实时荧光定量 pcr 原理与应用

实时荧光定量实时荧光定量 PCRPCR 原理与应用原理与应用

代文涛 技术支持

北京东胜创新生物科技有限公司

东胜创新生物科技有限公司Eastwin Life Science inc.

• 2002 年 4 月成立 , 专注于生命科学领域的高科技公司

• 总部设于北京，在全国 16 个主要城市设有分支，销售及售后服务网络覆盖全国

• 致力于为客户提供高技术、高质量、全方位的专业服务

• 拥有自主研发中心

高速的渠道扩张

公司总部北方区总部北京分公司

华东区总部上海分公司

东胜国际东胜创新香港分公

司

华南区总部广州办

厦门办

杭州办

南京办

沈阳办

武汉办

西安办

成都办

济南办

昆明办

乌鲁木齐办

哈尔滨办

2002.4

2002.8-11

2003.1-4

2004.5-6

筹建中2005.1-12

长沙办

太原办

大连办呼和浩特办

长春办

兰州办

南昌办

郑州办

南宁办

石家庄办

青岛办

南通办

温州办重庆办

福州办

合肥办

东胜创新创建于 2002 年 4 月， 3 年多的时间，成就了一个业界一流的渠道商和服务商，书写了业内企业高速发展的传奇！

020406080

100120140160180200

2002 2003 2004 2005 2006. 2

人数

高速的团队发展

公司现有员工近 200 人，其中具备本科以上学历者占 85% ，并拥有一支完全由博士、硕士组成的 30 多人的强大技术队伍；

人员教育背景涵盖了中国科学院、北京大学、清华大学、南京大学、复旦大学等国内几乎所有主要知名院校以及美国哈佛大学、哥伦比亚大学、芝加哥大学、香港大学等多所国际知名院校。

行业背景则包括麦肯锡公司、波士顿咨询公司、 GE 等国际知名公司以及国家人类基因组南方研究中心、上海生物芯片国家工程研究中心、中科院、珠海百奥生物技术工程公司等国内生物行业的学术中心及知名企业。

教育背景 行业背景

高速的团队发展

2

8

16

20

02468

101214161820

2002 2003 2004 2005

销售额

单位：百万美元

年复合增长率高达 78%

不断扩大的市场份额 不断丰富的产品线

高速的业绩增长

2002

2003

2004

2005

2006

2006

东胜创新自产品牌

东胜创新实验技术有限公司（东胜实验）是东胜创新旗下又一新兴品牌，她和东胜创新生物科技有限公司（东胜生物）一起，为广大客户提供高品质的服务。 东胜实验致力于打造一家提供全品类试剂、耗材和实验室通用仪器，集电子商务、配送上门、专业服务为一体的集成式渠道商。公司将首期投入 5000 万元，二期投入 3 亿元，以品类齐全、价格低廉、到货快捷、服务专业四大优势，真正成为客户科研工作中的亲密伙伴！

东胜创新实验技术有限公司Eastwin Scientific,Inc.

东胜实验部分合作厂商

全——一站式服务：品类齐全，购置方便

联合 AXYGEN 、 FALCON 、 QIAGEN 、 WHEATON 等众多国

内外著名厂商

涵盖实验通用仪器、试剂、耗材三大类，数千万种产品

专业的产品搜索引擎和电子商务平台（ www.bio168.net ），提供

在线订购、电话订购、上门订购三种灵活模式，让您的采购更加便

捷，实现真正的一站式服务

优惠的价格体系和丰富的客户回馈计划，让您在节省

经费的同时，体验更多超值惊喜

平——优惠的价格和丰富的客户回馈计划

上亿元常规备货，确保现货供应

在全国建设 3 大配送中心， 150 个配送站，超过 5000 个配送

终端

采用先进的 GPS 和 RFID 物流控制系统，保证到货的及时和安

全

快——高效的物流配送：现货储备，到货快捷

由多位博士、硕士组成的专业技术队伍，全面解决您在实验中遇到的

技术难题；此外，我们通过与厂商联合，及时引进先进技术与您分享

专——后顾无忧：技术领先，服务专业

•基本原理•实验体系的建立•应用

常规 PCR常规 PCR 技术： 对 PCR 扩增反应的终产物进行定性分析

S1 S2 M

DN

A E

ngi

ne

通过实时检测 PCR 每一个循环扩增产物相对应的荧光信号，来实现快速定性或者对起始模板进行定量分析的一种技术手段。

荧光定量 PCR

•如何对初始模板定量•荧光信号如何产生？

lens

•CT 值的定义是 PCR 扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段时，达到一个人为确定的阈值所对应的循环次数。

