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UNIVERSIDAD DE JAÉN Facultad de Ciencias Experimentales
Trabajo Fin de Grado
Estudio de la comunidad microbiana del kéfir
tradicional y aislamiento de microorganismos con
actividad microbiana
Estudio de la comunidad microbiana del kéfir
tradicional y aislamiento de microorganismos con
actividad microbiana
Alumno: Rocío Juzdado Martos
Julio, 2018
Alumno: Rocío Juzdado Martos
UNIVERSIDAD DE JAÉN Facultad de Ciencias Experimentales
Trabajo Fin de Grado
Estudio de la comunidad microbiana del kéfir
tradicional y aislamiento de microorganismos con
actividad microbiana
Alumno: Rocío Juzdado Martos
Julio, 2018
ÍNDICE
1. RESUMEN………………………………………………………………………………. 1
2. ABSTRACT……………………………………………………………………………… 1
3. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………….. 3
3.1. Definición del kéfir…………………………………………………………………. 3
3.2. Historia del kéfir……………………………………………………………………..3
3.3. Producción del kéfir…………………………………………………………………4
3.4. Tipos de kéfir………………………………………………………………………...5
3.5. Aspectos microbiológicos…………………………………………………………..7
3.5.1. Bacterias del Kéfir……………………………………………………………8
3.5.2. Levaduras del Kéfir…………………………………………………………..9
3.5.3. Matriz…………………………………………………………………………..9
3.6. Efectos beneficiosos………………………………………………………………..9
3.6.1. Actividad antimicrobiana…………………………………………………….9
3.6.2. Actividad antitumoral………………………………………………………..10
3.6.3. Otros efectos………………………………………………………………...10
4. OBJETIVOS……………………………………………………………………………..12
5. MATERIAL Y MÉTODOS……………………………………………………………...13
5.1. Muestras del kéfir………………………………………………………………….13
5.2. Medios de cultivo…………………………………………………………………..13
5.3. Material de laboratorio…………………………………………………………….17
5.4. Bacterias indicadoras utilizadas………………………………………………….18
5.5. Determinación de la microbiota del kéfir………………………………………...18
5.6. Identificación preliminar de microorganismos de interés……………………....20
5.7. Detección actividad antimicrobiana……………………………………………...21
5.7.1. En medio sólido……………………………………………………………..21
5.7.2. En medio líquido…………………………………………………………….22
6. RESULTADOS………………………………………………………………………….23
6.1. Recuento de la comunidad microbiana del kéfir……………………………......23
6.2. Selección de los microorganismos de interés e identificación preliminar…....27
6.3. Determinación de la actividad antimicrobiana en medio sólido……………….28
6.4. Determinación de la actividad antimicrobiana en medio líquido……………...29
7. DISCUSIÓN……………………………………………………………………………..31
8. CONCLUSIÓN…………………………………………………………………………32
9. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………...34
1
1. RESUMEN
En los últimos años, los alimentos beneficiosos con microorganismos probióticos
han ganado un gran interés para su consumo. Un claro ejemplo es el kéfir del cual
existen numerosos estudios que abalan su actividad antimicrobiana,
inmunoestimulante, antitumoral entre otros efectos beneficiosos. En este trabajo,
se plantea la investigación de la comunidad microbiana del kéfir de leche con la
finalidad de encontrar microorganismos que presenten actividad antimicrobiana
frente a bacterias indicadoras tales como Listeria innocua, Enterococcus faecalis
S-47 y Staphylococcus aureus, patógenos causantes de enfermedades en
humanos. Mediante el método de cruces en medio sólido y la técnica de ensayo
con pocillos en medio líquido con la fracción no microbiana del kéfir. Se concluyó
que el mejor efecto antimicrobiano observado fue contra S. aureus y L. innocua en
medio sólido con halos de inhibición de entre 5 y 10mm. Mientras que en medio
líquido la única actividad antimicrobiana observada fue contra S. aureus. Los
resultados obtenidos apoyan la actividad antimicrobiana que presenta la bebida
del kéfir probablemente debido a la compleja asociación de cepas próbioticas que
producen sustancias antibacterianas.
Palabras clave: Probóticos, actividad antimicrobiana, bacterias indicadoras,
sustancias antibacterianas.
2. ABSTRACT
In recent years, beneficial products with probiotic microorganisms have gained
great interest for their consumption. A clear example is that it contains so many
studies that its antimicrobial activity, immunostimulant, antitumor among other
beneficial effects. In this work, the investigation of the microbial community of milk
cancer was proposed in order to find microorganisms that show antimicrobial
activity against indicator bacteria such as Listeria inocua, Enterococcus faecalis S-
47 and Staphylococcus aureus, pathogens that cause diseases in humans. By
means of the method of crosses in solid medium and the test technique with wells
in liquid medium with the non-microbial fraction of kefir. It was concluded that the
best antimicrobial effect was against S. aureus and L. innocua on solid medium
with inhibition halos between 5 and 10 mm. While in liquid medium the only
antimicrobial activity observed was against S. aureus. The results obtained support
2
the antimicrobial activity of the kefir drink, probably due to the new association of
probiotic strains that produce antibacterial substances.
Key words: Probotic, antimicrobial activity, indicator bacteria, antibacterial
substances.
3
3. INTRODUCCIÓN
3.1. Definición del kéfir
El kéfir es una bebida fermentada, carbonatada y ácida cuyo sabor se debe al ácido
láctico. Se trata de una combinación de bacterias probióticas y levaduras en una matriz
de proteínas, lípidos y azúcares (González Alonso, 2011). Los granos de kéfir actúan
como iniciadores naturales durante la producción de kéfir (Ilustración 1), tras la
fermentación son recuperados (Machado et al, 2013). Dichos granos pueden dividirse
y dar lugar a una nueva generación de granos con las mismas características que los
antiguos. (Prado et al, 2015)
Desde hace mucho tiempo, se ha asociado el consumo de productos lácteos
fermentados con la capacidad de otorgar
beneficios a la salud (Bourrie, 2016).
Debido al importante número de
microorganismos que encontramos en el
kéfir, las interacciones microbianas que
establecen y los compuestos bioactivos
producidos a partir de su metabolismo
confieren al kefir el papel de un próbiotico
natural, conocido como el yogur del siglo
XXI (Machado et al, 2013).
Según la Organización Mundial de la Salud
(OMS) los probióticos son microorganismos vivos que cuando se administran en
cantidades adecuadas confieren un beneficio al hospedador.
3.2. Historia del kéfir
La palabra kéfir procede de la palabra turca keyif, que se traduce por “sentirse bien”.
Dicha bebida recibió este nombre debido a la agradable sensación percibida después
de su consumo (Lemos et al., 2013). Su origen se sitúa en los Balcanes, Europa del
Este y el Cáucaso (Rodriguez et al., 2017). La ingesta de kéfir ha estado asociada con
la longevidad de los habitantes del Cáucaso (Kuwabara et al,1995; Rodriguez et
al,2017).
Ilustración 1. Gránulos de kéfir de
leche
4
Tradicionalmente, la leche de vaca, oveja, cabra o búfalo ha servido para la obtención
de kéfir. Aunque la escasez, el coste de dichas leches o costumbres religiosas han
llevado al intento de la producción de kéfir a partir de otros alimentos como la leche
de soja (Prado et al., 2015).
