entretanto, o estágio final da síntese de DHA
ocorre no peroxissomo após translocação. No peroxissomo, o ácido
tetracosahexanóico é encurtado para DHA por uma rodada simples de β-
oxidação pela ação da acyl-coenzima-A oxidase, enzimas bifuncionais e
então, thiolases (Dyall, 2015).
1.5 METABOLISMO ENERGÉTICO CEREBRAL
A principal moeda energética para os processos celulares é o ATP
e seus níveis devem ser mantidos durante processos como a contração
muscular e a estimulação cerebral, pois as células do sistema nervoso
central têm alta demanda energética. A glicólise e a fosforilação
oxidativa são as principais rotas que participam da síntese de ATP do
tecido nervoso central.
1.5.1. Ciclo do ácido cítrico (Krebs)
No metabolismo dos AACR, a degradação da leucina forma
acetil-Coenzima A e acetoacetato, enquanto a valina é convertida em
succinil-CoA. Tanto a isoleucina quanto a valina são metabolizadas de
maneira a formar succinato. Outro produto do metabolismo da
isoleucina é o acetoacetato (Voet et al., 2014; Harris et al., 2005). Esses
produtos são intermediários do ciclo de ácido cítrico, para onde se
encaminham. Os grupos acetil entram no ciclo do ácido cítrico, que os
oxida a CO2; a energia liberada é conservada nos transportadores de
elétrons reduzidos NADH e FADH2 (Nelson e Cox, 2013). O ciclo do
ácido cítrico (Figura 3) tem início com a condensação de acetil-CoA
com o oxaloacetato, gerando citrato através da citrato sintase (EC
2.3.1.1). Em sequência, o citrato é isomerizado até isocitrato pela
49
enzima aconitase (E.C 4.2.1.3) que catalisa a transformação reversível
do citrato a isocitrato, a fim de entregar dois elétrons para o NAD+,
formando equivalentes reduzidos (Nelson e Cox, 2013; Riegel, 2001).
Na próxima etapa, a isocitrato desidrogenase (IDH; EC 1.1.1.42)
catalisa a descarboxilação oxidativa irreversível do citrato, originando a
primeira das três moléculas de NADH produzidas pelo ciclo e a primeira
liberação de CO2, e forma α-cetoglutarato (Champe et al., 2012; Nelson
e Cox, 2013). O α-cetoglutarato proveniente do isocitrato sofre uma
nova descarboxilação oxidativa e é convertido a succinil-CoA pela
enzima α-cetoglutarato desidrogenase (α-CGDH; EC 1.2.4.2) (Nelson e
Cox, 2013, Riegel, 2001). Nessa reação, um dos grupos carboxila do α-
cetoglutarato é liberado como CO2, ocorre a produção do segundo
NADH do ciclo e o grupo carbonila adjacente é oxidado pelo nível de
um ácido, o qual se combina para formar succinil-CoA (Champe et al.,
2012; Smith et al., 2007). A succinil-CoA é catalisada pela enzima
succinil-CoA-sintetase (EC 6.2.1.5) e forma succinato (Nelson e Cox,
2013). O succinato que se forma entrega elétrons para o dinucleotídeo
de adenina e flavina (FAD), em uma reação catalisada pela enzima
succinato desidrogenase (SDH; EC 1.3.99.1), produzindo a coenzima
reduzida FADH2 (Champe et al., 2012; Murray et al., 2014; Riegel,
2001; Smith et al., 2007). O fumarato resultante é convertido a malato
pela fumarase (EC 4.2.1.2) que catalisa a adição de água por meio da
dupla ligação do fumarato, e subsequentemente transformado em
oxalacetato pela malato desidrogenase (MDH; EC 1.1.1.37) (Murray et
al., 2014; Riegel, 2001; Smith et al., 2007). Nessa última reação do
ciclo, o malato é oxidado a um grupo carbonila pela doação de elétrons
para NAD+, produzindo o terceiro e último NADH do ciclo (Champe et
al., 2012; Smith et al., 2007). Em consequência das oxidações
catalisadas pelas desidrogenases do ciclo do ácido cítrico, são
produzidas três moléculas de NADH e uma de FADH2 para cada
molécula de acetil-CoA catabolizada em uma volta do ciclo, que são
transferidos para a cadeia de transporte de elétrons (Murray et al., 2014).
1.5.2 Cadeia transportadora de elétrons
O passo seguinte ao ciclo do ácido cítrico é a cadeia
transportadora de elétrons (Figura 4), A qual consiste de vários
complexos proteicos grandes e de dois componentes pequenos e
independentes – ubiquinona e citocromo c, formando uma série de
carregadores que agem sequencialmente (Nelson e Cox, 2013; Baynes e
Dominiczak, 2015). Cada etapa da cadeia de transporte de elétrons
50
envolve uma reação redox, na qual deixa os componentes com
potenciais de redução mais negativos e caminha para componentes com
potenciais de redução mais positivos (Baynes e Dominiczak, 2015).
Todo o processo inicia-se com a doação de elétrons pelas coenzimas
reduzidas NADH e FADH2. À medida que os elétrons fluem através da
cadeia transportadora de elétrons, eles perdem muito de sua energia
livre, que pode ser captada e armazenada para a produção de ATP a
partir de ADP e fosfato inorgânico (Pi) (Champe et al., 2012).
