3. m za analizu h i p bh 2014
Post on 06-Jul-2018
229 Views
Preview:
TRANSCRIPT
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
1/58
Metode umolekularnoj
biologiji
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
2/58
Metode za analizuhromozoma
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
3/58
Hromozom
• Hromozom – χρώμα (hroma) - boja i σώμα (soma) – telo• Sposobnost bojenja hromozoma je bila osnov na kojoj su se
bazirale pionirske metode za analizu hromozoma
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
4/58
• Skup svih hromozoma u jednoj ćeliji, sa opisom njihovogbroja i morfologije, predstavlja kariotip
• Hromozomi sloeni po nekom sistemu, naj!e"će poveli!ini i morfologiji, !ine kariogram
• Shematski prikaz kariograma ozna!ava se kao idiogram
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
5/58
#etode kariotipiza$ije
• %dre&ivanje kariotipa• 'zor$i Sva tkiva !ije se ćelije
dele ili se mogu stimulisati nadeobu
• naliza hromozoma vr"i se umetafazi ćelijske deobe
• *ajjednostavnija metodakariotipiza$ije je odre&ivanje
kariotipa iz limfo$ita perifernekrvi – #orheadova metoda• naliza kori"ćenjem
svetlosnog mikroskopa
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
6/58
+ trake
• ojenje tripsinom ( razlae proteine i pravi trake.) / +imzom
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
7/58
0-trake – reverzna tehnika
• 0ezultat suprotan od tehnike + traka
• %ni regioni hromozoma koji su se bojili tamno., kori"ćenjem 0tehnike boje se svetlo. i obrnuto
• 1oristi vrući alkalni rastvor i +imzu
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
8/58
2 – trake
• 3ro$edura ista kao kod +banding metode samo "to se zabojenje koristi 4uinea$rine
• naliza fluores$entnimmikroskopom
• 1oristi se za marka$iju 5hromozoma i satelita naakro$entri!nim hromozomima
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
9/58
6 – trake
• 7ehnika za bojenje konstitutivnog heterohromatina
• 8a analizu stukturnih promena u okolini $entromera
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
10/58
naliza hromozoma metodamabojenja traka
• *umeri!ke i strukturne abera$ije hromozoma
• 9etek$ija hromozomskih rearanmana većih od : #b
http;;
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
11/58
Fluorescentna in situ hibridizacija - FISH
• 9etek$ija spe$ifi!nih regiona 9*1 u $itolo"kommaterijalu fiksiranom na mikroskopskim plo!i$ama
• 3reporuka je da se ova metoda primenjuje paralelno sametodom analize hromozoma + traka.
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
12/58
Fluorescentna in situ hibridizacija - FISH
• 3ro$es sparivanja jednolan!anihpolinukleotida iz dva razli!itaizvora na osnovukomplementarnosti baza nazivase HC0C9C86CD
• ' mnogim tehnikama jedanpolinukleotid je definisanasekven$a ili hemijski sintetisanmolekul – 30% – EF'%0GS6G*7*%
%GFGG*G 30%G• In situ zna!i u mestu
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
13/58
Fluorescentna in situ hibridizacija - FISH
• 9enatura$ija $iljne 9*1
• Hibridiza$ija probe sa $iljnom 9*1
http;;
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
14/58
7C3%KC 30% 8 ECSH
0azli!iti tipovi proba za fluores$entnu in situ hibridiza$iju (ECSH)
+en-spe$ifičnaproba
6entromernaproba
7elomernaproba
Hromozom-spe$ifična proba(Chromosome-
painting probe)3robe za repetitivne 9*1 sekven$e
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
15/58
Fluorescentna in situ hibridizacija - FISH
metafazni hromozomi interfazna jedra
http;;
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
16/58
Fluorescentna in situ hibridizacija - FISH
• *umeri!ke hromozomske abera$ije
• Strukturni hromozomski rearanmani
• #ikrodele$ije
• Cdentifika$ija ta!ke prekida na hromozomima• bera$ije na nivou pojedina!nih gena
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
17/58
1omparativna genomskahibridiza$ija
#etoda za ispitivanje- duplika$ija i dele$ija velikih hromozomskih regiona
- numeri!kih hromozomskih abera$ija
- genomskih promena tumorskih ćelija
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
18/58
1omparativna genomskahibridiza$ija
• #etoda se bazira na kvantitativnom dvobojnom FISH-u• Simultana hibridiza$ija dva uzorka genomskih DNK koji
su obeleeni sa dve razli!ite genomske probe sa
normalnim metafaznim hromozomima• 'zor$i genomskih 9*1 – kontrolna genomska 9*1 igenomska 9*1 tumorskog tkiva
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
19/58
3riprema genomskih 9*1
• iotinom obeleene tumorske 9*1
• 9C+-om obeleene kontrolne 9*1
- KC9C* konugovan sa zelenom fluorobojom – EC76 za
detek$iju botinom obeleene tumorske 9*1- nti 9C+ antitelo konjugovano sa $rvenom bojom (0%9#C*om) za detek$iju 9C+-om obeleenekontrolne 9*1
