ΕΚΦΕ Κέντρου & Τούμπας · • Πρόσθεσε 2-3 σταγόνες...

ΕΚΦΕ Κέντρου & Τούμπας

Δ.Δ.Ε. Ανατολικής Θεσσαλονίκης

Βιολογία ΓΕΛ

ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΝΟΥΚΛΕΪΚΩΝ ΟΞΕΩΝ ΑΠO ΦΥΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ Γ΄ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΥΛΙΚΑ

1. Απορρυπαντικό για πιάτα

2. Μαγειρικό αλάτι (NaCI)

3. Φάβα

4. Διάλυμα πεψίνης 1% w/v

5. Παγωμένη αλκοόλη (καθαρή ή μπλε)

ΕΚΦΕ Κέντρου ΕΚΦΕ Κέντρου Απομόνωση Απομόνωση DNA DNA ΕΚΦΕ Τούμπας ΕΚΦΕ Τούμπας

ΟΡΓΑΝΑ

1. Blender

2. Λεπτό στραγγιστήρι

3. Γυάλινη ή ξύλινη ράβδος

4. Τρεις δοκιμαστικοί σωλήνες

5. Ποτήρι ζέσεως 250gΕΚΦΕ Κέντρου ΕΚΦΕ Κέντρου Απομόνωση Απομόνωση DNA DNA ΕΚΦΕ Τούμπας ΕΚΦΕ Τούμπας

ΒΗΜΑ 1: ΣΠΑΣΙΜΟ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΜΕΒΡΑΝΩΝ ΚΙ

ΕΛΕΥΘΕΡΩΣΗ ΤΩΝ ΝΟΥΚΛΕΪΚΩΝ ΟΞΕΩΝ

1. Βάλε στο Blender Μισό φλιτζάνι του τσαγιού (100g) φάβα Μισό κουταλάκι γλυκού μαγειρικό αλάτι Ένα φλιτζάνι τσαγιού κρύο νερό

2. Ομογενοποίησε για 15 δευτερόλεπτα

ΕΚΦΕ Κέντρου ΕΚΦΕ Κέντρου Απομόνωση Απομόνωση DNA DNA ΕΚΦΕ Τούμπας ΕΚΦΕ Τούμπας

3. Στράγγισε το ομογενοποιημένο μίγμα σε ένα λεπτό στραγγιστήρι

4. Πρόσθεσε 4 κουταλάκια γλυκού απορρυπαντικό πιάτων και ανάδευσε ήπια με κουταλάκι για 5-10 λεπτά

5. Μοίρασε το μίγμα αυτό σε 3 μεγάλους δοκιμαστικούς σωλήνες για σύγκριση του αποτελέσματος

ΕΚΦΕ Κέντρου ΕΚΦΕ Κέντρου Απομόνωση Απομόνωση DNA DNA ΕΚΦΕ Τούμπας ΕΚΦΕ Τούμπας

1. Πρόσθεσε 5-6 σταγόνες πεψίνης 1% W/V σε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα

2. Ανάδευσε ήπια με γυάλινη ή ξύλινη ράβδο

ΕΚΦΕ Κέντρου ΕΚΦΕ Κέντρου Απομόνωση Απομόνωση DNA DNA ΕΚΦΕ Τούμπας ΕΚΦΕ Τούμπας

ΒΗΜΑ 2: ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΠΟΣΥΝΔΕΣΗ ΤΩΝ ΝΟΥΚΛΕΪΚΩΝ ΟΞΕΩΝ ΑΠΟ ΤΙΣ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ

1. Γείρε προσεκτικά κάθε δοκιμαστικό σωλήνα και πρόσθεσε πολύ αργά ΠΑΓΩΜΕΝΗ αλκοόλη, έτσι ώστε να δημιουργηθεί μια ξεχωριστή φάση από τη φάση του μίγματος.

Πρόσθεσε τόση αλκοόλη όση είναι η

ποσότητα του μίγματος

ΕΚΦΕ Κέντρου ΕΚΦΕ Κέντρου Απομόνωση Απομόνωση DNA DNA ΕΚΦΕ Τούμπας ΕΚΦΕ Τούμπας

ΒΗΜΑ 3: ΑΝΥΨΩΣΗ ΤΟΥ DNA ΣΤΗ ΦΑΣΗ ΤΗΣ ΑΛΚΟΟΛΗΣ

2. Το DNA θα ανυψωθεί μέσα στη φάση της αλκοόλης από τη φάση του μίγματος της φάβας.

ΕΚΦΕ Κέντρου ΕΚΦΕ Κέντρου Απομόνωση Απομόνωση DNA DNA ΕΚΦΕ Τούμπας ΕΚΦΕ Τούμπας

3. Με ένα ξύλινο ραβδάκι μπορείς να σύρεις το DNA από τη φάση της αλκοόλης προς τα έξω.

