实验九 pcr 扩增检测转基因大豆、玉米

实验九 实验九 PCRPCR 扩增检测转基因大豆、玉扩增检测转基因大豆、玉米米

【【实验目的实验目的】】

通过通过 PCRPCR 扩增方法检测市场常见大豆、玉米扩增方法检测市场常见大豆、玉米产品是否含有转基因成分产品是否含有转基因成分

培养学生的实验设计能力和创新能力培养学生的实验设计能力和创新能力

以大豆特异性内源基因大豆凝集素以大豆特异性内源基因大豆凝集素 (Lecti(Lectin)n) 基因或者玉米特异性内源基因基因或者玉米特异性内源基因 IVRIVR 为内为内参， 花椰菜花叶病毒参， 花椰菜花叶病毒 35S35S 启动子启动子 (CaMV35S(CaMV35S启动子启动子 )) 、农杆菌胭脂碱合成酶终止子、农杆菌胭脂碱合成酶终止子 (NOS(NOS终止子终止子 )) 及外源基因及外源基因 5-5- 烯醇丙酮烯醇丙酮 -- 莽草酸莽草酸 -3--3-磷酸合酶磷酸合酶 (CP4-EPSPS)(CP4-EPSPS) 基因为靶基因检测大基因为靶基因检测大豆和玉米中的转基因成分。豆和玉米中的转基因成分。

【实验原理】【实验原理】

【实验步骤】【实验步骤】大豆、玉米大豆、玉米 DNA DNA 提取提取 ---- 改良的改良的 CTABCTAB 法法

称取称取 0.1g0.1g 样品，在研钵中充分研磨。加入样品，在研钵中充分研磨。加入 1000μL CTAB1000μL CTAB 提取液，提取液，继续研磨充分后加入到继续研磨充分后加入到 1.5mL Ep1.5mL Ep 管中；向管中；向 EPEP 管加入管加入 4μL RNase4μL RNaseAA ，至于，至于 65℃65℃ 水浴，过程中混匀水浴，过程中混匀 3~53~5 次，次， 30min30min ，， 12000r/min12000r/min室温离心室温离心 10min10min ；取上清于新的；取上清于新的 EpEp 管中，加入等体积氯仿：异管中，加入等体积氯仿：异戊醇戊醇 (24: 1)(24: 1) ，轻缓颠倒数次，轻缓颠倒数次 (( 或至于漩涡震荡器上混匀或至于漩涡震荡器上混匀 )) ，室温，室温静置静置 5min5min ，室温，室温 12000r/min12000r/min 离心离心 10min10min ；重复加入氯仿异戊醇；重复加入氯仿异戊醇一到两次 一到两次 (( 过程中如上清液量太少，可适量加入三重蒸馏水过程中如上清液量太少，可适量加入三重蒸馏水 )) ；；取上清于新的取上清于新的 EpEp 管管 (( 千万不要吸入下层液体千万不要吸入下层液体 )) ，再加入等体积，再加入等体积的的 CTABCTAB 沉淀液，轻缓颠倒混匀后室温静置沉淀液，轻缓颠倒混匀后室温静置 1h1h ，， 15000 r/min15000 r/min室温离心室温离心 10min10min ；弃上清液，加入；弃上清液，加入 400μL 1.2mol/L400μL 1.2mol/L 氯化钠溶解氯化钠溶解沉淀，沉淀， 56℃56℃ 温浴温浴 15min15min ，期间轻摇，期间轻摇 EPEP 管数次助溶；加入管数次助溶；加入 800μ800μL -20℃L -20℃ 无水乙醇，无水乙醇， -20℃-20℃ 静置静置 1h1h ，， 15000 r/min15000 r/min 室温离心室温离心 10mi10minn ；弃上清液，用；弃上清液，用 75%75% 乙醇洗涤沉淀两三次后，在室温下自然乙醇洗涤沉淀两三次后，在室温下自然风干用三重蒸馏水溶解储存于风干用三重蒸馏水溶解储存于 4℃4℃ 。。

【【实验步骤实验步骤】】基因组基因组 DNADNA 浓度和纯度的鉴定浓度和纯度的鉴定

取取 5μL5μL 样品溶于样品溶于 95μL95μL 三重蒸馏水中，用 三重蒸馏水中，用 BiophotometerBiophotometer

分析分析 DNADNA 的浓度，通过它对提取大豆的浓度，通过它对提取大豆 DNADNA 测测 ODOD 值。值。并记录数据。由并记录数据。由 OD260nm/OD280nmOD260nm/OD280nm 判定基因组判定基因组 DNADNA

的浓度，其比值在的浓度，其比值在 1.7~2.01.7~2.0 之间较好，符合之间较好，符合 PCRPCR 检测要检测要求。求。

聚合酶链式反应聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction, (Polymerase Chain Reaction, PCR)PCR) 是一种选择性体外扩增是一种选择性体外扩增 DNADNA 的方法，其基的方法，其基本原理类似于本原理类似于 DNADNA 的天然复制过程。 它包括的天然复制过程。 它包括 : : 变性变性 (Denature) (Denature) 、 退火、 退火 (Anneal)(Anneal) 和延伸和延伸 (Exte(Extension)nsion) 三个基本步骤。这三个基本步骤组成一轮三个基本步骤。这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的循环，理论上每一轮循环将使目的 DNADNA 扩增一扩增一倍，这些经合成产生的倍，这些经合成产生的 DNADNA 又可作为下一轮循又可作为下一轮循环的模板，所以经环的模板，所以经 2525 ～～ 3535 轮循环就可使轮循环就可使 DNADNA扩增达扩增达 101066 倍。倍。

