a funkcionális genomikában rejlő potenciálok

A funkcionális genomikában A funkcionális genomikában rejlő potenciálokrejlő potenciálok

Lars M. Steinmetz és Ronald W. Davies cikke alapjánLars M. Steinmetz és Ronald W. Davies cikke alapján

Horvát Sándor, IV. éves biológus Horvát Sándor, IV. éves biológus

értelmezésébenértelmezésében

A funkcionális genomika eszközeivel választ A funkcionális genomika eszközeivel választ kaphatunk olyan kérdésekre, mint pl.:kaphatunk olyan kérdésekre, mint pl.:

-Mikor expresszálódik egy gén?-Mikor expresszálódik egy gén?

-Hol lokalizálódik a terméke?-Hol lokalizálódik a terméke?

-Milyen más géntermékekkel kerül interakcióba?-Milyen más géntermékekkel kerül interakcióba?

-Milyen-Milyen fentotípust eredményez a gén mutációjafentotípust eredményez a gén mutációja??

A genomiális információ megismerésével a A genomiális információ megismerésével a biológia új korszakba ért.biológia új korszakba ért.

A genom project-ek nagy mértékben A genom project-ek nagy mértékben segítették a funkcionális genomika, segítették a funkcionális genomika, különösen a különösen a DNS microarray (DNS chip)DNS microarray (DNS chip) technológia fejlődését, elterjedését.technológia fejlődését, elterjedését.

Az igazi genom éra akkor köszönt be, Az igazi genom éra akkor köszönt be, amikor elsősorban a szekvencia adatokból amikor elsősorban a szekvencia adatokból következtethetünk a funkcionális következtethetünk a funkcionális információra. információra.

A génfunkció megváltoztatható:A génfunkció megváltoztatható:

-delécióval-delécióval

-inszerciós mutagenezissel-inszerciós mutagenezissel

-RNS interferenciával-RNS interferenciával

A génfunkció megállapításának hatékony A génfunkció megállapításának hatékony módja a mutánsok analízisemódja a mutánsok analízise

Célzott deléció homológ Célzott deléció homológ rekombinációvalrekombinációval

Eltávolítódik a célzott gén, így a funkcionális Eltávolítódik a célzott gén, így a funkcionális redukció teljesredukció teljes

Élesztőben, egérben jól használhatóÉlesztőben, egérben jól használható Újabban Drosophilában is alkalmazzákÚjabban Drosophilában is alkalmazzák Nem működik hatékonyan C. elegansban ill. Nem működik hatékonyan C. elegansban ill.

ArabidopsisbanArabidopsisban

Célzott deléció homológ rekombinációvalCélzott deléció homológ rekombinációval (molekuláris „vonalkód” tag-ek alkalmazása)

a Minden Saccharomyces cerevisiae génhez egy

deléciós kazettát szintetizáltak (deléciós pool). A deléciós kazettát PCR-rel hozták létre. A két végén 45 bp-nyi rész a cél gént ismeri fel. KanMX: antibiotikum rezisztancia UPTAG, DNTAG: upstream ill. downstream

egyedi felismerő rész CP (Common Priming helyek): különbözőek a

kereszthibridizációt elkerülendő bb A deléciós pool kompettív növekedése, A deléciós pool kompettív növekedése, genomi DNS extrakció, genomi DNS extrakció, PCR, PCR, hibridiáció (high-density oligonucleotide array)hibridiáció (high-density oligonucleotide array)

c

A deléciós fenotípusok kvantitatív mérése: a szelekció során összehasonlíthatják a szignál intenzitást, ebből következtetnek a törzsek fitness-ére

Átfedő ORF-eknél nem jól működik (másodlagos mutációk,életképtelenség esszenciális gének homozígóta deléciójánál)

Eredmények:Eredmények:

• Funkcionálisan releváns gének felismeréseFunkcionálisan releváns gének felismerése• Expresszió és funkció összehasonlításaExpresszió és funkció összehasonlítása• Drog (gyógyszer) targetek felderítéseDrog (gyógyszer) targetek felderítése• Betegség gének meghatározásaBetegség gének meghatározása• Molekuláris evolúció tanulmányozásaMolekuláris evolúció tanulmányozása

