การประเมินดีเอ็นเอ 6 ตําแหน ง...

DIPTEROCARPACEAE

การประเมนดเอนเอ 6 ตาแหนง เพอการระบชนดของพรรณไมวงศยาง

ในประเทศไทยในประเทศไทยAssessment of Six Candidate DNA Barcode Loci in

Dipterocarpaceae of Thailandp p

จดทาโดย

ส ส นางสาวสลลลา บญเทยม

สาขาวทยาศาสตรชวภาพปาไม

อาจารยทปรกษา อ.ดร.สธร ดวงใจ

DIPTEROCARPACEAE

บทนา

สวนมากเปนไมตนขนาดใหญลาตนมกมชน หรอนายาง มกลนเฉพาะตว ใบ เดยวออกสลบเสนแขนงใบมกขนานกนเปน

ระเบยบ

ดอก สมบรณเพศ กลบรองดอก 5 กลบ กลบดอก 5 กลบ โคนกลบมกดอก 5 กลบ กลบดอก 5 กลบ โคนกลบมก

เชอมตดกน เกสรเพศผมาก อาจเรยงกน 1-2-

3 ชน รงไขจมอยในฐานของดอกเพยงเลกนอย ม 3 ชอง แตละชองมไขออน 2 หนวย กานชเกสรเพศเมย 1-3 กาน ผล ชนดแหง แขง และไมแตก โดยมากมกมปก

DIPTEROCARPACEAE

ความหลากชนดและการกระจายพนธ

Dipterocarpoideaeอนวงศ Dipterocarpoideaeอนวงศ Dipterocarpoideaeพบ 13 สกล ประมาณ 470 ชนด

ขอบเขตการกระจายอยในเขตรอนของทวปขอบเขตการกร จายอยในเขตรอนของทวป

เอเชย

กระจายพนธในเขตรอนทวโลก มประมาณ 470-580 ชนด แบงเปน 3 อนวงศ คอ

1.Pakaraimoideae2.Monotoideae3.Dipterocarpoideae

DIPTEROCARPACEAE

การกระจาย : พรรณไมวงศยางในประเทศไทย

DIPTEROCARPACEAE

การกระจาย : พรรณไมวงศยางในประเทศไทย

Dipterocarpus 16 ชนด Neobalanocarpus 1 ชนด Dipterocarpus 16 ชนด Neobalanocarpus 1 ชนด

Hopea 17 ชนด Parashorea 2 ชนด

Anisoptera 4 ชนด Shorea 24 ชนด

Cotylelobium 1 ชนด Vatica 13 ชนด y

( มานพ, 2550 และ Pooma, 2003)

DIPTEROCARPACEAE

นเวศวทยาของพรรณไมวงศยาง ในประเทศไทย

DIPTEROCARPACEAE

ความสาคญและการใชประโยชน

DIPTEROCARPACEAE

ขอจากดบางประการในการจาแนกชนด

ของพรรณไมวงศยาง

การจาแนกชนดสวนใหญใชดอก และ ผล กรณทมขอจากด ไดแก

การตรวจสอบกลาไม

การตรวจสอบไมทอน

การวจยเกยวกบรากพรรณไมวงศยางกบรา

ไมคอรไรซา (mycorrhiza)

DIPTEROCARPACEAE

ดเอนเอบารโคด (DNA Barcode)

การบงชชนดของสงมชวต โดยใชขอมลลาดบ

นวคลโอไทดของสายดเอนเอในตาแหนงดเอนเอ

มาตรฐาน (standardized DNA) ฐ (sta da d ed )