检测基因 引物序列 扩增片段长度 基因性质 大豆 Lectin

玉米 IVR

CaMV 35S

NOS

CP4 EPSPS

p1 ： 5’-gcc ctc tac tcc acc ccc atc c-3’

p2 ： 5’-gcc cat ctg caa gcc ttt ttg tg-3’(54 ℃℃)

p3 ： 5’-ccgctgtatcacaagggctggtacc-3’

p4 ： 5’-ggagcccgtgtagagcatgacgatc-3’ (56℃℃)

p5 ： 5’-gat agt ggg att gtg cgt ca-3’p6 ： 5’-gct cct aca aat gcc atc a-3’(54 ℃℃)

p7 ： 5’-gaa tcc tgt tgc cgg tct tg-3’p8 ： 5’-tta tcc tag ttt gcg cgg ta-3’(54 ℃℃)

p9 ： 5’-ctt ctg tgc tgt agc cac tga tgc-3’

p10 ： 5’-cca cta tcc ttc gca aga ccc ttc c-3’ (56 ℃℃)

118 bp

226 bp

195 bp

180 bp

320 bp

内源基因

内源基因

外源基因

外源基因

外源基因

主要试剂主要试剂TaqTaq DNA polymerase DNA polymerase 底物：底物： 10mMdNTP10mMdNTP引物对：引物对： 11μmol/L PCRμmol/L PCR 缓冲液 缓冲液 ddHddH22

OO

主要实验器材主要实验器材

PCRPCR 主要操作步骤主要操作步骤 标记试管标记试管 加入各种试剂、混匀、离心（最后加酶）加入各种试剂、混匀、离心（最后加酶） 设立设立 PCRPCR 循环程序，进行扩增循环程序，进行扩增

标记标记 PCRPCR 反应管反应管

加入试剂加入试剂

【【实验步骤实验步骤】】 1. 1. 在在 0.2 mL Eppendorff0.2 mL Eppendorff 管内调制管内调制 50 μL50 μL 反应反应

体系：体系：

反应物反应物 体积（体积（ μLμL））dd Hdd H22O O 37.537.5PCRPCR 缓冲液 （缓冲液 （ 10×10×）） 55

dNTP dNTP （（ 2.5mM eac2.5mM eachh））

44

引物引物 1 1 11引物引物 2 2 11Taq DNATaq DNA 聚合酶 聚合酶 0.50.5模板模板 DNA DNA 11

反应管放入反应管放入 PCRPCR仪仪

编辑程序进行扩增编辑程序进行扩增

PCR反应包括三个基本步骤变性、退火和延伸。

2. 2. 按下述程序进行按下述程序进行 PCRPCR 扩增扩增 :: 11） ） 94℃ 94℃ 预变性 预变性 3 min3 min ；； 22） ） 94℃ 94℃ 变性 变性 1 min1 min ；； 33） ） 54℃54℃ ( ( 或者或者 56℃56℃ ) ) 退火 退火 45 sec45 sec ；； 44） ） 72℃ 72℃ 延伸 延伸 1 min1 min ；； 55） 重复步骤） 重复步骤 2~4, 292~4, 29 次；次； 66） ） 72℃ 72℃ 延伸 延伸 10 min10 min ；； 77） ） End.End.

3. 3. 琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测 PCRPCR 扩增结果扩增结果

配制配制 0.80.8 ％琼脂糖凝胶，取％琼脂糖凝胶，取 PCRPCR 产物产物5μL5μL 加加 1μL1μL 点样液混合后点入上样孔，点样液混合后点入上样孔，于于 120V120V 电压电泳电压电泳 20~30min20~30min 。电泳结。电泳结束后，用自动凝胶成像分析系统检测束后，用自动凝胶成像分析系统检测

外源启动子 (CaMV35S)特异性扩增 外源终止子 (NOS) 特异性扩增

内源基因 (Lectin) 特异性扩增 外源基因 ( EPSPS) 特异性扩增

1 2

M 1 2 3 4 5 6 7

M 1 2 3 4 5 6 7

M 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 M

1 未加模板对照 2 转基因大豆、玉米 3~7 非转基因大豆、玉米

PCR 假阳性结果1． 引物设计不当，应调换引物2． 循环参数不合适，导致非特异性扩增3． 靶序列的交叉污染

PCR 假阴性结果1． 模板问题2． 试剂浓度不够3． 标本中有 Taq 酶的抑制剂4． PCR 产物检测系统灵敏度不够

【【注意事项】】

1 提取高质量的模板 DNA 是 PCR 成功的决定因素之一

2 注意防止试剂的交叉污染

分析 PCR 产物电泳结果，判断所测样品是否含转基因成分。

五 结果处理

【思考题】【思考题】

11 、影响、影响 PCRPCR 反应效率的因素有哪些？反应效率的因素有哪些？ 22 、为什么检测转基因大豆或者玉米时，以、为什么检测转基因大豆或者玉米时，以

大豆凝集素大豆凝集素 (Lectin)(Lectin) 基因、玉米特异性内源基因、玉米特异性内源基因基因 IVRIVR 为内参 ？为内参 ？