蛋白质纯化技术
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蛋白质纯化技术
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蛋白质纯化技术
盐析，等电点沉淀
透析，超滤
凝胶过滤层析
离子交换层析
亲和层析
密度梯度离心
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常用中性盐：硫酸铵，硫酸钠，氯化钠
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盐析，等电点沉淀
透析，超滤
凝胶过滤层析
离子交换层析
亲和层析
密度梯度离心
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切向流过滤 切向流过滤（ Tangential Flow Filtration ，简称 TF
F ）其概念是相对于常规过滤（ Normal Flow Filtration ，简称 NFF ）而言的。
切向流过滤则是指液体的流动方向是平行于膜表面的，在压力的作用下只有一部分的液体穿过滤膜进入下游，这种操作方式也有人称之为“错流过滤”（ Cross Flow Filtration ）。
蛋白质纯化技术蛋白质纯化技术
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切向流过滤
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切向流工艺优化参数 切向流流量
跨膜压（ TMP ）
透出液控制
膜面积
透析条件
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具有透过液控制的切向流过滤系统示意图
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盐析，等电点沉淀
透析
凝胶过滤层析
离子交换层析
亲和层析
高压液相层析
密度梯度离心
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蛋白质纯化技术
盐析，等电点沉淀
透析
凝胶过滤层析
离子交换层析
亲和层析
密度梯度离心
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层析技术 层析分离又称色谱分离（ Chromatographic Resolution, CR）或色层分离。
根据物理化学性质的差异，使各组分以不同程度分布在两个相（固定相和流动相）中。
在固定相和流动相之间经过多次分配以不同的速率移动，从而达到分离的目的。
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层析技术基本原理 1. 吸附层析 混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，由于固
定相对不同物质的吸附力不同而使混合物得到分离。 2. 分配层析 其固定相和流动相都是液体，其原理类似于液液萃取，
利用混合物中各物质在两液相中的分配系数不同而分离。 3. 凝胶过滤层析 由于大分子和小分子在通过色谱柱时，所通过得路
径不同（大分子进入空隙，小分子进入孔内），流出色谱柱的时间不同，从而得到分离。
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层析技术分类 1.按分离机理不同分类 吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析 2.按固定相形状不同分类
柱层析、纸层析、薄层层析 3.根据流动相的物理形态不同分类
气相层析、液相层析、超临界层析 4. 根据层析分离的规模大小分类
分析型（一次进样量 <10 mg）、半制备型（一次进样量 10-50 mg）、制备型（一次进样量 0.1-10 g ）和工业生产型（ > 20 g/d）
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凝胶过滤层析（ gel chromatography ） 又称为凝胶排阻层析、分子筛层析、凝胶层析、凝胶渗透层析等。
利用凝胶过滤介质为固定相，根据物料中溶质相对分子质量的差异的液相色谱法。
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凝胶特性参数 排阻极限 (exclusion limit) 分级范围 (Fractionation range) Sepharose 6 Fast Flow，它的分级范围为 10KD-4000KD
吸水量 (Water regains) 凝胶粒径 Sepharose 6 Fast Flow，它的颗粒大小为 45-165um
床体积 (Bed volume ) 空隙体积 (Void volume)
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凝胶介质的种类 按基质组成主要可以分为 ： 葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶以及由两
种物质混合形成的如琼脂糖 - 葡聚糖混合凝胶、聚丙烯酰胺 - 葡聚糖混合凝胶等。
按凝胶过滤层析能达到的柱效和分辨率又可分为： 标准凝胶介质：颗粒尺寸较大（一般为 100~250 μm ），
机械强度相对较低 高效凝胶介质：颗粒尺寸小（一般为 5~50 μm ），机械强
度相对较高，柱效明显提高，适合于高分辨率或更快的分离。