Inszerciós mutagenezisInszerciós mutagenezis

Transzpozon, vagy más inszertálódó szekvenciaTranszpozon, vagy más inszertálódó szekvencia Random, ezért screenelés szükségesRandom, ezért screenelés szükséges Létrejöhet Létrejöhet teljesteljes, , inkomplettinkomplett, ill., ill.nem funkcionális nem funkcionális

redukció redukció az integrációtól függőenaz integrációtól függően Arabidopsis, Drosophila, élesztő, C. elegans, Arabidopsis, Drosophila, élesztő, C. elegans,

egéregér

Inszerciós mutagenezisInszerciós mutagenezis

-Élesztőben: transzpozonokkal mutáns fenotípusokat, génexpressziót, protein lokalizációt lehet vizsgálni

-Arabidopsisban: Agrobaci T-DNS alkalmazása

Hátrányai:

Teljes genom feltöltés nehéz, a genom egyes régiói nem alkalmasak inszercióra, intergenikus szekvenciába inzertálódásnak nincs hatása.

RNS interferenciaRNS interferencia

Legújabb technológia gén expresszió redukálásraLegújabb technológia gén expresszió redukálásra C. elegansban fedezték fel, hogy dsRNS szekvencia-C. elegansban fedezték fel, hogy dsRNS szekvencia-

specifikusan „elnémítja” a génfunkciótspecifikusan „elnémítja” a génfunkciót Rövid dupla szálú RNS könnyen előállíthatóRövid dupla szálú RNS könnyen előállítható Gyakran nem teljes, és a specifitás mértéke nehezen Gyakran nem teljes, és a specifitás mértéke nehezen

prediktálhatóprediktálható Mégis a legtöbb modell organizmusban működik pl: féreg Mégis a legtöbb modell organizmusban működik pl: féreg

(dsRNS-t produkáló plazmidokat tartalmazó E. colival (dsRNS-t produkáló plazmidokat tartalmazó E. colival etetik), Drozi, növények, emlősöketetik), Drozi, növények, emlősök

Komplex jellegek genetikai Komplex jellegek genetikai feltérképezésefeltérképezése

A genetikai térképezés sikeres volt pl. az A genetikai térképezés sikeres volt pl. az asztma génjeinek megtalálásábanasztma génjeinek megtalálásában

Gondosan kiválasztott populációkban több Gondosan kiválasztott populációkban több ezer polimorfizmus kutatása a szekvencia ezer polimorfizmus kutatása a szekvencia variánsok gyakoriságának felderítése variánsok gyakoriságának felderítése céljából céljából

A statisztikai predikciókhoz több marker A statisztikai predikciókhoz több marker kellene (kevés mintából, olcsón)kellene (kevés mintából, olcsón)

A genotipizálás módszereiA genotipizálás módszereiDNS hibridizálása DNS hibridizálása

microarray-hez:microarray-hez: PCR amplifikált, vagy genomi PCR amplifikált, vagy genomi

DNS, tökéletes egyezés eseten DNS, tökéletes egyezés eseten erős hibridizáció a próbáhozerős hibridizáció a próbához

Fluoreszcens polarizáció:Fluoreszcens polarizáció: PCR, a primer vége egy bázissal a PCR, a primer vége egy bázissal a

polimorf régió vége előtt van, polimorf régió vége előtt van, kiegészítve két különböző kiegészítve két különböző fluoreszcens dideoxi-nukleotiddalfluoreszcens dideoxi-nukleotiddal

Tömegspektroszkópia:Tömegspektroszkópia: gyors, pontosgyors, pontos

Molekuláris „vonalkódok”:Molekuláris „vonalkódok”: molekuláris inverziós próbának is molekuláris inverziós próbának is

nevezik, közvetlenül a genomi nevezik, közvetlenül a genomi DNS-en végezhető, egy reakcióval DNS-en végezhető, egy reakcióval SNP-k (single nucleotide SNP-k (single nucleotide polymorph, pontmutáció) ezrei polymorph, pontmutáció) ezrei analizálhatókanalizálhatók