No se conocen con total exactitud los mecanismos a partir de los cuales se originaron
los gránulos de kéfir. Se cree que el origen de estos fue debido a las prácticas
realizadas por las tribus del Caucaso. A partir de leche cruda y el cuajar de ternero o
carnero en un cuenco de madera, se deja cuajar la leche. Una vez ha cuajado, la
fermentación se activa moviendo levemente la masa. A continuación, se cubre dicho
cuenco con la piel de carnero dejándose reposar durante uno o dos días. Tras estos
días, se separa la leche cuajada y se añade leche fresca, la cual vuelve a cuajar. Este
proceso requiere de unas cuantas repeticiones, tras las cuales en el interior del cuenco
se crea un poso espeso formado de multitud de gránulos. Dichos gránulos se dejan
secar y con un raspador son recogidos. De esta forma se obtienen los nódulos de kéfir
los cuales producirán una nueva fermentación cada vez que se les añada leche. Este
proceso ha quedado distanciado del usado actualmente, del que ya se parte de cepas
ya formadas las cuales son reproducidas de forma similar al del yogurt (Gálvez, 2012).
3.3. Producción del kéfir
Existen varios métodos para la producción de Kéfir. Tanto el procesado artesanal
como el procesado industrial son los más comúnmente usados. Aunque actualmente
se está intentando encontrar técnicas más modernas para la producción de este.
Procesado tradicional
Se produce añadiendo directamente los granos dde kéfir. La leche cruda es hervida y
enfriada a 20-25ºC e inoculada posteriormente con un 2-10% del grano de Kéfir. Tras
un período de fermentación, entre 18-24 horas a 25º C, los granos son separados de
la leche mediante filtración con un támiz los cuales se pueden secar a temperatura
ambiente para la siguiente inoculación. El kéfir se almacena a 4ºC durante un breve
tiempo y está listo para el consumo (Otles & Cagindi, 2003).
Procesado industrial
Se pueden usar diferentes métodos pero básicamente se sigue el mismo principio. El
primer paso a llevar a cabo es la homogenización de la leche al 8% de materia seca
5
y mantenerla en tratamiento térmico a 90-95ºC durante uno 5-10 minutos. Tras esto
se enfría a 18-24 ºC y se inocula con un 2-8% de cultivos de kéfir (Bacterias
iniciadoras) en tanques. El tiempo de fermentación es de 18-24 horas tras el cual, el
coagulo es separado mediante bombas y distribuido en botellas. Por último se deja
madurar a una temperatura entre 12-14 ºC y es almacenado listo para consumir. (Otles
&Cagindi, 2003).
3.4. Tipos de Kéfir
Existen tres tipos de Kéfir, de leche, de agua y de té o Kombucha. El kéfir de agua procede
de agua azucarada fermentada, mientras que el de leche está compuesto por leche
fermentada. Ambos poseen la misma microbiota adaptándola a sus respectivos medios (Ruiz,
2017).
3.4.1. Kéfir de leche
Se obtiene un producto similar al yogurt, resultado de una doble
fermentación (Ilustración 2). Por un lado, la de los gránulos del hongo y de
sus bacterias y por otro lado la de la propia leche. (Ruiz, 2017)
Mantenimiento de los nódulos de Kéfir
La leche debe ser cambiada cada dos días aproximadamente de tal modo
que el kéfir este renovándose continuamente. Es recomendable dejarlo en
reposo cada 15 o 30 días, en un recipiente con agua sin cloro durante 24
horas. El agua resultante de lavar el kéfir, puede ser aprovechada ya que
contiene kefiran (hexopolisacárido soluble). Elevadas temperaturas de
agua o el cloro pueden afectar negativamente sobre el cultivo de kéfir.
Conservación de los nódulos de Kéfir
Si se quiere interrumpir el cultivo de kéfir, podremos conservar los granos
durante el tiempo que se desee. Dependiendo del tiempo podremos
conservarlo junto con la leche fermentada en la nevera durante unos 3 o 4
días. Si se trata de un período más largo, de 8 a 10 días se les añadirá
agua mineral y una cucharada de azúcar, de igual forma se guardará en
la nevera. En cambio, cuando este periodo supera el año, se introducirán
en el congelador.
Para la reactivación, la descongelación de los gránulos se lleva a cabo a
temperatura ambiente introducidos estos en un recipiente con agua. Tras
esto, se puede realizar el proceso con normalidad.
6
Ilustración 2. Aspecto del kefir de leche
3.4.2. Kéfir de agua
Es preparado a partir de una solución de sacarosa entre 3 y 10%, frutas
frescas; limones, frutas secas; higos y un inóculo de los granos de kéfir.
Se dejan fermentando durante uno o días aproximadamente,
obteniéndose una bebida carbonatada, con un sabor ligeramente ácido
debido a la producción de ácido láctico y ácido acético, leve concentración
de azúcar y una sutil cantidad de alcohol (Monar et al., 2014).
Actualmente se desconoce el verdadero origen de los gránulos de kéfir de
agua. Se han encontrado evidencias de que podrían tener origen en el
cactus (Opuntia) mexicano en donde los gránulos eran removidos de las
hojas. Lactobacillus hilgardii ha sido propuesta como la principal bacteria
encargada de la producción del polisacárido, el cual forma parte de la
estructura del kéfir (Monar et al., 2014).
3.4.3. Kéfir de té o “Kombucha”
Este tipo de kéfir fermenta a partir de una infusión de té azucarada. Es un
proceso más lento que en el caso de los dos anteriores, tiene lugar en
torno a unos 15-30 días (Ilustración 3). Es recomendable que el recipiente
se encuentre abierto, ya que este tipo de kéfir fermenta mejor en
condiciones de aerobiosis. En cuanto al sabor puede variar desde un sabor
suave a un fuerte sabor avinagrado, ello depende del tiempo de
7
fermentación y el té usado. Se puede mezclar con zumo o frutas para que
su consumo sea más agradable.
La principal función de este tipo de kéfir es digestiva gracias a los ácidos
y enzimas que posee ayudando al proceso digestivo. (ProkeyDrinks, 2016)
Ilustración 3. Gránulos del kéfir de té o tíbico junto con el aspecto del kéfir de
té o Kombucha.
3.5. Aspectos microbiológicos
La producción del kéfir está basada en la actividad fermentativa de la microbiota de
los granos de kéfir sobre los componentes químicos de la leche. Los granos de kéfir
están compuestos por una asociación de microorganismos, embebidos en una matriz
de exopolisacáridos, proteínas y lípidos formando pequeños gránulos irregulares,
semiduros y de color blanco-amarillento (Satir y Guzel-Seydim, 2016; Rodriguez,
2017)
En la composición de los granos de kéfir ha sido evidenciado el predominio de
bacterias ácido lácticas, bacterias acéticas, levaduras y hongos. La microbiota
presente depende del origen del kéfir, el sustrato que se ha usado para su
fermentación y la manera en la que se ha mantenido el cultivo (Prado et al, 2015).
Las bacterias ácido lácticas (BAL) son las principales responsables de convertir en
ácido láctico la lactosa presente en la leche, obteniendo como resultado una
disminución del pH y la conservación de la leche. Otros componentes microbianos del
kéfir incluyen levaduras fermentadoras de lactosa que producen etanol y CO₂
(Machado et al, 2013).
La tabla 1 muestra la composición de la microbiota presente en la bebida y/o en los
granos de kéfir.
8
Tabla 1. Microbiota del Kéfir (Rodriguez et al.,2017)
3.5.1. Bacterias del kéfir
Se pueden clasificar en dos grupos, bacteria lácticas homofermentativas y
heterofermentativas. Encontramos un 80% de Lactobacillus Kefiri en la bebida
fermentada final y un 20% de Lactobacillus paracasei ssp. Paracasei, Lactobacillus
acidophilus, Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus, Lactobacillus plantarum y
Lactobacillus kefiranofaciens. Además del género Lactococcus, Acetobacter y
Leuconostoc (Prado et al, 2015).