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琼脂糖凝胶 由 β-D- 半乳糖和 3,6- 脱水 -L- 半乳糖两种单糖交替连接 而成。
其商品名有三种①Sehparose
②Sepharose CL
③Superose
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Sepharose 由于没有交联剂的存在，决定凝胶颗粒网孔大小的
因素是形成凝胶时琼脂糖的含量。
分离范围 颗粒大小 特性 / 应用
Sepharose 2B
Sepharose 4B
Sepharose 6B
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Sepharose Fast Flow
Sepharose 6 Fast Flow
Sepharose 4 Fast Flow
分离颗粒 范围大小 特性 / 应用 pH 稳定性 耐压 最高流速 （ Mpa ） (cm/h)
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Sepharose CL
Sepharose CL 系列凝胶在颗粒直径、分级范围方面与Sepharose 系列完全相同
在 pH 稳定范围、机械强度（流速）及温度稳定性等方面得到了很大的改进
Superose 具有很好的机械稳定性、化学稳定性及热稳定性，
适合于高速分离过程。
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复合结构凝胶 Sephacryl HR 系列凝胶：是由烯丙基葡聚糖通过 N, N′-
亚甲基双丙烯酰胺交联而成 。 Superdex 系列凝胶：是将葡聚糖与高交联度的琼脂糖
颗粒共价结合而形成的。
2334
cross-linked agarose
dextran
cross-section from Superdex™ particle
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凝胶过滤层析的操作过程 1. 装柱 2. 平衡（ equilibrium) 3. 上样 (loading) 4. 洗脱 (elution) 5. 凝胶再生和保养
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凝胶过滤层析的影响因素 1. 凝胶介质的选择 一般排阻极限应大于目标分子，而分级范围应当涵盖目
标分子的大小。2. 层析柱的选择 如用凝胶过滤层析法分离蛋白质，层析柱的长度通常
为内径的 25~40 倍。 3. 上样量 分析型为 1-2% 床体积，制备型为 5-30% 床
体积。对于蛋白质的分级分离，上样量通常为柱体积的2%~5% 。
4. 洗脱流速
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离子交换层析（ Ion Exchange Chromatography)
以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力（静电作用力）的差别而进行分离的一种层析方法。
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蛋白质层析技术载体 官能团 可交换离子
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离子交换剂种类
强阳离子（酸）交换剂 （ -SO3H ） 阳离子交换剂 弱阳离子（酸）交换剂 （ -COOH ）
强阴离子（碱）交换剂（ -N(CH3)3） 阴离子交换剂 弱阴离子（碱）交换剂（ -NH2） 离子交换剂的基质 疏水性树脂 --- 聚苯乙烯树脂
亲水性聚合物 --- 纤维素 (Cellulose) 球状纤维素 (Sephacel) 葡聚糖
(Sephadex) 琼脂糖 (Sepharose)
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根据目的蛋白的 pI选择合适的缓冲液 pH pH=pI时，蛋白质表面电荷为零；
pH<pI时，蛋白质带正电荷；
pH>pI时，蛋白质带负电荷。
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亲和层析
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目标物
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亲和层析载体 琼脂糖，聚丙烯酰胺，硅胶亲和层析配体 酶 - 底物类似物，抗体抗原，过渡金属离子等亲和层析载体与配体的链接 需要进行化学反应使载体上化学集团处于活化状态连接臂 增大配基与载体之间的距离，使其与生物大分子有效
的亲和结合。
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2. 凝胶介质的种类
小结
凝胶过滤介质
（ 1 ）葡聚糖凝胶（ Sephadex G-
数字）
（ 2 ）琼脂糖凝胶
（ 3 ）复合结构凝胶
（＊数字越小，表示介质交联度越大，分级范围越小。）
①Sepharose （ 2B,4B,6B ）
②Sepharose CL （ 2B,4B,6B ）
③Superose (6,12)（＊数字表示琼脂糖含量，数字越大，分级范围越小。 ）
①Sephacryl HR （ S- 数字 HR ）②Superdex （ peptide ， 30 ， 75 ，200 ）（＊数字越小，表示介质交联度越大，分级范围越小。）
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