07-03-2007€¢07-03-2007 •1 lípidos triacilgliceróis, diacilgliceróis e monoacilgliceróis...
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•07-03-2007
•1
Lípidostriacilgliceróis, diacilgliceróis e monoacilgliceróisácidos gordos livresfosfolípidosesteróiscarotenóidesvitaminas A e D
Análise de lípidos
Componentes alimentares insolúveis em águasolúveis em solventes orgânicos
extraem ácidos gordos livres, mono, di e triacilgliceróis, fosfolípidos, glicolípidos e esfingolípidos
extraem parcialmente esteróis, ceras, pigmentos lipossolúveis e vitaminas
Análise de lípidos
•07-03-2007
•2
glicolípidos solúveis em álcooisbaixa solubilidade em hexano
triacilgliceróis solúveis em hexano e éter de petróleonão polares
Análise de lípidos
Preparação da amostrapode ser necessário conservar a amostra em atmosfera de N2,
baixa temperatura, escuras ou adicionar antioxidantesevitar oxidação do lípidos
passos comuns:pré-secagem
estufa sob vácuo a baixa temperaturaliofilizaçãoamostra mais fácil de moeremulsões quebradaslibertação de gordura dos tecidos
redução do tamanho da partículahidrólise ácida
quebra ligações covalentes e iónicasamostra pré-digerida com HCl 3 N (refluxo)
adição de EtOH e hexametafosfato facilitam separação dos lípidos, antes da extracção com solventes
Análise de lípidos
•07-03-2007
•3
razões:económica
não desperdiçar ingredientes caroslegalsaúdequalidadeprocessamento
condições variam em função do teor lipídico
Análise de lípidos
Métodos de extracçãosolvente a quentesolvente friohidrólise ácida e alcalina
Análise de lípidos Concentração total
•07-03-2007
•4
Extracção com solvente a quenteextracção da gordura da amostra com solventeeliminação do solvente por evaporaçãoquantificação da gordura extraída por pesagem
Análise de lípidos Concentração total
escolha do solvente depende dos componentes lipídicos existentes no alimento
extracção mais eficaz quando amostra seca antes da análisemaior penetração do solventepode usar-se amostra que foi utilizada para determinar
humidadepreparação cuidadosa da amostra
evitar degradaçãoalimentos processados
lípidos ligados a hidratos de carbono e proteínasnecessária hidrólise ácida ou básica ou outros métodos
de preparaçãocontrolo da temperatura e tempo de contacto com o solvente
Análise de lípidos
Extracção com solvente a quente
Concentração total
•07-03-2007
•5
eficiência depende de:natureza da amostratamanho das partículas
quanto menor, mais fácil a penetração do solventehumidade da amostra
água dificulta penetração do solvente orgânico imiscívelnatureza do solventesemelhança das polaridades do solvente e da amostraligação dos lípidos com outros componentes da amostracirculação do solvente através da amostravelocidade do refluxo
muito elevada leva a pouca penetração do solventeproporção relativa entre solvente e material a ser extraído
mais solvente, maior extracçãosolvente em excesso acarreta preço elevado
Análise de lípidos
Extracção com solvente a quente
Concentração total
solventesrequisitos:
elevada solubilidade para lípidosbaixa solubilidade para proteínas, aminoácidos e hidratos
de carbonoevaporar rapidamentenão deixar resíduosbaixo ponto de ebuliçãonão inflamávelnão tóxico
líquido e gásnão higroscópicobarato
Análise de lípidos
Extracção com solvente a quente
Concentração total
•07-03-2007
•6
solventeséter etílico
solvente de uso mais amplotambém extrai vitaminas, esteróides, resinas e
pigmentoscompostos geralmente presentes em pequenas
quantidadeserro aceitável
mais caro e perigosopode acumular água durante extracção
éter de petróleomais utilizadomais baratomenos higroscópicomenos perigoso
Análise de lípidos
Extracção com solvente a quente
Concentração total
solventespentano e hexano usados em alguns alimentospor vezes (lacticínios, …) é conveniente usar misturas de
solventes
Análise de lípidos
Extracção com solvente a quente
Concentração total
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equipamentos:Soxhlet
usa refluxo de solventeprocesso de extracção intermitenteutilizado apenas com amostras sólidasquantidade de solvente elevada
volume total suficiente para atingir sifãovantagem
evita contacto longo da amostra com solvente muito quente
não há decomposição da gorduradesvantagem
possível saturação do solventepermanece em contacto com a amostra antes de
ser sifonadodificulta a extracção
Análise de lípidos
Extracção com solvente a quente
Concentração total
Soxhletprocedimento:
amostras com >10% H2Osecar em estufa de vácuo, 5 h
pesar 2 g de amostra para um cadinho de extracção previamente seco
cobrir amostra com lã de vidropesar balão previamente secoencher balão com éter etílico anidro (ou éter de
petróleo)montar o sistema de extracção
aquecer o solventeextrair durante 4 h (5-6 gotas/s) ou 16 h (2-3
gotas/s)secar balão com extracto
30 min, estufa a 100 ºCarrefecer em exsicador e pesar
Análise de lípidos
Extracção com solvente a quente
Concentração total
•07-03-2007
•8
Soxhletcálculos:
Análise de lípidos
Extracção com solvente a quente
Concentração total
g gordura na amostra% gordura relativa a peso seco = ( ) x 100
g amostra seca
equipamentos:Goldfish
usa refluxo de solventeprocesso de extracção contínuo
mais rápidoutilizado apenas em amostras sólidasvantagens
utiliza menos solventeamostra permanentemente em contacto com solvente
desvantagenscontacto do solvente muito quente com a amostra
degradação da gorduraextracção pode ser incompleta
Análise de lípidos
Extracção com solvente a quente
Concentração total
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•9
Goldfishprocedimento:
