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2
INDICE
INDICE DELLE FIGURE ............................................................................................................. 4
INDICE DELLE TABELLE .......................................................................................................... 5
GLOSSARIO ................................................................................................................................... 5
RIASSUNTO ................................................................................................................................... 7
SUMMARY ..................................................................................................................................... 8
I. INTRODUZIONE ....................................................................................................................... 9
I.1. LADENOCARCINOMA PROSTATICO ............................................................................... 9
-LA PROSTATA: Struttura, Organizzazione e Funzione ................................................................... 9
-IL CARCINOMA PROSTATICO ................................................................................................... 12
-EPIDEMIOLOGIA ........................................................................................................................... 12
-SVILUPPO E PROGRESSIONE DEL CARCINOMA PROSTATICO ......................................... 12
-PATOLOGIA MOLECOLARE DELLADENOMA PROSTATICO ............................................ 15
-REGOLATORI DEL CICLO CELLULARE E ONCOGENESI DEL CARCINOMA
PROSTATICO ................................................................................................................................... 18
-ANOIKIS E METASTASI ............................................................................................................... 21
-SCREENING DEL CARCINOMA PROSTATICO ........................................................................ 25
-ESAMI DI LABORATORIO DIAGNOSTICI ................................................................................ 26
-DOSAGGIO DEL PSA, STADIAZIONE E CLASSIFICAZIONE ................................................ 26
-FARMACI DEMETILANTI ............................................................................................................ 30
I.2. SILENZIAMENTO EPIGENETICO ...................................................................................... 33
-LEPIGENETICA............................................................................................................................. 33
-MECCANISMI DI REGOLAZIONE EPIGENETICA ................................................................... 34
-METILAZIONE DEL DNA ............................................................................................................. 34
-MODIFICAZIONI COVALENTI DEGLI ISTONI ......................................................................... 35
-ALTERAZIONI DELLA METILAZIONE DEL DNA NEL CANCRO ......................................... 37
I.3. I microRNA ................................................................................................................................ 40
-I microRNA ...................................................................................................................................... 40
-LA BIOSINTESI DEI microRNA .................................................................................................... 41
-MECCANISMO DAZIONE E IL RUOLO MULTIFUNZIONALE DEI microRNA ................... 44
-MicroRNA E CANCRO ................................................................................................................... 46
-MicroRNA ONCOSOPPRESSORI .................................................................................................. 48
-MicroRNA ONCOGENI .................................................................................................................. 51
II. OBIETTIVO DELLA TESI .................................................................................................... 55
III. MATERIALI E METODI ..................................................................................................... 56
-COLTURE CELLULARI, TRATTAMENTO 5-aza-2-deossicitidina (Decitabina) E PROFILO DI
ESPRESSIONE DEI miRNA ............................................................................................................ 56
-ESTRAZIONE E CONVERSIONE BISULFITICA DEL DNA GENOMICO............................... 57
-METHYLATION SPECIFIC PCR (MSP) NELLE LINEE CELLULARI ....................................... 59
-PROFILO DI ESPRESSIONE DI miR-132 IN CAMPIONI CLINICI DAL DATASET TAYLOR
............................................................................................................................................................ 61
-METHYLATION ANALYSIS ED ESTRAZIONE DELLRNA DA 74 CAMPIONI FFPE ......... 61
-RETROTRASCRIZIONE E REAL TIME PCR (RT-qPCR) .......................................................... 63
-EFFETTI BIOLOGICI DI miR-132 SULLE CELLULE PC3 (citometria a flusso, analisi della
curva di crescita e della citotossicit) ................................................................................................ 63
-IMMUNOBLOTTING ..................................................................................................................... 64
-LUCIFERASI ASSAY E COSTRUTTI ........................................................................................... 64
-DATABASE BIOINFORMATICI ................................................................................................... 65
IV. RISULTATI ............................................................................................................................ 66
-SCREENING DEI miRNAs EPIGENETICAMENTE SILENZIATI NEL PCa ............................. 66
3
-LESPRESSIONE DI miR-132 E LA METILAZIONE DELLE CpG ISLANDS E CORRELATA
CON VARIABILI CLINICHE E PATOLOGICHE .......................................................................... 78
-miR-132 EVOCA LA MORTE CELLULARE TRAMITE LANOIKIS ........................................ 83
-HB-EGF E TALIN2 SONO I TARGET DIRETTI DI miR-132 ..................................................... 86
V. DISCUSSIONE ......................................................................................................................... 91
-IL TRATTAMENTO CON AZA DELLE CELLULE PCa RIVELA UNA CERTA QUANTITA
DI DATI INFORMATIVI ................................................................................................................ 91
-LA METILAZIONE CANCRO-SPECIFICA DEI miRNA NELLE LINEE CELLULARI DI PCa
............................................................................................................................................................ 93
-CORRELAZIONE DELLA METILAZIONE DEI miRNA NELLE LINEE CELLULARI DI PCa
CON I CASI DI PAZIENTI AFFETTI DA PCa ............................................................................... 94
-RILEVANZA CLINICA DELLESPRESSIONE E DELLA METILAZIONE DI miR-132.......... 95
-IL RUOLO BIOLOGICO DELLA FUNZIONE DI miR-132 NELLE CELLULE PC3 ................. 97
V. CONCLUSIONE ...................................................................................................................... 99
VI. BIBLIOGRAFIA .................................................................................................................. 100
VII. PUBBLICAZIONI .............................................................................................................. 122
VIII. PROGRAMMI DI RICERCA NAZIONALI E INTERNAZIONALI ......................... 123
IX. PARTECIPAZIONI A CONGRESSI (ABSTRACT) ....................................................... 124
X. RINGRAZIAMENTI ............................................................................................................. 128
4
INDICE DELLE FIGURE
Figura 1. Anatomia della prostata.. ...................................................................................................... 9
Figura 2. Anatomia della prostata: Le tre zone anatomiche .............................................................. 10
Figura 3. Anatomia della prostata: Tessuto Epiteliale Prostatico ...................................................... 10
Figura 4. Organizzazione Istologica della ghiandola prostatica. ....................................................... 11
Figura 5. Stadi evolutivi di un carcinoma prostatico ......................................................................... 13
Figura 6. Le vie di trasduzione del segnale del recettore degli androgeni nello sviluppo del cancro
della prostata. ............................................................................................................................. 14
Figura 7. Pathway Molecolare nello sviluppo del cancro della prostata ........................................... 17
Figura 8. La regolazione del ciclo cellulare. ...................................................................................... 19
Figura 9. Modello di tumorigenesi ..................................................................................................... 22
Figura 10. Pathway di sopravvivenza Adesione mediato ECM-integrina. ...................................... 23
Figura 11. Modello del Pathway estrinseco ed intrinseco dellapoptosi............................................ 24
Figura 12. Il Pathway estrinseco dellapoptosi .................................................................................. 25
Figura 13. Dosaggio del PSA ............................................................................................................. 27
Figura 14. Diagnosi istologica di Cancro della Prostata con i gradi di Gleason associati. ................ 28
Figura 15. Struttura dellAzacitidina e della Decitabina. ................................................................... 31
Figura 16. Sintesi della Decitabina .................................................................................................... 32
Figura 17. Alterazioni della metilazione nel cancro. ......................................................................... 39
Figura 18. La biogenesi dei microRNA ............................................................................................. 42
Figura 19. Struttura dellRNasi di tipoIII Dicer. ................................................................................ 43
Figura 20. Struttura delle proteine Argonauta ................................................................................... 44
Figura 21. I microRNA oncosoppressori e oncogeni ......................................................................... 48
Figura 22. Schematica rappresentazione dei miR coinvolti nel cancro della prostata. ...................... 50
Figura 23. Target del pathway apoptotico nel cancro della prostata. ................................................ 54
Figura 24. La conversione bisulfidica delle citosine non-metilate ad uracile. ................................... 58
Figura 25. Schema di Lavoro: screening miRNA............................................................................. 66
Figura 26. Identificazione dei miRNA metilati nelle linee cellulari di PCa trattate con il farmaco 5-
aza-2-deossicitidina (AZA) usando il miRNAome megaplex stemloop RT-qPCR. .................. 76
Figura 27. Lespressione del miR-132 correlata con variabili cliniche in 111 campioni di cancro
della prostata (Taylor dataset) .................................................................................................... 78
Figura 28. Analisi di espressione e metilazione del miR-132 in 50 campioni di cancro FFPE. ........ 80
Figura 29. Validit dellespressione di miR-132 nelle linee cellulari PC3 ........................................ 82
Figura 30. Analisi del ciclo cellulare delle linee cellulari PC3 trasfettate con le sequenze scrambled
o premiR-132 a 72h.................................................................................................................... 83
Figura 31. Lespressione successiva di miR-132 nelle cellule PC3 induce il distacco seguito dalla
morte cellulare ............................................................................................................................ 85
Figura 32. HB-EGF e TALIN2 target del miR-132 nelle cellule PC3. ............................................. 89
5
INDICE DELLE TABELLE
Tabella 1. Classificazione e stadiazione del tumore della prostata tramite il sistema TNM. ............ 30
Tabella 2. Sequenze di Primers usate in questo studio ...................................................................... 60
Tabella 3. Incidenza del Tumore Prostatico nei pazienti analizzati ................................................... 62
Tabella 4. MiRNA con unaumentata espressione ( 2 fold) dopo trattamento con 5-aza-2
deossicitidina nelle linee cellulari prostatiche. .......................................................................... 67
Tabella 5. Selezione e screening di candidati miRNA nelle linee cellulari tramite Megaplex
stemloop RT-PreAMP-qPCR: miRNA upregulati dallAZA 2 fold nelle linee tumorali ed
aventi CpG island entro 10kb a monte del loro TSS .................................................................. 71
Tabella 6. 38 miRNAs selezionati per lanalisi della metilazione tramite MSP nelle linee cellulari
prostatiche (tumorali e normali) ................................................................................................. 74
Tabella 7. Correlazione tra lespressione del miR-132 con il KEGG-pathway signature. ................ 87
GLOSSARIO
Anoikis Il distacco delle cellule dalla matrice extracellulare seguita dalla morte
cellulare
AR Recettore degli androgeni
AZA 5-aza-2-deoxycytidine
BH3 Bcl-2 homology 3
BIC B-cell integration cluster
CDKs Chinasi ciclina-dipendenti
CGH Ibridazione genomica comparativa
CKI Inibitori delle chinasi ciclina-dipendenti
CLL Leucemia linfocitica cronica delle cellule B
Ctrl Controllo
CZ Regione centrale della ghiandola prostatica
DNMTs DNA metiltransferasi
ECM Matrice extracellulare
EGF Fattore di crescita epidermico
Exp5 RAN-GTPasi Esportina 5
FISH Ibridazione in situ per fluorescenza
Fluoresceina DA Fluoresceina diacetato
FFPE Tessuti fissati in formalina e paraffina
FRA Regioni comuni di rottura e Siti fragili dei cromosomi
Fw Primer forward
GSTP1 Glutatione-S-transferasi
HATs Istone acetiltransferasi
HB-EGF Heparin-binding epidermal growth factor
HDACs Istone-deacetilasi
HDMs Istone demetiltransferasi
HPV Papilloma virus umano
6
HSO3- Ione sodico bisolfito
IGF-1 Fattore di crescita dell insulina simile
CpG islands/ Isole CpG Aggregati di regioni ricche in GC che precedono molti geni trascritti
di vertebrati
LCM Laser-capture microdissection
LDH Lattato deidrogenasi
LOH Loss of heterozigosity
LOI Perdita dellimprinting
M Primers Metilati
5me 5-metilcitosina
microRNA/miRNA Una classe di RNA non codificanti coinvolti nella regolazione
dellespressione genica
mRNA RNA messaggeri
MSP Methylation specific PCR
N Tessuto normale
ncRNAs small non-coding RNAs
NA Not available
NE Cellule neuroendocrine
PCa Carcinoma della prostata
PCA3 Prostate gene3
PET-CT Colina Positron Emission Tomography- computed tomography
PI Ioduro di propidio
PI3-K Fosfoinositol 3 chinasi B
PIA Atrofia infiammatoria prostatica
PIN Lesione intraepiteliale
PolII RNA polimerasi II
PSA Prostate specific antigen
PTEN Phosphatase and tensin homologue
PZ Regione periferica della ghiandola prostatica
Rb Oncosoppressore retinoblastoma
RISC RNA induced-silencing complex Rv Primer riverse
RU Unit relative
SAM S-adenosil-L-metionina
SIRT1 Sirtuina istone deacetilasi di classe III
SnoRNA small nucleolar RNA
T Tumorale
TNM Tumore primario, metastasi linfo-nodale e metastasi ad altri organi
TRAIL-R Recettore di morte cellulare
TRUS Transrectal Ultrasound Sonography
TZ Regione di transizione della ghiandola prostatica
U Primers Non Metilati
3UTR Regioni non tradotte al 3
7
RIASSUNTO
LEpigenetica lo studio dei meccanismi responsabili di cambiamenti ereditabili nelle funzioni del
genoma senza alcuna modificazione nella sequenza del DNA. Parte dellepigenoma coinvolto
nella metilazione delle citosine in regioni ricche di dinucleotidi CpG chiamate isole CpG oppure
CpG islands. Le isole CpG sono localizzate nel promotore e la loro metilazione inibisce la
trascrizione genica a valle.
