Неінвазивна пренатальна ДНК-діагностика:можливості...
Post on 20-Jun-2015
590 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
Львів2013
Неінвазивна пренатальна ДНК-діагностика:
можливості та обмеженняМикитенко Д. О., Зукін В. Д.
Клініка репродуктивної медицини «НАДІЯ»
2
Історія питання
3
1998 – RhD ni (обгрунтування)Lo YMD, New Eng J Med, 339Faas B. H. Lancet, 352
2000 – Моногенна діагностикаSaito H Lancet, 350
2001 / 2002 – Діагностика статі плодаRijnders RJ, Obstet Gynecol, 2001, 98Costa JM, New Engl J Med, 2002, 346
2003 – 2007 – Маркери виділення плодової ДНК2003 – епігенетичні – Lui Y. Y..Clin Chem, 492006 – ins/del – Page-Christiaens G.C. Ann NY Acad Sci, 10752007 – SNP – Chow KCK, Clin Chem, 53
2008 – діагностика материнських мутаційLun FMF, Proc Natl, Acad Sci USA, 105
2008 – NIPD – NGSFan H. C. Proc Natl Acad Sci USA, 105Chiu PWK Proc Natl Acad Sci USA, 105
2006 –ануеплоідії епігенетичні маркериTong Y.K. Clin Chem. 52
2007 – анеуплоідії по РНКLo YMD, NatMed, 13
2009 – ануеплоідії – цифрова ПЛРChiu RWK. Trends Genet, 25
2010 – Епігенетично-генетичний підхід до д-ки анеуплоідійTong Y. K. Clin Chem, 56
2010 2013
1995 – відкриття cffDNAKazakov V.I. et al. Tsitologiia, 37(3)
1977 /79– Циркуляція клітин плода в крові вагітної1977 - Ciaranfi A Schweiz Med Wochenschr 1071979- Herzenberg L.A. Proc Natl Acad Sci USA 76(3)
1997 – відкриття cffDNALo YMD, Lancet, 350
1948 – cell-free DNAMandel P, Mйtals P: Les acides nuclйiques du sanguine chez l’homme.CR Acad Sci Paris, 142.
19701940 1990
4
1997: detection of cffDNA fragments in maternal plasma
Наукова основа неінвазивної ДНК-діагностики Cell Free Fetal DNA (cffDNA)
• Detection: starting week 4
• Fetal fraction: 2 – 40 %• Stability: < 2 hours• Characteristics:
- short fragments, 80 % < 200 bp- released from trophoblast cells
(placenta) by apoptosis / necrosis
* Lo et al., Lancet 1997; 350:485-7
5
Динаміка концентрації cffDNA при вагітності
6
Cell-free fetal nucleic acids for non-invasive prenatal diagnosis (Report of the UK expert working group) 2009
7
Неінвазивна ДНК-діагностика резус-фактору плода
Принцип: пошук послідовностей ДНК, характерних для гена RhD.
з 9 ембр. т. (Клініка «Надія»)
Недоліки: - Підтвердження виділення плодової ДНК- Псевдонегативний результат внаслідок
низької концентрації cffDNA (потребує повторного аналізу через 2 тижні)
- Тільки для одноплідних вагітностей- Можливість розходження генотипу та фенотипу (~1% для Європеоїдної раси).
8
Many RHD-positive Hybrid Alleles
Avent and Reid Blood (2000) 95:375
>50
9
Gene Conversion in RH Genes
Wagner et al BMC Genet 2001 2(1):10
10Wagner et al BMC Genet 2001 2(1):10
Additional RHD-Negative Alleles
RHD
RHCE
11
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
RHCE RHD
RhD-Negative Haplotyes in Africans
Stop codon37 bp insert
Singleton et al , Blood (2000) 95:12-18
D-positive
D-negativeRhD
D-negative(C)ces
D-negativeDeletion
66%
15%
18%
RHD observed in 24% RhD negative African Americans
?