secar e pesar um cadinho poroso de cerâmicacolocar amostra previamente seca em estufa de vácuo
e pesarpesar frasco de extracção previamente secoencher com éter etílico anidro (ou éter de petróleo)colocar tudo no aquecedor do aparelhoextrair 4 hdeixar arrefecerremover frasco de extracção
secar ao ar durante a noitesecar 30 min a 100 ºC
arrefecer no exsicador e pesar
Análise de lípidos
Extracção com solvente a quente
Concentração total
Goldfishcálculos:
Análise de lípidos
Extracção com solvente a quente
Concentração total
Peso de gordura na amostra = (frasco + gordura) - frasco
g gordura na amostra% gordura relativa a peso seco = ( ) x 100
g amostra seca
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•10
equipamentos:extracção acelerada
trabalha-se a temperatura e pressão mais elevadasaumento da temperatura aumenta eficácia da
extracçãonecessário trabalhar a pressão elevada para
manter solvente no estado líquidomenor quantidade de solvente necessária
menor customenos problemas ambientais
Análise de lípidos
Extracção com solvente a quente
Concentração total
equipamentos:extracção acelerada por solvente
pode operar-se em modos estático ou dinâmicomodo estático
não há fluxo de solventemodo dinâmico
solvente fresco flui continuamente através da amostra
utilização de gás comprimido conduz gordura solubilizada para um recipiente de recolha
solvente evaporadogordura seca e pesada
Análise de lípidos
Extracção com solvente a quente
Concentração total
•07-03-2007
•11
extracção acelerada por solventemodo dinâmico
mais rápidomaior consumo de solvente
modo estáticomais adequado para análise de pequenas quantidades
combinação de ambos geralmente produz melhores resultados
Análise de lípidos
Extracção com solvente a quente
Concentração total
extracção acelerada por solventeprocedimento:
pesar 3-5 g de amostra seca e moídacolocar na célula de extracçãofechar célula e colocar no forno
aquecer a 150 ºCabrir válvula estática
fazer correr solvente para a célulaaté acumular 1 mL no recipiente de recolha
fechar válvula estática e pressurizar até ~13.8 MPa (140 atm)
extracção estática durante 10 minabrir válvula e deixar entrar solvente frescorecolher extracto no recipiente de recolhaforçar o solvente para o recipiente de recolha
evaporar num balão previamente pesadorotavap, 50 ºC, 60 min
pesar
Análise de lípidos
Extracção com solvente a quente
Concentração total
processo misto
estático + dinâmico
•07-03-2007
•12
extracção acelerada por solventecálculos:
Análise de lípidos
Extracção com solvente a quente
Concentração total
peso gordura + balão - peso balão% gordura = x 100
peso amostra seca
equipamentos:extracção supercrítica
usa CO2 supercrítico como solventepropriedades de gás
penetra facilmente na amostra para extrair os lípidos
propriedades de fluidocapaz de dissolver grandes teores de lípidos
(sobretudo a pressão elevada)procedimento
amostra aquecida numa câmara pressurizadamisturada com CO2 supecríticoCO2 extrai lípidos e forma fase separada dos
componentes hidrossolúveispressão e temperatura do solvente reduzidas
CO2 volta ao estado gasosofracção lipídica isolada e determinada
Análise de lípidos
Extracção com solvente a quente
Concentração total
•07-03-2007
•13
extracção supercríticapor vezes necessário usar modificadores (co-solventes)
MeOH, ...extracção de compostos muito polares
SFE pode ser acoplado a GCseparação e quantificação dos componentes
Análise de lípidos
Extracção com solvente a quente
Concentração total
cálculos:
Análise de lípidos
Extracção com solvente a quente
Concentração total
peso gordura + recipiente peso recipiente% gordura = x 100
peso amostra seca
•07-03-2007
•14
Extracção com solvente frio – método de Bligh-Dyerutiliza uma mistura de 3 solventes
clorofórmio, metanol, águaamostra misturada com clorofórmio e MeOH
uma única fase com a amostraadição de H2O e mais clorofórmio
forma 2 fasesuma fase de CHCl3 contendo lípidosuma fase de MeOH + H2O com substâncias não lipídicas
fase lipídica isoladaCHCl3 evaporadogordura pesada
Análise de lípidos Concentração total
vantagens relativamente a extrcção a quente:extrai todos os lípidos (incl. polares)extracção sem aquecimento
extractos podem ser usados para determinar índices de peróxidos e ácidos gordos livres, carotenóides, vit. E, composição de ácidos gordos e esteróis
utiliza-se com produtos secos e húmidosdeterminação não requer equipamento sofisticado
pode ser realizada em tubo de ensaio
Análise de lípidos
Extracção com solvente frio
Concentração total
•07-03-2007
•15
Ex:produtos com >20% de teor de gordura
pesar 2-5 gprodutos com <20% de teor de gordura
pesar 3-3.5 gamostras moídascolocar amostras pesadas em tubos de ensaio de 70 L
adicionar 10 mL CHCl3, 20 mL MeOH, 8 mL H2Ofechar hermeticamente
agitar 30 minadicionar 10 mL CHCl3 e 10 mL de sol. sulfato de sódio 1.5%
tapar e agitar 2 minfase de clorofórmio separa
fase inferior contendo lípidosseparar as fases
Análise de lípidos
Extracção com solvente frio
Concentração total
Ex:retirar 13-15 mL da fase inferior
colocar num tubo de ensaio de 30 mLadicionar 1 g sulfato de sódio anidro
tapar e agitarremoção de restos de água
filtrar rapidamente sobre papel de filtrosolução límpida
medir 5 mL do filtrado para um copo de 50 mL, previamente pesado
colocar em estufa a 100 ºC, até evaporar o solventearrefecer em exsicador e pesar
Análise de lípidos
Extracção com solvente frio
Concentração total
•07-03-2007
•16
Extracção de lípidos ligados a outros compostos – hidrólises ácida e alcalina
usada em alimentos nos quais lípidos ligados a proteínas e hidratos de carbono
leite, pão, ...
