การตรวจสอบจุลินทรีย์ในน้ำนม ...¸ªศ414...

การตรวจหาปรมาณจลนทรยในน านม Determination of Microorganism in Milk

ความส าคญของจลนทรยตอคณภาพน านม

@ น ำนมประกอบดวยสำรอำหำรตำง ๆ เหมำะสมตอกำรเจรญเตบโตของจลนทรยชนด

@ ตองเกบทอณหภมต ำกวำ 10 C

@ จลนทรยทอยในน ำนม เปนแบคทเรย เชน Streptococcus lactis

พวกยสต เชน Sccharomyces, Mycoderma

เชอรำ (mold) Pennicillium

1. เตานม และผวหนงสวนใกลเคยง 2. น า และอากาศ 3. ผท าการรดนม หรอผลตภณฑจากน านม 4. ตวแมโค 5. เครองมอ และอปกรณ 6. แมลง 7. สวนผสมท าผลตภณฑนม

สาเหตของการปนเปอนจลนทรยในน านม

ขอก าหนดดานจลนทรยตามมาตรฐานสนคาเกษตรและอาหารแหงชาต มกอช.6003-2548 จ านวนจลนทรยทงหมด (TOTAL BACTERIA)

นมดบตองไมเกน < 600,000 colony/ml. จ านวนแบคทเรยชนดโคลฟอรม (coliform) นมดบตองไมเกน < 10,000 colony/ml. จ านวนแบคทเรยทนรอน นมดบตองไมเกน < 10,000 colony/ml.

มาตรฐานการรบซอนมดบของกระทรวงเกษตรและสหกรณ:จลนทรย

จ านวนจลนทรยโดยการตรวจนบวธ Direct microscopic count ไมมากกวา 1,500,000 กลมตอ ลบ.ซม.

จ านวนจลนทรยโดยการตรวจนบวธ Standard Plate Count นอยกวา 150,000 colony/ml. เพมขน 0.20 บาท/กก.

150,000-300,000 colony/ml. เพมขน 0.10 บาท/กก.

300,001-500,000 colony/ml. เพมขน 0.00 บาท/กก.

500,001-700,000 colony/ml ลดลง 0.10 บาท/กก.

มากกวา 700,000 colony/ml ลดลง 0.20 บาท/กก.

วธการตรวจสอบจลนทรยในน านม (Determination of Microorganism in Milk )

การตรวจสอบจลนทรยโดยตรง (direct Method)

กำรนบจลนทรยโดยกลองจลทรรศน (Direct microscopic count, DMC) กำรนบจลนทรยบนจำนเลยงเชอ (Standard plate count, SPC) กำรตรวจแบคทเรยโคลฟอรม (Coliform Test) กำรตรวจหำโซมำตกเซลลโดยวธ California Mastitis Test (CMT )

กำรตรวจสอบจลนทรยโดยกำรประมำณส เมทธลนบลรดกชนเทสต (methylene blue test) การตรวจสอบรซาซรน 1 hr. (resazurine test)

การตรวจสอบจลนทรยโดยการประมาณส

เปนการประมาณจ านวนแบคทเรยทางออมโดยวด oxiation-reduction potential

แบคทเรยใชออกซเจนในกระบวนการ oxidation-reduction ท าใหออกซเจนลดลง

การลดลงของออกซเจนวดในรปของเวลาทแบคทเรยใชในการเปลยนส

เวลาในการจางสเปนสดสวนผกผนกบจ านวนแบคทเรย

ตวบงชทนยมใชไดแก methylene blue และ resazurine

การตรวจสอบโดยการเปลยนสของเมทธลน บล (Methylene Blue Reduction Test, MBRT)

@ ใชเมทลนบลเปน (redox indicator) ทดสอบอตราการใชออกซเจนและประมาณจ านวนแบคทเรยในน านม

@ สเมทลนบล จะท าใหน านมมสน าเงน

@ เมอแบคทเรยเจรญเตบโตและใชออกซเจน ท าใหปรมาณออกซเจนในน านมลดลง เมท ลนบลจะถกรดวซเปนลโคเมทลน (leucomethylenr) ท าใหสน านมจางลง