12
Неінвазивна ДНК-діагностика статі плода
Принцип: пошук послідовностей ДНК, характерних для гена Y-хромосоми.
з 7 ембр. т. (Клініка «Надія»)
Недоліки: - Підтвердження виділення плодової ДНК- Псевдонегативний результат внаслідок низької концентрації cffDNA
(потребує повторного аналізу через 2 тижні)- Тільки для одноплідних вагітностей- Визначення тільки генетичної статі- Не виключає можливість наявності генної / хромосомної патології
- Синдром де ля Шапеля (ХХ-синдром чоловіків)- Синдром Нуан (Каріотип 46,XY, фенотип 46,ХО через мутацію PTPN11)- Синдром Сваєра (каріотип XY, Фенотип жіночий через мутацію DHH
(12), NR0B1 (Х), NR5A1 (9), SRY (Y), 9p24.3del )- Синдром тестикулярної фемінізації- Адреногенітальний синдром
13
Неінвазивна ДНК-діагностика моногенної патології
На даний час – виявлення тільки
батьківськх мутантних алелей, відмінних від
материнских
Носій:Мутантний алель виявлений у плазмі
Норма:Мутантний алель не виявлений
14
«Цифрова ПЛР»: аналіз розведенної ДНК у мікрореакторах
Prenatal Diagnosis 2013, 33, 555–562
Алель дикого типу Мутантний алель
Мати (клітини)
Бітько
Плазма, 1-а вагітність
Плазма, контроль
Негативних контроль
Плазма, 2-а вагітність
Актуальність
15Cell-free fetal nucleic acids for non-invasive prenatal diagnosis (Report of the UK expert working group) 2009
Неінвазивна ДНК-діагностика анеуплоїдій
16
Неінвазивна ДНК-діагностика анеуплоїдій
17
Сепарація клітин плода з крові вагітної
18
Компанія Тест Технологія Франшиза
MaterniT21® S-MPS
PrenaTest ® S-MPS
verifi® S-MPS
NIFTY test T-MPS PrenaScan (Чехія)
Harmony® T-MPS
Panorama® SNP
Неінвазивна діагностика шляхом NGS
1. S-MPS (shotgun massively parallel sequencing):• Секвенування всієї ДНК плазми з низьким покриттям (<1x);• Аналіз співвідношення кількості «рідів» за кожною хромосомою (13, 18, 21, X, Y) у змішаній
фракції ДНК.• Відносно проста біоінформатика;• Вимагає визначення вмісту cffDNA! • Висока собівартість одного тесту за рахунок зниження продуктивності секвенатору (оптимум
150 зразків / тиждень).
2. T-MPS (targeted shotgun massively parallel sequencing):• Секвенування локусів ДНК тільки певних хромосом.• Аналіз співвідношення кількості «рідів» за кожною хромосомою (13, 18, 21, X, Y) у змішаній
фракції ДНК.• Відносно проста біоінформатика;• Низкая себестоимость одного теста при большом потоке.• Вимагає визначення вмісту cffDNA! • Вимагає великого потоку пацієнтів (300 зразків / тиждень, не менш, ніж 90 зразків / запуск).
3. Методики на основі SNP:• Секвенуються вибіркові ділянки геному з нейтральними SNP;• Аналіз співвідношення генотипів за кожним SNP у змішаній фракції ДНК.• Розраховується ступінь ризику за кожною хромосомою;• Необхідна система збагачення SNP-вмісних ділянок та їх зчитування з високим перекриттям;• Складні статистичні алгоритми.• Бажане отримання зразку батьківської ДНК
Технології
Технології S-MPS & T-MPS
ДНК плаценти:~87% материнская
~13% плодная
Вільна ДНК плами крові вагітної
Еритроцити
Фрагмент ДНК плода
Тотальне секвенування ДНК
Підрахунок кількості зчитувань за хромосомами Детекція анеуплоідії
ATTGTTCCCACAGACCGCGGCGAAGCATTGTTCC ACCGTGTTTTCCGACCG
TTTCCGACCGAAATGGCTTGTTCCCACAGACCGTGAGCTCGATGCCGGCGAAGATGCCGGCGAAGCATTGT
TAATGCGACCTCGATGCCACAGACCGTGTTTCCCGA
AAGCATTGTTCCCACAG TGTTTTCCGACCGAAATCCGACCGAAATGGCTCCTGCCGGCGAAGCCTTGT
17 bp
66 bp
Довжина зчитувань (ріда): гарантована середня (454, Ion Torrent) чи стандартна (Illumina) довжина 1 зчитування.