Análise de lípidos Concentração total
Hidrólise ácida – processo de Gerbermétodo de rotina para leite e lacticíniosamostra tratada com H2SO4
adicionado álcool isoamílicofacilita separação da gordurareduz efeito de carbonização do ácido sobre gordura
após digestão, amostra centrifugadatubo com escala volumétrica
butirómetro
Análise de lípidos
Extracção de lípidos ligados a outros componentes
Concentração total
•07-03-2007
•17
processo de Gerberprocedimento:
transferir 10 mL H2SO4 (15-21 ºC) para uma garrafa de Gerberadicionar 11 mL de leitefacilita separação da gorduraadicionar 1 mL álcool isoamílicotapar e agitarcentrifugar 4 mincolocar a garrafa num banho de água a 60-63 ºC, 5 min
ler teor de gordura na escala graduada
Análise de lípidos
Extracção de lípidos ligados a outros componentes
Concentração total
Hidrólise ácidarequisitos:
densidade do H2SO4 usado = 1.82necessário diluir
leitura da gordura no butirómetro feita a 71 ºC
Análise de lípidos
Extracção de lípidos ligados a outros componentes
Concentração total
•07-03-2007
•18
Hidrólise ácida – processo de Babcockutiliza H2SO4 para hidrólise da proteína
diferentes quantidades de amostra e ácido adicionadasadiciona-se água quente em vez de álcool isoamílico
método volumétricomedida feita em tubo graduado
Análise de lípidos
Extracção de lípidos ligados a outros componentes
Concentração total
processo de Babcockprocedimento:
pipetar a amostra de leite (17.6 mL) para uma garrafa de Babcock
adicionar 17.5 mL H2SO4
ácido hidrolisa proteínascentrifugar a mistura 5 min (55-60 ºC)
gordura líquida sobe para o gargalo calibradoadicionar água quente
ler percentagem de gordura por peso
Análise de lípidos
Extracção de lípidos ligados a outros componentes
Concentração total
•07-03-2007
•19
Hidrólise ácidamétodo de Gerber mais usado na Europamétodo de Babcock mais usado nos EUAambos métodos não determinam fosfolípidosmétodo de Gerber mais rápido
Análise de lípidos
Extracção de lípidos ligados a outros componentes
Concentração total
Método detergentealternativa à utilização de ácidos muito corrosivos
amostra misturada com mistura de tensioactivos num tubo de Babcock
tensioactivos perturbam membranas dos glóbulos de gordura no leite
coalescem e separam-seamostra centrifugada
gordura desloca-se para o gargalo graduado do tuboconcentração determinada
Análise de lípidos
Extracção de lípidos ligados a outros componentes
Concentração total
•07-03-2007
•20
Hidrólise alcalina – método de Rose-Gottlieb e Mojonniermétodo descontínuonão requer secagem da amostrapode ser usado com amostras líquidas ou sólidasamostra tratada com hidróxido de amónio e álcool
hidrolisa ligação entre proteína e gorduragordura separada extraída com éter de petróleo e éter etílico
éter de petróleo mais eficaz em amostras com muito açúcarleite condensado, ...