Egyedi DNS vonalkódot tartalmazó próba, a 2 vége komplementer a polimorf r.-t szegélyező résszel

Humán mendeli öröklődésű Humán mendeli öröklődésű betegségekbetegségek

Egy korábbi review szerint a több, mint 1400 ismert Egy korábbi review szerint a több, mint 1400 ismert mendeli öröklődésű betegség gén közül:mendeli öröklődésű betegség gén közül:

- - 1%-nál kevesebb regulátoros változás1%-nál kevesebb regulátoros változás

-- 58% missense, vagy nonsense mutáció az ORF-ekben 58% missense, vagy nonsense mutáció az ORF-ekben

- - 30% inszerció,vagy deléció30% inszerció,vagy deléció

- - 10% splicing variáns10% splicing variáns

Polimorfizmusok felismerése mismatch-repair Polimorfizmusok felismerése mismatch-repair detektálássaldetektálással

Polimorfizmust tartalmazó DNS szakaszok elkülönítése a nem Polimorfizmust tartalmazó DNS szakaszok elkülönítése a nem tartalmazóktóltartalmazóktól

PCR termék pool összekeverése lineáris vektor DNS-sel (metilált, PCR termék pool összekeverése lineáris vektor DNS-sel (metilált, 5bp 5bp CRECRE deléció) + standardok (teljes deléció) + standardok (teljes CRECRE, nem metilált), nem metilált)

Heteroduplex képződésHeteroduplex képződés Heteroduplexek transzformálása E. coli törzsbe, aminek az Heteroduplexek transzformálása E. coli törzsbe, aminek az

episzómáján (genomba integrálódni képes plazmid) 2 episzómáján (genomba integrálódni képes plazmid) 2 LOXLOX hely (ide hely (ide CRECRE rekombináz rekombináz kötödik) van, köztük tetraciklin rezisztencia ( kötödik) van, köztük tetraciklin rezisztencia ( tetRtetR) ill. ) ill. streptomycin szenzitivitás (streptomycin szenzitivitás (strSstrS) gének találhatók) gének találhatók

Ha a teszt fragmentben nincs polimorfizmus, nincs repair (5bp-nyi Ha a teszt fragmentben nincs polimorfizmus, nincs repair (5bp-nyi del./inszerció nem inditja el) del./inszerció nem inditja el) tetRtetR//strSstrS//loxlox kazetta rekombinálódik, a kazetta rekombinálódik, a bacik bacik tet. tet. szenzitívekszenzitívek és és str. str. rezisztensekrezisztensek lesznek (a törzs lesznek (a törzs str. str. rez.rez. gént tartalmaz a kromoszómáján) gént tartalmaz a kromoszómáján)

Ha van polimorfizmus, a javítás a Ha van polimorfizmus, a javítás a CRECRE génre is kiterjed, így az génre is kiterjed, így az inaktív, a sejtek inaktív, a sejtek tettet. rezisztensek. rezisztensek, ill. , ill. str.str. szenzitívek szenzitívek maradnak. maradnak.

Nagy teljesítményű fejlesztési ciklusokNagy teljesítményű fejlesztési ciklusok

1.-2. amplifikálás (PCR)1.-2. amplifikálás (PCR)

2.-3. miniatürizálás („single 2.-3. miniatürizálás („single tube”)tube”)

4. több párhuzamos nagy 4. több párhuzamos nagy teljesítményű kísérletteljesítményű kísérlet

5. egész genomot érintő 5. egész genomot érintő mérések (gén expresszió, mérések (gén expresszió, genotipizálás, knock-out genotipizálás, knock-out analízis, protein analízis, analízis, protein analízis, splicing, stb.) kombinálásasplicing, stb.) kombinálása

