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COLTURE CELLULARI
Popolazione omogenea di cellule singole più o meno aggregate traloro che si riproducono e si accrescono in substrato liquido o solido
Applicazioni colture cellulari:
- industriali- ricerca
morfologiabiochimicapatologiagenetica
Applicazioni industriali
Produzione di sostanze varie
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Vantaggi delle colture cellulari rispetto ai metoditradizionali di coltivazione:
- Indipendenza da fattori ambientali (clima, parassiti,terreno, ecc)
- sistema ben definito, dovuto all'omogeneità dellapopolazione (si evitano fluttuazioni nelle produzioni)
- migliore qualità e quantità nelle produzioni
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RICERCA
Morfologia: primo uso delle colture cellulari
- eventi morfologici differenziazione cellulare
- eventi morfologici formazione di organi
- eventi morfologici dedifferenzazione (sviluppo callo)
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Biochimica:
uso industriale delle colture cellulariper la produzione di sostanze
"metaboliti secondari" di alto valoreeconomico
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Patologia:
nell'eliminazione dei virus (colturein vitro) (meristema: assenza di virus)
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Genetica:
- variabilità genetica (somaclonal variation)(Colture in vitro) relazione alla instabilitàcariologica, numero cromosomico, aneuploidia
-variabilità genetica: individuazione di nuovi e positivi caratteri
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-ibridazione da fusione di protoplasti:
pianta ibrida spesso non fertile, superamento delle barriere di incompatibilitàsessuali (grosso ostacolo nel trasferimento di geni utili da genetipo a genotipo)
- trasferimento di DNA: trasformazione genetica
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Studio stress abiotici
Ruolo fondamentale delle colture cellulari:
Limiti:
- informazioni su processi biochimici-fisiologici-molecolari, ma meccanismi dirisposta allo stress dipendeno dalle funzioni estruttura dell'intera pianta (interazione cellula-cellula della struttura rigida della pianta èpersa, il turgore cellulare e altri meccanismifisici di risposta allo stress non possono esserevalutati)
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-composizione substrato colture cellularimolto diverso da quello in cui le radicicrescono normalmente
-se un carattere è definito a livello cellulare èessenziale che l'impatto di questo si trasmettaall'intera pianta, ereditato e trasferito allesuccessive generazioni
-fondamentale è quindi la rigenerazione dacellula a pianta
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Vantaggi:
-tutte le cellule sono esposte ad un uniforme potenziale idrico che può essere modificato per l'intera popolazione di cellule (stress idrico, salino)
-cellule sono uniformi nello sviluppo ed accrescimento => qualsiasi cambiamento biochimico-fisiologico dovuto a stress riguarderà tutte le cellule; mentre le piante sono popolazioni di cellule eterogenee, lo stress può influenzare solo parti di pianta (stress idrico, salino, metalli, freddo, caldo)
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-può essere facilmente valutata la relazione tra potenziale idrico e osmotico indipendentemente dall'interazione cellula-cellula che si ha nella pianta (stress idrico, salino)
sistema permette facilmente il dosaggio dello stress:
FREDDO - CALDO : si agisce sulla regolazione temperaturacamera di crescita (tutte le cellule saranno stressate)
IDRICO: uso di agenti osmotici da aggiungere al sustrato:glicerolo: penetra nella cellulamannitolo: penetra solo la parete cellularePEG: non penetra(diminuisce disponibilità acqua intra-extracellulare)
SALINO- METALLI: somministrazione diretta nel substrato c o r sformazione GenHORT
Ottenimento colture cellulari
CALLO
-Essenziale passare da questo stadio
Che cos’è?
-E' essenzialmente tessuto indifferenziato capacepiù o meno di proliferazione indefinita quandoporzioni dello stesso sono propagate a intervalliregolari su substrato fresco in condizioni di sterilità
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Come si ottiene?