Análise de lípidos
Extracção de lípidos ligados a outros componentes
Concentração total
método de Mojonniergordura no leite
preparação da amostraamostra homogeneizada a 20 ºC (até 38 ºC, se necessário)
pesar 10 g de leite para um balão de Mojonnieradicionar 1.5 mL NH4OH
agitar vigorosamenteNH4OH neutraliza a amostra e dissolve proteínas
adicionar 10 mL EtOH 95%agitar 90 s
EtOH impede formação de geladicionar 25 mL éter etílico
agitar 90 séter dissolve lípidos
Análise de lípidos
Extracção de lípidos ligados a outros componentes
Concentração total
•07-03-2007
•21
método de Mojonnierarrefecer e adicionar25 mL éter de petróleo
agitar 90 séter de petróleo elimina humidade e dissolve lípidos
não polarescentrifugar 30 s a 600 rpmdecantar para prato de Mojonnier previamente pesadorepetir procedimento mais 2 vezesevaporar solvente do prato aquecendo (≤100 ºC)secar o prato e a gordura até peso constante em estufa com
ventilação (100 ºC)arrefecer até tempeartura ambiente e pesar
Análise de lípidos
Extracção de lípidos ligados a outros componentes
Concentração total
método de Mojonniercálculos:
necessário preparar brancos10 mL H2O em vez de leite
Análise de lípidos
Extracção de lípidos ligados a outros componentes
Concentração total
(peso prato + gordura) - peso prato - pe so médio resíduo branco% gordura = 100 x
peso amostra
•07-03-2007
•22
método de Mojonniergordura em farinhas ou em rações
misturar 2 g amostra com 2 mL EtOH, num copo de 50 mLadicionar 10 mL HCl
colocar copo em banho de água a 70-80 ºCagitar 30-40 min
dá-se a hidróliseNH4OH neutraliza a amostra e dissolve proteínas
adicionar 10 mL EtOH e arrefecerextrair com éter etílico e éter de petróleo
idêntico a método para leite
Análise de lípidos
Extracção de lípidos ligados a outros componentes
Concentração total
Métodos instrumentaismedição de propriedades físicas brutasmedida de adsorção de radiaçãomedida da dispersão de radiação
Análise de lípidos Concentração total
•07-03-2007
•23
Medição de propriedades físicas brutasdensidade
densidade de um óleo inferior à da maioria dos restantes componentes
densidade diminui com aumento do teor de gordura do alimento
conductividade eléctricaconductividade eléctrica de lípidos inferior ao das substâncias
hidrossolúveisconductividade diminui à medida que teor de lípidos do
alimento aumentavelocidade ultrasónica
velocidade de ultrasons através de um alimento depende da concentração de gordura
técnica rápida e não destrutivapermite análise on-line
Análise de lípidos Concentração total
Medida de adsorção de radiaçãoabsorção electrónica (UV-Vis)
absorvância de um lípido é proporcional à sua concentraçãolípido extraído e diluído num solvente adequado
técnica pode ser demorada e laboriosaabsorção no IV
vibrações e rotações moleculares associadas a moléculas de gordura a 5730 nm
maior intensidade indica maior teor de gorduratécnica rápidapermite quantificção on-line
requer recta de calibração
Análise de lípidos Concentração total
•07-03-2007
•24
Medida de adsorção de radiaçãoNMR
método de rotina para determinar lípidos totaismedição da área dos picos correspondentes à fracção
lipídicamuitas vezes, determinação feita em segundos, sem
necessidade de preparação de amostraabsorção de raios X
carne magra absorve rais X mais fortemente que carne gordaabsorção de raios X diminui com aumento da concentração
em lípidospermite quantificção on-line
requer recta de calibração
Análise de lípidos Concentração total
Medida da dispersão de radiaçãodispersão de luz
turbidez de uma emulsão é directamente proporcional à concentração de gotículas de óleo presentes
dispersão de ultrasonsvelocidade e absorção de ultrasons por uma emulsão estão
relacionadas com a concentração das gotículas de óleovelocidade do som no leite
aumenta ou diminui quando o teor de gordura aumenta ou diminui acima ou abaixo de um valor crítico
Análise de lípidos Concentração total
•07-03-2007
•25
Caracterização de óleos e gordurasrazões para determinação da composição lipídica de um alimento:
legalrótulos expressam teores de lípidos saturados, insaturados
e polinsaturados, teor de colesterol, ...qualidade
tipos de lípidos afectam aparência, flavour, textura, corpo, ...
oxidaçãoalimentos com maiores teores de lípidos insaturados mais
susceptíveis a oxidaçãoformação de aromas e sabores desagradáveisformação de compostos potencialmente tóxicos
óxidos de colesterol
Análise de lípidos
adulteraçãoanálise do tipo de lípidos presentes
processamentocondições de processamento dependem do tipo de lípidos
presentestemperaturas, fluxos, ...
Análise de lípidos Composição lipídica
•07-03-2007
•26
preparação da amostraalimentos predominantemente compostos por lípidos
azeite, óleo, ...pouca preparação
restantes alimentosextrair e purificar lípidos antes da análise
aplicação de pressão para extrair óleoalguns peixes, frutos secos, sementes
extracção com solventes ou outros processosapós separados, lípidos são derretidos e filtrados ou
centrifugadosremoção de impurezas
remoção de restos de águaminimização da oxidação
adição de antioxidantesatmosfera de N2
evitar expor à luz e calor
Análise de lípidos Composição lipídica
medida da insaturaçãohabitualmente feita através do índice de iodo
g de I2 adicionadas por 100 g de amostrapode ser utilizado outro halogénio (F, Cl, Br), mas
resultado sempre expresso em termos de iodoreacção de adição de halogénios às ligações duplas dos
ácidos gordos insaturadosmaior insaturação ɸ maior índice de iodo