การวเคราะหลาดบนวคลโอไทด คอ การวเคราะห=การจดเรยงตวของเบส 4 ตว คอ A,T,C, และ G

=

DIPTEROCARPACEAE

DNA barcode และ DNA marker แตกตางกนอยางไร

DNA barcode DNA marker

DIPTEROCARPACEAE

ดเอนเอบารโคด

ตาแหนงดเอนเอมาตรฐาน คอ ตาแหนงกรณพชมการเสนอตาแหนงดเอนเอมาตรฐาน

ใ โ โ hl l tตาแหนงดเอนเอมาตรฐาน คอ ตาแหนง

ของดเอนเอทมการประเมนแลววาม

ในคลอโรพลาสตจโนม (chloroplast genome) ไดแก

1 t F t Hศกยภาพเพยงพอทจะจาแนกชนด 1.atpF-atpH spacer 2.ยน matK3 b L3.ยน rbcL

4.ยน rpoB5 C15.ยน rpoC16. psbK-psbl spacer 7 t H bA7. trnH-psbA spacer

DIPTEROCARPACEAE

การประเมนดเอนเอทเหมาะสม

โครงสรางแผนภาพ (topology) intra- specific divergences

การคานวณคา genetic distance

divergences<

inter specificgดวย Kimura 2-parameter

(K2P) distances

inter-specificdivergences

( )

DIPTEROCARPACEAE

ตวอยางการวเคราะหขอมล

DIPTEROCARPACEAE

ขนตอนการทาด

เอนเอบารโคด

DIPTEROCARPACEAE

ประโยชนดเอนเอบารโคด

ช การระบชนด

ตรวจสอบและวเคราะหชนดพชอาหาร

และเหยอ

ป ประเมนความหลากหลายทางชวภาพ

DIPTEROCARPACEAE

วตถประสงค

1 สรางดเอนเอบารโคด (DNA barcode) เพอร บชนด1. สรางดเอนเอบารโคด (DNA barcode) เพอระบชนด

พรรณไมวงศยางในประเทศไทย

2 ศกษาความสมพนธทางวงศวานววฒนาการของพรรณไม2. ศกษาความสมพนธทางวงศวานววฒนาการของพรรณไม

วงศยางในประเทศไทย

DIPTEROCARPACEAE

วสดอปกรณ

อปกรณใน วสดอปกรณสาหรบสกดดเอนเอ อปกรณใน

ภาคสนาม วสดอปกรณสาหรบตรวจสอบ

คณภาพดเอนเอ

อปกรณใน

คณภาพดเอนเอ

วสดอปกรณสาหรบทาปฏกรยา

ลกโซพอลเมอเรส หองปฏบตการ

วสดอปกรณสาหรบทาผลตผล

ลกโซพอลเมอเรส

ปฏกรยาลกโซพอลเมอเรสใหบรสทธ

วสดอปกรณสาหรบวเคราะห

ขอมล

DIPTEROCARPACEAE

หลอดทดลอง โกรง เครองเขยา ชอนชา

ป ไ โ ป ป ปเครองปนเหวยง เครองควบคมอณหภม ตเยน ไมโครปเปต และทป

สารเคมสาหรบสกดดเอนเอ ไดแก liquid nitrogen, Sorbital buffer, 2% CTAB

buffer, Chloroform :isoamylalkohal 24:1, Isopropanal ,70 % Ethanol, TE buffer และ

RNAse (10 mg/ml)

DIPTEROCARPACEAE

อปกรณและสารเคมสาหรบตรวจสอบคณภาพดเอนเอ

ไดแก ชด electrophoresis กลองพลาสตกสาหรบยอมเจล ไมโครปเปต และ tip ไดแก ชด electrophoresis กลองพลาสตกสาหรบยอมเจล ไมโครปเปต และ tip

สารเคมสาหรบตรวจสอบคณภาพดเอนเอ ไดแก agarose gel,

สารละลาย 0.5 X TAE buffer, สารละลาย 6x loading buffer, สารละลายg

ethidium bromide (10 mg/ml)