Nelle cellule tumorali la metilazione aberrante del promotore determina la diminuzione
dellespressione endogena di una piccola classe di RNA chiamati microRNA (o miRNA). I
microRNA inibiscono la traduzione dellmRNA per regolare il network cellulare. Nel cancro alla
prostata, la diminuzione dellespressione dei microRNA potrebbe contribuire allinizio e allo
sviluppo del cancro, e la causa potrebbe essere lipermetilazione del loro promotore.
Per analizzare il ruolo del silenziamento epigenetico dei microRNA attraverso la metilazione del
DNA nel cancro alla prostata, le cellule normali (PrEC) e tumorali (PC3, DU145 e LNCaP) sono
state trattate con il farmaco demetilante 5-aza-2-deoxycytidine (AZA), inseguito sono stati
determinati i cambiamenti despressione di 650 miRNA usando la megaplex stemloop RT-qPCR.
Dopo aver applicato unaccurata selezione stato analizzato il pattern di metilazione delle isole
CpG a monte di un set di microRNA tramite la methylation specific PCR (MSP). Le isole CpG di
miR-18b, miR-132, miR-34b/c, miR-148a, miR-450a and miR-542-3p mostrano un pattern di
metilazione congruente con la loro variazione di espressione in risposta allAZA.
Lanalisi di metilazione di queste isole CpG in un pannello di 50 campioni umani di cancro alla
prostata e 24 campioni di controllo normali hanno mostrato che miR-132 metilato nel 42% dei
tessuti umani di cancro in modo positivamente correlato al Gleason score e alla stadiazione
patologica.
Lanalisi di espressione di miR-132 nel nostro pannello di tessuti ha confermato la sua diminuzione
di espressione tramite la metilazione nel tumore. La ri-espressione di miR-132 nelle cellule PC3 ha
indotto il distacco delle cellule dalla matrice extracellulare seguita dalla morte cellulare (anoikis).
Due proteine coinvolte nelladesione cellulare [heparin-binding epidermal growth factor (HB-EGF)
e Talin2] sono state confermate come target diretti di miR-132.
Questi risultati dimostrano che mir-132 un microRNA la cui diminuzione di espressione
correlata con la metilazione ed ha un ruolo anti-metastatico nel cancro alla prostata controllando
ladesione cellulare. Inoltre, lespressione di miR-132 o la metilazione delle isole CpG pu essere
utilizzato come un biomarcatore per la progressione del tumore prostatico e come potenziale
strategia terapeutica per il tumore della prostata ad uno stadio avanzato.
8
SUMMARY
Epigenetic refers to heritable changes in gene expression not involving the DNA sequence. Part of
the epigenome involves the methylation of cytosine in regions rich of CpG dinucleotides
calledCpG islands.
The CpG islands are placed at the promoter regions and their methylation silenced the downstream
gene transcription.
In cancer aberrant promoter methylation has begun to explain the deregulated expression of small,
endogenous RNAs called microRNA (or miRNA). MicroRNAs inhibit mRNA translation to fine
tune gene network. In prostate cancer, the downregulation of microRNAs may contribute to cancer
initiation and development, and the cause may be their promoter hypermethylation.
To screen for epigenetically silenced miRNAs in prostate cancer, prostate normal epithelial (PrEC)
and carcinoma cells (PC3, DU145 and LNCaP) were treated with the demethylation agent 5-aza-2-
deoxycytidine (AZA) and subsequently examined the expression changes of 650 miRNAs using
megaplex stemloop RT-qPCR.
After applying a selection strategy it was analyzed the methylation status of CpG islands upstream
a subset of miRNAs by methylation specific PCR (MSP). The CpG islands of miR-18b, miR-132,
miR-34b/c, miR-148a, miR-450a and miR-542-3p exhibited methylation patterns congruent with
their expression modulations in response to AZA.
Methylation analysis of these CpG islands in a panel of 50 human prostate carcinoma specimens
and 24 normal controls revealed miR-132 to be methylated in 42% of human cancer cases in a
positively manner correlated to total Gleason and tumor stage.
Expression analysis of miR-132 in our tissue panel confirmed its downregulation through
methylation in tumor. Re-expression of miR-132 in PC3 cells induced cell detachment followed by
cell death (anoikis).
Two proteins involved in cellular adhesion [heparin-binding epidermal growth factor (HB-EGF)
and Talin2] were confirmed as direct targets of miR-132.
These results demonstrate that miR-132 is a methylation-silenced miRNA with an antimetastatic
role in prostate cancer controlling cellular adhesion, furthermore taking into account the use of
miR-132 expression or CpG island methylation as a biomarker for PCa progression and its potential
therapeutic strategy for advanced PCa.
9
I. INTRODUZIONE
I.1. LADENOCARCINOMA PROSTATICO
LA PROSTATA: Struttura, Organizzazione e Funzione
La prostata una ghiandola tubolo-alveolare che si trova sotto la vescica e davanti al retto,
circondando il collo della vescica e luretra nella quale secerne parte del fluido che trasporta gli
spermatozoi durante leiaculazione (Fig.1).
Figura 1. Anatomia della prostata. Copyright 2004, 2000, 1995 by Elsevier Inc.
La ghiandola prostatica viene divisa in tre zone biologicamente e anatomicamente distinte: la
regione periferica (PZ), la centrale (CZ) e quella di transizione (TZ). (Fig.2)
10
Figura 2. Anatomia della prostata: Le tre zone anatomiche Copyright 2004, 2000, 1995 by Elsevier Inc.
Ciascuna di queste zone formata da una serie di dotti ed acini ghiandolari rivestiti da cellule
epiteliali. Lepitelio ghiandolare prostatico diviso in due strati: lo strato basale, vicino alla
membrana basale, e lo strato luminale costituito da cellule secretorie colonnari alte con nuclei basali
(Fig.3).
Figura 3. Anatomia della prostata: Tessuto Epiteliale Prostatico. Copyright 2004, 2000, 1995 by Elsevier Inc.
C. EPITELIALI BASALI C. COLONNARI SECRETORIE
C. NEUROENDOCRINE
STROMA
Circonda lepitelio
prostatico fibroblasti
m.liscio
11
Nello strato basale sono presenti le cellule staminali costituenti il compartimento proliferativo
dellepitelio prostatico; queste cellule androgeno-indipendenti danno origine ad un tipo cellulare
intermedio, le cellule di transizione pluripotenti e androgeno-responsive, che generano le cellule
secretorie differenziate e probabilmente anche le cellule neuroendocrine (Isaacs and Copffey,
1989).
Le cellule luminali, derivate da quelle di transizione, esprimono il recettore degli androgeni (AR) e
sono dipendenti dalla stimolazione ormonale per la loro vitalit e attivit secretoria; in assenza degli
androgeni esse vanno incontro ad apoptosi (Isaacs, 1999).
Lepitelio ghiandolare circondato da una membrana basale che lo separa dallo stroma
fibromuscolare contenente cellule muscolari AR-positive, fibroblasti, nervi, linfociti, e macrofagi
infiltrati ed una rete vascolare capillare (Fig. 4).
Figura 4. Organizzazione Istologica della ghiandola prostatica.
Sono mostrate le cellule epiteliali dello strato basale e dello strato secretorio, le cellule neuroendocrine (NE) e la
componente stromale allinterno del quale si trovano terminazioni neuronali e vasi sanguigni. Si noti che non vi sono
vasi allinterno del compartimento epiteliale.