3.5.2. Levaduras del kéfir
Bifidobacterias Bacterias ácido acéticas
Bifidobacterium spp. Lb. acetobacter lavaniensis
Bifidobacterium bifidum Lb. Acetobacter syzygii
Bifidobacterium choerinum Lb. Acetobacter orientalis
Bifidobacterium choerinum Lb. Gluconobacter japonicus
Bifidobacterium longun Lb. Gluconobacter frateurii
Bifidobacterium pseudolongun
Bacterias ácido lácticas
Lactococcus (Lc.) lactis Lb. Satsumensis
Lc. Lactis subsp. lactis Lb. Brevis
Lc. Lactis subsp. cremoris Lb. plantarum
Lc. Raffinolactis Lb. Delbrueckii
Streptococcus thermophilus Lb. Acidophilus
Lactobacillus (Lb.) kefiranofaciens Lb. Delbrueckii subsp. bulgaricus
Lb. Kefiranofaciens subsp. kefirgranum Lb. Casei subsp. pseudoplantarum
Lb. Kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens Lb. Buchneri
Lb. Kefiri Lb. Sunkii
Lb. Parakefiri Lb. Otakiensis
Lb. Plantarum Lb. Diolivorans
Lb. Kéfir Lb. Crispatus
Lb. Paracasei Lb. Reuteri
Lb. Helveticus Lb. Leuconostoc mesenteroides
Lb. Parakefir Lb. Leuconostoc pseudomesenteroides
Levaduras
Lb. Saccharomyces (S.) cerevisiae Lb. Klu. Siamensis
Lb. S. martinae Lb. Klu. Lactis
Lb. S. unisporus Lb. Klu. Dobzhanskii
Lb. Candida humilis Lb. Kazachatania (Kaz.) unispora
Lb. Candida inconspicua Lb. Kaz. Exigua
Lb. Candida maris Lb. Torulospora delbrueckii
Lb. Candida kefir Lb. Brettanomyces anomalus
Lb. Candida colliculosa
Lb. Kluyveromyces (Klu.) marxianus
9
Han sido aisladas más de 23 especies de levadura diferentes. Aunque las
predominantes osn Saccharomyces cerevisiae, S. unisporus, Candida kefyr y
Kluyveromyces marxianus ssp. Marxianus (Prado et al., 2015)
3.5.3. Matriz
Kefirano, es un hexopolisacárido, compuesto por dos monosacáridos; glucosa y
galactosa el cual es separado de los granos de kéfir mediante la acción de
Lactobacillus kefiranofaciens. Por lo tanto, es esta bacteria la que da origen a esta
sustancia gelatinosa con múltiples efectos beneficiosos conocidos (Martin, 2017).
3.6. Efectos beneficiosos
3.6.1. Actividad antimicrobiana
La actividad antagonista de las BAL se debe a la producción de metabolitos con acción
antimicrobiana tales como; ácido láctico, ácido acético, peróxido de hidógeno, diacetilo
y bacteriocinas (Ramírez, 2010). Las bacteriocinas son un pequeño grupo de péptidos
antimicrobianos producidos por numerosas bacterias que inhiben el crecimiento de
otras bacterias. Se ha demostrado la presencia de cepas bacterianas productoras de
bacteriocinas en los granos de kéfir. (Miao et al, 2014)
A través de ensayos in vitro con extractos libres de células de kéfir, se ha demostrado
la inhibición del crecimiento de bacterias patógenas tales como, Staphylococcus
aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Clostridium perfringens y Listeria
monocytogenes (Van Wyk, 2001)
Bolla et al (2013) reportaron evidencias del efecto protector de una mezcla constituida
por cepas bacterianas y levaduras aisladas del kéfir de leche contra una infección por
Clostridium difficile en un modelo de hámster. Dichos hámsteres bebieron ad libitum
una mezcla de extractos de microorganismos previamente aislados de los granos de
kéfir. Los resultados mostraron que solo aquellos hámsteres que ingirieron el extracto
de los microorganismos permanecieron vivos.
Lactobacillus kefiranofaciens actúa contra los principales patógenos causantes de
caries dental, Streptococcus mutans y Streptococcus sobrinus. Inhibe directamente el
crecimiento de estos dos patógenos (Jeong et al, 2018)
3.6.2. Actividad antitumoral
10
Ha sido evidenciada la actividad antitumoral presente en el kéfir contra múltiples tipos
de células cancerosas (Rodriguez et al, 2017). Ensayos in vivo como el llevado a cabo
por de Moreno de Le Blanc (2013) refuerzan este hecho. Mediante la ingesta de kéfir
ad libitum se produjo una disminución en el crecimiento de tumores en el modelo
murino de cáncer de mama. Además fue observado un incremento de la IL-10 en
suero y un decremento de células IL-6 (+) en las glándulas mamarias. Estos hechos
manifiestan la capacidad modulatoria del kefir sobre la respuesta inmune en las
glándulas mamarias y tumores.
Se ha demostrado la actividad inmuno-moduladora de las BAL aisladas de los granos
de kéfir las cuales aumentan la apoptosis de células de leucemia mieloide humana
resistentes a múltiples fármacos in vitro a través de la activación de la caspasa 3 de
una manera dependiente a la dosis. (Hong et al, 2009)
Ha sido evidenciado como el sobrenadante de kefir, induce la producción de citocinas
pro-inflamatorias en células RAW 264.7, tales como el factor de necrosis tumoral
(TFN)- α Interleucina (IL)-1β, IL-6 y IL-12. (Hong et al, 2009).
3.6.3. Otros efectos
Metabolismo del colesterol
Han sido investigados los efectos del Kéfir sobre el índice de aterogenicidad (IA) en
conejos machos blancos de Nueva Zelanda con una dieta alta en colesterol (0,5%). Al
grupo control (n=7) no le fue administrado kéfir mientras que al grupo del kéfir sí (n=8).
Mediante técnica histoquímica la aorta fue analizada y las lesiones arteriosclerótico
cuantificadas. Lípidos y azucares también fueron medidos. La formación de células
RAW264.7 por lipoproteína de muy baja densidad (βVLDL) fue investigada en ambos
grupos. Los resultados obtenidos encontraron diferencias significativas en las lesiones
arterioscleróticas, las cuales eran menores en el grupo, al cual le fue suministrado
kéfir. En cuanto a la concentración de colesterol en el hígado se coincidió también en
que en el grupo del kéfir era menor (Uchida et al., 2010)
Impacto en el tracto gastrointestinal
La composición de la microbiota intestinal se ve afectada por la ingesta de kéfir, lo
cual puede ser debido a la combinación de la inhibición directa de patógenos por parte
de los ácidos y la producción de bacteriocinas (Rattray et O´Connel, 2011). Estudios
11
in-vitro llevados a cabo sobre células epiteliales intestinales han evidenciado que
microorganismos aislados del kéfir poseen capacidad para antagonizar el efecto de
patógenos intestinales, tales como Escherichia coli, Salmonella spp. y Shigella spp
(Iraporda, 2016).
Bioconservante
Las industrias sufren grandes pérdidas económicas por la contaminación fúngica de
los alimentos para el ganado. Además del riesgo que supone para la salud de los
animales. Se ha demostrado que el suero de leche fermentado con granos de kéfir
añadido a los alimentos de aves de corral actúa como un bioconservante, evitando la
contaminación por hongos y aumentando su vida útil (Londero et al., 2014).