maior possibilidade de rancidez por oxidação
Análise de lípidos Composição lipídica
Técnicas químicas
•07-03-2007
•27
determinação do índice de iodoadição de um halogénio (ICl ou IBr) a uma dada massa de
amostraadiciona-se KI antes da titulação do excesso de
halogéniofornece a quantidade equivalente de iodo
ICl + KI ↓ I2 + KClIBr + KI ↓ I2 + KBr
I2 titulado com tiossulfato de sódio, usando amido como indicador
Análise de lípidos
Técnicas químicas
Composição lipídica
determinação do índice de iodoICl – método de Wijs
mais utilizadomaior exactidão
IBr – método de Hanusreagente mais estável
Análise de lípidos
Técnicas químicas
Composição lipídica
•07-03-2007
•28
determinação de adulteraçãoutiliza-se medida do índice de saponificação
mg de KOH necessário para neutralizar os ácidos gordos resultantes da hidrólise completa de 1 g da amostra
indica quantidade relativa de ácidos gordos de alto e baixo peso molecular
ésteres de ács. gordos de baixo PM requerem mais base para saponificação
índice de saponificação inversamente proporcional ao PM dos ács. gordos presentes nos triacilgliceróis
num mesmo peso de amostramaior nº de grupos carboxilo se ács. gordos
tiverem predominantemente baixo PMíndices de saponificação diferem de óleo para óleo
determinação de adulterações
Análise de lípidos
Técnicas químicas
Composição lipídica
determinação do índice de saponificaçãoamostra em solução alcoólica de KOH
aquecida em banho-maria, 1 hjuntar fenolftaleína e titular o excesso de base com HCl
Análise de lípidos
Técnicas químicas
Composição lipídica
•07-03-2007
•29
caracterização da rancidezrancidez hidrolítica
hidrólise da ligação éster por lipase e humidadeacelerada por luz e calor
formação de ácidos gordos livresflavour desagradável
rancidez oxidativaautoxidação dos acilgliceróis com ácidos gordos
insaturados, pelo O2 atmoféricodestruição de vitaminas lipossolúveis e ács. gordos
essenciaisformação de subprodutos com flavour forte e
desagradável
Análise de lípidos
Técnicas químicas
Composição lipídica
rancidez hidrolítica medida pelo índice de acidez3 modos de expressão:
peso (mg) de KOH necessário para neutralizar os ács. gordos livres em 1 g de amostra
volume (mL) de NaOH 1N necessário para neutralizar ács. gordos em 100 g de gordura
percentagem (em peso) de ács. gordos livres em relação a um ácido gordo específico
procedimentodissolução da gordura num solvente neutralizadotitulação com uma solução padrão de NaOH
indicador - fenolftaleína
Análise de lípidos
Técnicas químicas
Composição lipídica
•07-03-2007
•30
rancidez oxidativa medida por:índice de peróxidoíndice de p-anisidinamedição dos compostos orgânicos voláteis (VOCs)
ex: hexanalteste do ácido tiobarbitúrico (TBA)índice de iodovalor ácidoensaio de Kreisteste de oxiranomedida de dienos e trienos conjugadosmedida de compostos com carbonilos, voláteis ou totaismedida de compostos polaresmedida de hidrocarbonetos gasosos
Análise de lípidos
Técnicas químicas
Composição lipídica
índice de peróxidoperóxidos são os primeiros compostos formados durante a
deterioração de uma gorduraprocedimento
dissolve-se um peso de gordura numa solução de ácido acético/clorofórmio
adiciona-se KI em excessoKI reage com peróxidos, libertando I2
ROOH + KI ↓ ROH + KOH(excesso) + I2
titula-se I2 libertado, com solução padrão de tiossulfato de sódio
indicador – amido
I2 + amido(azul) + 2 Na2S2O3 ↓ 2NaI + amido(incolor) + Na2S4O6
Análise de lípidos
Técnicas químicas
Composição lipídica
•07-03-2007
•31
índice de peróxidoresultado expresso como miliequivalente de peróxido
por 1000 g de amostra
Análise de lípidos
Técnicas químicas
Composição lipídica
(S - B) x NÍndice de peróxido = x 1000
W
S – volume titulante para a amostra (mL)
B – volume titulante para o branco (mL)
N – normalidade Na2S2O3 (mEq/ mL)
1000 – factor de conversão (g/kg)
W – massa da amostra (g)
índice de peróxidovalor baixo:
início da oxidaçãoou
oxidação avançadamedição do índice ao longo do tempo permite
distinguirvalor > 20
óleo ou gordura de muito baixa qualidadevalor = 0
óleo ou gordura de elevada qualidade
desvantagem:necessidade de amostra grande (5 g)
Análise de lípidos
Técnicas químicas
Composição lipídica
•07-03-2007
•32
índice de p-anisidinacalcula a quantidade de aldeídos e insaturados
produtos secundários da oxidaçãoaldeídos reagem com p-anisidina
forma composto cromóforomedido espectrofotometricamente
Análise de lípidos
Técnicas químicas
Composição lipídica
índice de p-anisidina
Análise de lípidos
Técnicas químicas
Composição lipídica
•07-03-2007
•33
índice de p-anisidinaíndice totox
indica a oxidação total de uma amostra, usando índice de peróxido e índice de p-anisidina
Índice totox = Índice de p-anisidina + 2 x Índice de peróxido
sobe continuamente durante a oxidação
Análise de lípidos
Técnicas químicas
Composição lipídica
índice de p-anisidina100 vezes a absorvância a 350 nm de uma solução
contendo 1 g da gordura diluída para 100 mL numa mistura de isooctano (solvente) e p-ansidina
Análise de lípidos
Técnicas químicas
Composição lipídica
•07-03-2007
•34
medição dos compostos orgânicos voláteis (VOCs)produtos secundários da autoxidação, responsáveis por
sabores e aromas desagradáveiscompostos formados dependem da amostra e das
condições ambientaiscompostos habitualmente medidos:
pentanopentanalhexanal2,4-decadienal
medição do hexanal no espaço de cabeça permite seguir a extensão da oxidação
normalmente feita por “headspace” estático
Análise de lípidos
Técnicas químicas
Composição lipídica