12
IL CARCINOMA PROSTATICO
EPIDEMIOLOGIA
Il carcinoma della prostata (PCa) nel mondo occidentale la pi frequente neoplasia maschile e
rappresenta la seconda causa di morte per neoplasia dopo il tumore del polmone (Cookson, 2001).
Le cause principali dello sviluppo del cancro prostatico sono probabilmente riconducibili a fattori
ambientali e genetici. Il tumore della prostata tipicamente una malattia degli uomini di et
superiore ai 50 anni, essendo il 75% della diagnosi associato ad individui con et superiore ai 65
anni (Breslow et al., 1977). Esiste anche una ben nota correlazione fra lincidenza di tale neoplasia
e differenze etniche e geografiche (Albani et al., 2009). Il cancro della prostata, molto raro nella
popolazione asiatica il cui tasso di mortalit pari alla met rispetto a quello dei caucasici, risulta
essere al contrario molto frequente nella popolazione afro-americana. Tra i fattori di rischio
probabilmente coinvolti nello sviluppo del carcinoma prostatico possono essere annoverati: obesit,
peso corporeo, diete ricche di grassi, fumo di sigaretta, livelli elevati di androgeni, ridotto apporto
di vitamina E, vitamina D e selenio, agenti infettivi trasmessi sessualmente e alterazioni genetiche.
SVILUPPO E PROGRESSIONE DEL CARCINOMA PROSTATICO
Sebbene sia chiaro che il carcinoma della prostata origini dal compartimento epiteliale,
lidentificazione dello specifico sottotipo cellulare (androgeno dipendente, sensibile o indipendente)
da cui origina il carcinoma non ancora chiaro. Il modello tuttoggi accettato che in una delle
popolazioni epiteliali (cellule staminali basali, cellule di transizione o cellule luminali) una cellula
perda il controllo del proprio tasso di crescita originando un clone in attiva divisione che forma una
lesione intraepiteliale (PIN).
Latrofia infiammatoria prostatica (PIA) viene considerata uno stadio precursore del PIN essendo
solitamente osservata nella regione periferica della ghiandola prostatica in cui hanno origine la
maggior parte dei carcinomi prostatici, e presenta uninstabilit cromosomica molto simile a quella
osservata nel PIN e nelle cellule di carcinoma prostatico (Nelson et al., 2003).
Con laccumulo di alterazioni sempre maggiori, il PIN pu accrescersi fino a trasformarsi in un vero
e proprio adenocarcinoma prostatico.
Negli stadi iniziali il tumore prostatico confinato alla ghiandola, ed essendo generalmente
caratterizzato da cellule a crescita molto lenta (Berges et al., 1995) pu restare asintomatico e non
13
diagnosticato per anni. Successivamente, lacquisita capacit migratoria delle cellule tumorali
consente la loro diffusione anche in altri parti del corpo, portando alla formazione di metastasi
soprattutto a livello linfonodale ed osseo (Fig.5).
Figura 5. Stadi evolutivi di un carcinoma prostatico.
Pannello I: lesione intraepiteliale (PIN) di alto grado. Dal pannello II al pannello VI sono mostrati tumori differenziati
con grado di malignit (Gleason pattern) sempre pi elevato; si noti che con il progredire del tumore si perde sempre di
pi la distinzione tra i dotti e si osserva una fusione delle strutture ghiandolari. Pannello VII: carcinoma prostatico con
metastasi alle ossa. (Le sezioni istologiche sono colorate con ematossilina-eosina).
La caratteristica principale dello sviluppo del carcinoma prostatico rappresentato dalla
progressione dello stadio iniziale di crescita dipendente dagli androgeni (androgeno-dipendenza) a
quello avanzato, irreversibile, di refrattariet ormonale (androgeno-indipendenza).
Sebbene negli ultimi anni la ricerca abbia impiegato un notevole sforzo nel tentativo di individuare
le basi genetiche coinvolte in questo tipo di transizione, il meccanismo molecolare rimane ancora
scarsamente conosciuto. Il recettore degli androgeni (AR) riveste sicuramente un ruolo
fondamentale nella progressione del carcinoma prostatico, essendo la sua attivazione essenziale per
le fasi iniziali della crescita tumorale. Infatti la terapia ormonale basata sulla deprivazione dagli
androgeni attraverso castrazione chirurgica o chimica produce una sensibile regressione del tumore
causata dallinduzione dellapoptosi nelle cellule ormone-responsive (Scott et al., 1980; Denmeade
et al., 1996; Denmeade and Isaacs, 1996).
Sfortunatamente, per, la terapia ormonale diventa inefficace e la regressione del tumore quindi
solo transiente, quando, inevitabilmente, le cellule neoplastiche iniziano a dividersi in modo
indipendente dallazione degli androgeni. Numerose evidenze suggeriscono un ruolo determinante
del recettore degli androgeni anche durante lo stadio di androgeno-indipendenza. Questa teoria
supportata dal fatto che linespressione e linattivazione di tali recettori sono state riscontrate nella
maggior parte dei carcinomi androgeno-indipendenti. Inoltre, a carico di questi stessi recettori
14
risultano essere presenti una serie di alterazioni raramente osservate nei tumori androgeno-
dipendenti.
Questi cambiamenti che comprendono mutazioni puntiformi e variazioni nellespressione di
proteine coregolatrici, convergono verso lidentificazione di un recettore degli androgeni che in
grado di rispondere sia a basse concentrazioni di androgeni che ad un gran numero di ligandi
agonisti (Taplin and Balk, 2004).
Sembra inoltre evidente che in questo stadio avanzato i recettori degli androgeni possano essere
attivati in maniera ligando-indipendente da fattori di crescita o citochine come ad esempio il fattore
di crescita dell insulina simile (IGF-1), il fattore di crescita epidermico (EGF) e le interleuchine 1
e 6 ( Taplin and Balk, 2004; Ueda et al., 2002; Lattouf et al., 2006a) (Fig.6).
Figura 6. Le vie di trasduzione del segnale del recettore degli androgeni nello sviluppo del cancro della prostata.
( Lattouf et al., 2006a Nature Clinical Practice Urology).
Linsorgere di tutte queste alterazioni a carico dei recettori degli androgeni produce da parte delle
cellule tumorali una risposta in termini di crescita alternativa o dipendente dagli androgeni,
rendendo la terapia ormonale inefficace.
La conseguenza naturale al fallimento di tale terapia viene rappresentata dalla prostatectomia
radicale con le sue ovvie ripercussioni a livello psicologico sul paziente.
15
In ambito scientifico quindi cresciuta lattenzione verso alternative terapeutiche che consentono di
debellare il tumore con complicazioni ed effetti collaterali minori (Lattouf et al., 2006b).
Esistono almeno tre possibili approcci per cercare di bloccare la crescita delle cellule tumorali a
prescindere dalla loro dipendenza dagli androgeni.
Il primo stimolare il sistema immunitario dellospite ad indurre una risposta citotossica
antitumorale (Morris and Scher, 2002); il secondo bloccare farmacologicamente le vie di
trasduzione del segnale intracellulare al fine di inibire la sintesi del DNA e quindi il ciclo cellulare
delle cellule neoplastiche (si veda la completa review di Morris and Scher, 2000); il terzo approccio
bloccare la neo-angiogenesi tumorale, ossia la formazione dei nuovi vasi sanguigni a partire da
vasi pre-esistenti, necessaria allo sviluppo di tutti i tumori solidi tra cui anche il tumore della
prostata (Jimenez et al., 2006).
PATOLOGIA MOLECOLARE DELLADENOMA PROSTATICO
Come stato precedentemente accennato, tra i fattori di rischio per la progressione del tumore
prostatico spicca una gran variet di alterazioni genetiche che, associata alla componente
epigenetica ed ambientale, fornisce le basi essenziali per lo sviluppo di tale neoplasia.
Lindividuazione dei polimorfismi genetici associati a questa malattia potrebbe rappresentare un
passo importante nella comprensione dei pathway molecolari coinvolti nel processo di
carcinogenesi della prostata, ed allo stesso tempo gettare le basi per lo sviluppo futuro di nuove
applicazioni cliniche.
Sebbene nella ricerca biomolecolare la recente diffusione di nuove metodologie scientifiche (come
la tecnica del microarray o le applicazioni di proteomica) abbia contribuito enormemente alla
comprensione della funzione di proteine coinvolte nella biologia tumorale, risulta ancora molto
difficile individuare e classificare quelle alterazioni genetiche che caratterizzano in maniera
specifica il carcinoma prostatico.
Questo sembra essere in parte dovuto alla marcata eterogeneit e alla natura multifocale di questa
specifica neoplasia (Konishi et al., 2005).
Morfologicamente, infatti, il carcinoma della prostata presenta non solo una sensibile eterogeneit
del grado istologico nei singoli tumori, ma anche unistogenesi multifocale dello stesso organo
prostatico.
In alcuni casi questa eterogeneit potrebbe essere il risultato di una tumorigenesi multifocale
originata da tumori multifocali di vario grado, che con il passare del tempo si fondono a formare
una lesione unica (Konishi et al., 2005).
16
Per questo motivo anche molto complicato distinguere a livello molecolare le forme di carcinoma
ereditarie da quelle sporadiche.
Il numero dei loci genetici coinvolti nella carcinogenesi prostatica sembra essere molto ampio.
Approcci citogenetici di ibridazione in situ per fluorescenza (FISH) o di ibridazione genomica
comparativa (CGH) hanno rivelato una serie consistente di anomalie cromosomiche che alterano
linespressione di geni correlati con la progressione e lo sviluppo del tumore.
Limitate sono le informazioni relative al coinvolgimento di oncogeni nel carcinoma prostatico; fra
questi spiccano c-myc, ras, c-ErbB-2, Bcl-2.
Linespressione del noto attivatore trascrizionale c-myc stata correlata con il grado di Gleason del
tumore, mentre quella della proteina antiapoptotica Bcl-2 presente in circa met dei tumori ed in
particolare in quelli androgeno-indipendenti e metastatici (McDonnel et al., 1992).
Al contrario, sembrano essere molto numerose le evidenze sul coinvolgimento di oncosoppressori,
il cui prodotto genico pu essere alterato da mutazioni, delezioni, riarrangiamenti, ipermetilazione
dei promotori e aploinsufficienze.
Infatti, una delle pi comuni alterazioni genetiche di questa patologia riguarda proprio un
oncosoppressore, il gene per la glutatione-S-transferasi (GSTP1), la cui inattivazione causata
dallipermetilazione del suo promotore, stata riscontrata in pi del 90% dei casi (Millar et al.,
1999; Bernardini et al., 2004).