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
20/58
1omparativna genomskahibridiza$ija
• 0egioni metafaznih hromozoma koji jednakimintezitetom hibridizuju sa obe fluoro boje "to za rezultatima emitovanje ute boje daju informa$iju o delovimatumorskog genoma bez strukturnih ili numeri!kih izmena=
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
21/58
1omparativna genomskahibridiza$ija
• ' slu!aju delecija hromozma tumorskog tkiva detektuje se boja kojom su Mbojeni uzor$i kontrolne 9*1(u prikazanom slu!aju to je $rvena boja)=
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
22/58
1omparativna genomskahibridiza$ija
• Cstovremeno, regioni koji su dupliciranih utumorskom tkivu za rezultat imaju pojavu boje nametafaznih hromozomima kojom je obeleenagenomska 9*1 kontrolnog uzorka (u prikazanom slu!aju
to je zelena boja)=
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
23/58
1omparativna genomskahibridiza$ija
• Karija$ije u intenzitetu boje !itavih normalnih metafaznihhromozoma odraavaju numeri!ke hromozomskeabera$ije, dok varija$ije u intenzitetu fluoroboja udelovima istih hromozoma reflektuju promene u broju
kopija delova hromozoma (duplika$ije ili dele$ije delovahromozoma)
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
24/58
1omparativna genomskahibridiza$ija
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
25/58
#olekularno - biolo"ke metode zaanalizu proteina
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
26/58
• Cmunohistohemija• Nestern blot
• 1o-imunopre$ipita$ija
8DG9*CO1C 0G+G*S
*7C7GF%
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
27/58
ntitelo
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
28/58
C#'*%HCS7%HG#CD
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
29/58
Cmunohistohemija
Cmunohistohemijske metode omogućavaju vizueliza$ijudefinisanih antigena u tkivnim prese$ima, vezivanjemantitela za male, spe$ifi!ne regione antigena, antigenedeterminante ili epitope=
Imunohistohemija kao metoda zasniva se na kori"ćenjeobeleenih antitela kao spe$ifi!nih reagenasa zalokaliza$iju i detek$iju tkivnih konstituenata (antigena) insitu=
ntigen ntitelo! ntigen " ntitelo kompleks
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
30/58
3rimarno antitelo
Spe$ifi!no lo$ira antigen u tkivnom preseku
3%FC1F%*S1 *7C7GF
3rvootkrivena ili prvosintetisana antitela
• 3otrebno je bilo izolovati antigen
• 'raditi imuniza$iju ivotinje
• 9obro biohemijski okarakterisati g
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
31/58
3rimarno antitelo
#%*%1F%*S1 *7C7GF
• APIQ= godine - +eorge1ohler i 6esar #ilstein
• 0azvoja hibridomatehnologije – hibridiza$ijasomatskih ćelija - fuzijaspleno$ita (ćelije koje
stvaraju antitela) i ćelijamijeloma (ćelije koje sekontinuirano dele)
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
32/58
08FC1G 3oliklonska antitela #onoklonska antitela
3repoznaju na g-nu #ultiple epitope Krlo spe$ifi!na –prepoznaje
pojedina!ne epitope'kr"tena reaktivnost 3risutna !esto 8avisi od spe$ifi!nosti
epitopa, moe bitiprividno odsutna
*espe$ifi!no
(ba$kground) bojenje
Karira 3rividno odsutno
%setljivost Krlo osetljiva 0elativno niska,afinitet za epitopenizak
Sastav 0azli!ite klase isubklase Cg-na
3ojedina!ne klase ilisubklase Cg-na,uniformnih molekula
0eprodu$ibilitet Karira Hibridoma produkti sustabilni tokomvremena
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
33/58
Cmunohistohemijaa# $utinski% u para&in uklopljeni% tkivnih preseci
b# Krio ise'ci " nativni (zamrznuti) delovi tkiva
c# *elijski razmazi odnosno suspenzije
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
34/58
Cmuno$itohemija
Cmunohistohemija
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
35/58
Cmunohistohemija
DI$+K,N M+,D
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
36/58
Cmunohistohemija
INDI$+K,NI M+,D
.rimarno antitelo koje se vezuje za antigenSekundarno antitelo koje se vezuje za primarno antitelo
Sekundarno antitelo je Ig/ za animalnu vrstu iz koje je izlovano primano antitelo
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
37/58
Cmunohistohemija
Gnzim kao obeleiva! antitela
3eroksidaza – supstrat vodonik peroksid - razlaevodonik peroksid do vode, a oslobo&eni elektroni
polimerizuju hromogenu supstan$u koja se taloi namestu reak$ije antigen – antitelo=
7alog je nerastvoran i time je omogućena vizueliza$ijareak$ije – S7CF*, 70D* C KC9FDCK
SKG7F%S*C# #C10%S1%3%# lkalna fosfataza – supstrat naftol fosfati
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
38/58
Cmunohistohemija
9alji razvoj ovih tehnika i"ao je u prav$u povećanja broja primenjenihslojeva antitela i povećanju osetljivosti i spe$ifi!nosti bojenja.=33 kompleks 3eroksidaza anti - peroksidaza kao ter$ijerni sloj