Το DNA είναι ένα μακρύ ινώδες μόριο που εύκολα διακρίνεται μέσα στην αλκοόλη

ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ1. Με την ομογενοποίηση ανοίγουν πολλά κύτταρα

ΕΚΦΕ Κέντρου ΕΚΦΕ Κέντρου Απομόνωση Απομόνωση DNA DNA ΕΚΦΕ Τούμπας ΕΚΦΕ Τούμπας

2. Το απορρυπαντικό προκαλεί γαλακτωματοποίηση των λιπιδίων

ΕΚΦΕ Κέντρου ΕΚΦΕ Κέντρου Απομόνωση Απομόνωση DNA DNA ΕΚΦΕ Τούμπας ΕΚΦΕ Τούμπας

ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ

ΕΚΦΕ Κέντρου ΕΚΦΕ Κέντρου Απομόνωση Απομόνωση DNA DNA ΕΚΦΕ Τούμπας ΕΚΦΕ Τούμπας

3. Το απορρυπαντικό καταστρέφει τις μεμβράνες με τη γαλακτωποίηση των λιπιδίων, με αποτέλεσμα να εξέρχεται το DNA από τον πυρήνα και τα μιτοχόνδρια

ΕΚΦΕ Κέντρου ΕΚΦΕ Κέντρου Απομόνωση Απομόνωση DNA DNA ΕΚΦΕ Τούμπας ΕΚΦΕ Τούμπας

4. Δράση του NaCI

Τα ιόντα Να+ εξουδετερώνουν τις αρνητικά φορτισμένες φωσφορικές ομάδες του DNA, που θα οδηγούσαν στην αποδιάταξη του δίκλωνου DNA

Επιτρέπει τους κλώνους του DNA να παραμείνουν ενωμένοι και τα διαχωρίζει από τις πρωτεΐνες που και αυτές απελευθερώνονται κατά την λύση των κυττάρων

ΕΚΦΕ Κέντρου ΕΚΦΕ Κέντρου Απομόνωση Απομόνωση DNA DNA ΕΚΦΕ Τούμπας ΕΚΦΕ Τούμπας

H ΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΕΝΖΥΜΩΝ

Η χρήση των ενζύμων έχει σαν στόχο: τη προστασία του DNA από τις νουκλεάσες του

κυτταροπλάσματος που μπορούν να προκαλέσουν την αλλοίωση του (ολόκληρες αλυσίδες )

την απελευθέρωση του DNA από τις πρωτεΐνες με τις οποίες είναι συνδεδεμένο π.χ. ιστόνες (καθαρό δείγμα)

ΕΚΦΕ Κέντρου ΕΚΦΕ Κέντρου Απομόνωση Απομόνωση DNA DNA ΕΚΦΕ Τούμπας ΕΚΦΕ Τούμπας

φρέσκος χυμός ανανά ο οποίος περιέχει την πρωτεϊνάση Βromelain

ή ενζυμικό διάλυμα καθαρισμού φακών

επαφής που περιέχει Σουμπλισίνη Α και παγκρεατίνη

ΕΚΦΕ Κέντρου ΕΚΦΕ Κέντρου Απομόνωση Απομόνωση DNA DNA ΕΚΦΕ Τούμπας ΕΚΦΕ Τούμπας

Εναλλακτικά αντί για πεψίνη μπορεί να χρησιμοποιηθεί:

5. Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΑΛΚΟΟΛΗΣ

Η αλκοόλη έχει μικρότερη πυκνότητα από το νερό και γι’ αυτό παραμένει πάνω από

τη φάση του μίγματος

ΕΚΦΕ Κέντρου ΕΚΦΕ Κέντρου Απομόνωση Απομόνωση DNA DNA ΕΚΦΕ Τούμπας ΕΚΦΕ Τούμπας

ΤΟ DNA ΕΙΝΑΙ ΑΣΘΕΝΕΣ ΟΞΥ (PH ~ 6,2-6,8)

Τοποθέτησε το DNA σε ύαλο ωρολογίου

• Πρόσθεσε 2-3 σταγόνες δείκτη μπλε της βρωμοθυμόλης

• Παρατήρεισε αλλαγή χρώματος από μπλε (ΡΗ =7,6) σε κίτρινο (ΡΗ~ 6)

Αυτό συμβαίνει λόγω ιονισμού του ασθενούς νουκλεϊκού οξέος

ΕΚΦΕ Κέντρου ΕΚΦΕ Κέντρου Απομόνωση Απομόνωση DNA DNA ΕΚΦΕ Τούμπας ΕΚΦΕ Τούμπας

ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ

Το δείγμα που έχεις συλλέξει μπορεί να διατηρηθεί σε διάλυμα αιθανόλης 70ο ή 95ο στο ψυγείο για μεγάλο χρονικό διάστημα, για περαιτέρω έρευνα

Πως θα μπορούσα να χρησιμοποιήσω το δείγμα μου;

ΕΚΦΕ Κέντρου ΕΚΦΕ Κέντρου Απομόνωση Απομόνωση DNA DNA ΕΚΦΕ Τούμπας ΕΚΦΕ Τούμπας

ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ

Εικόνα από μικροσκόπιο αντίθετης φάσης

ΕΚΦΕ Κέντρου ΕΚΦΕ Κέντρου Απομόνωση Απομόνωση DNA DNA ΕΚΦΕ Τούμπας ΕΚΦΕ Τούμπας

Επαναδιαλύω το δείγμα DNA /RNA σε διάλυμα NaCl 5% κ.β

Παρατηρώ στο μικροσκόπιο τις ίνες των νουκλεϊνικών οξέων σε μία σταγόνα κυανού του μεθυλενίου ή lugol

ΤΟ DNA ΕΙΝΑΙ ΑΣΘΕΝΕΣ ΟΞΥ

• Τοποθετήστε το DNA σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα του περιλαμβάνει περίπου 15 ml διαλύματος 5% NaCl.

• Προσθέστε 5 σταγόνες δείκτη ερυθρού της φαινόλης σε αυτό το δοκιμαστικό σωλήνα. Καταγράψτε τις παρατηρήσεις σας.

ΕΚΦΕ Κέντρου ΕΚΦΕ Κέντρου Απομόνωση Απομόνωση DNA DNA ΕΚΦΕ Τούμπας ΕΚΦΕ Τούμπας