Довші зчитування – легше зборка
Основний принцип NGS (shotgun sequencing)
Method – Bioinformatic Analysis of the Sequencing Data
Alignment of the fragments to the respective chromosome by comparison with a human reference genome in the public data base
Counting of the sequences per chromosome, calculation of percentage (e.g. % chromosome 21)
Sequencing and Alignment
Quantification
Example for a Bioinformatic Analysis
Data per sample (single read sequencing)
• About 14.8 million 36bp reads (cover about 8 % of the human genome)
• Thereof, 6.8 million reads fit to only one single position in the human reference genome (unique reads)
• Thereof, 5.7 million reads fit exactly without mismatch to the human reference genome (unique without mismatch)
• Thereof, about 70,000 belong to chromosome 21• %chr21 (euploid): 1.25 vs.
%chr21 (T21): 1.32 (= 73,000;
only 1.05 fold higher)
14.8 m
6.8 m5.7 m
70,00073,000
Method – Calculation of the z-score
z-score calculation:
z-score ≥ 3 T21 positive < 3 T21 negative
The z-score represents the distance between the value measured for a given sample and the median of the reference set in terms of the median absolute deviation (MAD)
z-score of 1 = exactly 1 deviation
z-score of 3 = 3 deviations
Example for a frequency distribution of z-scores
Representation of z-scores as dot plot
Representation of z-scores for a euploid reference set and a case of trisomy 21 as dot plot
28
Неінвазивна ДНК-даігностика за SNP (Natera)
Dhallan et al., 2007
Ринок неінвазивної ДНК-дагностики анеуплоідій
Данные на 27 февраля 2013
Метод: SNP S-MPS S-MPS T-MPS
30
• Технологічні платформи усіх компаній характеризуються однаковою ефективністю, мають подібні показники специфічності та чутливості.
• Усі компанії мають певні труднощі з детекцією анеуплоідій за 13 та статевими хромосомами.
Платформи NIPD
32
33
Залежність ефективності діагностики від концентрації плодової ДНК
Метод: S-MPS
Zimmerman et al., 2012
Метод: SNP
Залежність ефективності діагностики від концентрації плодової ДНК
Which group of pregnant women is the PrenaTest® suitable for?