DIPTEROCARPACEAE

หลอดทดลองขนาด เครองพซอาร เครองปนเหวยงขนาดเลก ไมโครปเปตตและ tip,

Dream Taq TM Green

PCR Master Mix, BSA/DMSO, ไพรเมอร, นากลน

DIPTEROCARPACEAE

ใชอปกรณชดเดยวกนกบอปกรณการทาปฏกรยาลกโซพอลใชอปกรณชดเดยวกนกบอปกรณการทาปฏกรยาลกโซพอล

เมอเรส สารเคมทใชคอ เอนไซม Exonuclease และ

Alk li Ph h tAlkaline Phosphatase

DIPTEROCARPACEAE

คอมพวเตอร โปรแกรม ChromasPro โปรแกรม Clustal X

โปรแกรม MEXGA 5 โปรแกรม PAUP โปรแกรม Mrbayes

DIPTEROCARPACEAE

วธการ

ใ ใ ตาแหนงของดเอนเอทใชในการศกษา

1.rbcL2 dhF2.ndhF3.trnK-matK4 t L t F4.trnL-trnF 5trnS-trnG6 bA t H6.psbA-trnH

DIPTEROCARPACEAE

วธการ

สกดดเอนเอเกบตวอยาง

สกดดเอนเอ

และตรวสอบ

ใ หาลาดบนว ทาดเอนเอให

บรสทธ เพมปรมาณดเอนเอ

หาลาดบนว

คลโอไทด

วเคราะหขอมลในการหาตาแหนง ดเอนเอทเหมาะสม บนทกเขาสฐานขอมล

DIPTEROCARPACEAE

การวเคราะหขอมล

การแกไขขอมล (Editing) : Assembling ดวยโปรแกรม Chromas ( g) gPro + multiple alignment ดวยโปรแกรม Clustal X

วเคราะหลกษณะความผนแปรของลาดบนวคลโอไทด ดวยและคานวนณคา

genetic distanceโปรแกรม MEXGA 5 0genetic distanceโปรแกรม MEXGA 5.0

สรางแผนภาพวงศวานววฒนาการ แบบ parsimony ในโปรแกรม PAUP*

Version 4 0b10 และแบบ likelyhood ในโปรแกรม MrbayesVersion 4.0b10 และแบบ likelyhood ในโปรแกรม Mrbayes

DIPTEROCARPACEAE

วธการ

Editing DNA sequence : chromas Pro or Bioedit

DIPTEROCARPACEAE

วธการ

การทา Multiple Alignment: clustral X

Species A: ATCCAAGTTTTAGGCGGATAGSpecies B: ATCCAAGGTTTATCCGTAGTATAG

DNA data

Species B: ATCCAAGGTTTATCCGTAGTATAGSpecies C: ATCCAGGTATAACCGTATAG

Species D: ??CCATGGTATAACCGTATAG

DNA dataSpecies A: ATCCAAGTTTTAGGC GGATAGSpecies A: ATCCAAGTTTTAGGC---GGATAGSpecies B: ATCCAAGGTTTATCCGTAGTATAGSpecies C: ATCCA-GGTATAACC---GTATAG

D ?? CC TGGT T CC GT T GSpecies D: ?? CCATGGTATAACC---GTATAG

DIPTEROCARPACEAE

วธการ

เปด nexus matrix ใน MEGA5 วเคราะห K2P distance

DIPTEROCARPACEAE

วธการ

คา K2P distance ทง interspecific and intraspecific ทไดจากการวเคราะห

DIPTEROCARPACEAE

วธการ

เปด nexus matrix ใน PAUP or MrBayes ทา tree เพอใชในการประเมนความเหมาะสม

DIPTEROCARPACEAE

Tree from gene A Tree from gene B

Dipterocarpus baudiiDipterocarpus kerriiDipterocarpus kerrii Dip04Dipterocarpus kerrii Dip14

Dipterocarpus turbinatus Dip37

Dipterocarpus baudii Dip21

Dipterocarpus alatus Dip16Dipterocarpus alatus Dip20

Dipterocarpus baudiiDipterocarpus kerriiDipterocarpus kerrii Dip04Dipterocarpus kerrii Dip14Dipterocarpus turbinatus Dip37

Dipterocarpus baudii Dip21

Dipterocarpus alatus Dip16Dipterocarpus alatus Dip20

p p pDipterocarpus turbinatus Dip46Dipterocarpus turbinatus Dip48

Dipterocarpus intricatus Dip01Dipterocarpus intricatus Dip02Dipterocarpus intricatus Dip05Dipterocarpus intricatus Dip07Dipterocarpus intricatus Dip08

Dipterocarpus intricatus Dip09

Dipterocarpus turbinatus Dip37Dipterocarpus turbinatus Dip46Dipterocarpus turbinatus Dip48