หลกการ

ขอจ ากดการตรวจสอบโดยการเปลยนสของเมทธลน บล

แบคทเรยบางชนด เชน S. agalactia, B. Subtilis จะเปลยนสไดชา

Somatic cell และเมดโลหตขาวจะฟอกส methylene Blue ได

เมดไขมนคอย ๆ ลอยสผวบนและกวาดเอาแบคทเรยขนสผวดานบน จงท าใหการเปลยนสกนเวลานาน

นมน าเหลอง และนมปลาย lactation ระยะการเปลยนสสนกวาการบงชดวยจ านวยแบคทเรยทมอย

วธการ (Method)

ไปเปตสารละลายเมธลนบล 1 ml. ลงในหลอดทดลอง

ไปเปตตวอยางน านม 10 ml. ดงกลาว ปดฝาเกลยวใหสนทกลบหลอดไป-มา ใหเปนเนอเดยวกบน านม

น าหลอดเขาบมใน water bath อณหภม 37+5 C บนทกเวลาทเรมบม และสงเกตการเปลยนแปลงสนาท 30 , ชวโมงท 1, 2,… ไปเรอย ๆ จนกวาตวอยางจะเปลยนเปนสขาว

การวเคราะหผล จ านวนชวโมงการ

เปลยนส เกรด คณภาพ ลงความเหน

มากกวา 6 ชวโมง 1 ดเยยม (Excellent) ผาน

มากกวา 4-6 ชวโมง 2 ด (good) ผาน

มากกวา 3-4 ชวโมง 3 พอใช (Fair) ไมผาน

นอยกวา 3 ชวโมง 4 ไมมคณภาพ (Poor)

ไมผาน

การตรวจสอบรซาซรน 1 hr (Resazurin Reduction Test, RRT)

หลกการเชนเดยวกบการทดสอบ Methylene Blue Reduction Test การเตมรซาซรนจะท าใหน านมมสน าเงน เมอปรมาณออกซเจนในน านมลดลงรซาซรนจะถก reduce เปลยนสจากมวงเปนชมพ และในทสดจะกลายเปนสขาว ถาทดสอบกบตวอยางน านมดบทแชเยนไดจะใชเวลานานเกนไป เวลาทใชในการจางสจะเปนสดสวนผกผนกบจ านวนแบคทเรย

หลกการ

ขนตอนของปฏกรยา

ขน 1 Resazurin ----------> Resorufin (สน าเงน) (สชมพ ) ขน 2 Resorufin ----->Hydroresorufin (สชมพ) (ไมมส, ขาว)

วธการ (Method)

เมอครบเวลา 1 ชวโมง น าตวอยางมาเทยบสกบ lovibond comparation แลวอานผล

ไปเปตรซาซรน 1 ml. ใส test tube แลวไปเปตตวอยางนม 10 ml. ใสลงไปในหลอด ปดฝาเกลยวใหสนท ผสมตวอยางใหเขากน

น าตวอยางเขาบมใน water bath อณหภม 37 C ปดฝาอางน าใหสนท การเตรยมตวอยางควบคม Negative(-) UHTและรซาซรน Positive (-) UHT ไมเตมรซาซรน

การวเคราะหผล

Quality of Milk Lovibond disc % ลงความเหน

Colour Reading Resazurin Resorufin Dihydro resorufin

ดเยยม (Excellent) น าเงน (Blue) 6 100 0 0 ยอมรบ

ดมาก (Very good) มวง (Lilac) 5 80 20 0 ยอมรบ

ด (Good) มวงสด (Mauve) 4 60 40 0 ยอมรบ

พอใช (Fair) ชมพอมมวง (Pink-purple) 3 40 60 0 ไมรบ

ไมคอยด (Poor) มวงอมชมพ (Purple-Pink) 2 20 80 0 ไมรบ

ไมด (Very poor) ชมพ (Pink) 1 0 100 0 ไมรบ

แย (Bad) ขาว (Colourless) 0 0 0 0 ไมยอมรบ

การนบจลนทรยบนจานเลยง (Standard Plate Count)