medição dos compostos orgânicos voláteisprocedimento:
amostra pequena colocada num recipiente fechado por um septo
pode adicionar-se um padrão interno4-heptanona
recipiente selado e aquecidoaquecimento aumenta concentração de voláteis
retirar alíquota e injectar em GC-FID ou GC-MSárea do pico dá teor de hexanal
existem aparelhos automatizadosaquecem amostra e garantem análise de volume
constanteoutros VOCs podem ser medidos simultaneamente
melhor caracterização da oxidação
Análise de lípidos
Técnicas químicas
Composição lipídica
•07-03-2007
•35
medição dos compostos orgânicos voláteisvantagem:
não requer extracção de lípidosanálise de alimentos intactos
Análise de lípidos
Técnicas químicas
Composição lipídica
índice de TBAmede um produto secundário da autoxidação
malonaldeídocompostos de oxidação das gorduras reagem com
ácido 2-tiobarbitúricoprodutos de cor vermelha
medição espectrofotométricaamostra pode ser feita reagir directamente com TBA
muitas vezes previamente destiladaeliminação de interferentes
existem diversas versões do teste
Análise de lípidos
Técnicas químicas
Composição lipídica
•07-03-2007
•36
índice de TBAprocedimento:
dissolução da amostra de gordura num solvente orgânico (benzeno, clorofórmio, CCl4)
extracção do material reactivo com solução de ác. acético/ác. tiobarbitúrico/água
extracto aquoso aquecidoaparece cor vermelha se contiver gordura
oxidadapigmento resulta da condensação de 2
moléculas de TBA com 1 de malonaldeído
intensidade da cor pode ser quantificada em espectrofotómetro
Análise de lípidos
Técnicas químicas
Composição lipídica
índice de TBAprocedimento com destilação da amostra:
amostra pesada e misturada com H2OpH ajustado a 1.2amostra colocada em balão de destilação
rapidamente destiladaprimeiros 50 mL recolhidos
alíquota reage com TBAaquecimento em banho de água; 35 min
absorvância lida a 530 nmvalores convertidos em mg malonaldeído por
kg amostracurva de calibração
Análise de lípidos
Técnicas químicas
Composição lipídica
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•37
índice de TBAmelhor correlação com características sensoriais que
índice de peróxidométodo apenas válido nos primeiros estágios de
oxidaçãoestágios mais avançados causam alteração nos
compostos produzidosespecificidade limitada, mas muito usado em produtos
cárneosprodutos secundários da reacção podem reagir com
TBATBARS
Análise de lípidos
Técnicas químicas
Composição lipídica
índice de TBAalternativa à medida espectrofotométrica
determinação do teor em malonaldeído por análise do destilado em HPLC
Análise de lípidos
Técnicas químicas
Composição lipídica
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•38
medição de dienos conjugadosapós formação de peróxidos, ligações duplas não
conjugadas dos lípidos insaturados são convertidas em ligações duplas conjugadas
dienos conjugados absorvem radiação a 233 nmtrienos conjugados a 268 nm
dissolve-se lípido num solvente orgânico adequadoisooctano, ciclohexano
mede-se absorvância ao longo do temponos estádios mais avançados da oxidação
dienos conjugados degradadosprodutos não absorvem
processo apenas válido na primeira fase da oxidação
Análise de lípidos
Técnicas químicas
R
RR
R
Composição lipídica
ensaios de oxidação aceleradaaceleram artificialmente velocidade de oxidaçãoexposição dos lípidos a:
calorO2
catalisadores metálicosluzenzimas
período de induçãoperíodo de tempo antes da detecção de rancidez
outempo antes da aceleração da autoxidaçãodá indicação sobre estabilidade à oxidação durante
armazenamento e sobre eficácia de antioxidantes
Análise de lípidos
Técnicas químicas
Composição lipídica
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•39
ensaios de oxidação aceleradamétodo do oxigénio activo
amostra líquida aquecida a 98 ºCborbulha-se ar
voláteis ácidos recolhidos numa armadilha de água desionizada
condutividdae da água continuamente medidaestabilidade expressa em termos de tempo (h) de
aquecimento até ocorrer rancidezdeterminada por detecção de odor ou medição do
índice de peróxidosaplicável a todos os óleos e gorduras
Análise de lípidos
Técnicas químicas
Composição lipídica
ensaios de oxidação aceleradamétodo do forno de Schaal
método recomendado pela AOCSmassa conhecida de óleo colocada num forno a uma
dada temperaturageralmente 65 ºC
mecanismo de oxidação idêntico ao que ocorre à temperatura ambiente
teste efectuado às escurasmede-se tempo até ocorrer rancidez
detecção sensorial ou índice de peróxidosdeterminação do período de indução
Análise de lípidos
Técnicas químicas
Composição lipídica
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•40
ensaios de oxidação aceleradabomba de oxigénio
medição do tempo necessário para o início do rápido desaparecimento de O2, num sistema fechado
determinação da estabilidade oxidativaprocedimento:
amostra colocada num contentor pressurizado com O2 (~700 kPa)
contentor colocado num banho de água a ferverperíodo de indução determinado por medição do
tempo até ocorrer uma queda de pressão significativa
absorção de O2 pela amostravantagem:
podem ser usado com alimentos intactosnão requer extracção de lípidos
Análise de lípidos
Técnicas químicas
Composição lipídica
Análise de fracções lipídicasácidos gordosmono, di e triacilgliceróisfosfolípidosesteróispigmentos lipossolúveisvitaminasquantificação de gorduras saturadas, monoinsaturadas,
polinsaturadas e ácidos gordos transpoliésteres de sacarosetriacilgliceróis de cadeia média e de cadeia curta