Do NADH, os elétrons são transferidos através do complexo I
(NADH-desidrogenase), uma grande proteína com múltiplas
subunidades em forma de L, com um braço “horizontal” saindo na
membrana e um braço “vertical” que se projeta para dentro da matriz
mitocondrial. E o FADH2 participa como grupo prostético do complexo
II (succinato desidrogenase), uma proteína integrante da membrana
mitocondrial interna (Berg et al., 2011; Murray et al., 2014; Smith et al.,
2007). A partir daí, sequencialmente, os elétrons são carreados pela
coenzima Q (CoQ ou ubiquinona) até o complexo II-III (citocromo c
oxirredutase). A coenzima Q pode aceitar átomos de hidrogênio tanto do
complexo I, quanto do complexo II (Champe et al., 2012; Smith et al.,
2007). Do complexo II-III, os elétrons são passados ao citocromo c e,
finalmente, chegam ao complexo IV (citocromo c oxidase) (Smith et al.,
2007). Esse último apresenta uma afinidade muito alta pelo O2, pois
contém o sítio de ligação para o O2, o que permite à cadeia respiratória
funcionar à velocidade máxima até o tecido tornar-se virtualmente
anóxico (Murray et al., 2006; Smith et al., 2007). Quando o O2 recebe
elétrons da cadeia, ele é reduzido a H2O (Smith et al., 2007). Como essa
reação é irreversível, ela orienta a direção do movimento dos
equivalentes redutores na cadeia respiratória e a produção de ATP, a
qual a cadeia está acoplada (Murray et al., 2006).
A transferência de elétrons entre os componentes da cadeia de
transporte de elétrons faz com que os prótons sejam bombeados da
matriz para o espaço intermembranas, de dentro para fora da membrana
mitocondrial interna através dos complexos I, III e IV, que atuam como
uma bomba de prótons (Baynes e Dominiczak, 2015; Murray et al.,
2006). Para cada par de elétrons transferidos para o O2, quatro prótons
são bombeados para fora pelo complexo I, quatro pelo complexo III e
dois pelo complexo IV (Nelson e Cox, 2013). O movimento
transmembrana de prótons produz um gradiente eletroquímico com dois
componentes: o potencial de membrana e o gradiente de prótons. Esse
gradiente eletroquímico também é chamado de força próton-motriz, pois
é a energia que empurra os prótons a reentrar na matriz para equilibrar
51
ambos os lados da membrana e que impulsiona a síntese de ATP (Smith
et al., 2007). A diferença de potencial eletroquímico é utilizada para
orientar a ATP-sintase (complexo V), que na presença de ADP+Pi,
forma ATP (Murray et al., 2006). O complexo V está embebida na
matriz interna, onde diversas subunidades de proteínas assumem uma
forma semelhante a uma bola, dispostas ao redor de um eixo que se
projeta para dentro da matriz e contém o mecanismo de fosforilação
(Murray et al., 2014). Uma proteína ligada a esse eixo afasta a
membrana e forma um canal de prótons. O fluxo de prótons por essa
proteína provoca sua rotação, direcionando a produção de ATP no
complexo (Murray et al., 2014).
Edema cerebral grave, deficiência na mielina, degeneração da
substância branca, necrose cerebelar e considerável perda de células
nervosas na substância negra e no núcleo pontino sugere que a
homeostase energética cerebral está alterada na DXB (Pilla et al.,
2003a).
1.6 CREATINA QUINASE (CK)
Em 1963, Cain e Davis demonstraram que o ATP era usado
diretamente nos processos contráteis e deram suporte ao papel da
fosfocreatina como uma reserva de fosfato 'rica em energia' que poderia
ser usada para manter a concentração de ATP (Newsholme et al., 1978).
A creatina quinase (CK, EC 2.7.3.2) é uma importante enzima,
cujo desenvolvimento padrão indica um rápido aumento na atividade
total da CK entre os 15-20 dias de idade em ratos jovens. Antes desse
período, a atividade permanece em menos de um terço dos adultos. Isso
corresponde ao período em que o crescimento neuronal e o
estabelecimento de sinapses está ocorrendo e logo após o
desenvolvimento de enzimas do ciclo de Krebs e ao mesmo tempo do
desenvolvimento da piruvato desidrogenase cerebral e do início da
atividade da hexoquinase mitocondrial (Booth e Clark, 1978). A CK
catalisa a transferência reversível de um grupo N-fosforil da
fosfocreatina (PCr) para o difosfato de adenosina (ADP), originando
trifosfato de adenosina (ATP) e creatina (Cr). Posteriormente, a
fosfocreatina pode ser ressintetizada na mitocôndria e transportado para
exercer o seu papel na geração de trifosfato de adenosina no citosol
(Campos-Ferraz et al., 2014). O grupo fosfato do ATP sintetizado na
matriz mitocondrial é transferido pela enzima CK mitocondrial para a
Cr, através da transferência reversível desse grupo para o grupo
guanidino da Cr, com consequente liberação de ADP e PCr. A reação da
52
CK é de equilíbrio e, por essa razão, reversível. O ADP, liberado pela
ação dessa enzima mitocondrial pode ser transportado diretamente de
volta à matriz, onde é refosforilado a ATP (Wyss e Kaddurah-Daouk,
2000). A constância da concentração de ATP é devido à regeneração de
ATP a partir do catabolismo da fosfocreatina (Newsholme et al., 1978).