หลกการ

เปนการประเมนหาปรมาณแบคทเรยทงหมดในน านม

น านมทมคณภาพดจะมปรมาณแบคทเรยอยนอย

คาทไดบงชถง

ความสะอาดในการรดนม และอปกรณในการรด

การท าความสะอาดเตานมกอนรด

การเกบรกษาน านม

ปญหาเตานมอกเสบ

วธการ (Procedure)

1. ท าการเจอจางตวอยางน านมแบบ Ten fold dilution

Sample 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000 1:100,000

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

การเลอกใช dilutions กบน านมชนดตาง ๆ

ชนดตวอยางน านม

Dilutions

standard plate count (SPC) Coliform

น านมดบ 1: 1,000 (10 -3 ) 1: 10,000 (10 -4 )

1: 100 (10 -2 ) 1: 1,000 (10 -3)

น านมพาสเจอรไรส

1:10 (10 -1 ) 1: 100 (10 -2 ) 1: 1,000 (10 -3 )

1 1: 10 1: 1,00

นมยเอชท 1 1 : 10 (10 -1 )

1 1 : 10 (10 -1)

SPC กลม .............

ตวอยางน านมดบ Dilution 1: 10

วน

SPC

กลม ............. Control

วนท

2. การเพาะเชอ

2.1) น าจานทจะใช มาเขยนชอตวอยางน านม

2.2 การหยด Dilution

ใช ไปเปท ลนไฟ กอนดดน านมจาก dilution

จ านวน 1 ml. ลงในจานเลยงเชอ

2.3 การเท Agar

- ตรวจอณหภมโ ด ย ใชหลงมอแตะขวดพอทนได

- ใชไฟตะเกยงลนปากขวดagar กอนเปดฝา - และเท agar ประมาณ 15 ซซ สจานเลยง

-แกวงตวจานในแนวราบบนโตะให agar เขากนด

2.4 การผสมตวอยางใหเขากน

โยก Plate ขน- ลง 5 ครง ซาย--ขวา 5 ครง วนขวา 5 ครง วนซาย 5 ครง โยก Plate ขน- ลง 5 ครง

2.5 รอจน agar แขงตว น าเขาบมท 32 0C นาน 48 ชวโมง (การวาง ตองกลบดานลางขน)

การอานผล เลอกนบจากจานทมจ านวนโคโลน 25-250 โคโลน จ านวนแบคทเรยทนบได = จ านวนแบคทเรยทนบได / คา dilute ตวอยางเชน นบจ านวนแบคทเรยได 250 โคโลน ท dilution 10 - 3 (0.001) จะมจ านวนแบคทเรย = 250 / 0.001 = 250,000 cfu/ml หรอ = 250 x 1,000 = 250,000 cfu/ml

*cfu = colony forming unit

การตรวจสอบแบคทเรย Coliform

หลกการ

เปนการตรวจสอบน านมภายหลงการพาสเจอรไรส

Coliform Group ทตรวจสอบไดแก Escherichia หรอ E.Coli

ความส าคญของแบคทเรยโคลฟอรม

พบไดทวไปในน านมดบ

ไมทนอณหภมพาสเจอรไรส (68 องศาขนไป)

ถาตรวจพบ แสดงวาเกดการปนเปอนจากอจาระ

ขน ทตดมากบแมโค

วธการ (Method)

ปฏบตเชนเดยวกนกบวธการ Standard Plate Count

แต เมอ Agar แขงตวแลว ใหเท Agar ทบลงไปอกชนหนง

รอให Agar แขงตว จงน าเขาบมทอณหภม 32 0C ท 24 ชวโมง

ขอแตกตางระหวาง Standard Plate Count และการตรวจสอบแบคทเรยโคลฟอรม

อาหารเลยงเชอ SPC – Nutrient Agar (สทอง) Coliform – Violet Red Bile Agar (สแดง) ชนดของเชอ SPC เพาะเชอทกชนด จงเรยกวา Total Plate Count Coliform – เพาะเฉพาะในกลมโคลฟอรม ระยะเวลาบม SPC - 48 ชวโมง Coliform 24 ชวโมง โคโลน SPC ขนาดเลก สทอง Coliform ขนาดใหญ เสนผานศนยกลาง ประมาณ 0.5 มม. สแดงเขม