muitos destes componentes determinados por análise da composição em ácidos gordos
cálculos permitem determinar gordura total, gordura saturada, índice de iodo e índice de saponificação
Análise de lípidos
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Métodos cromatográficosGC
ideal para análise de lípidosácidos gordos totaisdistribuição e posição dos ácidos gordos nos lípidosestudos de estabilidade e oxidaçãoestudos sobre danos causados por aquecimento e
irradiaçãodetecção de adulterantes e antioxidantes
GC-MS permite identificaçãoHPLCTLC
barato e fácil utilização
Análise de lípidos
Fracções lipídicas
TLCmétodo rápido e baratoseparação e determinação de triacilgliceróis, diacilgliceróis,
monoacilgliceróis, colesterol, óxidos de colesterol e fosfolípidosmanchas podem ser raspadas e analisdas por GC, NMR ou MS
Análise de lípidos
Técnicas cromatográficas
Composição lipídica
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TLCadsorvente – silica gel Geluente – hexano/éter dietílico/ácido fórmico (80:20:2 vol/vol/vol)placas nebulizadas com 2’,7’-diclorofluoresceína em MeOHreveladas sob UV
manchas amarelas
Análise de lípidos
Técnicas cromatográficas
Composição lipídica
GCdeterminação da composição em ácidos gordostriacilgliceróis e ácidos gordos livres pouco voláteis
derivatização para aumentar volatilidadetriacilgliceróis saponificados
hidrólise em glicerol e ácidos gordos livresácidos gordos metilados
saponificação reduz PMmetilação reduz polaridade
aumento da volatilidade
Análise de lípidos
Técnicas cromatográficas
Composição lipídica
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GCprocedimento:
lípidos extraídoshexano/isopropanol (3:2)
solvente evaporadoadicionar NaOH, MeOH, trifluoreto de boro e heptano
H2SO4 em alternativa ao trifluoreto de borolevar a refluxoretirar uma alíquota da fase de heptano
secar com Na2SO4 anidrodiluir para 5-10%injectar no GC
Análise de lípidos
Técnicas cromatográficas
Composição lipídica
GCésteres metílicos dos ácidos gordos (FAMEs) analisados por GC
separação baseada em PM e polaridadecaracterização e quantificação dos ács.gordos
presentes na amostra
Análise de lípidos
Técnicas cromatográficas
Composição lipídica
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•44
determinação de colesterollípidos saponificadoscolesterol extraído da fracção não saponificável e derivatizado
formação de éteres de TMSquantificação por GC capilar
Análise de lípidos
Técnicas cromatográficas
Composição lipídica
determinação de colesterolprocedimento:
lípidos saponificados a partir do alimentoextracção da fracção não saponificável
filtrar alíquota da fase de clorofórmio através de Na2SO4
anidroevaporar até secura
corrente de azoto em banho de águaadicionar KOH conc. e EtOHlevar a refluxo
adicionar benzeno e KOH 1Nagitar
remover fase aquosarepetir procedimento com KOH 0.5 N
Análise de lípidos
Técnicas cromatográficas
Composição lipídica
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determinação de colesterolprocedimento:
lavar diversas vezes com águasecar fase de benzeno sobre Na2SO4 anidro
levar uma alíquota à secura em evaporador rotativoresíduo dissolvido em DMF
alíquota derivatizada com hexametildissilazano e trimetilclorosilano
adicionar água e padrão interno em heptanocentrifugarremover fase aquosaalíquota da fase de heptano injectada no GC
Análise de lípidos
Técnicas cromatográficas
Composição lipídica
determinação de colesterolalimentos cárneos e congelados
passo de extracção desnecessárioamostra directamente saponificada
Análise de lípidos
Técnicas cromatográficas
Composição lipídica
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produtos de oxidção do colesterolGCHPLCTLC
Análise de lípidos
Técnicas cromatográficas
Composição lipídica
oxidação medida por cromatografiamelhor método de controlo, sobretudo se hifenada a MS ou NMRpermite seguir evolução ao longo do tempo
perca de lípidos insaturadosformação de produtos de reacção
aldeídos, cetonas, hidratos de carbonomedições podem ser feitas em:
lípidos não polares extraídos do alimentoprodutos de reacção hidrossolúveis presentes na fase aquosa
de um alimentocomponentes voláteis no espaço de cabeça de um alimento
Análise de lípidos
Técnicas cromatográficas
Composição lipídica
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rápidosnão destructivosmínima preparação da amostrareduzido consumo de reagentesequipamento carorequerem curvas de calibração
Análise de lípidos
Técnicas instrumentais
isómeros trans por IValternativa a métodos oficiais por GCácidos gordos trans produzem pico típico 966 cm-1
procedimento:amostras líquidas convertidas em ésteres metílicosdissolvidas num solvente dequado
dissulfureto de carbono (CS2), ...registar espectro entre 1050 e 900 cm-1
usar padrão externoelaidato de metilo (derivado do ác. oleico)
Análise de lípidos
Técnicas instrumentais
•07-03-2007
•48
isómeros trans por IVmétodo não detecta isómeros trans conjugados
usado no controlo de oxidaçõesoxidação converte ligações duplas não conjugadas em
conjugadas
Análise de lípidos
Técnicas instrumentais
densidade e índice de refracçãoinformação indirecta sobre PM médio e grau de insaturação
índice de refracção aumenta com aumento da cadeia e aumento da insaturação
densidade diminui com aumento da cadeia e diminuição da insaturação
varia com oxidação, tratamento térmico, temperatura da análise e teor de gordura
utilizados na monitorização de processos que envolvem alteração na composição dos óleos
hidrogenação, ...