A PCr deixa a mitocôndria e se difunde através do citosol para os sítios
de consumo de ATP, onde a enzima CK citosólica regenera o ATP e
assim garantem alto potencial de fosforilação. De acordo com essa
hipótese, o transporte de fosfatos de alta energia entre os sítios de
produção e consumo de ATP é alcançado principalmente pela PCr e Cr
(Wyss e Kaddurah-Daouk, 2000). Altas concentrações da atividade de
fosfocreatina e CK também são encontradas no cérebro. A CK também
tem função na manutenção dos gradientes iônicos no cérebro ao ser
acoplada a um conjunto particularmente instável de ATP associada com
adenosina trifosfatase e na estimulação da respiração mitocondrial ao
sustentar concentrações locais de ADP (Booth e Clark, 1978). A
creatina e a fosfocreatina têm efeitos neuroprotetores contra a privação
de energia e da excitotoxicidade do glutamato, atribuível a um aumento
nas reservas de fosfato de alta energia citosólicas (Brustovetsky et al.,
2001).
A CK é altamente sensível às espécies reativas de oxigênio
(EROs) devido à presença de resíduos de cisteína em seu sítio ativo
(Kaneko et al., 1993; Gross et al., 1996). Com essa inibição causada
pela oxidação dos grupos sulfidrila, pode ocorrer deficiência energética,
acúmulo de ADP e excesso de cálcio intracelular (Gross et al., 1996).
Sabe-se que a desestabilização da energia celular por exposição crônica
a EROs pode ocorrer em muitas doenças neuromusculares (Mattson,
1992). Além disso, estudos demonstraram a relação fisiopatológica da
CK com patologias cerebrais tais como doenças de Alzheimer e Pick
(Aksenov et al., 1997; David et al., 1998).
53
2 JUSTIFICATIVA
Considerando-se que os mecanismos fisiopatológicos envolvidos
no dano cerebral característico da DXB ainda não estão completamente
estabelecidos e que o tratamento mais utilizado baseia-se na restrição
dietética, o que acarreta a deficiência de ácidos graxos ômega-3, torna-
se importante estudar o efeito da suplementação com ômega-3 sobre as
alterações metabólicas causadas pelos AACR, na tentativa de
estabelecer novas estratégicas para essa doença.
54
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Investigar o efeito da suplementação com ácidos graxos ômega-3
em tratamentos pré e pós-natal sobre parâmetros de metabolismo
energético em animais submetidos a um modelo experimental de DXB.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) Avaliar o efeito da suplementação pré e pós-natal com ácidos
graxos ômega-3 sobre a atividade dos complexos da cadeia
transportadora de elétrons em cérebro (córtex cerebral,
estriado e hipocampo) de animais submetidos a um modelo
experimental de DXB;
b) Avaliar o efeito da suplementação pré e pós-natal com ácidos
graxos ômega-3 sobre a atividade da enzima CK em cérebro
(córtex cerebral, estriado e hipocampo) de animais submetidos
a um modelo experimental de DXB.
55
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 ANIMAIS
Foram utilizados aproximadamente 30 ratos (machos e fêmeas de
7 dias de idade) e 6 fêmeas adultas (60 dias de idade) da espécie Rattus norvegicus, linhagem Wistar, provenientes do biotério da Universidade
do Extremo Sul Catarinense. Os animais foram mantidos em grupos de
5 animais por caixa, em ciclos de claro-escuro de ±12 horas (07h00
às19h00), a uma temperatura de 23±1°C e com exaustão. Os animais
tiveram livre acesso à água e ao alimento. Os filhotes foram mantidos
com as mães até o desmame (21 dias). A utilização dos animais seguiu o
protocolo experimental aprovado pela Comissão de Ética no Uso de
Animais desta Universidade (protocolo n° 057/2015-1; Anexo A),
levando em consideração a Diretriz Brasileira para o Cuidado e a
Utilização de Animais para Fins Científicos e Didáticos, aprovada por
meio da Portaria do Conselho Nacional de Controle de Experimentação
Animal (CONCEA) nº 465 (23/05/2013).
Todos os procedimentos foram realizados por pessoas treinadas e
qualificadas em local específico para manipulação animal.
4.2 POOL DE AMINOÁCIDOS DE CADEIA RAMIFICADA
Uma solução de aminoácidos de cadeia ramificada, contendo 190
mM de leucina, 59 mM de isoleucina e 69 mM de valina, foi preparada
em solução salina (0,85%, peso/volume) para induzir quimicamente a
DXB. Os animais foram submetidos à administração crônica do pool de
AACR (15,8 μL/g de peso corporal) ou salina (grupo controle), por 21
dias, duas vezes ao dia com intervalos de 12 h, por via subcutânea (Bridi
et al., 2006).
4.3 ÁCIDOS GRAXOS ÔMEGA-3
Para a administração de ácidos graxos ômega-3 aos animais tanto
no período pré-natal quanto no pós-natal, foram utilizadas cápsulas
comerciais contendo 125 mg de DHA e 188 mg de EPA dissolvidos em
1 mL de óleo de peixe, conforme descrito no rótulo do fabricante, marca
Vitamed (Caxias do Sul, Brasil).
56
4.4 DESENHO EXPERIMENTAL
Foram utilizados dois protocolos de tratamento, sendo um
protocolo pré-natal e um segundo protocolo pós-natal. No primeiro
protocolo (pré-natal), as mães foram suplementadas (tratadas) com
ômega-3 durante o período gestacional e os filhos foram submetidos ao
modelo de DXB induzido quimicamente. No segundo protocolo (pós-
natal), as mães não foram tratadas durante o período gestacional e os
filhos foram submetidos ao modelo de DXB induzido quimicamente e
tratados com ômega-3.
4.4.1 Protocolo Pré-natal - Administração crônica do pool de
aminoácidos de cadeia ramificada e tratamento com ácidos
graxos ômega-3 no período pré-natal.