-Teoricamente da qualsiasi parte di pianta, è comunque preferibile tessuto giovane (foglie a quadrato, stelo capovolto), messa su un particolare substrato solido al buio (bianco-giallino) o alla luce (giallo-verdino)
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-Il sito di inizio della crescita, proliferazione, è la superficie tagliata => massimizzare la superficie di contatto col substrato
-Microscopicamente un tipico callo si presenta con grossi vacuoli, sottile strato di citoplasma, nucleo pressato contro la parete
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Continue subcolture:
-perdita o riduzione organogenesi e embriogenesi, correlato cambiamento di ploidia (predominano poliploidi ed aneuploidi), cambiamento di natura fisiologica ma nongenetica
-comparsa di tessuto con tessitura diversa ⇒ aumenta la friabilità (utile per ottenere cellule, non per organogenesi)
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Per ottenere le colture cellulari:
-ottenuto il callo, subclonarlo molti cicli (5-10 volte) per avere callo friabile
-si sfrantuma il callo friabile in un mezzo liquido ⇒ si ottengono cellule più o meno aggregate, poche singole
-in agitazione continua al buio, 25-28ーC
- diversi cicli per stabilizzazione coltura: inizio coltura crescita lenta, spesso non partono, degenerazione, poi crescita rapida e stabilizzata
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Per le piante in natura tre fonti di nutrizione:
- nutrienti minerali, dal suolo via radici- CO2 atmosferica per la fotosintesi, fonte dicarbonio- prodotti della fissazione di C e minerali =>sostanze di riserva, ormoni, vitamine ecc.
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Per le colture in vitro stesse richieste:calli (solido) e cellule (liquido)
-per le colture cellulari: no luce, no CO2 -somministrazione esogena di nutrienti
minerali, nutrienti organici, vitamine, ormoni
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NUTRIENTI MINERALI: MS 4.7 g/lNUTRIENTI ORGANICI: Saccarosio 30 g/lVitamine: tiamina 9.9 mg/l
piridossina 9.5 mg/lAc.nicotinico4.5 mg/l
ESTRATTI NATURALI: come supplementi(acqua di cocco, estratto di lievito, estratto di malto,caseina idrolizzata, succo di arancia e di pomodoro,aminoacidi: caseina idrol. 2.0 g/lORMONI (specificità del substrato):
2,4 D 5.0 mg/ldopo autoclave
Kinetina 1.0 mg/lAgar(solido) 8.0 g/l
pH 5.8 con HCl
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Citochinine: KinetinaBenzil-aminopurina (BAP)
- Molto attive sulle colture cellulari
stimolano continua crescita e divisione cellulare
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Auxine: Acido indol-acetico (IIA)Acido dicloro fenolacetico (2,4 D)Acido naftalenacetico (NAA)
-stimolano:
divisione cellulareallungamento cellularedifferenziamento
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FASI CICLO CELLULARE
-Singola popolazione è omogenea (stesso substrato, origine, condizioni di crescita, trattamento, ecc.);
- ma differenze in: misura, struttura-aggregazione, forma, cariotipo tra le cellule => eterogeneità spaziale
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Eterogeneità temporale:
analisi ciclo colturale (7-10 giorni):
1 - Lag-fase: subito dopo trasferimento (diluizione) cellule su substrato fresco: cambiamento metabolico che prepara le cellule alla divisione; incrementa livello di: NADPH, ATP, RNA cellulare, proteine totali
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2 - Esponenziale o lineare:
fase di intensa divisione cellulare =>rapido aumento del numero di cellule, diminuzione dei nutrienti, sintesi di metaboliti primari
diluizione cellulare (più diluite, maggior substrato fresco, => maggiore sarà la divisione
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3 - Stazionaria:
diminuzione fino alla cessazione divisione cellulare, diminiusce metabolismo in genere, fenomeno di affamamento (scarsa disponibilità di nutrienti), differenziazione, produzione di metaboliti secondari
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MANTENIMENTO COLTURA
Agitazione 100-120 rpm, al buio (12 ore di sopravvivenza)
Temperatura 26-28ーC costante
Beute da 100ml (20) - 250ml (50) sterili con tappo cotone più alluminio
Subcoltura: 7-10 giorni: 1:1 fino a 1:4
Filtrazione: uso di siringhe, filtri
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Controllo sterilità:- colore- pH- odore- chiarezza menisco- vetrino microscopio- crescita su brodo colturale
Controllo vitalità: uso di fluoresceina diacetato(50mg/ml acetone)1:1 con la coltura cellulare
Misura crescita (curva di crescita):P.C.V.Peso secco (o fresco)Misura corda
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