Anche in altri geni, le mutazioni germinali predispongono allo sviluppo della neoplasia; questi geni
sono: RNASEL (HCP1) localizzazione 1q25 e MSR1 localizzazione 8p22, definiti come geni di
suscettibilit (Cybulsky et al., 2007; Beuten et al., 2010).
La mancanza di espressione di PTEN (Phosphatase and tensin homologue) in linee cellulari di
carcinoma della prostata (Vlietstra et al., 1998) risulta essere spesso frequente anche nei carcinomi
associati a stadi di sviluppo avanzati (Suzuki et al., 1998; Vivanco et al., 2002).
Il gene per PTEN codifica per una fosfatasi che agisce da regolatore negativo della via di
trasduzione del segnale della fosfoinositol 3 chinasi B (PI3-K Akt) essenziale per la progressione
del ciclo cellulare e per il mantenimento della sopravvivenza cellulare (Sun et al., 1999; Jose et al.,
2004). (Fig.7).
17
Figura 7. Pathway Molecolare nello sviluppo del cancro della prostata. (Jose et al., 2004 N.Engl.J.Med.).
La perdita del braccio corto del cromosoma 8, che sembra essere un evento precoce della neoplasia
prostatica, causa la scomparsa delloncosoppressore NKX3.1.
Questa proteina, essenziale per il normale sviluppo dellorgano prostatico, assume un notevole
interesse perch in grado di legarsi al DNA ed aumentare lespressione del gene PSA (prostate
specific antigen) (Chen et al., 2002). La sua perdita, dunque, potrebbe essere coinvolta
nellincremento della concentrazione del PSA osservata nella progressione del tumore della
prostata.
Sebbene la letteratura presenti risultati contrastanti, sembrerebbe che anche il gene per
loncosoppressore retinoblastoma (Rb), la cui deregolazione stata associata con unampia variet
di carcinomi umani, possa giocare un ruolo importante nella carcinogenesi della prostata; infatti
stato recentemente dimostrato che in modelli di topi la sua inattivazione causa un incremento del
tasso proliferativi dellepitelio prostatico con un fenotipo assimilabile a quello della neoplasia
intraepiteliale prostatica (PIN) (Hill et al., 2005; Maddison et al., 2004).
E ormai noto che le mutazioni a carico di p53, il pi famoso degli oncosoppressori, siano rare nei
carcinomi primari, ma molto comuni nei tumori di alto grado associati a stadi avanzati dello
sviluppo come per esempio allandrogeno-indipendenza o alle metastasi ossee (Bookstein et al.,
1993; Dinjens et al., 1994).
18
REGOLATORI DEL CICLO CELLULARE E ONCOGENESI DEL
CARCINOMA PROSTATICO
Un ruolo chiave nella patogenesi prostatica svolto dallinterazione di proteine coinvolte nel ciclo
cellulare, soprattutto di quelle deputate alla regolazione dellazione delle chinasi ciclina-dipendenti
(CDKs). Queste ultime sono una famiglia di serin/treonin-chinasi che, fosforilando specifiche
proteine nucleari, assumono un ruolo centrale nel controllo ordinato della progressione tra le varie
fasi del ciclo cellulare (Pestell et al., 1999).
La loro attivit viene regolata mediante fosforilazione causata dallinterazione con subunit
regolatorie positive, meglio conosciute come cicline (Pestell et al., 1999; Sherr et al., 1996), o in
maniera negativa con gli inibitori delle chinasi ciclina-dipendenti (CKI) (Sherr et al., 1999) (Fig.8).
E stato osservato il coinvolgimento di alcune cicline nella progressione del carcinoma prostatico.
Per esempio, la ciclina di tipo D, coinvolta nella transizione dalla fase G1 alla fase S del ciclo
cellulare stata associata a tumori derivati da metastasi ossee (Drobnjak et al., 2000) e la sua
overespressione aumenta la crescita e la tumorigenicit della linea cellulare androgeno-dipendente
derivata da metastasi linfonodale LNCaP (Chen et al., 1998).
Recenti evidenze supportano anche il fatto che linnalzamento dei livelli della ciclina D1 causi,
mediante inibizione di CDK6, la sottoespressione del recettore degli androgeni e possa essere
dunque responsabile della resistenza alla terapia androgeno ablativa (Petre-Draviam et al., 2003;
Lim et al., 2005).
19
Figura 8. La regolazione del ciclo cellulare.
Per la progressione controllata nelle varie fasi del ciclo cellulare richiesta unassociazione coordinata fra le specifiche
cicline e le chinasi ciclina-dipendenti: il complesso ciclina D-CDK4/6 agisce nella fase G1, ciclina E-CDK2 e ciclina
A-CDK2 nella transizione tra G1 e la fase S, mentre ciclina A o B-CDK1 in quella G2/M (Sherr et al., 1996; Del Sal et
al., 1996).
Anche alcune alterazioni a livello degli inibitori delle chinasi ciclina-dipendenti (CKI) sono state
spesso associate con la neoplasia prostatica. Fra queste spiccano le mutazioni del gene CDKN2
(p16), riscontrate frequentemente in tumori metastatici (Jarrad et al.,1997; Gu et al., 1998), e quelle
osservate in p21 (Gao et al., 1995), la cui espressione potrebbe essere coinvolta nella comparsa di
recidive (Aaltomaa et al., 1999); tuttavia le pi interessanti nello studio della biologia tumorale
risultano essere quelle correlate allespressione del gene CDKN1B, che codifica per p27 Kip1.
Questultimo esercita la sua azione molecolare inibendo lattivit dei complessi delle chinasi
ciclina-dipendenti e con le cicline E ed A, regolando cos negativamente la transizione dalla fase G1
alla fase S del ciclo cellulare (Tsihlias et al., 1998).
I livelli di p27, normalmente abbondanti nelle cellule quiescenti, subiscono una rapida diminuzione
a seguito di stimoli fitogeni, causando lentrata nella fase S del ciclo cellulare.
Questa caratteristica conferisce a p27 un ruolo determinante nella regolazione della proliferazione
cellulare (Kiyokawa et al., 1996), del differenziamento (Casaccia-Boneffi et al., 1997) e della
trasformazione maligna (Nakayama et al., 1996).
20
Infatti, una diminuzione dei suoi livelli di espressione, che risulta in una perdita del normale tasso di
crescita cellulare, stata riscontrata in molti tipi di tumori, quali ad esempio quello della mammella,
quello gastrico, polmonare, esofageo e colorettale (Sgambato et al., 2000; Kawamata et al., 1995;
Slingerland and Pagano, 2000) rendendolo nella maggior parte dei casi un indicatore di prognosi
infausta.
La riduzione dei livelli di p27 stata pi volte associata alla neoplasia della prostata come ad
esempio nelliperplasia prostatica benigna, nella neoplasia intraepiteliale prostatica e nel carcinoma
prostatico conclamato (Yang et al., 1998), ed stata correlata con il fallimento della terapia
antiormonale, con un elevato grado del punteggio di Gleason e con uno stadio aggressivo di
metastatizzazione (Yang et al., 1998; Lloyd et al., 1999).
Tutte queste evidenze hanno suggerito un possibile ruolo di p27 come marcatore molecolare di
cancro prostatico maligno (Tsihlias et al., 1999).
Le mutazioni a carico del gene p27 sono per molto rare: ci sono scarse evidenze sulla perdita di
espressione per delezione della regione cromosomiale 12p12-3 su cui il gene stesso mappa, ma
invece ormai accertato che la regolazione dei suoi livelli di espressione sia principalmente dovuta
allazione di meccanismi post-trascrizionali (Loda et al., 1997).
Fra questi, fino ad oggi, il pi caratterizzato risulta essere quello della degradazione mediata dal
proteasoma, che fortemente acceso in molti tipi di cancro (Alkarain et al., 2004) per opera
dellinattivazione oncogenica di vari recettori tirosin-chinasici e di vie di trasduzione del segnale.
La proteolisi di p27 sembra comprendere due meccanismi dazione temporalmente coordinati fra
loro, che agiscono insieme nel promuovere la scomparsa di p27 richiesta per lentrata in fase S del
ciclo cellulare (Alkarain et al., 2004). Il primo dei due inizia ad agire in risposta a stimoli mitogeni
nelle fasi iniziali di G1, causando, tramite fosforilazione di un residuo serinico specifico (Ser10) di
p27, la degradazione mediata dallesportazione della proteina stessa nel citoplasma (Bohem et al.,
2002).
Di conseguenza, il risultante abbassamento dei livelli intranucleari di p27 causa un ovvio
incremento di attivazione del complesso E-CDK2. Questultimo a sua volta agisce nella fase tardiva
di G1 ed in S, fosforilando lo specifico residuo treoninico 187 di p27, permettendone il
riconoscimento da parte del complesso multifattoriale SCF che media lubiquitinazione e la
degradazione da parte del proteasoma 26S (Sheaff et al., 1997; Vlach et al., 1997; Pagano et al.,
1995; Ganoth et al., 2001).
21
ANOIKIS E METASTASI
La comunit scientifica in questi anni ha investito notevoli risorse a favore del progresso della
ricerca oncologica trovando cure giuste per il cancro attraverso strumenti davanguardia.
Nella lotta contro il cancro si cominciano a raccogliere i primi frutti, grazie alla campagna di
prevenzione e lintroduzione di cure pi efficaci anche da un punto di vista farmacologico: ad oggi
sono stati identificati centinaia di oncogeni e soppressori tumorali con un profilo di espressione
cancro-specifico. Tuttavia trattamenti attraverso singole molecole target (target therapy) fanno
fronte ad un sofisticato background di processi aberranti inerenti ad un complicato ed ingegnoso
network cellulare con lattivazione di pathway di sopravvivenza che evolvono di anno in anno.
La Figura 9 illustra il processo di tumorigenesi. Le caratteristiche fenotipiche di una cellula
tumorale differiscono in molti aspetti da una cellula normale, ed ogni aspetto ha un proprio
meccanismo legato a diverse molecole che subiscono cambiamenti di espressione coinvolti nella
sopravvivenza tumorale. In confronto ad una cellula normale, la cellula tumorale ha una migliore
capacit di migrazione, di proliferazione, di produrre metastasi e pertanto elevata efficienza di
invasione e di sopravvivenza.
Le cellule metastatiche evadono da un certo tipo di morte cellulare presente in tutte le cellule del
tessuto solido innescato dal distacco dalla loro matrice, chiamato anoikis.