Alternativa para la intolerancia a la lactosa
En la fermentación del kéfir, la lactosa se ha digerido en sus dos componentes. Una
vez ingerida esta bebida no es necesario la presencia de la enzima lactasa para
digerirla. Aportando el kéfir los beneficios de la leche sin dificultar la digestión.
Presión arterial
Estudios recientes indican que la administración a largo plazo de la fracción no
bacteriana del kéfir, produce una disminución en la presión arterial y de la hipertrofia
cardiaca en un experimento con ratas Wistar espontáneamente hipertensas. Se cree
que esto es debido a la inhibición de la Enzima Convertidora de Angiotensina (ECA)
y a la disminución de la relación citoquinina inflamatoria-antiinflamatoria (Brasil et al.,
2018).
12
4. OBJETIVOS
Los objetivos de este estudio son:
-Determinación de la microbiota del kéfir tradicional
-Detección de microorganismos con actividad antimicrobiana
13
5. MATERIAL Y MÉTODOS
5.1. Muestras del Kéfir
A lo largo de la etapa experimental se trabajó con dos muestras de kéfir de leche, ya
que es el más comúnmente consumido, las cuales diferían en su origen. Una fue
adquirida en un supermercado y otra a partir de los gránulos de kéfir de forma casera.
Las muestras recolectadas fueron clasificadas bajo la siguiente nomenclatura:
o Kéfir de supermercado: KS
o Kéfir elaborado de forma artesanal: KF
5.2. Medios de cultivo
Se utilizaron 4 medios generales para el crecimiento bacteriano; TSA, MRS-agar, YMA
y McConkey agar. Por otro lado se utilizó BHA tamponado blando y BHA tamponado
e YMB medios utilizados para el ensayo de la actividad antimicrobiana.
Todos los medios tras su preparación fueron esterilizados en autoclave a 121ºC.
Atemperados a 50ºC y vertidos en las placas de Petri a razón de 15 ml en cada una
de ellas. Siempre en condiciones de esterilidad, trabajando al lado del mechero para
evitar cualquier posible contaminación. Tras esto se dejan enfriar y se mantienen en
la cámara frigorífica para su posterior uso.
o Medio Tripticase Soy Agar (TSA):
Es un medio de uso generalizado para el cultivo una amplia variedad de
microorganismos. La adición de un 5% de sangre proporciona un medio no-
selectivo para la visualización de reacciones hemolíticas por parte de algunas
especies bacterianas.
Se prepararon 800 ml siguiendo las recomendaciones del fabricante. La marca
comercial utilizada fue Panreac Applichen.
Su composición de reactivos por litro de agua destilada es la siguiente:
Reactivos Peso (gramos)
Digerido pancreático de caseína 14,5
Digerido papaico de harina de
soja
5,0
Cloruro sódico 5,0
14
Agar 14,0
Factores de crecimiento 1,5
o Medio DE MAN, ROGOSA, SHARPE agar (MRS-agar):
Se trata de un medio natural selectivo que permite el aislamiento, cultivo y
enumeración de Lactobacilos y otras bacterias ácido lácticas de alimentos y
otros materiales.
Se prepararon 800 ml según las recomendaciones del fabricante, la marca
comercial del producto correspondía con la casa Scharlau. La composición de
reactivos por litro de agua destilada es la siguiente:
Reactivos Peso (gramos)
Mezcla de peptona 18.0
Extracto de levadura 4.0
Glucosa 20.0
Tween 80 1.0
Fosfato dipotasio de hidrógeno 2.0
Citrato triamonio 2.0
Acetato de sodio anhidro 3.0
Sulfato de magnesio 7 H₂O 0.2
Sulfato de magnesio anhidro 0.034
Agar 12.0
o Medio Yeast Malt Agar (YMA):
Se trata de un medio de cultivo selectivo que permite el crecimiento de
levaduras.
Se prepararon 800 ml según las indicaciones del fabricante, el producto
pertenecía a la marca Panreac. La composición de reactivos por litro de agua
destilada es la siguiente:
Reactivos Peso (gramos)
Manitol 10.0
Extracto de levadura 4.0
15
K₂POH₄ 0.5
MgSO₄ 0.2
NaCl 0.1
Agar 15
Rojo Congo 81g/400 ml
o Medio MacConkey Agar:
Este medio es utilizado para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil
desarrollo, aerobios y anaerobios. En este medio las peptonas aportan los
nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de
carbono no fermentable y la mezcla del cristal violeta junto con las sales biliares
son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora
Gram positiva. El agar es el agente solidificante. Por fermentación de la lactosa,
disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del
indicador de pH, la absorción en las colonias y la precipitación de las sales
biliares.
Fueron preparados 800 ml según recomendaciones del fabricante de la casa
Scharlau.
La composición de reactivos por litro de agua destilada es la siguiente:
Reactivos Peso (gramos)
Digerido pancreático de gelatina 17.0
Digerido pancreático de caseína 1.5
Digerido péptico de tejido animal 1.5
Lactosa 10.0
Mezcla de sales biliares 1.5
Cloruro de sodio 5.0
Rojo neutro 30.0
Cristal violeta 1.0
Agar 13.5
o Medio Brain Heart Infusion-agar tamponado (BHA-T):
16
Medio utilizado como capa base para el ensayo de la actividad antimicrobiana
en placas de Petri.
Se prepararon 800 ml siguiendo la receta que se detalla más abajo. Los
productos comerciales usados pertenecían a la marca Panreac y BHB
perteneciente a la casa Fluka Analytical. Se trata de un medio utilizado para el
ensayo
Reactivos Peso (gramos)
Fosfato dibásico 3.5
Fosfato monobásico 1.505
Agar 5.95
BHA 12.95
H₂O 350 ml
o Medio Brain Heart Infusion-agar blando y tamponado (BHA-T):
Medio empleado como sobrecapa para cubrir la capa base tras la inoculación
de la bacteria patógena.
Fueron preparados 350 ml siguiendo la receta que se adjunta más abajo. Se
hirvió en microondas y se dispuso en tubos a razón de 6 ml para a continuación
ser esterilizado. Los productos fueron adquiridos de la marca comercial
Panreac excepto BHA el cual pertenecia a la marca Fluka Analytical.
Reactivos Peso (gramos)
Fosfato dibásico 3.5
Fosfato
monobásico
1.4
Agar 2.8
BHA 5.25
H₂O 350 ml
o Yeast Malt Broth (YMB):
Medio empleado como capa base para el ensayo de la actividad
antimicrobiana.
17
Fueron preparados 350 ml según las recomendaciones del fabricante en placas
de Petri. Además se añadió Agar para la solidificación. Se utilizó la marca
comercial de Scharlau.
Reactivos Peso (gramos)
Destroxe 10,0
Peptone 5,0
Malt extract 3,0
Yeast extract 3,0
Agar 18,0
o Yeast Malt Broth-blando (YMB):
Medio empleado como sobrecapa para cubrir la capa base tras la inoculación
con la bacteria indicadora en el ensayo para la detección de actividad
antimicrobiana.
Se prepararon 350 ml siguiendo las recomendaciones del fabricante al igual
que la capa. En este caso se añadió Agar al 85%. Dicho medio fue previamente
hervido y dispuesto en tubos a razón de 6ml para a continuación esterilizarlo
en el autoclave.