Ct 值的概念

Threshold line

C(t) value C(t) value18.12 +/- 0.04

阈值线 Ct 值

Ct 值

如何对初始模板定量？

荧光定量 PCR 原理• 理想的 PCR 反应：• X=X0*2n

• 非理想的 PCR 反应：• X=X0 (1+Ex)n

•n ：扩增反应的循环次数•X ：第 n 次循环后的产物量•X0 ：初始模板量•Ex ：扩增效率

XCt=X0 (1+Ex)Ct =N

log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log N

原理：初始模板量的对数值与 C(T) 值之间 呈线性关系

相同样品在一台 PCR 仪上同条件下重复 96 次的扩增曲线图

为什么要引入 Ct 值

Ct 值则极具重现性，可稳定反应起始模板量 终点产物量不恒定，因此终点定量不准确

荧光定量分析原理

荧光定量技术的发展简史

1992 年第一次报告提出： EB 染色，激发、检测装置，观察 PCR 反应过程

PCR 反应动力学公式演算推导，借助标准曲线定量

1994 年第一篇 Real time PCR 文献正式发表

1995 年世界第一台商品化的荧光定量 PCR仪诞生

SYBR Green 1SYBR Green 1

Molecular Molecular BeaconsBeacons

TaqManTaqMan

荧光化学试剂荧光信号如何产生？

SYBR Green I

SYBR Green 1SYBR Green 1

SYBR Green I 工作原理SYBR Green 1 结合到双链 DNA 的小沟部位

SYBR Green 1 染料和双链 DNA 结合后荧光信号大大增强。

G

TT TG G

C

C CCCC

CA AA

GGG

ACT

T

G

ATAG

C

AT

CG

TA

A

荧光信号值与扩增产物量成正比

• 荧光强度的变化是由于– 温度不断升高– 双链 DNA 解离， SGI 游离

• Tm 是熔解曲线的特征值

SYBR Green I SYBR Green I 熔解曲线分析熔解曲线分析

融解曲线的作用

Non-specific product

Amplicon

•判断 PCR 产物的特异性；•排除非特异性扩增产物的干扰

使用方便 —— 不必设计复杂的荧光探针

便宜灵敏

SYBR Green I SYBR Green I 优点优点

Molecular Molecular BeaconsBeacons

Molecular Beacons

发夹型杂交探针

Molecular Beacons

茎由互补配对的序列组成

环与目标序列完全配对

茎

荧光素 淬灭剂

环

Molecular Beacons

TA

C CGG GG

GT T

A CGA

AC

G GT

A AT

T TT TG

C C C CC

A A AA

Q

荧光素

目标序列

茎

淬灭剂

Molecular Beacons Molecular Beacons 应用范应用范围围

鉴定 PCR 产物 ( 定性）

定量起始模板浓度

单核苷酸多态性（ SNP ）检测

Molecular Beacons Molecular Beacons 优优缺点缺点

有很高的特异性， 用于 SNP 检测荧光背景低

设计困难

一个探针只能用于检测一个特定的目标价格较贵

TaqMan探针

探针荧光素淬灭剂

TaqManTaqMan

水解型杂交探针

TaqMan探针工作原理

3’3’5’

5’