Após um período de acasalamento de aproximadamente 3 dias, os
machos foram retirados das caixas e as ratas gestantes foram
suplementadas com ácidos graxos ômega-3 ou água (controle), uma vez
por dia, durante o período gestacional (± 21 dias). A dose de ômega-3
foi de 0,8 g/kg de peso corporal (Ozyurt et al., 2007) administrada por
via orogástrica (gavagem). Após o nascimento dos filhotes, as ratas não
foram mais suplementadas. Os ratos infantes (com 7 dias de idade)
receberam duas administrações diárias de um pool de AACR (15,8 L/g
de peso corporal), com intervalo de 12 horas entre as administrações,
por via subcutânea, no período de 21 dias (crônico), sendo a última
administração no 28º dia de vida (Bridi et al., 2006). Doze horas após a
última administração do pool de AACR, os animais sofreram eutanásia
por decapitação com guilhotina e as estruturas cerebrais hipocampo,
estriado e córtex foram removidas e homogeneizadas em tampão PBS
(Figura 2).
P.S. Os ratos não foram anestesiados para não alterar a
bioquímica cerebral.
57
Figura 2: Representação esquemática da administração de ômega-3 em ratas
gestantes e indução do modelo da doença da urina do xarope do bordo (DXB)
na prole. Ratas gestantes (n=3 animais por grupo) receberam ômega-3 ou água
por gavagem durante o período gestacional. Na sequência, a prole recebeu
administração subcutânea do pool de aminoácidos de cadeia ramificada
(AACR) (7º ao 28º dia de vida) para indução de DXB
4.4.2 Protocolo Pós-natal - Administração crônica do pool de
aminoácidos de cadeia ramificada e tratamento com ácidos
graxos ômega-3 no período pós-natal.
Nesse segundo experimento, as ratas grávidas não receberam
nenhum tratamento, enquanto que a prole foi dividido em três grupos: 1)
controle (salina), 2) DXB e 3) DXB + ômega-3. Os ratos infantes (7
dias de idade) receberam duas administrações diárias de um pool de
AACR (15,8 L/g de peso corporal), com intervalo de 12 horas entre as
administrações, por via subcutânea (grupo teste), pelo período de 21
dias (Bridi et al., 2006) e foram suplementados com ômega-3 (100
mg/kg de peso corporal) por via orogástrica, uma vez por dia, pelo
mesmo período (El-Ansary et al., 2011). Os animais do grupo controle
receberam o mesmo protocolo de tratamento, porém foi administrada
solução salina por via subcutânea e água por via orogástrica (gavagem).
A última administração foi realizada no 28º dia de vida. Doze horas
após a última administração do pool de AACR, os animais sofreram
eutanásia por decapitação com guilhotina e as estruturas cerebrais
58
hipocampo, estriado e córtex foram removidas e homogeneizadas em
tampão PBS (Figura 3).
P.S. Os ratos não foram anestesiados para não alterar a
bioquímica cerebral.
Figura 3: Representação esquemática do modelo da doença da urina do xarope
do bordo (DXB) em ratos infantes e tratamento pós-natal com ômega-3. A
figura mostra a administração do pool de aminoácidos de cadeia ramificada
(AACR) para indução de DXB ou salina (controle) por 21 dias (7° ao 28° dia)
em ratos Wistar e tratamento com ômega-3 ou água por via orogástrica também
por 21 dias (n= 6 animais por grupo).
4.5 PREPARO DA AMOSTRA
Após a eutanásia, a caixa craniana foi aberta e o seu conteúdo
retirado e, a partir de então, mantido sobre uma placa de vidro a
aproximadamente 0 ºC. O bulbo olfatório e o tronco cerebral foram
desprezados. As estruturas cerebrais córtex, estriado e hipocampo foram
isoladas, limpas e homogeneizadas (1:20, peso/volume) em tampão
SETH (250 mM de sacarose, 2 mM de ácido etilenodiaminotetracético
(EDTA), 10 mM de trizma base e 50 UI/mL de heparina) pH 7,4. As
amostras foram centrifugadas a 800 x g por 10 min a 4 oC e o
sobrenadante foi reservado em alíquotas e armazenado a -80 °C até o
momento da determinação das atividades enzimáticas.
59
4.6 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DOS COMPLEXOS DA
CADEIA RESPIRATÓRIA
4.6.1 Determinação da atividade do Complexo I (NADH
desidrogenase)
Ao meio contendo tampão fosfato de potássio (100 mM, pH 7,4)
e proteínas do homogeneizado foram adicionados 14 mM de NADH, 1
mM de rotenona e 10 mM de ferrocianeto de potássio. As absorbâncias
foram registradas por 3 minutos a 420 °C. A atividade do complexo I
(EC 1.6.5.3) foi medida através da taxa de redução do ferricianeto
dependente de NADH (Cassina e Radi, 1996). Os resultados foram
expressos em nmol . min-1 . mg de proteína-1.
4.6.2 Determinação da atividade do Complexo II
(succinato:ubiquinona oxirredutase)
O meio de incubação foi constituído de fosfato de potássio
(40 mM, pH 7,4), 16 mM de succinato de sódio e 8 μM de 2,6-
dicloroindofenol (DCIP). Inicialmente, pré-incubou-se com 40-80 μg de
proteínas do homogeneizado a 30°C por 20 minutos. Depois, foram
adicionados ao meio 4 mM de azida sódica e 7 μM de rotenona e a
reação iniciou com adição de 40 μM de DCIP. As absorbâncias foram
registradas por 5 minutos em 600 nm. A atividade do complexo II (EC
1.3.5.1) foi medida pela diminuição da absorbância causada pela
redução do DCIP (Fischer et al., 1985). Os resultados foram expressos
em nmol . min-1. mg de proteína-1.