Dipterocarpus intricatus Dip01Dipterocarpus intricatus Dip02Dipterocarpus intricatus Dip05Dipterocarpus intricatus Dip07Dipterocarpus intricatus Dip08

Dipterocarpus intricatus Dip09p p pDipterocarpus intricatus Dip33

Dipterocarpus tuberculatus Dip03Dipterocarpus tuberculatus Dip06

Dipterocarpus gracilis Dip30Dipterocarpus obtusifolius Dip36Dipterocarpus obtusifolius Dip38

Dipterocarpus tuberculatus Dip03Dipterocarpus tuberculatus Dip06

Dipterocarpus intricatus Dip09Dipterocarpus intricatus Dip33

Dipterocarpus tuberculatus Dip03Dipterocarpus tuberculatus Dip06

Dipterocarpus gracilis Dip30Dipterocarpus obtusifolius Dip36Dipterocarpus obtusifolius Dip38

Dipterocarpus tuberculatus Dip03Di t t b l t Di 06

Dipterocarpus tuberculatus Dip50Dipterocarpus tuberculatus Dip52

Dipterocarpus dyeri Dip28Dipterocarpus grandiflorus Dip15Dipterocarpus grandiflorus Dip32

Dipterocarpus costatus Dip47Di t h t Di 23

Dipterocarpus tuberculatus Dip06

Dipterocarpus dyeri Dip68

Dipterocarpus tuberculatus Dip50Dipterocarpus tuberculatus Dip52

Dipterocarpus dyeri Dip28Dipterocarpus grandiflorus Dip15Dipterocarpus grandiflorus Dip32

Dipterocarpus costatus Dip47

Dipterocarpus tuberculatus Dip06

Dipterocarpus dyeri Dip68

Dipterocarpus crinitus Dip26Dipterocarpus cornutus

Dipterocarpus chartaceus Dip23Dipterocarpus chartaceus Dip24

Dipterocarpus glandulosusDipterocarpus hispidusDipterocarpus insignisDipterocarpus zeylanicus

Dipterocarpus crinitus Dip26Dipterocarpus cornutus

Dipterocarpus chartaceus Dip23Dipterocarpus chartaceus Dip24

Dipterocarpus glandulosusDipterocarpus hispidusDipterocarpus insignisDipterocarpus zeylanicusDipterocarpus zeylanicus Dipterocarpus zeylanicus

Therefore: for DNA barcoding, gene A better than gene B

DIPTEROCARPACEAE

สถานทและระยะเวลาทาการวจย

สถานท

1. การปฏบตงานภาคสนาม เกบตวอยางพรรณไมวงศยางทกระจายใน

ประเทศไทย

2. การปฏบตงานในหองปฏบตการ ศกษาและปฏบตงานใน

หองปฏบตการ ภาควชาชววทยาปาไม คณะวนศาสตร

มหาวทยาลยเกษตรศาสตร

ระยะเวลาทาการวจย

เรมตงแตเดอนพฤศจกายน พ.ศ. 2554 สนสดเดอน กรกฎาคม พ.ศ. 2556

DIPTEROCARPACEAE

ผลประโยชนทคาดวาจะไดรบ

ใ ไ ใ ป ไ ไ 1. สามารถใชดเอนเอระบชนดพรรณไมวงศยางในประเทศไทยได

2. สามารถจดทาฐานขอมลลาดบนวคลโอไทดของพรรณไมวงศยาง

ในประเทศไทย ในประเทศไทย

3. ทราบความสมพนธทางวงศวานววฒนาการของพรรณไมวงศยางใน

ประเทศไทยเพอเปนขอมลพนฐานในการนาไปจดการดานการอนรกษอยาง ฐ

ถกตอง และเปนขอมลสนบสนนงานทางดานอนกรมวธาน (taxonomy)

DIPTEROCARPACEAE

ขอขอบคณ

อ.ดร.สธร ดวงใจ อาจารยทปรกษาวทยานพนธหลก

อ.ดร.อไรวรรณ อรญวาสน อาจารยทปรกษา วทยานพนธรวม

และ นองๆปรญญาตร ทมสวนรวมในงานวจย

DIPTEROCARPACEAEDIPTEROCARPACEAE

ขอบคณคะขอบคณคะ