Il 90% delle morti dovute a tumore il risultato di metastasi dove le cellule tumorali si distaccano
dal loro sito di origine e crescono in una gamma prevedibile di organi bersaglio dipendente
dallorgano cui il tumore inizialmente si sviluppato (Cooper and Pienta, 2000; Weigelt et al.,
2005; Yilmaz and Christofori, 2009).
Il processo include molti passaggi come la degradazione della matrice extracellulare, migrazione
cellulare, ancoraggio-indipendente dalla crescita, evasione dal processo apoptotico, angiogenesi,
invasione dei tessuti circostanti, adesione cellulare, movimento e colonizzazione di siti distanti
(Sakamoto and Kyprianou, 2010).
22
Figura 9. Modello di tumorigenesi. Freimuth et al., 2009.
Anoikis una parola di derivazione greca coniata da Frisch e Francis in un articolo pubblicato nel
Journal of Cell Biology nel 1994 (Frisch and Francis, 1994) che significa letteralmente lo stato di
essere senza casa per descrivere la risposta apoptotica delle cellule causata dallassenza di
interazioni cellula-matrice. E una forma di morte cellulare programmata che indotta da cellule
ancoraggio-dipendenti con conseguente distacco dalla matrice extracellulare (ECM). Di solito le
cellule stanno vicino al tessuto a cui appartengono in quanto la comunicazione tra le cellule
prossimali, come pure tra cellule ed ECM fornisce segnali essenziali per la crescita o la
sopravvivenza. Le cellule tumorali possono controllare i pathways anoikis-dipendenti come il
pathway estrinseco ed il pathway di sopravvivenza cellulare ECM-integrina (Frisch and Rouslahti,
1997; Frisch and Screaton, 2001; Sakamoto and Kyprianou, 2010).
In un microambiente sano, le cellule epiteliali si distaccano dalla loro matrice e vanno incontro ad
anoikis, ma la loro omeostasi inalterata (Frisch and Francis, 1994).
23
La Figura 10 mostra lattivazione del pathway di sopravvivenza cellulare adesione-dipendente
mediato dallinterazione dellintegrina con lECM e la conseguente attivazione di Talin1, FAK/SRC
e ILK-1.
Lattivazione di ILK-1 determina la fosforilazione di GSK3, il reclutamento di Snail e
lattivazione di segnali di sopravvivenza cellulare tramite PI3K/AKT. La perdita dei segnali di
sopravvivenza causata dal distacco sensibilizza le cellule allapoptosi.
Figura 10. Pathway di sopravvivenza Adesione mediato ECM-integrina.
Ricreato da Sakamoto e Kyprianou, 2010.
Il distacco cellulare come lo stimolo di morte rappresenta lunico aspetto dell anoikis, in quanto il
conseguente meccanismo di morte risulta da una comune apoptosi, in molti casi dal pathway
estrinseco di morte (Pellegrini and Stasser, 2000; Sakamoto and Kyprianou, 2010).
La Figura 11 semplifica i due pathway di apoptosi, mentre la Figura 12 illustra il pathway
estrinseco in grande dettaglio. Nel pathway intrinseco, alcuni stimoli come il danno del DNA, la
mancanza di fattori di crescita o fattori di stress cellulare attivano p53 oppure le proteine pro-
apoptotiche Bcl-2 homology 3 (BH3), provocando cos la permeabilizzazione della membrana
mitocondriale esterna ed il rilascio del citocromo c e Smac (Ziegler et al., 2008).
ECM
Pathway
24
In seguito, la Caspasi 9 si attiva, a cui segue lattivazione delleffettore delle caspasi 3 e 7 dando il
segnale per lapoptosi. Nel pathway estrinseco, lattivazione diretta del recettore di morte cellulare
(TRAIL-R) attraverso i ligandi come FAS, TRAIL e TNF determinano il reclutamento delle
proteine FADD e TRADD, lattivazione della caspasi 8 e/o caspasi 10, delleffettore della caspasi, a
cui segue la morte cellulare (Pellegrini and Stasser, 2000; Ziegler et al., 2008; Sakamoto and
Kyprianou, 2010).
Figura 11. Modello del Pathway estrinseco ed intrinseco dellapoptosi. Ziegler et al., 2008
25
Procaspasi 8
Caspasi 8
Attiva
Attivazione Effettori Delle Caspasi
APOPTOSI
Procaspasi 8
Caspasi 8
Attiva
Attivazione Effettori Delle Caspasi
APOPTOSI
Figura 12. Il Pathway estrinseco dellapoptosi. Ricreato da Pellegrini and Strasser, 2000.
SCREENING DEL CARCINOMA PROSTATICO
Il carcinoma della prostata insorge solitamente (80%) nella parte periferica della ghiandola, dando
cos ragione della scarsa incidenza di disturbi minzionali, anche quando la neoplasia raggiunge
volumi importanti. Al contrario, liperplasia prostatica benigna si sviluppa nella zona di transizione
della ghiandola (McNeal, 1978) e quindi si accompagna a tutta una serie di sintomi causati
dallostruzione uretrale, come esitazione minzionale, nicturia, incompleto svuotamento della
vescica, mitto ipovalido. Tali sintomi sono raramente causati dal carcinoma, e in tal caso la loro
presenza indice di cattiva prognosi.
In altri casi il tumore d segno di s solo quando ormai ha dato origine a metastasi, pi
frequentemente allosso, che si accompagnano nella maggior parte dei casi a dolore osseo e astenia.
I metodi di screening oggi utilizzati sono:
26
Esame Rettale
Dosaggio del PSA
La TRUS (Transrectal Ultrasound Sonography) e la PET-CT Colina (Positron Emission
Tomography- computed tomography) per identificare eventuali metastasi osee
Conferma Diagnostica tramite Biopsia della stadiazione
ESAMI DI LABORATORIO DIAGNOSTICI
DOSAGGIO DEL PSA, STADIAZIONE E CLASSIFICAZIONE
Il PSA una glicoproteina con attivit serino-proteasica, presente nel citoplasma delle cellule
epiteliali prostatiche, sia normali sia maligne la cui funzione di fluidificare il liquido seminale nel
momento delleiaculazione.
I suoi livelli possono essere facilmente dosati con metodo radioimmunologico: essi rispecchiano
fedelmente lattivit della ghiandola prostatica. Possiamo quindi affermare che il PSA un marker
organo specifico, ma non tumore specifico, poich pu risultare alterato anche in caso di prostatiti,
IPB e manipolazione sullorgano.
E per importante valutare il livello dellaumento: solitamente un valore superiore a 10ng/ml
fortemente suggestivo di neoplasia.
Ponendo il cutpoint del PSA a 4ng/ml si ottiene una sensibilit dell86% ed una specificit dell38%
(Hoffman et al., 2002), il che significa che solo una persona su tre, tra i pazienti risultati positivi,
sar realmente affetta da tumore prostatico.
E quindi da considerare la presenza di un elevato numero di falsi positivi, che pu portare a rischio
di overdiagnosi (Etzioni et al., 2002) e ad un eccessivo ricorso alla biopsia, che rimane tuttavia un
punto fondamentale nel percorso diagnostico, non esistendo ancora un marker ideale per il tumore
prostatico.
Per aumentare la sensibilit del PSA si pu affiancare al dosaggio totale la valutazione del PSA
free, ovvero della quota di glicoproteina non legata, che aumenta maggiormente nelle lesioni
benigne piuttosto che nel cancro, e del PSA ratio (PSA free/PSA tot) (Montironi et al., 2000).
In recenti studi si ipotizza di introdurre anche il dosaggio della percentuale di pro-PSA, che ha
dimostrato di essere il pi potente marker del tumore prostatico anche a bassi livelli,
particolarmente tra 2 e 4 ng/ml (Otto et al., 2004).
27
Laumento dei valori di PSA oltre un livello di 4ng/ml correlato con un rischio crescente di
neoplasia; valori di PSA tra 4 e 10ng/ml indicano un sospetto di tumore della prostata, ma occorre
considerare lesistenza di una possibile iperplasia. Livelli di PSA superiori a 10 ng/ml sono correlati
con un rischio ancora pi alto di neoplasia, anche in assenza di parametri critici di sospetto.
Lincidenza dei tumori in soggetti con PSA inferiori a 4ng/ml del 2% contro il 70% di quelli con
PSA superiore a 10ng/ml.
Il rischio di tumore prostatico si pu quantificare nel modo seguente (Fig.13)
Figura 13. Dosaggio del PSA
Oggi possibile dosare un ulteriore marker per il carcinoma prostatico, il PCA3 (prostate gene3);
liperespressione di questo gene (valutabile mediante dosaggio dellmRNA nelle urine)
strettamente associata alla trasformazione maligna delle cellule della prostata. Il dosaggio quindi
particolarmente utile nei pazienti gi sottoposti a biopsia, per predire levoluzione del tumore
(Hessels et al., 2009; Laxman et al., 2008; de la Taille et al., 2007; Bussemakers et al., 1999;
Neves et al., 2008; Haese et al., 2008; Marks et al., 2007).
La diagnosi di carcinoma prostatico necessita della valutazione istologica della lesione, attraverso
prelievo bioptico (manovra diagnostica obbligatoria) in caso di elevazione del PSA sierico non
altrimenti spiegabile di esplorazione rettale sospetta, di riscontro di aree ipoecogene allecografia
prostatica transrettale o di una combinazione di questi elementi). Se la diagnosi confermata il
patologo assegna un grado Gleason per ogni sezione istologica analizzata (ODowd et al., 2001). La
Figura 14 illustra larchitettura del grado di Gleason. Un elevato grado corrisponde ad una grande
perdita della normale struttura tissutale in quella specifica sezione.
28
Il sistema di classificazione secondo Gleason valuta larchitettura (pattern) del carcinoma
prostatico.
Sono identificati sia il pattern principale (predominante) sia il secondario (secondo pi comune);
poi viene attribuito un punteggio da 1 a 5 indicando con 1 laspetto pi differenziato e con 5 quello
meno differenziato. Se un tumore ha solo un pattern istologico allora ai patterns primari e secondari
assegnato lo stesso numero.
Il grado primario rappresenta la maggioranza del tumore che deve essere superiore al 50% del
pattern osservato. Il grado secondario si riferisce invece alla minoranza del tumore che deve essere
inferiore al 50%, ma almeno il 5% del totale pattern osservato.
La somma dei due pattern rappresenta il Gleason score. Questo valore numerico ha un range 2-10.