4.6.3 Determinação da atividade do Complexo II+CoQ+III
(succinato: citocromo c oxirredutase)
O meio de reação, constituído de fosfato de potássio (40 mM, pH
7,4) contendo 16 mM de succinato de sódio, foi pré-incubado com 40-
80 μg de proteínas do homogeneizado a 30°C por 30 minutos. Em
seguida, foram adicionados 4 mM de azida sódica e 7 μM de rotenona e
a reação se iniciou pela adição de 0,6 μg/mL de citocromo c e as
absorbâncias foram registradas por 5 minutos a 550 nm. A atividade do
complexo II+CoQ+III (EC 1.3.99.1) foi medida pelo aumento da
absorbância causado pela redução do citocromo c (Fischer et al., 1985).
Os resultados foram expressos em nmol . min-1. mg de proteína-1.
60
4.6.4 Determinação da atividade do Complexo IV (citocromo c
oxidase)
O meio de incubação continha tampão fosfato de potássio (10
mM, pH 7,0), N-dodecil-D-maltosídeo (0,6 mM) e 10-20 μg de
proteínas (homogeneizado). A reação foi iniciada pela a adição de 0,7
μg de citocromo c reduzido. A atividade do complexo IV (EC 1.9.3.1)
foi medida a 25°C por 10 minutos pelo decréscimo na absorbância
devido à oxidação de citocromo c previamente reduzido. As leituras
foram feitas em 550 nm (Rustin et al., 1994). Os resultados foram
expressos em nmol . min-1. mg de proteína-1.
4.7 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA ENZIMA CREATINA
QUINASE (CK)
Para a determinação da atividade da CK (EC 2.7.3.2), a reação foi
iniciada pela adição de difosfato de adenosina (ADP) 3,2 mM em meio
contendo 7,08 mM de fosfocreatina e de 0,8 a 1 μg de proteínas
(homogeneizado). Após um período de 10 minutos de incubação, a
reação foi interrompida pela adição de ácido p-hidroximercuribenzoico
50 mM e a coloração rósea foi obtida pela adição de α-naftol 20% e
diacetil 20%. A leitura foi realizada por espectrofotometria a 540 nm,
segundo o método de Hughes (1962). Para calcular a atividade da
creatina quinase nas amostras, foi feita uma curva de calibração
utilizando-se creatina como padrão. Os resultados foram expressos em
μmol de creatina . min-1. mg de proteína-1.
4.8 DOSAGEM DE PROTEÍNAS
A dosagem de proteínas foi realizada através do método de
Lowry (1951), utilizando-se albumina sérica bovina como padrão.
4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística utilizada foi selecionada de acordo com o
desenho experimental utilizado e com o tipo de distribuição apresentado
pelo conjunto dos dados.
Os resultados são apresentados como média ± desvio padrão da
média. Os ensaios foram realizados em duplicata, e foram utilizadas as
médias para as análises estatísticas. O teste t de Student para amostras
independentes foi utilizado para comparações entre duas médias. Para
61
comparações entre três médias foi utilizada análise de variância de uma
via (ANOVA) seguida por teste post-hoc de Tukey. As diferenças entre
os grupos foram consideradas significativas quando o valor de p<0,05.
Todas as análises foram realizadas em um PC compatível com
computador IBM utilizando o programa estatístico aplicado as ciências
sociais (SPSS) versão 20.0.
62
5 RESULTADOS
5.1 1º EXPERIMENTO – PRÉ-NATAL
Para verificar o efeito da suplementação de ômega-3 no período
gestacional (pré-natal) em ratas mães que receberam suplementação com
ômega-3 das que não receberam, foram analisadas as atividades dos
Complexos I, II, II-III, IV da cadeia de transporte de elétrons e CK em
estruturas cerebrais da prole com Doença da Urina de Xarope de Bordo
(DXB).
Com relação aos complexos da cadeia de transporte de elétrons,
pode-se observar que os resultados não indicam alterações
estatisticamente significativas sobre as atividades dos complexo I, II, II-
III e IV nas estruturas cerebrais hipocampo, estriado e córtex cerebral
(Figura 4).
63
Figura 4 - Efeito da suplementação materna com ômega-3 durante o período
gestacional (pré-natal) sobre o dano as atividades dos complexos I (A),
complexo II (B), complexo II-III (C) e complexo IV (D), em estruturas
cerebrais da prole com doença da urina do xarope do bordo (DXB). Método
Estatístico Empregado: Teste t de Student para amostras independentes
expressos por média±DP. Não houve diferença significativa entre os grupos
(p>0,05).
Com relação à CK, pode-se observar que os resultados não
indicam alterações estatisticamente significativas sobre a atividade da
enzima nas estruturas cerebrais hipocampo, estriado e córtex cerebral,
conforme os dados apresentados abaixo (Figura 5), com suplementação
com ômega-3 durante a gestação (pré-natal)
A) B)
C) D)
64
Figura 5 - Efeito da suplementação materna com ômega-3 durante o período
gestacional (pré-natal) sobre a atividade da Creatina Quinase (CK) em
estruturas cerebrais da prole com doença da urina do xarope do bordo (DXB).
Método Estatístico Empregado: Teste t de Student para amostras independentes
expressos por média±DP. Não houve diferença significativa entre os grupos
(p>0,05).