Reactivos Peso (gramos)
Dextrosa 10,0
Peptona 5,0
Extracto de Malta 3,0
Extracto de levadura 3,0
Agar (85%) 18,0
5.3. Material de laboratorio
1. Placas Petri
2. Mechero Bunsen
3. Asa de siembra
4. Guantes
5. Matras
6. Balanza de precisión
18
7. Pipetas y micropipetas
8. Puntas estériles
9. Agua destilada
10. Matraces estériles
11. Gradillas
12. Eppendorfs
13. Tubos de ensayo
14. Torres de acero inoxidable
15. Pinzas estériles
16. Alcohol
17. Portaobjetos
18. Microscopio
19. Estufa
20. Centrífuga
5.4. Bacterias indicadoras utilizadas
Las bacterias indicadoras utilizadas fueron Enterococcus faecalis S-47,
Staphylococcus aureus y Listereia innocua. Dichas cepas fueron sembradas el día
anterior al ensayo, para evitar que perdieran su virulencia. Este proceso fue llevado a
cabo por el personal del departamento de microbiología en la Universidad de Jaén.
5.5. Determinación de la microbiota del kéfir
Técnica de diluciones seriadas
Es el primer paso que se lleva a cabo para la identificación y aislamiento de los
microorganismos presentes en los gránulos de kéfir. Para ello a partir de la muestra
madre, muy concentrada se preparan diluciones al décimo (1:10). Obteniéndose una
serie de soluciones relacionadas por un factor de dilución 10, es decir, 1/10, 1/100,
1/1000 y así sucesivamente. (Gálvez & Heras, 2012)
Partimos de dos soluciones madre, ambas formadas por 10 ml de solución salina junto
con 1 gramo aproximadamente de muestra, por un lado el kéfir de supermercado y
por otro el obtenido de forma casera. Anteriormente se han preparado alrededor de
25 eppendorfs con 900 µl de solución salina cada uno. A partir de la solución madre
de la cual se extraen 100 µl y se depositan en un eppendorf y tras pasarlo por el vórtex,
se obtiene la dilución 1/10. De dicha solución se toman otros 100 µl y se pasan a otro
19
eppendorf y de igual manera se obtiene la dilución 1/100. Se procede de esta forma
con ambas muestras por separado hasta llegar a la dilución 10⁻⁵. Obteniendo 5
diluciones por cada muestra original. Todo el proceso se realiza con las máximas
condiciones de esterilidad, trabajando al lado del mechero Bunsen.
Siembra de las soluciones en los medios de cultivo
Se tuvo que diferenciar entre las diluciones procedentes de la muestra del kéfir de
supermercado (KS) y las procedentes del kéfir obtenido de forma manual (KF). Se
realizó la siembra de cada dilución por duplicado en cada medio, es decir, partiendo
de 5 diluciones seriadas y dos replicas por cada una de ellas, se obtuvo un total de 10
placas de KS en cada medio de TSA, MRS, YMA y MacConkey. Igualmente con las
diluciones procedentes de KF.
Tras agitar las diluciones en el vórtex, se procedió a la siembra de estas, desde la más
diluida (10⁻⁵) hasta la menos diluida (10⁻¹). Se tomó 100 µl de cada dilución y se
depositó sobre la placa. Tras flamear el asa de siembra, se extendió dicha alícuota
por toda la placa, siguiendo una siembra en césped. Dicho proceso tuvo lugar en
condiciones de esterilidad. A continuación, las placas de YMA y MRS sembradas se
incubaron a 30ºC y las de TSA y McConkey a 35ºC durante 24 horas en la estufa.
Aislamiento de colonias
En primer lugar, se realizó el recuento de colonias de aquellas placas más favorables.
Para ello por cada medio tendremos que contar aquella placa que sea más
conveniente junto con su respectiva replica. Por lo tanto, por un lado tendremos el
recuento de 2 placas de KS y 2 de KS respectivamente, en cada medio de cultivo.
Tras el recuento, se seleccionaron las colonias procedentes de los medios de cultivo
MRS e YMA agar, intentando que fueran diferentes en cuanto a su morfología. A
continuación, mediante el asa de siembra se picaron las colonias y fueron sembradas
siguiendo la técnica de agotamiento en el medio YMA y MRS agar según el medio de
procedencia. Además las placas fueron rotuladas en cuanto a si se trataban de
colonias procedentes de kefir de supermercado o al obtenido de forma casera para
evitar una posterior confusión, además del número de colonia, obteniendo un total de
22 colonias. Estas placas se dejaron incubar en la estufa a 30ºC durante 24 horas.
Conservación de las colonias
20
Tras el crecimiento de las colonias en el medio de cultivo con el fin de aumentar la
concentración de las mismas para su uso posterior en las diferentes pruebas que se
realizaran. Sera necesario que sean sembradas en tubos de medio MRS e YMA
líquido, los cuales serán incubados durante 24 horas a 30ºC en la estufa. Después fue
comprobado su crecimiento, a través de la turbidez que presentaban. La turbidez
indica crecimiento. Tras el crecimiento en los tubos de medio líquido se desecharon
las que no crecieron y el resto se conservó en la cámara frigorífica. De igual modo
cada tubo fue identificado dependiendo de la cepa de la cual se tratara. Todo ello en
condiciones de esterilidad para evitar cualquier contaminación.
5.6. Identificación preliminar de microorganismos de interés
Se realizó una identificación previa sobre las cepas bacterianas presentes en las
muestras de kéfir con el fin posterior de conocer con qué clase de microorganismo se
estaba trabajando. Para ello se utilizó la tinción de Gram.
Tinción de Gram
Esta tinción pone de manifiesto la afinidad tintorial de la pared, la cual depende de su
composición para que el microorganismo sea considerado gram positivo o gram
negativo. La diferencia existente entre microorganismos Gram positivos y Gram
negativos reside en la composición de su pared celular. Mientras que los Gram
positivos poseen una pared monoestratificada, con ácidos teitoicos y más mureína en
la cual queda atrapado el cristal violeta tiñiendose de azul/morado. Los Gram
negativos tienen una pared celular biestratificada y no poseen ácidos teitoicos por lo
que el cristal violeta no queda atrapado y son teñidas con la safranina quedando de
color rojo. Para ello se emplean dos colorantes; cristal violeta de carácter primario y
safranina que actúa de contraste. El lugol sirve como fijador de la safranina y un
decolorante como el alcohol. Esta técnica nos permite diferenciar entre bacilos, cocos
y cocobacilos.
En primer lugar, tras seleccionar la colonia crecida en la placa de medio MRS e YMA
agar, con el asa de siembra se extiende sobre un portaobjetos en el cual previamente
se colocado una gota de agua destilada. Fijamos las bacterias por calor, colocando el
portaobjetos a una distancia suficiente del mechero bunsen con cuidado de no
destruirlas. Una vez fijadas, se aplican los colorantes, primero se añade cristal violeta
el cual se deja actuar alrededor de dos minutos. Tras esto, se aplica lugol durante dos
21
minutos y seguidamente se lava con alcohol unos 30 segundos. Para retirar el alcohol
lavamos con agua destilada. En el último paso, añadimos safranina durante 3 minutos.
Después se lava con agua destilada, se seca la preparación y se observa al
microscopio.
5.7. Detección de la actividad antimicrobiana
5.7.1. En medio sólido
Método de cruces
A partir de los tubos de medios MRS e YMA líquido que anteriormente habíamos
sembrado, se realiza una siembra en cruz mediante el asa de siembra en los medios
BHA-T e YMB previamente preparados. De tal forma que las cepas procedentes del
medio líquido MRS serán sembradas en el medio BHA-T y las procedentes del medio
líquido YMA en el medio sólido YMB.
En cada placa habrá en torno a unas 4 cepas juntas, con cuidado de que no se solapen
unas con otras para ver la actividad microbiana que presentan sin ninguna dificultad.