Un Gleason score di 7 o sopra identifica un alto grado tumorale con uno scarso differenziamento.
Sempre pi spesso i patologi forniscono una componente terziaria. Questa viene assegnata dove
presente una compenente di un terzo pattern, generalmente pi aggressivo.
Figura 14. Diagnosi istologica di Cancro della Prostata con i gradi di Gleason associati.
National Cancer Institute, 2011.
Il materiale bioptico offre la possibilit di assegnare un Gleason score, ma non uno stadio tumorale.
Lo stadio descrive quanto il cancro si diffuso dentro la prostata, la sua grandezza e se ha formato
metastasi (Palo Alto Medical Foundation, 2011). La determinazione dei due tipi di stadi- clinico e
patologico- dipende per prima cosa dal quadro clinico della malattia (basata su DRE, test di
29
laboratorio, materiale bioptico e test di imaging) e in secondo luogo il giudizio di un patologo di
tutta la prostata dopo la rimozione chirurgica dellorgano (prostatectomia radicale).
Lassegnazione dello stadio dipende dal sistema TNM, dove le lettere T, N e M si riferiscono al
tumore primario, metastasi linfo-nodale e metastasi ad altri organi, rispettivamente. La tabella 1
tratta in dettaglio il sistema per entrambi gli stadi clinico e patologico.
Laggiunta di metodi sopra descritti per lo screeening, la diagnosi e la predizione della prognosi ha
migliorato le prospettive cliniche per i pazienti con PCa. Comunque, queste tecniche hanno
problemi nellaccuratezza e sensibilit. I loro svantaggi richiedono pertanto una ricerca
approfondita di nuovi biomarcatori per la diagnosi del carcinoma prostatico.
30
T stages N stages M stages
Clinico
TX-- Il tumore primario non pu essere valutato T0--Nessuna evidenza di tumore primario T1-- Il tumore non pu essere individuato con i test di imaging T1a- -Meno del 5% della prostata affetta da tumore T1b- -Pi del 5% della prostata affetta da tumore T1c- - ll tumore identificato attraverso biopsia, elevato PSA T2 --Tumore confinato allinterno della prostata T2a- -Il tumore colpisce la met di un lobo o meno T2b- - Il tumore colpisce della met di un lobo ma non entrambi T2c- - Il tumore colpisce entrambi i lobi T3-- Il tumore si estende attraverso la capsula della prostata T3a- - Il tumore si estende oltre la capsula della prostata T3b- - Il tumore invade le vescicole seminali T4-- Il tumore si stabilizzato oppure invade le aree circostanti, come il collo della vescica, lo sfintere esterno, il retto, i muscoli levatori, e/o la parete pelvica.
Patologico
pT2 -- Il tumore limitato nella prostata pT2a -- Il tumore colpisce la met di un lobo o meno pT2b -- Il tumore colpisce pi della met di un lobo ma non entrambi i lobi pT2c --Il tumore colpisce entrambi i lobi pT3 --Il tumore si estende oltre la prostata pT3a --Il tumore si estende oltre la prostata pT3b --Il tumore invade le vescicole seminali pT4 -- Il tumore invade il collo, il retto
Clinico
NX -- I linfonodi locali non sono stimati N0 --Il tumore non si esteso nei linfonodi locali N1 --Il tumore ha invaso i linfonodi locali
Patologico
pNX --I linfonodi locali non sono stimati pN0 --I linfonodi locali non sono affetti da tumore pN1 --I linfonodi locali sono affetti da tumore
Clinico
MX -- Non sono stimate metastasi distali M0 --Non sono presenti metastasi distali M1a --I linfonodi locali non sono affetti da tumore M1b --Le ossa sono affette da tumore M1c -- Altri siti sono affetti da tumore con o senza malattia dellosso
Tabella 1. Classificazione e stadiazione del tumore della prostata tramite il sistema TNM.
Palo Alto Medical Foundation, 2011.
FARMACI DEMETILANTI
Le modificazioni epigenetiche sono eventi potenzialmente reversibili che determinano
riarrangiamenti cromatinici trasmissibili da una cellula alla sua progenie. Tali modificazioni
modulano e alterano lespressione genica senza cambiare la sequenza del DNA. Modificazioni
epigenetiche sono numerose e sono date da metilazione del DNA, acetilazione, fosforilazione,
ubiquitinazione degli istoni, etc. (Portela and Esteller 2010).
I farmaci inibitori delle DNMT (DNA metiltransferasi) sono stati sintetizzati da ormai quasi mezzo
secolo, come analoghi della citosina ad azione citotossica, da utilizzare come chemioterapici (Issa et
al., 2005; Gore et al., 2006) (Fig.15).
31
CITOSINA 5-METILCITOSINA5-AZACITIDINA
(AZACITIDINA)
5-AZA-2-DEOSSICITIDINA
(DECITABINA)CITOSINA 5-METILCITOSINA
5-AZACITIDINA
(AZACITIDINA)
5-AZA-2-DEOSSICITIDINA
(DECITABINA)
Figura 15. Struttura dellAzacitidina e della Decitabina.
In questi analoghi il residuo 5 dellanello pirimidinico citosinico sostituito con una molecola di
fluoro o di azoto (Fig. 16) (Piml et al., 1964). Tale sostituzione impedisce la metilazione, pertanto
quando il farmaco si integra nel filamento di DNA, la DNMT viene bloccata.
Bench vi siano altri inibitori delle DNMT sintetizzati e di possibile uso clinico, i farmaci
attualmente impiegati sono 5-azacitidina e 5-aza-2deossicitidina o decitabina. Il primo si integra
nellRNA e poi nel DNA, mentre la decitabina si integra solo e direttamente nel DNA. Dunque pur
essendo analoghi e avendo lo stesso effetto inibente le DNMT, si tratta senzaltro di farmaci con un
diverso spettro di azione. Tali farmaci hanno anche un effetto citotossico, ma finch sono stati usati
a dosaggi elevati non hanno manifestato propriet terapeutiche superiori alla citosina arabinoside,
bens maggiore tossicit.
Solo recentemente, dopo la scoperta della loro attivit di inibizione delle DNMT, lazacitidina e la
decitabina sono state usate a dosaggi molto inferiori, tali da determinare solo leffetto ipometilante e
non citotossico (Oki et al., 2008; Issa et al., 2003; Saunthararajah et al., 2003; Santini et al., 2001).
32
Figura 16. Sintesi della Decitabina. (Piml et al., 1964).
33
I.2. SILENZIAMENTO EPIGENETICO
LEPIGENETICA
Lepigenetica definita come lo studio dei cambiamenti ereditari nellespressione genica, associati
a modificazioni del DNA o delle proteine della cromatina, non riconducibili ad alterazioni nella
sequenza primaria del DNA (Egger et al., 2004; Zoghbi and Beaudet, 2007; Feinberg, 2008).
La cromatina costituita da unit ripetute di nucleosomi, i quali presentano un nucleo formato da
un complesso di otto proteine istoniche (H2A, H2B, H3 e H4), intorno al quale si avvolge il DNA a
doppio filamento di circa 146bp (Luger et al., 1997).
I meccanismi epigenetici che modificano la struttura della cromatina possono essere suddivisi in
quattro grandi categorie:
Metilazione del DNA
Modificazioni covalenti degli istoni
Modificazioni non covalenti come linserimento di varianti istoniche o il rimodellamento
dei nucleosomi
Le modificazioni non covalenti, come il rimodellamento dei nucleosomi, e la sostituzione delle
canoniche proteine istoniche con varianti specializzate giocano un ruolo importante nella
modulazione della struttura della cromatina associata alla regolazione dellattivit genica.
Oltre ad essere la struttura base per il packaging del DNA allinterno della cellula, i nucleosomi
regolano lespressione genica alterando laccessibilit di sequenze regolatrici del DNA ai fattori di
trascrizione (Jiang et al., 2009).
Non-coding RNA (ncRNA), inclusi i microRNAs.
Queste modificazioni cooperano per la regolazione funzionale del genoma alterando le strutture
dinamiche della cromatina, soprattutto regolandone accessibilit e compattezza.
Linterazione tra questi meccanismi di regolazione crea un paesaggio epigenetico che modifica il
tipo di espressione del genoma dei mammiferi in diversi tipi cellulari, in differenti stadi di sviluppo,
stadi di malattia o nel cancro (Jones et al., 2007; Bernstein et al., 2007; Jiang et al., 2009).
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MECCANISMI DI REGOLAZIONE EPIGENETICA
METILAZIONE DEL DNA
Per metilazione del DNA sintende laggiunta di un gruppo metilico da un donatore universale, S-
adenosil-L-metionina (SAM), allatomo di carbonio posto in posizione 5 dellanello pirimidinico
della citosina, che porta alla formazione della 5-metilcitosina (5me) (Chiang et al., 1996).
La reazione catalizzata dallenzima DNA metil-transferasi (DNMTs) (Goll et al., 2005; Li et al.,
2007).
I precisi pattern di metilazione del DNA nel genoma dei mammiferi sono originati e conservati
nelle generazioni dallattivit cooperativa delle de novo metiltransferasi (DNMT3A, DNMT3B, che
agiscono indipendentemente dalla replicazione cellulare e mostrano uguale preferenza per entrambi
i filamenti di DNA, non metilato ed emimetilato) e delle DNMT1 (che agiscono durante la
replicazione metilando preferenzialmente il filamento di DNA emimetilato (Kim et al., 2002;
Okano et al., 1999). Nella specie umana e negli altri mammiferi questa modificazione avviene
soltanto sulle citosine che precedono le guanine nella sequenza del DNA: i dinucleotidi CpG
(Rideout et al., 1990), dove la p indica il legame fosfodiesterico tra la citosina e la guanina).
I dinucleotidi CpG non sono uniformemente distribuiti allinterno del genoma, ma sono concentrati
in piccoli tratti ricchi in CpG, chiamati CpG islands, ed in tratti contenenti sequenze ripetute (Bird
et al., 2002; Takai et al., 2002).
Le CpG islands si trovano generalmente allestremit 5 dei geni e occupano circa il 60% dei
promotori dei geni umani (Wang et al., 2004). Mentre la maggior parte dei siti CpG nel genoma
metilata, le CpG-islands restano non metilate durante lo sviluppo e nei tessuti differenziati (Suzuki
et al., 2008).