Análise de lípidos
Técnicas instrumentais
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•49
índice de refracçãoprocedimento:
pesar 2 g amostratransferir amostra para almofarizadicionar 1.5 g de areia secaadicionar 3 g sulfato sódio anidroadicionar 3 mL bromonaftalenotriturar durante 3 minfiltrar sobre papel de filtrorecolher o filtrado
solução com gordura extraídadeterminar índice de refracção
Análise de lípidos
Técnicas instrumentais
índice de refracçãocálculos:
Análise de lípidos
Técnicas instrumentais
1 2
2
d n -n% gordura = 100 V
W n -n
V – mL bromonaftalenod – densidade da gorduran – índice de refracção da gorduran1 – índice de refracção do bromonaftalenon2 – índice de refracção da solução extraídaW – peso da amostra
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NMRmais potente
desvios químicos permitem determinar concentração de diferentes tipos de lípidos (diferentes grupos funcionais)
NMR de baixa resolução mais usado para identificar e quantificar lípidos em alimentos
permite distinguir entre lípidos sólidos e líquidos
Análise de lípidos
Técnicas instrumentais
NMR de baixa resoluçãoNMR pulsado
sinais de 1H dos componentes alimentares distinguidos pelas diferentes velocidades de decaímento ou relaxação nuclear
1H em fases sólidas relaxam muito rapidamentesinal desaparece rapidamente
1H em fases líquidas relaxam lentamenteem alguns alimentos (oleaginosas, …) protões da água
relaxam mais rapidamente que os dos óleosintensidade do sinal proporcional ao teor em 1H
através de métodos de calibração, pode converter-se intensidade em teor de óleo
método utilizado para:teor em águateor em óleoteor em gordura sólidarazão sólido/líquido
Análise de lípidos
Técnicas instrumentais
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•51
NMR de baixa resoluçãoNMR de onda contínua
componentes dos alimentos distinguidos pelos desvios químicos
reflectem grau de insaturação e outras propriedades químicas
intensidade proporcional a concentraçãorequer amostras secas
mais lento que NMR pulsado
Análise de lípidos
Técnicas instrumentais
NMR de baixa resoluçãotécnicas de quantificação
medida absolutatécnica spin ecomedida relativaem todas as técnicas, temperatura da amostra tem que ser
consistente entre as medidassinal depende da temperatura
Análise de lípidos
Técnicas instrumentais
•07-03-2007
•52
NMR de baixa resoluçãomedida absoluta
mais usada para determinação de lípidos totaisutiliza-se a amplitude do sinal relativamente à massa
da amostradeterminação da concentração total de protões na
amostraproporcional à quantidade de lípidos ou de
águatodos os lípidos têm que se encontrar na fase líquida
da amostrapreparação da amostra tem que seguir regras estritas
para resultados serem comparáveis
Análise de lípidos
Técnicas instrumentais
NMR de baixa resoluçãotécnica spin eco
protões de proteínas ou gorduras sólidas têm diferentes frequências de ressonância relativamente àqueles em óleos ou água
pico de spin eco é proporcional ao componente do alimento com maior tempo de relaxação
distinção entre óleo e água
Análise de lípidos
Técnicas instrumentais
•07-03-2007
•53
NMR de baixa resoluçãomedida relativa
sinal de um sólido diminui mais rapidamente que num líquido
determinação da razão líquido/sólidoteor de gordura sólida
Análise de lípidos
Técnicas instrumentais
absorção de raios Xmétodo rápidoanálise in-lineanálise de lípidos em carnes
absorção em carne magra maior que na gordura
Análise de lípidos
Técnicas instrumentais
•07-03-2007
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comparação de métodosextracção por Soxhlet é mais comum
requer amostras secasmétodo de Mojonnier mais indicado para amostras húmidas ou
líquidasIV e NMR são simples rápidos e reprodutíveis
apenas aplicáveis a alimentos específicosgeralmente requerem curvas de calibração
Análise de lípidos
Ácidos gordos livres e Valor ácidoácidos gordos livres
percentagem em peso de um determinado ácido gordovalor ácido
mg de KOH necessários para neutralizar os ácidos livres presentes em 1 g de gordura ou óleo
por vezes, a acidez das gorduras alimentares expressa como mL de NaOH necessários para neutralizar ácidos gordos em 100 g da gordura
Análise de lípidos
•07-03-2007
•55
Ácidos gordos livres e Valor ácidoprocedimento:
adicionar EtOH 95% e fenolftaleína a uma amostra líquida de gordura
titular com NaOHcalcular % ácido gordo livre (como ácido oleico):
Análise de lípidos
V x N x 282%FFA = x 100
W
V – volume NaOH (mL)
N – normalidade NaOH (mol/1000 mL)
282 – PM ácido oleico (g/mol)
W – massa da amostra (g)
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