ForwardPrimer

ReversePrimer

QR

TaqMan TaqMan 应用范围应用范围

鉴定 PCR 产物 ( 定性）

定量起始模板浓度

单核苷酸多态性（ SNP ）检测

TaqMan TaqMan 优优缺点缺点

特异性好， 适合于 SNP 检测 与 Molecular Beacons 相比设计相对简单

价格较高一个探针只能用于检测一个特定的目标背景比分子信标探针高

荧光化学试剂总结

结合于双链DNA 的小沟中

发夹型杂交探针

水解型杂交探针（ 5‘-3’外切）

延伸

复性任何步骤

定量融解曲线分析

SNP 分析定量、定性

SNP 分析定量、定性

信号检测工作原理 有否淬灭剂化学试剂

否

有

有

主要应用范围

荧光定量实验体系的建立使用 SYBR Green I 染料

常规 PCR 体系

SGI

荧光定量 PCR 体系

标准曲线如何制作

•PCR 产物、质粒DNA

•OD260 定量•分子量计算•拷贝数换算•10倍系列稀释液

SYBR Green I 的稀释• 原液 10 倍稀释于 DMSO ，可长期储存• 使用前 100 倍稀释于纯水

SYBR Green I 的保存• SYBR Green I 的原液十分稳定• 稀释后 -20 度可保存半年• 避光，避免反复冻融

SYBR Green I 试剂盒• Bio-Rad Finnzyme Qiagen 等

SYBR Green I

1. 94 ℃ 5 min1. 94 ℃ 5 min2. 95 ℃ 10 sec2. 95 ℃ 10 sec3. 58 ℃ 30 sec3. 58 ℃ 30 sec4. 72 ℃ 20 sec4. 72 ℃ 20 sec5. 5. Plate readPlate read6.6. 82 ℃ 30 sec82 ℃ 30 sec7. 7. Plate readPlate read8. Goto step 2 for more 39 times8. Goto step 2 for more 39 times9. 9. Perform melting curve from 55.0 Perform melting curve from 55.0 ℃ to 95.0 ℃,read every 0.2 ℃, hold ℃ to 95.0 ℃,read every 0.2 ℃, hold for 1 secfor 1 sec

SYBR Green I 实验程序

不同读板温度对实验结果的影响： 72℃

不同读板温度对实验结果的影响： 82℃

荧光定量实验体系的建立使用 TaqMan 探针

•探针、引物的设计•引物反应条件的优化•加入探针进行预实验•标准曲线的制作探针设计软件： Primer express 、 Beacon

designer

TaqMan探针及引物设计原则GC含量 30 － 80％5’端避免出现重复的 G 碱基探针的退火温度 68 － 70

先设计探针，再设计引物正向引物与探针的距离尽量避免重复的 G 出现退火温度 58 － 60 ，低于探针 10

探针设计

引物设计

　 TaqMan 实验程序

1. 94 ℃ 5 min1. 94 ℃ 5 min2. 95 ℃ 10 sec2. 95 ℃ 10 sec3. 58 ℃ 30 sec3. 58 ℃ 30 sec4. 4. Plate readPlate read 5. Goto step 2 for more 39 5. Goto step 2 for more 39 timestimes6. end6. end

荧光定量实验条件的优化

•扩增片段的长度•引物浓度： 0.1 － 0.5uM （建议HPLC纯化）•产物特异性－－融解曲线分析、 DNA 电泳•退火温度的优化－－温度梯度功能•MgCl2浓度的调节•助解链剂 DMSO 的使用（ <5% ）