Tuttavia, alcuni promotori contenenti CpG-islands diventano metilati durante lo sviluppo e ci si
traduce in un silenziamento trascrizionale a lungo termine (Bird et al., 2002). Negli organismi pi
semplici come la Drosophila, invece, c poca o alcuna metilazione del DNA (Bird et al., 2002), e
studi nei mammiferi hanno consentito di correlare i pattern di metilazione del DNA allespressione
genica: la metilazione nel promotore di un gene generalmente associata al silenziamento del gene
stesso (Bird et al., 2002; Jones et al., 1999; Herman et al., 1999).
Nelle cellule degli organismi pi sviluppati la metilazione si verifica in una porzione molto estesa
del DNA che non codifica geni (noncoding DNA o ncDNA), mantenendo quindi unelevata quantit
di DNA non codificante in uno stato trascrizionalmente inerte. Inoltre, il DNA con maggiore
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metilazione replica pi tardi rispetto a quello non metilato (Antequera et al., 1993), il che significa
che la metilazione aiuta ad assicurare una replicazione tardiva di gran parte del genoma.
La replicazione tardiva associata alla formazione di cromatina inattiva, che facilita il
silenziamento trascrizionale delle regioni non codificanti (Bird et al., 1999).
Questo processo potrebbe aiutare a prevenire la trascrizione di una larga parte del genoma che
contiene sequenze ripetute, sequenze virali inserite e trasposoni, considerando che la trascrizione di
questi elementi porterebbe danno cellulare (Bestor et al., 1990; 1998). Inoltre, la metilazione pu
determinare silenziamento genico prevenendo o promuovendo il reclutamento di proteine con
funzione regolatrice a livello del DNA. Per esempio, pu inibire lattivazione trascrizionale
bloccando laccesso dei fattori di trascrizione ai propri siti target, es. c-myc e MLTF (Prendergast et
al., 1991; Watt et al., 1988). In alternativa, pu fornire siti di legame per proteine con domini che
riconoscono la metilazione, le quali possono mediare la repressione genica attraverso linterazione
con le istone-deacetilasi (HDACs) (Jones et al., 1998; Nan et al., 1998).
MODIFICAZIONI COVALENTI DEGLI ISTONI
Gli istoni che compongono il core nucleosomico presentano un dominio C-terminale globulare ed
unestremit N-terminale non strutturata (Luger et al., 1997). Lestremit N-terminale, che si
estende fuori dal nucleo DNA-istoni, pu subire diverse modificazioni covalenti post-trascrizionali
come la metilazione, lacetilazione, lubiquitinazione, la sumoilazione e la fosforilazione a livello di
specifici residui amminoacidici.
Tali modificazioni regolano processi cellulari chiave come la trascrizione, la replicazione e la
riparazione del materiale genetico (Kouzarides et al., 2007).
Il complemento di modificazioni proposto per garantire la memoria epigenetica nella cellula sotto
forma di codice istonico che determina la struttura e lattivit di differenti regioni cromatiniche
(Jenuwein et al., 2001).
A differenza della metilazione del DNA, le modificazioni degli istoni possono portare ad
attivazione o repressione a seconda di quali residui vengano modificati e dal tipo di modificazioni
presenti. Per esempio, lacetilazione della lisina associata ad attivazione della trascrizione
(Kouzarides et al., 2007; Hebbe et al., 1988), mentre la metilazione della lisina porta ad attivazione
trascrizionale o a repressione a seconda di quale residuo venga modificato e dal grado di
metilazione.
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Infatti, la trimetilazione della lisina in posizione 4 dellistone H3 (H3K4me3) si verifica a livello dei
promotori di geni trascrizionalmente attivi, mentre la trimetilazione in posizione 9 ed in posizione
27 dellistone H3 (H3K9me3) (H3K27me3) presente sui promotori di geni trascrizionalmente
inattivi (Kouzarides et al., 2007).
Le modificazioni degli istoni vengono regolate dagli enzimi in maniera dinamica tramite laggiunta
o la rimozione di gruppi covalenti. Le istone acetiltransferasi (HATs) e istone metiltranferasi
(HMTs) aggiungono, rispettivamente, gruppi acetili e metilici; mentre le istone deacetiltransferasi
(HDACs) e le istone demetiltransferasi (HDMs) rimuovono, rispettivamente, gruppi acetili e
metilici (Haberland et al., 2009; Shi et al., 2007).
Diverse HTMs, come SUV39H1, possono indirizzare la metilazione su specifici geni target
reclutando direttamente le DNA metiltransferasi (DNMTs) per indurre silenziamento genico
(Tachibana et al., 2008; Lehnertz et al., 2003; Zhao et al., 2009 ).
Oltre al diretto reclutamento delle DNMTs, le HMTs e le demetilasi influenzano i livelli di
metilazione del DNA regolando la stabilit delle proteine DNMT (Esteve et al., 2009; Wang et al.,
2009).
Le interazioni tra il macchinario di metilazione del DNA e gli enzimi che modificano gli istoni
aumenta ulteriormente la complessit della regolazione epigenetica, la quale determina e mantiene
lidentit e la funzione della cellula.
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ALTERAZIONI DELLA METILAZIONE DEL DNA NEL CANCRO
Linizio e la progressione del cancro sono eventi accompagnati da profondi cambiamenti nello stato
di metilazione del DNA, prima alterazione epigenetica ad essere stata identificata nel tumore
(Feinberg et al., 1983; Riggs et al., 1983).
Il genoma di cellule tumorali caratterizzato da unestesa ipometilazione e da una ipermetilazione
di CpG islands presenti su siti specifici dei promotori (Fig.17) (Jones et al., 2002; Gal-Yam et al.,
2008). Mentre il meccanismo che induce questi cambiamenti globali ancora da definire, recenti
studi indicano che alcune di queste modificazioni si verificano in stadi molto precoci dello sviluppo
del cancro e possono contribuire allo sviluppo del tumore (Feinberg et al., 2006).
Lipometilazione globale del DNA gioca un ruolo significativo nella tumorigenesi e si verifica a
livello di sequenze ripetute, retrotrasposoni, promotori poveri in CpG e introni (Rodriguez et al.,
2006).
Lipometilazione del DNA a livello di sequenze ripetute porta ad un aumento dellinstabilit
genomica promuovendo riarrangiamenti cromosomiali (Jones et al., 2002; Eden et al., 2003).
A livello dei trasposoni, invece, pu indursi nella loro attivazione e traslocazione in altre regioni
geniche, determinando ulteriore instabilit genomica (Basame et al., 2006). Inoltre, la stessa
mancanza di metilazione pu portare allattivazione di geni promotori della crescita cellulare come
R-Ras e MASPIN nel carcinoma gastrico, S-100 nel cancro del colon e MAGE (antigene associato
al melanoma) nel melanoma (Wilson et al., 2007), e ad una perdita dellimprinting (LOI) nei tumori
(Rainier et al., 1993).
Pertanto, lipometilazione del DNA porta ad unattivazione aberrante di geni e regioni non
codificanti attraverso una variet di meccanismi che contribuiscono allo sviluppo e alla
progressione del tumore aumentando linstabilit genomica e attivando i proto-oncogeni.
Al contrario, lipermetilazione sito-specifica contribuisce alla tumorigenesi silenziando geni
oncosoppressori.
Da quando stato scoperto il primo promotore con ipermetilazione delle CpG islands, Rb (gene
oncosoppressore associato al tumore del retinoblastoma) (Greger et al., 1989), stato poi
dimostrato che, nel tumore, altri oncosoppressori come p-16, MLH1 e BRCA1 subiscono
silenziamento in seguito a metilazione (Jones et al., 2002; Jones et al., 2007; Baylin et al., 2005).
Questi geni sono coinvolti in processi cellulari fondamentali nello sviluppo e nella progressione del
tumore come il riparo del DNA, il ciclo cellulare, ladesione cellulare, lapoptosi e langiogenesi
(Jones et al., 1999).
Oltre allinattivazione diretta di geni oncosoppressori, lipermetilazione del DNA pu
indirettamente inibire lespressione di altre classi di geni, tramite silenziamento di fattori di
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trascrizione o geni per il riparo del DNA. Per esempio il silenziamento di fattori di trascrizione
indotto tramite metilazione del promotore, come RUNX3 nel carcinoma gastrico (Long et al.,
2007), e GATA-4 e GATA-5 nel carcinoma colorettale e gastrico (Akiyama et al., 2003) porta ad
inattivare i loro target a valle.
Il silenziamento dei geni per il riparo del DNA (MLH1, BRCA1, ecc.) facilita nelle cellule un
maggiore accumulo di lesioni genetiche che si traduce in una rapida progressione del tumore.
Mentre labilit dellipermetilazione del DNA di silenziare geni oncosoppressori nel cancro nota,
come questi geni siano identificati come i target di metilazione, resta da chiarire.
Una possibilit che i geni silenziati in modo specifico forniscano un vantaggio alle cellule,
aiutando la selezione e la proliferazione cellulare (Di Croce et al., 2002).
La metilazione tumore-specifica delle CpG islands si verifica attraverso un meccanismo sequenza-
specifico grazie al quale le DNMTs riconoscono specifici geni tramite lassociazione con fattori di
trascrizione oncogenici (Di Croce et al., 2002).
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Figura 17. Alterazioni della metilazione nel cancro.
Nelle cellule normali i promotori dei geni oncosoppressori attivi presentano CpG non metilate, acetilazione degli istoni
e metilazione H3K4, determinando la formazione di una struttura aperta della cromatina che la rende trascrizionalmente
attiva. Invece, le regioni ripetitive, i trasposoni, le regioni intergeniche povere in CpG, e i promotori di geni sottoposti
ad imprinting, sono fortemente metilati, sottoposti a marcatura istonica come la metilazione H3K9 e pertanto trascrizionalmente inattivi. Durante la tumorigenesi, i promotori dei geni oncosoppressori, che contengono CpG islands
diventano metilati e ci si traduce in una struttura silente della cromatina e in un silenziamento aberrante mentre, le
sequenze ripetute, i trasposoni e i promotori di geni sottoposti ad imprinting diventano ipometilati e di conseguenza
trascrizionalmente attivi. (Gal-Yam et al., 2008).
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I.3. I microRNA
I microRNA
I microRNA (miRNA) sono unampia classe di piccoli RNA non codificanti di 21-25 nucleotidi che
regolano negativamente lespressione genica a livello post-trascrizionale (He and Hannon, 2004)
mediante appaiamento con specifici RNA messaggeri (mRNA), inducendone la degradazione o
impedendone la traduzione nel corrispondente prodotto (Kim, 2005; Petersen et al., 2006).