33 kompleks lkalna fosfataza anti - alkalna fosfataza kao ter$ijerni sloj priimunohistohemijskim bojenjima. onih tkiva u kojima ja te"ko blokiratiaktivnost endogene peroksidaze
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
39/58
3riprema uzorka
• 'zimanje uzoraka tkiva – biopsija, hirur"ki materijal,tkiva oglednih ivotinja,===
• Eiksa$ija uzoraka
• 9ehidrata$ija, proimanje i kalupljenje odabranihuzoraka u parafin
• Se!enje parafinskih kalupa na mikrotomu na ise!kedebljine oko R-Qµ
• dhezija tkivnih ise!aka na staklene predmetneplo!i$e
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
40/58
3riprema uzorka
• 1rio ise!$i
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
41/58
Cmunohistohemijska pro$edura
• 9eparafiniza$ija i rehidrata$ija ako su uzor$i tkiva zaimunohistohemijsku analizu ukalupljeni u parafin
• Eiksa$ija
• 9emaskiranje. antigena
• Cmunuhistohemijska pro$edura
• ojenje
http://labtrader.com/equipment_images/VVS0803003_larger.jpg
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
42/58
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
43/58
3rimena imunohistohemije
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
44/58
Nestern blot analiza
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
45/58
Nestern blotting
• Cdentifika$ija proteina• %dre&ivanje koli!ine
ispitivanog proteina
• %dre&ivanje molekulsketeine polipeptida
• 3ro$ena efikasnostiekstrak$ije proteina
• 9etek$ija proteina
• 8a izolovanje ikarkateriza$iju antitela izpoliklonalnih seruma
E Color product
substrate
3 i k i l j t i i bi l "k t ij l
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
46/58
• 3riprema uzorka – izolovanje protein iz biolo"kog materijala
• 0azdvajanje uzorka proteina elektroforezom na gelu
• 7ransfer uzorka proteina sa gela na membranu
•lokiranje nespe$ifi!nog vezivanja antitela na membrani• Cnkuba$ija membrana sa antitelom za protein od interesa
• 9etek$ija kompleksa antigen - antitelo
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
47/58
3riprema uzorka
*aj!e"ći izvor proteina ćelijski lizati - *edenaturisani pufer - Fiza ćelija -
%sloba&anje proteina – Ouvanje uzoraka proteina
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
48/58
dre0ivanje koncentracije proteina
1olorimetrijskog odre&ivana kon$entra$ije proteina na osnovustandardne krive, konstruisane na osnovu asporban$ija uzoraka
poznate kon$entra$ije - 1oefi$ijent prav$a krive
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
49/58
/el za koncentrovanje12 akrilamid3N4N4-bis akrilamid
Nestern blotting
/el za razdvajanje562 akrilamid3N4N4-bis akrilamid
0azdvajanje
po molekulskoj tezini
SDS " ./+ elektro&oreza
kori78enjem poliakrilamidnog gelarazdvajanje po molekulskoj tezini
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
50/58
,rans&er uzorka proteinasa gela na membrane
a= nitro$elulozna membrana
b= aktivirana papirna membrana
$= aktivirana najlonska membrana
A= 3rosta difuzija
:= Kakum transfer
L= Glektroforetska elu$ija
(vlani i polusuvi)
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
51/58
Cmunobloting
• lokiranje nespe$ifi!nog vezivanjaantitela (obrano mleko ili S –albumin iz seruma gove!eta)
• Cnkuba$ija blotova primarnim
antitelom• %GFGG* *7C7GF – direktna
detek$ija
• *G%GFGG* *7C7GF –
indirektna detek$ija - kolorimetrijskaenzimska detek$ija ihemiluminis$en$ija
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
52/58
Nestern blot analize
utoradiogra&ski signali se skeniraju a trake se kvanti&ikuju kori78enjem so&tvera
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
53/58
Nestern blotting
• *C#6CDhttp;;
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
54/58
K - IM9N.$+:I.I,:I;
M+,D
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
55/58
1% - C#'*%30G6C3C76CD
• #etoda ko-imunoper$ipita$ije zasniva se na prin$ipupre$ipita$ije $iljnog proteina, kori"ćenjem primarnogantitela, iz rastvora nedenaturisanih totalnih proteina, uprisustvu protein + sefaroze - streptokokni protein sa
velikim afinitetom vezivanje za sve klase imunoglobulinarazli!itog porekla=
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
56/58
1% - C#'*%30G6C3C76CD
*akon pre$ipita$ije, u talogu se nalazi $iljni protein, kao isvi proteini koji su sa njim, u formi dimera, bili povezanislabim nekovalentnim vezama=
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
57/58
1%-C#'*%30G6C3C76CD
• *akon imunopref$ipita$ije prisustvo razli!itih proteina,analizira primenom Nester blotting metode (S9S-3+G)
Slede metode a anali
-
8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014
58/58
Slede metode za analizunukleinskih kiselina
top related