Tendremos que realizar tres réplicas, ya que probaremos la actividad que presentan
nuestras cepas frente a tres patógenos distintos; Enterococcus faecalis S-47,
Staphylococcus aureus y Listereia innocua. Las placas serán incubadas a 30ºC
durante 24 horas.
Técnica de las sobrecapas
Son necesarias las cepas patógenas las cuales fueron proporcionadas por el
departamento de microbiología de la Universidad de Jaén.
En primer lugar, las sobrecapas tanto del medio BHA-T e YMB solidificadas, fueron
fundidas en el baño termostático a una temperatura de 90ºC-100ºC. Tras fundirse,
fueron atemperadas en torno a unos 50ºC. Una vez atemperadas se pipetearon 60 µl
de bacteria patógena al medio que correspondiese todo ello muy rápido y en
condiciones de esterilidad, ya que el medio tiende a solidificar. Se pasa por el vórtex
y se deja caer sobre las placas, en las cuales están sembradas nuestras cepas en
cruces, dejando que se expanda sobre toda la placa. Dichas placas son incubadas a
30ºC durante 24 horas. La finalidad de este método es observar un halo de inhibición,
lo cual indicará que nuestras bacterias presentan actividad antimicrobiana frente a
dichas bacterias patógenas.
22
5.7.2. En medio líquido
Técnica de ensayo con pocillos (Tagg y McGiven, 1971)
Previamente se deben de autoclavar los pocillos y las pinzas para su posterior
utilización. Además de cultivar aquellas cepas que han presentado halo de inhibición,
lo cual indica como hemos comentado anteriormente que presentan actividad
antimicrobiana. Para el cultivo, tomaremos 20 µl de dichas cepas en 2 ml de los
medios líquidos MRS e YMA. Dejaremos los tubos durante 24 horas a 30ºC.
Una vez han crecido las cepas, las pasaremos a eppendorfs y las centrifugaremos a
14.000 rev/min durante 10 minutos, obteniendo el sobrenadante en el cual
encontraremos todas aquellas sustancias producidas por nuestras bacterias del medio
de cultivo y resto celulares que quedarán depositados en el fondo. Tras una primera
centrifugación recogeremos el sobrenadante en eppendorfs nuevos y se volverán a
centrifugar a 14.000 rev/min durante 10 minutos, asegurando que en el sobrenadante
no encontremos bacterias.
Mientras tanto las sobrecapas son fundidas y posteriormente atemperadas en el baño
termostático para su posterior uso. Igual que para el método anterior necesitaremos 3
réplicas para cada uno de los patógenos.
En las placas de BHA-T e YMB colocaremos los pocillos de acero inoxidable, a razón
de unos 4-5 pocillos por placa evitando que se interfiera en el resultado de las
diferentes muestras localizadas en cada uno de ellos. Tras la colocación, se vierten
los 6 ml de sobrecapas de YMB y BHA-T blando según corresponda, a las cuales se
les añaden 60 µl de bacteria patógena, pasándose por el vórtex y quedando estas
homogéneamente por la placa sin que llegue a sobrepasar los pocillos.
Tras la solidificación de las sobrecapas, se continua con la retirada de los pocillos con
ayuda de unas pinzas esterilizas con sumo cuidado. Obteniendo como resultado una
pequeña oquedad dónde más tarde verteremos 85µl del sobrenadante.
Por último, incubaremos dichas placas durante 24 horas a 30ºC. Transcurrido este
período de tiempo podremos observar la presencia o ausencia de halo de inhibición,
incluido el diámetro de este.
23
6. RESULTADOS
6.1. Determinación de la comunidad microbiana del kéfir
Se seleccionaron aquellas placas más favorables para realizar el recuento, es decir
las que tuvieran entre 30 y 300 colonias aproximadamente. Por lo tanto, por cada
medio y muestra fueron escogidas dos réplicas pertenecientes ambas a la misma
dilución. A continuación, se calculó la media del número de colonias presentes en
ambas réplicas y se continúo con el cálculo de unidades formadoras de colonias por
ml (UFC/ml) a partir de la siguiente fórmula:
𝑈𝐹𝐶/𝑚𝑙 =𝑛º 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠
𝑚𝑙 𝑒𝑛 𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎 𝑥 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛
En la tabla 2 fueron recogidos los resultados obtenidos.
MEDIOS MUESTRAS DILUCIONES Nº
COLONIAS
MEDIA EN
UFC/ML
TSA Kéfir supermercado
(KS)
10⁻5 392 344 3,6 x 108
Kéfir casero (KF) 10⁻5 260 220 2,4 x 108
MRS KS 10⁻3 157 183 1,7 x 106
KF 10⁻4 171 198 1,8 x 107
YMA KS 10⁻3 129 112 1,2 x 105
KF 10⁻4 97 106 1,0 x 107
McConkey KS 10⁻3 125 127 1,2 x 106
KF - - - -
Tabla 2. Resultados del recuento de microorganismos (UFC/ml) presentes en las
muestras de kéfir.
Estos datos experimentales tabulados, serán expresados en las siguientes
gráficas. En concreto analizaremos las diferencias entre las unidades formadoras
de colonias por mililitro (UFC/ml) según el tipo de muestra. Para una mayor
comodidad, dichos datos fueron pasados a escala logarítmica.
24
Gráfica 1. Representación gráfica del número de UFC/ml en el kéfir de supermercado
Se observa un crecimiento superior en el medio general TSA respecto al resto,
esto es debido a que se trata de un medio general, dónde se busca la carga límite
bacteriana (Gráfica 1). Se observa que en el resto de medios la cantidad de UFC/ml
es similar. Se advierte una presencia de 1,2 x 105 UFC/ml en el medio YMA, lo que
ratifica la presencia de levaduras en la composición microbiológica del kéfir. En el
medio MRS, se contempla 1,7 x 106 UFC/ml una cantidad por encima de la
encontrada en el medio YMA, indicando una mayor presencia de bacterias ácido
lácticas que de levaduras (Gráfica 1).
Por último, el crecimiento en el medio de cultivo McConkey indica la presencia de
enterobacteria, en concreto un número de 1,2 x 106 UFC/ml (Gráfica 1). Según el
Instituto Nacional de Alimentos esto podría ser debido a una contaminación en la
cadena de elaboración del producto, más concretamente a una contaminación post
tratamiento térmico.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
TSA YMA MRS McConkey
UFC/ml
KÉFIR DE SUPERMERCADO
25
Gráfica 2. Representación gráfica del número de UFC/ml en el Kéfir casero
Los datos obtenidos para el kéfir obtenido de forma casera al igual que para el kéfir
de supermercado, presenta una carga bacteriana superior en medio TSA, la
presencia de levaduras por el crecimiento en medio YMA y un mayor número de
UFC/ml de bacterias ácido lácticas que de levaduras (Gráfica 2). En medio
McConkey no se observa ningún crecimiento, por lo que se descarta la presencia
de enterobacterias en el kéfir casero (Gráfica 2)
Gráfica 3. Comparación del número de UFC/ml entre el kéfir de supermercado y el
casero
En esta última gráfica (Gráfica 3), se pueden observar las diferencias entre el número
de UFC/ml en el kéfir de supermercado y el kéfir casero. Se observan diferencias
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
TSA YMA MRS McConkey
UFC/ml
KÉFIR CASERO
26
significativas entre la concentración de bacterias ácido lácticas y levaduras, siendo
mayor en el kéfir casero, 1,8 x 107 UFC/ml y 1,0 x 107 UFC/ml respectivamente.