Le prime evidenze sullesistenza dei microRNA risalgono al 1993 quando il gruppo di Victor
Ambros (Ambros et al., 1993) identific mediante screening genetico di geni alla base di difetti nel
controllo temporale dello sviluppo post-embrionale nel nematode C. Elegans, un piccolo RNA non
codificante di 22 nucleotidi, chiamato lin-4.
Questultimo risultava essere parzialmente complementare con sette nucleotidi conservati nella
regione 3 non tradotta dellmRNA che codifica per la proteina nucleare LIN-14 (Lee et al., 1993),
la cui sottoespressione essenziale per la corretta progressione temporale dal primo al secondo stadio
di sviluppo larvale.
Levidenza della complementarit di sequenze fra lin-4 e lin-14, unita al fatto che mutazioni a
carico di lin-4 fossero in grado di alterare il corretto andamento dello sviluppo, sugger una serie
numerosa di studi molecolari e biochimici che condussero alla dimostrazione che linterazione
diretta fra i due RNA responsabile del controllo dellespressione della proteina LIN-14 (Ha et al.,
1996; Wightman et al., 1993).
Mediante un analogo meccanismo fu scoperto che lin-4 era in grado di regolare negativamente
anche il gene lin-28 coinvolto in uno stadio pi avanzato dello sviluppo larvale di C. Elegans (Moss
et al., 1997). Questi risultati condussero allidentificazione di un meccanismo completamente nuovo
di regolazione genica post-trascrizionale coinvolto nei processi di sviluppo.
Dopo questa scoperta i microRNA sono stati individuati anche negli animali e nelle piante; ormai
accertato che tutti gli eucarioti pluricellulari, e perfino qualche unicellulare, si avvalgono
dellazione di questi piccoli RNA nella regolazione dellespressione genica (Kent and Mendell,
2006).
Nelluomo fino ad oggi sono stati identificati pi di 400 microRNA ma alcune ricerche
suggeriscono che il numero totale possa addirittura superare le mille unit (Bentwich et al., 2005;
Berezikov et al., 2005).
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Questa evidenza correlata alla loro natura regolatoria conferma il fatto, oggi supportato anche da
numerosi dati sperimentali, che i microRNA possano agire non solo nello sviluppo ma nella
maggior parte dei processi fisiologici della cellula, quali ad esempio la crescita e la divisione
cellulare, lapoptosi ed il differenziamento.
LA BIOSINTESI DEI microRNA
Il processo che conduce alla formazione dei microRNA maturi stato recentemente chiarito
(Fig.18) (Garofalo and Croce, 2011). I geni per i microRNA possono essere localizzati nel genoma
singolarmente, o in cluster, in regioni intergeniche o addirittura, come suggeriscono numerose
evidenze, nelle sequenze introniche di specifici geni (Rodriguez et al., 2004).
I geni per i microRNA sono generalmente trascritti nel nucleo dalla RNA polimerasi II (PolII) in
lunghi precursori, i pri-miRNA. Questi ultimi vengono processati da unendonucleasi (RNasi di tipo
III) Drosha, e dal suo cofattore DGCR-8 (Pasha in Drosophila), per formare un trascritto di 70
nucleotidi chiamato pre-miRNA che consiste di una struttura a forcina imperfetta.
Drosha prevalentemente localizzata nel nucleo e presenta due domini sequenziali con attivit di
RNAsi III, un dominio di legame per gli RNA a doppio filamento e un segmento N-terminale a
funzione ancora ignota (Lee et al., 2003). Sebbene il meccanismo mediante il quale Drosha riesca a
discriminare i differenti precursori dei microRNA sia ancora sconosciuto, le evidenze sperimentali
odierne stanno portando alla luce il ruolo chiave della struttura stessa del pri-microRNA in questo
processo. Infatti linefficienza del processamento da parte di Drosha dipende dalla grandezza
dellansa terminale, dalla struttura della forcina, e dalle sequenze fiancheggianti il sito riconosciuto
di taglio, poich stato osservato che mutazioni che alterano le caratteristiche di queste regioni
inducono in maniera significativa linibizione della sua attivit (Zeng et al., 2003).
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Figura 18. La biogenesi dei microRNA. (Garofalo and Croce Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2011)
Dopo questo passaggio iniziale, il pre-microRNA viene esportato grazie al trasportatore della
famiglia delle RAN-GTPasi Esportina 5 (Exp5), dal nucleo verso il citoplasma dove unaltra RNasi
di tipo III, Dicer, ne catalizza un ulteriore processamento che conduce alla formazione di un RNA
di circa 22 nucleotidi a doppio filamento imperfetto (duplex) (miRNA:miRNA*) contenente sia il
filamento del microRNA maturo sia (miRNA) sia il suo complementare (miRNA*) (Murchison.
and Hannon., 2004). La proteina Dicer, di circa 200 kDa, contiene due domini RIIIa e RIIIb, ad
attivit Rnasica, un dominio con attivit ATPasica ed elicasica, un dominio DUF283 a funzione
ancora ignota, un dominio di legame C-terminale di legame con gli RNA duplex ed un dominio
PAZ (Piwi-Argonaute-Zwille).
Questultimo risulta essere fondamentale nel riconoscimento dellestremit 3 protundente generato
dal taglio catalizzato da Drosha (Lingel et al., 2003; Song et al., 2003) e potrebbe inoltre essere il
responsabile del corretto posizionamento della regione ad attivit RNasica di Dicer sul sito di taglio
del pre-microRNA (Fig.19) (Carmell and Hannon, 2004).
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Figura 19. Struttura dellRNasi di tipoIII Dicer.
a) Schema che riassume un possibile meccanismo del processamento del pre-microRNA da parte di Dicer. Il
posizionamento dei domini RIII dimostra lasimmetria della regione catalitica, con RIIIa che taglia il braccio
discendente ed RIIIb ascendente del pre-microRNA (frecce rosse). b) Modello di interazione dellRNasi III di batterio
(Aquifex aeolicus) con RNA a doppio filamento. Questa interazione potrebbe essere molto simile a quella di Dicer.
Tratto da Filipowicz et al., 2005.
Lultimo stadio per la formazione dei microRNA richiede lintervento di RISC (RNA induced-
silencing complex), il complesso proteico che induce il silenziamento dellRNA. La selezione
dellRNA messaggero bersaglio specifico e linefficienza funzionale di un microRNA richiedono
che il filamento maturo del microRNA, proveniente dal duplex miRNA:miRNA*, sia
selettivamente incorporato nel complesso RISC (Schwarz et al., 2003; Khvorova et al., 2003 ). Il
filamento complementare miRNA* viene, al contrario, rapidamente degradato. Sebbene i
microRNA maturi possano risiedere su entrambi i filamenti del RNA duplex, stato osservato che
lincorporazione preferenziale in RISC di uno rispetto allaltro principalmente dovuta
allinstabilit relativa allestremit 5, ovvero viene scelta come microRNA attivo e maturo la
molecola dotata di una minore stabilit alla sua estremit 5.
Sono dunque le propriet termodinamiche del microRNA precursore a determinare lassemblaggio
asimmetrico RISC e di conseguenza, la specificit dellmRNA bersaglio durante il meccanismo di
inibizione post-trascrizionale (He and Hannon, 2004).
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MECCANISMO DAZIONE E IL RUOLO MULTIFUNZIONALE DEI
microRNA
Come stato accennato precedentemente, il complesso RISC formato da una serie di proteine fra
le quali spiccano quelle della famiglia Argonauta (Bernstein et al., 2001).
Questultime presentano due domini caratteristici conservati: il dominio PAZ, presente anche in
Dicer, ed il dominio Piwi. Il dominio PAZ, sia in H. sapiens (hAgo2) sia in Drosophila, contiene un
sito di legame per gli acidi nucleici (OB) come mostrato nella figura 20a, mentre Piwi, considerata
la sua omologia strutturale con la RNasi H, sembrerebbe essere imputato nel processo di taglio
dellmRNA bersaglio (Song et al., 2004).
Il meccanismo mediante il quale il complesso RISC-microRNA induce il suo effetto regolatorio di
silenziamento dellRNA messaggero, viene esplicato secondo una doppia modalit di azione che
consiste nella degradazione dellmRNA stesso o nellinibizione della sua traduzione.
Figura 20. Struttura delle proteine Argonauta.
a) Struttura del dominio PAZ di Ago2 di H. Sapiens in un complesso con dsRNA di 7bp. Il dominio PAZ assomiglia ad
un ripiegamento OB (di legame ad acidi nucleici). b) Strutture proteiche di PfAgo, AfPiwi e EcRNAasiHI. Tratto da
Filipowicz et al., 2005.
Questo dipende dal grado di complementarit fra la sequenza del microRNA e quella del suo
bersaglio (Fig.18). Infatti i microRNA che si legano con complementarit perfetta ai loro RNA
messaggeri target, ne determinano la degradazione; in questo caso presente un solo sito di
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appaiamento che generalmente si trova sulla ORF (open reading frame) o sequenza codificante
dellmRNA bersaglio.
Questa modalit di azione omologa a quella dellRNA interference viene comunemente riscontrata
nelle piante (Hake, 2003). Al contrario, negli animali, eccetto poche eccezioni come ad esempio
quella di mir-196 (Yekta et al., 2004), i microRNA, appaiandosi in maniera imperfetta con
sequenze specifiche delle regioni non tradotte al 3 (3UTR) dei loro messaggeri target, ne inducono
linibizione della traduzione (He and Hannon, 2004; Doench et al., 2004).
In questo tipo di regolazione, stato osservato che la sequenza dei primi 7-8 nucleotidi che si
trovano al 5 del microRNA, meglio conosciuta come seed sequence, si appaia in maniera
perfettamente complementare con il sito sul 3UTR dellmRNA bersaglio, e che questo
appaiamento fondamentale per il corretto funzionamento dellazione del microRNA.
Per la caratterizzazione funzionale di un microRNA risulta essere determinante lidentificazione
accurata del suo (o dei suoi) mRNA bersaglio. Il fatto che negli animali i microRNA conducano la
loro azione tramite complementarit perfetta solamente dei nucleotidi 2-7 o 2-8 della seed sequence,
complica notevolmente lo studio per lindividuazione dei geni bersaglio di ogni microRNA, poich
una sequenza cos corta potrebbe teoricamente essere complementare ad un numero enorme di
sequenze nei 3UTR di tutto il genoma, conducen
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