Taking the legal and methodological facts into account for the PrenaTest® to be carried out, the pregnant woman must
• be in the 9th week of pregnancy or later
• have an increased risk for chromosomal aberrations, especially for trisomy 13, 18 or 21 in the unborn child
Risk factors (also inclusion criteria for the clinical study) are determined as follows:
35 years of age or older
Fetal ultrasonographic findings indicating an increased risk of aneuploidy
Increased risk for aneuploidy based on first trimester, sequential, or integrated screen, or quadruple screen
History of a prior pregnancy with a trisomy
Genetic predisposition for translocation trisomy
Other medical reasons (to be decided by responsible doctor and patient)
• Неможливість застосування у випадку багатоплідних вагітностей• Неможливість детекції збалансованих структурних хромосомних перебудов• Можливість фетоплацентарного розходження каріотипу (джерело cffDNA – клітини
трофобласту)• Неможливість детекції / кількісної характеритики мозаїцизму
Обмеження PrenaTest®
Додаткові умови ISPD, DGGG, GfH/GenDG , ACOG :
• Неінвазивна діагностика – метод високої точності, але не є діагностичним.• Необхідність консультації пацієнтки до та після проведення тесту фахівцем,
компетентним у питаннях неінвазивної діагностики.• До пацієнтки мають буди доведені усі шляхи дослідження аномалій та каріотипу плода,
ризики, можливості та обмеження інвазивної та неінвазивної процедур• У випадку «позитивного результату» - медико-генетичне консультування та дослідження
каріотипу плода (інвазивний метод)• У випадку «негативного результату» - УЗД-моніторинг з метою виключення вад розвитку
1:10
29:1 1:1100
NIPT positive NIPT negative
1:100
3:1 1:11.000
NIPT negativeNIPT positive
1:270
1:1 1:13.000
NIPT positive
positive:Confirmation of the result by
invasive diagnosis
negative:Substantial reduction of the risk, most likely no invasive
diagnosis required
Risk after FTS:
Adjusted risk after NIPT:
NIPT negative
Model for the implementation of NIPT into the prenatal risk assessment of trisomy 21
Having an increased risk for fetal trisomy 21 after conventional first trimester screening (FTS), NIPT can help to decide for or against invasive diagnostic methods:
modified from Benn et al., Ultrasound Obstet Gynecol 2012; 39: 127-130
6000 pregnancies at 1:19 risk for fetal trisomy 21
300 trisomy 21 5700 euploid
295 NIPT + 2 no result 3 NIPT - 17 NIPT + 5637 NIPT -46 no result
amniocentesis297 + 63
1-2 miscarriages (1:200)
low risk, probably abandon AC
3 + 5637
NIPT as Secondary Screening Test After Positive FTS Has the Potential to Decrease Procedure Related Fetal Losses: a Model
Courtesy of Glenn E. Palomaki, Women & Infants Hospital, Alpert Medical School of Brown University, Providence, RI, USA
direct AC in 6000 pregnancies
30 miscarriages (1:200)
„…yet be considered diagnostic. However, offering MPSS testing to women already at high risk for Down syndrome can reduce procedure-related losses by up
96%, while maintaining high detection. Confirmation by invasive testing is still needed…“
„… trisomy 21 among high risk pregnancies. If referrals for amniocentesis chorionic villus sampling were based on the sequencing
results, about 98% of the invasive diagnostic procedures could be avoided…“
NIPT as Secondary Screening Test After Positive FTS
As advanced or secondary screening test for pregnancies at increased risk after FTS, NIPT has the potential to
substantially reduce the number of invasive prenatal procedures
avoid procedure related fetal losses
Chiu et al. 2011 BMJ Palomaki et al. 2011 Genetics in Medicine
Facts about the PrenaTest®
• The only NIPT for fetal trisomies 21, 18 and 13 available in Europe, which is in accordance with the IVD Directive of the EU
NGS based aneuploidy tests for trisomy are covered by the In-Vitro Diagnostics Directive 98/79/EG* of the European Union and the respective national laws.
The Software is CE-marked and monitored by a Notified Body
The Legal Manufacturer must ensure the application of a full quality assurance system (EN ISO 13485)
Right now, PrenaTest® is the only test in accordance with these regulatory requirements.
Therefore, PrenaTest® is the only lawfully marketable NIPT in Europe.
2 Nicolaides, Prenat Diagn 2011; 31:7-15
Клінічні випробування LifeCodexx
Результати LifeCodexx
Висновки• Неінвазивна пренатальна ДНК-діагностика є
високочутливим методом, що в майбутньому стане альтернативою інвазивним, однак характеризується певними обмеженнями, що мають враховуватись при інтерпретації результатів.
• Перспективи:– Розширення кількості хромосом, що аналізуються, та
детекція материнських мутантних алелей у плода.– Здешевлення діагностики у випадку запровадження
обов’язкового медичного страхування та покриття ним зазначених процедур
44
Дякуємо за увагу
45
(044) 537 7 597 info@ivf.com.ua www.ivf.com.uaКлініка репродуктивної медицини «НАДІЯ»
top related