5.2 2º EXPERIMENTO – PÓS-NATAL
Para verificar a suplementação de ômega-3 pós natal, foram
utilizados três grupos: controle, DXB e prole de DXB suplementado
com ômega-3. Assim como no período pré natal, foram analisadas as
atividades dos complexos da cadeia de transporte de elétrons, Complexo
I, Complexo II, Complexo II-III, Complexo IV e CK em estruturas
cerebrais da prole com Doença da Urina de Xarope de Bordo (DXB).
Os resultados mostram que a suplementação com ômega-3
durante o período pós-natal não indicam relevância estatística sobre a
atividade dos complexos I, II, II-III e IV nas estruturas cerebrais
hipocampo, estriado e córtex cerebral (Figura 6).
65
Figura 6 - Efeito da suplementação do ômega-3 no período puerperal (pós-natal)
sobre o dano a atividade dos complexos I (A), complexo II (B), complexo II-III
(C) e complexo IV (D), em estruturas cerebrais da prole com doença da urina do
xarope do bordo (DXB). Método Estatístico Empregado: Teste One Way Anova
para amostras emparelhadas expressos por média±DP. Não houve diferença
significativa entre os grupos (p>0,05).
Os resultados mostram que a suplementação com ômega-3
durante o período pós-natal não indicam relevância estatística sobre a
atividade da CK nas estruturas cerebrais hipocampo e estriado. Já no
córtex cerebral, os animais da prole DXB que recebeu a suplementação
de ômega-3 tiveram uma diminuição estatisticamente significativa na
atividade de CK quando comparado com os demais grupos, conforme os
dados apresentados abaixo (Figura 7).
A) B)
C) D)
66
Figura 7 - Efeito da suplementação do ômega-3 no período puerperal (pós-natal)
sobre o dano a atividade da Creatina Quinase (CK) em estruturas cerebrais da
prole com doença da urina do xarope do bordo (DXB). Método Estatístico
Empregado: Teste One Way Anova para amostras emparelhadas expressos por
média±DP. Houve diferença significativa entre os grupos (p<0,05).
67
6 DISCUSSÃO
Quando o metabolismo dos AACR é prejudicado geneticamente
em humanos, os níveis séricos de AACR e seus metabólitos sobem
consideravelmente, causando uma disfunção neurológica grave (Wang
et al., 2015). O dano neurológico que ocorre na DXB estabelece o risco
associado com as concentrações elevadas de AACRs ou seus cetoácidos
(Harris et al., 2005). Os ácidos graxos ômega-3 e seus derivados podem
auxiliar processos fisiológicos e de desenvolvimento importantes;
podem formar eicosanoides; apresentam propriedades neuroprotetoras e
representam um tratamento potencial para uma variedade de doenças
neurodegenerativas e neurológicas (Lands, 1992; Dyall, 2015).
Nesse estudo, foram realizados dois experimentos para investigar
o efeito da suplementação com ácidos graxos ômega-3 em tratamentos
pré e pós-natal sobre parâmetros de metabolismo energético em animais
submetidos a um modelo experimental de DXB. No primeiro
experimento, ratas grávidas foram submetidas à suplementação com
ácidos graxos ômega-3 e sua prole foi submetida a um modelo
experimental de DXB. No segundo experimento, as mães não foram
tratadas durante o período gestacional e os filhotes foram submetidos ao
modelo de DXB induzido quimicamente e tratados com ácidos graxos
ômega-3. Esses dois protocolos de tratamento foram aplicados para
avaliar se os ácidos graxos ômega-3 alterariam o funcionamento a
atividade dos complexos da cadeia transportadora de elétrons e da
enzima CK em estruturas cerebrais (córtex cerebral, estriado e
hipocampo) dos filhotes submetidos a um modelo experimental de
DXB.
O desenvolvimento do tecido nervoso do feto tem início durante
as primeiras fases (semanas) da gestação. O processo de mielinização
ocorre, principalmente, entre o 2º trimestre da gestação e final do
primeiro ano pós-natal. (Hadders-Algra, 2010). A formação do sistema
nervoso é mediada por processos neuroquímicos e atividade neural
(Goda e Davis, 2003).
O feto tem uma necessidade de ácidos graxos ômega 6 e ômega 3
e seus derivados, o ácido dihomo gama linolênico (DGLA), ácido
araquidônico (AA), ácido eicosapentaenóico (EPA) e o ácido
docosahexaenóico (DHA), esse essencial para o desenvolvimento do
cérebro e da retina, para suportar o crescimento e a atividade celular
rápidas (Haggarty, 2004; Haggarty, 2010). O organismo do feto e do
recém-nascido consegue realizar os processos de conversão dos
precursores ômega-3 e ômega-6, mas os sistemas enzimáticos
68
envolvidos parecem ser incapazes de fornecer DHA e AA suficientes
para atender às altas exigências até a 16ª semana de idade (Lauritzen et
al., 2001). Isso indica que no desenvolvimento fetal, o fornecimento
desses ácidos graxos depende da ingestão materna e após o nascimento,
os mesmos devem ser fornecidos no leite (Green et al, 1998; Larque et
al., 2002; Hadders-Algra et al., 2010).