QTL-ek genetikai térképezéseQTL-ek genetikai térképezése

QTL (quantitative trait loci, mennyiségi jellegek)QTL (quantitative trait loci, mennyiségi jellegek) Nem mindig praktikus minden vizsgált gén esetében Nem mindig praktikus minden vizsgált gén esetében

komplementációs tesztet végeznikomplementációs tesztet végezni Ezért élesztőben nagyon ígéretes eszköznek tűnik a Ezért élesztőben nagyon ígéretes eszköznek tűnik a

reciprok hemizigóciareciprok hemizigócia (diploid genotípus, de csak egy (diploid genotípus, de csak egy kópiában van jelen a gén, pl. X kromoszóma génjei hím kópiában van jelen a gén, pl. X kromoszóma génjei hím egyedben)egyedben) Ezzel a technikával egyetlen allél hatásának Ezzel a technikával egyetlen allél hatásának

meghatározásával -különben egyöntetű genetikai meghatározásával -különben egyöntetű genetikai környezetben- felismerhető egy QTL allélkörnyezetben- felismerhető egy QTL allél

A technika két diploid, heterozigóta törzs A technika két diploid, heterozigóta törzs összehasonlításán alapulösszehasonlításán alapul

Alkalmas kapcsoltság megcáfolására ill. két genom Alkalmas kapcsoltság megcáfolására ill. két genom allélvariánsainak analizálására egyetlen lépésbenallélvariánsainak analizálására egyetlen lépésben

Allél kapcsolás reciprok hemizigóciávalAllél kapcsolás reciprok hemizigóciával

aa Két-két heterozigóta törzs Két-két heterozigóta törzs genomja 1-1 allélre nézve genomja 1-1 allélre nézve reciprok módon hemizigótareciprok módon hemizigóta

bb Molekuláris „vonalkódok” Molekuláris „vonalkódok” alkalmazásával az egész alkalmazásával az egész genom összehasonlítható genom összehasonlítható

c c Hibridizálás után az Hibridizálás után az allélvariánsok allélvariánsok meghatározhatók, a meghatározhatók, a példában a B1 allél erősebb példában a B1 allél erősebb szignált produkál, tehát szignált produkál, tehát domináns a B2 felettdomináns a B2 felett

KonklúziókKonklúziók A funkcionális genomika új távlatokat nyitott a biológiában, A funkcionális genomika új távlatokat nyitott a biológiában,

mindazonáltal még gyerekcipőben jár pl. a komplex genetikai mindazonáltal még gyerekcipőben jár pl. a komplex genetikai reguláció, protein interakciók, és biokémiai reakciók terénreguláció, protein interakciók, és biokémiai reakciók terén

A modell organizmusokon végzett vizsgálatok magasabbrendű A modell organizmusokon végzett vizsgálatok magasabbrendű szervezetekben is hasznosak pl. humán rendellenességek szervezetekben is hasznosak pl. humán rendellenességek kutatásábankutatásában

Elterjedés a klinikumban, diagnosztikában, személyre szabott Elterjedés a klinikumban, diagnosztikában, személyre szabott terápiábanterápiában

A felfedezéseket elősegítendő a nagy teljesítményű biológiának az A felfedezéseket elősegítendő a nagy teljesítményű biológiának az önálló laboratóriumokban van igazán jövőjeönálló laboratóriumokban van igazán jövője

Miniatürizálás, költségek csökkentése fontosMiniatürizálás, költségek csökkentése fontos Különböző kísérletek (gén expresszió, genotipizálás, knock-out Különböző kísérletek (gén expresszió, genotipizálás, knock-out

analízis, protein analízis, stb.) egyesítése („single tube” elképzelés )analízis, protein analízis, stb.) egyesítése („single tube” elképzelés ) Mindezek megvalósításval jobb, és olcsóbb diagnosztika ill. Mindezek megvalósításval jobb, és olcsóbb diagnosztika ill.

egészségügyi ellátás (szép új jövő…:)egészségügyi ellátás (szép új jövő…:)

Egyebet nem tudok Egyebet nem tudok elmondani…elmondani…

Kérem kapcsolja ki!Kérem kapcsolja ki!