荧光定量荧光定量 PCRPCR 技术的应用技术的应用

基因表达差异

•直接得出拷贝数，再计算表达差异（标准曲线）

•ddCt ( 有内参基因）

•dCt (无内参基因）

ERBB2 的表达（正常组织 vs. 肿瘤组织）

•目标基因： ERBB2 oncogene

•内标基因： GAPDH

•模板

•从 正常乳腺组织中提取的 Total RNA

•从乳腺癌组织中提取的 Total RNA

•含 ERBB2 and GAPDH 质粒用于生成标准曲线

基因表达差异 直接计算法

内标引入的必要性•取材差异•提取效率差异•反转录效率差异

内标基因的选择•原则：内标基因在不同组织或者

处理前后表达量不变•内标基因的选择

一般选取 GAPDH 、 β-actin 、 18sRNA

使用 TaqMan 探针进行双通道荧光定量

Fam 标记目标基因探针 （ ERBB2 oncogene ）

VIC 标记看家基因探针（ GAPDH ）

基因表达差异 直接计算法

基因表达差异

实验流程

直接计算法

基因表达差异标准曲线

直接计算法

PMT1-FAM detection- ERBB2 PMT2-VIC detection- GAPDH

基因表达差异

样本扩增曲线

直接计算法

HealthyRNA

TumorRNA

GAPDH

ERBB210951052

21302492

9550085730

136000130800

Copies ng/ µl Total RNA

基因表达差异

结果分析

直接计算法

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

HealthyTissue

Carc.Tissue

Relative Expression

ERBB2 的表达差异

基因表达差异0.018/0.011=1.6

直接计算法

基因表达差异 ddCt 方法

E = X0*(1+Ex)n + Eb （ 1 ） Xm1*(1+Exm)Ctm1 =

Xm0*(1+Exm)Ctmo （ 2 ） Xn1*(1+Exn)Ctn1 =

Xn0*(1+Exn)Ctno (Xm1/Xn1)/(Xm0/Xn0) = (1+Exm) Ctm0-Ctm1/ （ 1+Exn ） Ctn1-Ctn0

Exm ＝ Exn ＝100％

(Xm1/Xn1)/(Xm0/Xn0) ＝ 2 －△△ Ct

基因表达差异 ddCt 方法

前提条件： Exm ＝ Exn ＝ 100％

验证方法：相对标准曲线法

如果两者扩增效率不同

(Xm1/Xn1)/(Xm0/Xn0) = (1+Exm) Ctm0-Ctm1/ （ 1+Exn ） Ctn1-Ctn0

结果更准确！

基因表达差异 dCt 方法（无内参基因）

Xm1*(1+Exm)Ctm1 = Xm0*(1+Exm)Ctmo

Xm1/Xm0 = (1+Exm) Ctm0-Ctm1

Exm ＝100％

Xm1/Xm0 ＝ 2 －△ Ct

SSH结果验证SSH ：抑制差减杂交，可筛选出处理样品中差

异表达的基因库。

兰尼啶受体基因 (RYR1) 、钙依赖性蛋白激酶基因 (CAMK2) 、人类胰岛素生长因子结合蛋白 -7 基因

(IGFBP7) 695 号882 号480 号

具体实例：非双肌臀大白猪双肌臀大白猪

肌肉组织差异表达的消减 cDNA文库

荧光定量分析

测定结果

基因芯片验证

•芯片结果需要复证•假阴性•假阳性

转基因植物的定量分析

外源基因在植物基因组中的拷贝数转基因植物在食品中的含量

具体实例：

外源基因 GOX; 内源基因 PEP 作为内参

转基因抗草甘磷油菜籽的检测

转基因油菜籽

非转基因油菜籽

配成转基因油菜籽含量分别为 0.1% 、

0.5% 、 1.0% 、 2.0% 、 5.0% 的标准系列

提取 DNA ，定量

不同体积比混合

转基因定量标准品的制备

分析结果标准曲线

样品分析

肿瘤与耐药性 实验背景

药物： Gemcitabine 是脱氧胞嘧啶（ C ）的类似物 ， 它的代谢物二磷酸 Gemcitabine （ dFd-CDP ）

可抑制 DNA 的合成。细胞系： RL-7 正常淋巴瘤细胞系

RL-G 耐药淋巴瘤细胞系

突破点：研究相关因子在两个细胞系中的表达量差异

与 Gemcitabine转运相关的因子及细胞内靶点

Gemcitabine 的活化以及降解因子

脱氧胞嘧啶激酶（ dCK ）：使 Gemcitabine 磷酸化

进一步研究

BMC Pharmacology 2004, 4:8

从病人血液样品中提取 DNA 基因型分类：

A/A (Allele 1)

G/G (Allele 2)

G/A (Heterozygote)

CF Q

TV Q

基因型分析

VIC

FAM

VIC

FAM

SNP 检测 - 基因型分析

VIC

FAM

FAMVIC

TV Q

CF Q

A/A (Allele 1)

G/G (Allele 2)

G/A (Heterozygote)

甲基化检测DNA

与 SNP 检测原理类似

基因启动子序列中一个 CpG 则可能会有 2 种结果：

CG 和 TG 。

•未甲基化的 C 碱基突变为 T

•甲基化的 C 碱基则不改变

亚硫酸氢盐

盐处理法

检测方法示意图 盐处理法

甲基化检测 酶切法

MspI 位点特异性酶切，不管甲基化与否

二恶英检测

金标准方法：高效气相色谱－质谱联用（ GC/MS)

昂贵、费时、费力

酶切保护荧光定量 PCR法

多环芳烃受体 AhR ，核转运蛋白 Arnt 二恶英反应元件 DREs （ CYP1A1 基因上游增强子特异序列）

检验检疫相关 ：动物检疫，如各种动物流行病植物检疫，如各种植物流行病食品检测，如各种有害病原微生物，如细菌、支原体

其他方面的应用医院临床诊断：病毒及病原菌的定性定量

公安系统 ：个人身份鉴定考古方面： 古细菌鉴定

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96孔－单通道 96孔－五通道

谢谢