Estudos indicam que a suplementação com esses ácidos graxos
pode exercer efeitos benéficos durante a gravidez, pois exibem
propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias, prevenindo o parto
prematuro, melhora o desenvolvimento visual e cognitivo do feto
(Haggarty, 2004; Carlson et al., 2013; Jones et al., 2013a; Jones et al.,
2014). Durante o período da gravidez, há uma preocupação quanto à
ingestão insuficiente de ômega 3 durante os períodos críticos de
desenvolvimento neurológico fetal, em função da dieta pobre desses
ácidos graxos na dieta ocidental (Meldrum et al., 2015). Dados
demonstram que a proporção na ingestão de ácidos graxos ômega 3 e
ômega 6 sofreu variações ao longo da evolução, de uma proporção de
1:1 para 1:10-20, podendo isso estar associado a algumas patologias
(Simopoulos, 2011)
Nos resultados do experimento, comprovou-se que a
suplementação materna com ácidos graxos ômega-3 durante o período
pré-natal não trouxe resultados estatísticos relevantes quanto ao
funcionamento da mitocôndria e, consequentemente, aos complexos da
cadeia de transporte de elétrons e também os dados não foram
estatisticamente significativos com relação à CK, nas estruturas
cerebrais hipocampo, estriado e córtex cerebral da prole de ratos
submetida ao modelo de DXB quimicamente induzido. Esses resultados
estão em desacordo com estudos que indicam que a suplementação
materna com ácido graxo ômega 3 pode melhorar as respostas
inflamatórias nos infantes pré-termo; apresentar funções importantes no
desenvolvimento neurológico do feto e recém-nascido e por causa de
seu papel na inflamação; aumentar a duração gestacional e reforçar o
neurodesenvolvimento infantil e proporcionar uma intervenção
terapêutica para limitar a inflamação da placenta e o estresse oxidativo
associados com vários distúrbios de gravidez (Jensen, 2006; Grenberg et
al., 2008; Valentine, 2012; Rogers et al., 2013; Jones et al., 2014).
Ressalta-se a importância dos dados do primeiro experimento,
que estão em acordo com estudos que sugerem que embora o cérebro do
recém-nascido tenha uma concentração relativamente elevada de DHA,
a acreção absoluta durante a vida no útero é pequena (Haggarty, 2004).
Um súbito acréscimo DHA e AA ocorre pela primeira vez no último
69
trimestre de gestação, com evidências de maior acúmulo de AA do que
DHA (Martinez e Mougan, 1998; Hadders-Algra, 2010).
Muitos estudos clínicos recentes têm fornecido DHA de alguma
forma para mulheres grávidas para avaliar tanto o desenvolvimento da
gravidez e/ou o desenvolvimento infantil, com resultados conflitantes
em ambos os casos (Carlson et al., 2013). Existem muitas variáveis
entre os estudos de suplementação na gravidez que poderiam explicar a
discrepância nos resultados observados, como dosagem da
suplementação, o tipo de alimentação materna e até mesmo a fonte do
DHA suplementado. Após o nascimento, o DHA armazenado é
largamente utilizado nos primeiros 2 meses de vida pós-natal
(Farquharson et al., 1993), aparentemente para manter processos como o
desenvolvimento cerebral e da retina durante os primeiros meses críticos
de vida pós-natal (Haggarty, 2004). Como não houve suplementação nos
filhotes após o nascimento no primeiro experimento, esse fator talvez
explique os resultados apresentados.
Quanto à administração de ômega-3 no período pós-natal, os
resultados do estudo mostraram que também não houveram resultados
estatísticos relevantes quanto ao funcionamento da mitocôndria e,
portanto, aos complexos da cadeia de transporte de elétrons nas
estruturas cerebrais avaliadas da prole de ratos submetida ao modelo de
DXB quimicamente induzido. Com relação à CK, os dados também não
resultaram em dados estatísticos importantes sobre sua atividade nas
estruturas cerebrais hipocampo e estriado, sendo identificado uma
diminuição estatisticamente significativa de sua ação na área do córtex
cerebral, nesses mesmos ratos. No cérebro, os ácidos graxos de cadeia
longa acumulam principalmente na substância cinzenta cortical,
particularmente nas membranas sinápticas e, em menor medida, na
substância branca (Hadders-Algra, 2010).
Está bem estabelecido que a amamentação está associada a um
melhor prognóstico neurológico, cognitivo e comportamental do que a
alimentação com fórmulas, a questão é se a suplementação de DHA,
EPA e AA da fórmula infantil pode promover o desenvolvimento
neurológico (Hadders-Algra, 2010). No caso da DXB, um dos caminhos
do tratamento é através da manutenção das concentrações plasmáticas
dos AACR normais, com uma dieta rígida e ingestão mínima dos AACR
para evitar o seu acúmulo, limitando ao mínimo necessário para o
desenvolvimento normal. As fórmulas comerciais dietéticas para o
tratamento da DXB apresentam uma ausência quase que total de ácidos
graxos da classe ômega-3 e um excesso de ácidos graxos ômega-6, o
que leva a uma proporção ômega-6/ ômega -3 na dieta de quatro a cinco
70
vezes mais elevada do que a estimada para o equilíbrio dietético de
ácidos graxos essenciais para os humanos (Strauss e Morton, 2003).
Existe um efeito competitivo entre os ácidos graxos ômega-3 e ômega-6
pelas enzimas redutoras de saturação e o alto consumo de ácido
linoleico interfere no alongamento das cadeias do ácido α-linolênico
(Farahani et al., 2015). Tipicamente, na deficiência de ácidos graxos, o
DPA, tende a acumular-se ao mesmo tempo em que o DHA diminui
(Neuringer et al., 1986).