Además, se advierte una leve diferencia de microorganismos siendo mayor en el kéfir
de supermercado que en el kéfir casero. Por último, sólo se perciben enterobacterias
en el kéfir de supermercado.
6.2. Selección de los microorganismos de interés e identificación preliminar
En primer lugar, se llevó a cabo el aislamiento de las colonias tanto del medio de
cultivo MRS e YMA, intentado que difirieran en cuanto a su morfología a nivel
macroscópico. Tras el aislamiento, dichas colonias fueron sometidas a una tinción de
Gram, donde pudimos conocer tanto si pertenecían a microorganismos Gram positivos
o negativos. Además de si correspondían a bacilos, cocos o levaduras dependiendo
de su morfología microscópica.
La nomenclatura utilizada fue la siguiente; se diferenció entre el tipo de muestra, la
perteneciente al kéfir de supermercado se denominó por KS y la perteneciente al kéfir
artesanal por KF seguido del número de colonia aislada empezando por la 1, 2, 3,…
y así sucesivamente.
A continuación, se muestran los resultados obtenidos de esta selección preliminar
(Tabla 3):
COLONIA MEDIO DE CULTIVO MORFOLOGIA TINCIÓN
KS1 YMA Colonia pequeña blanca Bacilo Gram -
KS2 YMA Colonia grande blanca Coco Gram -
KS3 YMA Colonia pequeña blanca Bacilo Gram -
KS4 YMA Colonia pequeña blanca Bacilo Gram -
KS5 YMA Colonia pequeña blanca Bacilo Gram-
KS6 YMA Colonia pequeña blanca Bacilo Gram-
KF8 YMA Colonia grande blanca mucosa Levadura
KF9 YMA Colonia mediana blanca mucosa Levadura
KF10 YMA Colonia pequeña blanca mucosa Levadura
KF11 YMA Colonia grande blanca mucosa Levadura
KF12 YMA Colonia grande blanca mucosa Levadura
KF13 YMA Colonia pequeña blanca mucosa Coco Gram +
KF14 MRS Colonia pequeña blanca mucosa Levadura
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KF15 MRS Colonia grande blanca mucosa Levadura
KF16 MRS Colonia mediana blanca mucosa Levadura
KF17 MRS Colonia mediana blanca mucosa Bacilo Gram -
KS18 MRS Colonia grande blanca mucosa Bacilo Gram -
KS19 MRS Colonia grande blanca mucosa Bacilo Gram -
KS20 MRS Colonia mediana blanca mucosa Bacilo Gram -
KS21 MRS Colonia mediana blanca mucosa Coco Gram +
KS22 MRS Colonia pequeña blanca mucosa Bacilo Gram -
Tabla 3. Resultados de la tinción de Gram
6.3. Determinación de la actividad antimicrobiana en medio sólido
Para evaluar la actividad antimicrobiana que poseían las colonias aisladas se llevó a
cabo el método de cruces. El objetivo de esta técnica fue la observación de halos de
inhibición producidos por estas frente a las bacterias indicadoras. La presencia de un
halo de inhibición alrededor de las cepas sembradas en cruz sugeriría que la presencia
de estas inhibe el crecimiento de las bacterias patógenas. A continuación, se muestran
los resultados obtenidos (Tabla 4):
BACTERIAS INDICADORAS
COLONIAS MEDIO MORFOLOGIA S. aureus E. faecalis S-47 L. innocua
KS1 YMA Bacilo Gram - ++ (6mm) + ++ (3mm)
KS2 YMA Coco Gram - ++ (2mm) + ++ (10mm)
KS3 YMA Bacilo Gram - - - +
KS4 YMA Bacilo Gram - - - -
KS5 YMA Bacilo Gram - ++ (2mm) + +
KS6 YMA Bacilo Gram - ++ (6mm) - ++ (4mm)
KF8 YMA Levadura +++(10mm) - +++(5 mm)
KF9 YMA Levadura - - -
KF10 YMA Levadura +++(5,5mm) - +
KF11 YMA Levadura +++ (7mm) + +
KF12 YMA Levadura +++(6,5mm) + +
KF13 MRS Coco Gram + + + +
KF14 MRS Levadura - + -
KF15 MRS Levadura - + -
KF16 MRS Levadura - + +
KF17 MRS Bacilo Gram - + + -
KS18 MRS Bacilo Gram - - - +
KS19 MRS Bacilo Gram - + + +
28
KS20 MRS Bacilo Gram - + + +
KS21 MRS Coco Gram + + + -
KS22 MRS Bacilo Gram - ++ - -
Tabla 4. Actividad antimicrobiana de los aislados de kéfir
Se estableció una escala para medir la presencia de halo de inhibición. Por un lado la
presencia fue representada por “+” y dependiendo si esta era más o menos intensa
por “++” o “+++”. Mientras que la ausencia de halo fue representada por “-“. Entre las
colonias que presentaron halo, este fue medido en el caso de que fuera posible, en
milímetros.
Se observa como en la mayoría de los casos las colonias aisladas presentan actividad
antimicrobiana frente a las bacterias patógenas (Ilustraciones 4 y 5). Se podría citar la
intensa actividad de la colonia KF10, KF11, KF12 y KS5 frente a Staphylococcus
aureus.
Ilustración 4. Halo de inhibición frente a Ilustración 5. Halo de inhibición frente a L. inocua
S. aureus
6.4. Determinación de la actividad antimicrobiana en medio líquido
Tras centrifugar los cultivos microbianos y quedarnos con la porción no microbiana del
kéfir (Sobrenadante), es decir obviando las células del resto de sustancias liberadas
por ellas. Se pretende comprobar si los compuestos desprendidos por nuestros
microorganismos producían alguna actividad antimicrobiana, observándose un halo
de inhibición del crecimiento por parte de las bacterias indicadoras
29
Sólo se evidencio actividad antimicrobiana para las colonias KS5 y KS6 contra la
bacteria indicadora Staphylococcus aureus. El halo de inhibición de KS5 fue de 5 mm
y de 6 mm para KS6 (Ilustración 6). Ambas colonias pertenecían a la muestra de Kéfir
obtenida en el supermercado. El resto de colonias o bien no presentaron halo o
estaban contaminadas posiblemente por una mala manipulación en la recogida del
sobrenadante tras la centrifugación, pudiéndose recoger parte de la carga bacteriana.
En el caso de las colonias que no han presentado halo de inhibición, excepto las
contaminadas, se puede pensar que dichas colonias presentan las sustancias
inhibidoras pegadas a su pared celular por eso al desechar en la centrifugación las
células bacterianas, no se observó actividad alguna.
Ilustración 6. Presencia de halo de inhibición por parte de las colonias KS5 y KS6 frente a S. aureus.
6.5. Análisis estadístico
Para la evaluación de la existencia de diferencias entre el número de unidades
formadoras de colonias por mililitro entre kéfir de supermercado y kéfir casero, se
utilizó la prueba t-student para muestras independientes, considerando varianzas
desiguales. Los datos se consideraron significativamente distintos cuando el valor de
p fue inferior a 0,05. Para el procesado de datos se utilizó el programa Microsoft Excel.
30
En primer lugar, se establece una hipótesis: El promedio del número de unidades
formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml) del kéfir casero es mayor que el del kéfir
de supermercado.
Para llevar a cabo el análisis es necesario la consideración de los siguientes puntos:
H₁ (Hipótesis alternativa): Existen diferencias entre la media de UFC/ml del kéfir
de supermercado y la meda de UFC/ml del kéfir casero.
H0(Hipótesis nula): No existen diferencias entre la media de UFC/ml de ambas
muestras.
El nivel de significación, α, tomado suele ser 0,05.