O EPA e DHA são aumentados em lipídios plasmáticos e
membranas celulares do sangue em resposta à suplementação, enquanto
o AA é correspondentemente diminuído (Walker e al., 2015). Uma
ingestão elevada de DHA reduz a inflamação deslocando o AA, um
precursor pró-inflamatório, e colesterol a partir da membrana celular,
assim, diminuindo os precursores biossintéticos disponíveis para a
produção de mediadores inflamatórios (Begum et al., 2013). Uma
diminuição no teor de AA na membrana celular e um aumento em EPA
e DHA altera o equilíbrio de eicosanóides e produção de citocinas a
partir de um perfil geralmente pró-inflamatório para um perfil menos
inflamatório e ainda resolver a inflamação (Calder, 2015). Devido às
ações opostas de AA e de EPA e DHA na inflamação, na imunidade e
na coagulação do sangue, tem sido considerável o foco na capacidade de
EPA e DHA de diminuir o teor de AA de lípidos no sangue e celulas
(Walker et al., 2015).
As implicações práticas para os estudos sobre o efeito da
suplementação de os ácidos graxos de cadeia longa dependem do
momento da suplementação, pois o efeito da suplementação pós-natal
em pré-termos deve ser diferente daqueles a termo, em função das
contínuas mudanças no desenvolvimento cerebral (Hadders-Algra,
2010). Simmer et al. (2008), concluiram que os ensaios clínicos
randomizados sobre o efeito da suplementação de DHA, EPA e AA pós-
natal da fórmula de leite em bebês nascidos a termo não mostraram um
efeito benéfico desses ácidos graxos em resultado do desenvolvimento
neurológico. Essa mesma suplementação em nascidos pré-termo e nos
nascidos a termo não demonstraram evidências de um efeito positivo
nos resultados de neurodesenvolvimento na infância tardia (Hadders-
Algra, 2010; Hadders-Algra, 2011).
A deficiência cerebral de DHA pode levar a deficiência do
sistema visual, disfunção sináptica, dinâmica de neurotransmissores
anormais, excitabilidade patológica, a expressão genética cerebral
alterada, e distúrbios comportamentais (Strauss e Morton, 2003). O
DHA também demonstrou papeis neuroprotetores contra o estresse
71
oxidativo através de sua habilidade de limpar a produção de radicais
livres intracelulares que são induzidos por peróxido de hidrogênio,
ânion superóxido e radicais hidroxila em células ganglionares de retina
(Shimazawa et al., 2009). O mecanismo neuroprotetor pelo qual a
neuroprotetina D1 (NPD-1), um derivado do DHA, age em condições de
estresse oxidativo é pelo aumento na regulação dos fatores
antiapoptóticos Bcl-2 e Bcl-x e a consequente diminuição na regulação
dos fatores pro-apoptóticos Bax and Bad (Lukiw et al., 2005).
Estudos em animais mostraram que a produção excessiva de
radicais livres e a diminuição das defesas antioxidantes são induzidos
por metabolitos acumulados em vários erros inatos do metabolismo
(Barschak et al., 2008b). Na DXB, o aumento dos níveis de AACRs,
principalmente a leucina, provoca um aumento no estresse oxidativo. O
estresse oxidativo tem sido reconhecido como um risco e um fator de
contribuição para várias fisiopatologias, incluindo inflamação e lesão
tecidual, arteriosclerose, diabetes, doenças neurodegenerativas, tais
como doença de Alzheimer e doença, Parkinson, câncer e
envelhecimento, entre outras (Barschak et al., 2008a; O’neil et al.,
2015). Consequências indesejáveis do aumento de espécies reativas de
oxigênio (EROs) devido a superprodução desregulada ou falha nos
sistemas antioxidantes podem ser detectadas por mudanças nas respostas
celulares, como o aumento da apoptose ou proliferação celular e até em
casos de adaptação celular global pelo aparecimento de modificações
oxidativas no DNA, proteínas ou lipídios. (O’neil et al., 2015; Sullivan e
Chandel, 2014).
As indicações das funções neuroprotetoras dos ácidos graxos
ômega 3 tem aumentado constantemente nos últimos anos, incluindo
efeitos sobre memória e aprendizado e prevenção de doenças
neurodegenerativas pela desaceleração do declínio cognitivo e
representam um tratamento potencial para uma variedade de doenças
neurodegenerativas e neurológicas (Dyall, 2015; Schmidt et al., 2015).
Os importantes progressos no entendimento das bases
bioquímicas e moleculares dos erros inatos do metabolismo (EIMs)
intermediários tem proporcionado um arsenal terapêutico cada vez
maior para o manejo de muitas dessas condições (Schwartz et al., 2008).
Dessa forma a utilização da suplementação com ácidos graxos ômega-3
deve ser melhor avaliada como uma estratégia terapêutica para diversas
doenças neurodegenerativas, entre elas, a DXB.
72
7 CONCLUSÃO
Diante dos resultados apresentados nos experimentos,
identificou-se que a suplementação pré e pós-natal com ácidos graxos
ômega-3 não apresentou dados estatísticos significativos sobre a
atividade dos complexos da cadeia transportadora de elétrons em áreas
cerebrais de animais submetidos a um modelo experimental de DXB.
No caso da atividade da enzima creatina quinase, a suplementação
materna com ácidos graxos ômega-3 também não apresentou resultados
significativos estatisticamente nas mesmas estruturas cerebrais. Já a
suplementação pós-natal apresentou uma tendência de diminuição na
atividade dessa enzima, especificamente na região do córtex cerebral.
Esses resultados sugerem que estudos adicionais são necessários para se
avaliar a efetividade da suplementação com ácidos graxos ômega 3, nos
períodos pré e pós-natal e determinar sua eficácia sobre os complexos da
cadeia de transporte de elétrons e sobre a enzima CK.
73
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89
ANEXO
90
ANEXO A – PARECER DA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE
ANIMAIS