Si p-valor ≥ α se acepta H0. Por lo tanto, no existen diferencias significativas
entre las medias de ambas muestras.
Si p-valor ≤ α se acepta H1. Por lo tanto, existen diferencias significativas entre
las medias de ambas muestras.
Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas desiguales
Kéfir supermercado
Kéfir casero
Media 6,486278 5,658871
Varianza 2,165366 14,59188
Observaciones 4 4
Diferencia hipotética de las medias 0
Grados de libertad 4
Estadístico t 0,404248
P(T<=t) una cola 0,353356
Valor crítico de t (una cola) 2,131847
P(T<=t) dos colas 0,706712
Valor crítico de t (dos colas) 2,776445
El p-valor obtenido es de 0,706712 > 0,05 por lo que aceptamos la hipótesis nula, no
existen diferencias significativas entre las medias de ambas muestras.
7. DISCUSIÓN
En los últimos años un tema de interés creciente ha sido el consumo de alimentos
probióticos que contribuyan a la salud y al bienestar, especialmente a aquellos que
reducen el riesgo de padecer enfermedades (Iraporda, 2016).
31
Actualmente, el kéfir es reconocido como una fuente potencial de probióticos y
moléculas con propiedades altamente saludables muy interesantes. El estudio y la
caracterización de la composición del kéfir ha contribuido a abrir nuevas posibilidades
para su aplicación en el ámbito de la industria alimenticia (Prado et al., 2015). Es por
ello, que el objeto de nuestro estudio ha sido la caracterización de la microbiota del
kéfir con la finalidad de conseguir cepas con actividad antimicrobiana.
En cuanto al análisis de la composición microbiológica del producto fermentado, no se
encontraron diferencias significativas, según el análisis estadístico llevado a cabo.
Quizás no se encontraron diferencias porque el tamaño de la muestra no era lo
suficientemente representativo. En ambas muestras se cotejo una concentración de
1,7 x 106 – 1,8 x 107 UFC/ml de bacterias ácido láctica. Mientras que en levaduras el
valor oscilo entre 1,2 x 105 – 1,0 x 107 UFC/ml. Se reveló la presencia de
enterobacterias aisladas de la muestra procedente del supermercado, lo cual indica
una contaminación en la cadena de elaboración del producto fermentado. Witthum et
al. (2005) evidenciaron que la concentración de bacterias ácido lácticas presentes en
el kéfir puede oscilar desde 6,4 x 104 a 8,5 x 108 UFC/ml y los niveles de levaduras
desde 1,5 x 105 a 3,7 x 108 UFC/ml. Además ha sido reportado la presencia de
bacterias ácido acéticas en el orden de 106 UCF/ml en el producto fermentado por los
gránulos de kéfir (Irigoyen et al, 2005). Comúnmente, existen mayores niveles de
bacterias ácido lácticas que de levaduras en el kéfir. Pese a esto, las condiciones de
fermentación también influyen en la distribución de los microorganismos presentes
tras la fermentación (Magalhães et al., 2011). Para una mejor compresión de la
diversidad microbiana del kéfir, se recomienda el uso de técnicas de secuenciación
masiva, como la pirosecuenciación. Dobson et al. (2011) llevaron a cabo esta técnica
y reportaron la presencia de microorganismos pertenecientes a grupos minoritarios,
no advertidos previamente, los cuales podrían contribuir a las características
sensoriales presentes en la bebida fermentada.
La capacidad inhibitoria presente en el kéfir, quizás sea debido a la compleja
asociación de cepas probióticas que producen sustancias antimicrobianas (Chifiriuc et
al., 2011). En nuestros ensayos pudimos comprobar como en medio sólido en la
mayoría de los casos las colonias aisladas presentan actividad antimicrobiana frente
a las bacterias patógenas. Se podría citar la intensa actividad de la colonia KF10,
KF11 y KF12, las cuales correspondían a una morfología del tipo levadura y KS5,
32
correspondiente a un bacilo Gram negativo, frente a Staphylococcus aureus. Las
levaduras que presentaron actividad antimicrobiana fueron aisladas de la muestra
obtenida de forma casera. Mientras que el bacilo Gram negativo fue obtenido de la
muestra adquirida en el supermercado. Por otro lado, las colonias KF8 y KS1
correspondiente a una morfología del tipo bacilo Gram negativo, presentan una
notable actividad inhibitoria frente a Listeria innocua.
El ensayo en medio líquido, con la fracción no microbiana del cultivo bacteriano, dio
como resultado inhibición del desarrollo de Staphylococcus aureus por parte de las
cepas aisladas KS5 y KS6. Ambas cepas fueron identificadas como bacilos Gram
negativos a partir de la muestra obtenida en el supermercado. El halo de inhibición
para ambas colonias fue de 5-6 mm respectivamente. De modo general, el kéfir
presenta actividad antibacteriana en microorganismos Gram negativos. Aunque en
microorganismo Gram positivos también ha sido evidenciado efectos inhibitorios frente
a microorganismos patógenos (Ahmed et al., 2013). Han sido una considerable
cantidad de estudios los que han reportado actividad antimicrobiana del kéfir frente a
Listeria innocua, Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus,
Escherichia coli, Listeria monocytogenes (Ahmed et al., 2013). Chifiriuc et al. (2011)
encontraron también que el crecimiento de Enterococcus faecalis y Bacillus subtilis
ssp. Spizizenii eran inhibidas por la fracción no microbiana del kéfir. Ulusoy et al.
(2007) mostraron el efecto inhibitorio producido por el kéfir sobre Staphylococcus
aureus con un diámetro de inhibición que vario desde los 21,1 a los 21,4 mm.
Recientes estudios han demostrado como cepas aisladas de los granos de kéfir, como
Lactobacillus producían zonas de inhibición de 19-22 mm contra Listeria innocua y
Clostridium perfringens respectivamente (Dobson et al., 2011).
8. CONCLUSIONES
La creciente tendencia a consumir productos alimenticios beneficiosos para la salud
ha sido el desencadenante del ensayo llevado a cabo. El kéfir es un ejemplo de un
claro alimento próbiotico debido a los múltiples efectos beneficios conocidos y
estudiados tales como la actividad antimicrobiana en la que hemos centrado dicho
estudio. Ha quedado evidenciado como el kéfir de leche es capaz de inhibir el
crecimiento de patógenos humanos comunes tales como Staphylococcus aureus o
Listeria. Cabe destacar que se observa un mayor número de microorganismos
33
presentes en el kéfir obtenido de forma casera que en el kéfir adquirido en el
supermercado. Además la presencia de enterobacterias en este último nos lleva a
pensar que su consumo, pese a los efectos antimicrobianos encontrados, no sería
muy seguro.
Por último, se debería disponer de un número mayor de trabajos sobre la composición
química presente en el kéfir, así como de los mecanismos de acción los cuales tienen
lugar in-vivo que aportan beneficios a la salud de humanos. Un sólido conocimiento
acerca de esta bebida sería posible con una mayor experimentación, lo cual permitiría
un uso más racional de esta bebida y un impacto en su consumo.
34
9. BIBLIOGRAFÍA
Administración Nacional de Medicamentos Alimentos y Tecnología Médica. (2017).
Guía de interpretación de resultados microbiológicos de alimentos. Recuperado de:
http://www.anmat.gov.ar/Alimentos/Guia_de_interpretacion_resultados_microbiologic
os.pdf
Bolaños, V., & Jiménez, P.,(2014). Elaboración de dos bebidas fermentadas con
gránulos de kéfir en agua y leche, para corroborar si son bebidas probióticas según la
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