agaroz jel elektroforezi & İki boyutlu jel elektroforez

Agaroz Jel Elektroforezi

&

İki Boyutlu PAGE Jel

Elektroforezi (2D PAGE)

Mesut Akpunar

Jel elektroforezi, makro molekülleri büyüklük, elekterik yükü, ve diğer fiziksel özellikler temelinde ayıran bir yöntemdir.

Elektroforez (elektrophoresis) terimi yüklü partiküllerin elektrik akımı etkisi altında hareketini açıklamaktadır.

Elektro (electro) elektriğe karşılık gelir, forez (phoresis) anlamı karşıya geçirmek /taşımak olan Yunanca bir kelimedir.

Jel elektroforezi elektrik varlığında hareketlenen moleküllerin jel boyunca karşıya hareket ettiği bir tekniği tanımlar

Birçok biyolojik makromolekül (ör. Amino asitler, peptitler, proteinler,

nükleotidler ve nükleik asitler) iyonlaşabilen gruplara sahiptir ve pH’a bağlı

olarak çözeltide katyon (+) ya da anyon (-) biçiminde elektrik yükü taşıyan

türler olarak bulunurlar.

Elektrik alana maruz kaldıklarında bu moleküller anyon veya katyon

ağırlıkları farklarına göre birbirinden yük\ kütle oranına uygun olarak

ayrılırlar.

Elektroforez Çeşitleri

• a. Agaroz Jel Elektroforez

• b. Sellüloz Asetat Elektroforez

• c. Poliakrilamid Jel Elektroforez

• d. Isoelektrik Odaklama

• e. Iki Yönlü Elektroforez

• f. Kapiller Elektroforez

Agar/Agaroz Jel Elektroforezi

Agaroz jel elektroforezi DNA moleküllerinin ayrımı,

tanımlanması ve saflaştırılması için kullanılan standart bir

yöntemdir.

Teknik -basit, hızlı ve diğer prosedürlerle ayrıştırılamayan DNA

fragmanlarını çözebilme yeteneğindedir.

Ayrıca DNA’nın jeldeki konumu, düşük konsantrasyonlarda

floresan veren Etidyum bromid ile boyayarak belirlemek

mümkündür.

Agaroz jel elektroforezinin fizksel özellikleri

Makromoleküllerin ayrılması iki değişkene bağlıdır; yük ve

kütle.

DNA bir tampon çözeltiye karıştırılıp jele uygulandığı zaman

bu iki değişken birlikte rol oynar.

Bir elekrottan gelen elektrik akımı, molekülleri iterken aynı

anda diğer elektrot molekülleri kendine doğru çeker.

Jeldeki sürtünme kaynaklı ayrım gücü molekülleri

büyüklüklerine göre ayırarak ‘’moleküler elek’’ görevi yapar.

Elektriksel alan altında hareket oranları;

•Alanın gücüne

•Moleküllerin büyüklüğü ve şekline

•Örneklerin göreceli hidrofobitesine

•Moleküllerin içinde hareket ettiği tamponun iyonik kuvveti ve

sıcaklığı

Aynı zaman da yüklü moleküllerin hareketini yavaşlatan,sürtünmeden doğan birde direnç vardır.

Direnç fonksiyonunu etkileyen faktörler;

• Moleküllerin hidrodinamik büyüklüğü

• Molekülün şekli

• Elektrofrez için kullanılan ortamdaki por büyüklüğü

• Tampon yoğunluğu

Agaroz jel elektroforezinin kullanım alanları

Jel elektroforez ile;

Serum proteinleri

Nükleik asitler

Hemoglobin varyantları

Laktat dehidrogenaz ve

kreatinkinaz izoenzimleri

DNA ve RNA calışılabilir

Çalışma Alanları

• PCR

• RFLP

• Jel Ekstraksiyonu

Agaroz jel elektroforez bileşenleri

1. AGAROZ

2. TAMPON ÇÖZELTİ

3. ETİDYUM-BROMÜR

4. MARKER

5. YÜRÜTME TAMPONU

• Deniz yosunundan ekstrakte edilen doğal

bir kolloittir.

• Büyük Por çapına sahiptir

• Çok hassastır ve elle dokunulduğunda

kolayca bozulabilir.

• 200 kDa’dan daha büyük moleküllerin

ayrılmasında kullanılır.

Hazırlanışı:

• Agoroz jel kuru toz halindeki agorozun,

sıvı tampon içine konması ve berraklaşana

kadar kaynatılması ile oluşur.

Agaroz

Belirli büyüklükteki bir DNA parçası agarozun konsantrasyonuna

bağlı olarak Jel içinde farklı hızlarda hareket eder.

•Düşük agaroz konsantrasyonu büyük DNA’ların ayrılmasını

sağlarken

•Yüksek agaroz konsantrasyonu küçük DNA’ların ayrılmasını

kolaylaştırır.

• DNA’nın elektroforetik

hareketliliği tamponun

kompozisyonuna ve iyonik

gücüne göre değişir.

• Tris-borat-EDTA

Elektroforez Tamponu

Hazırlanışı;

• 108gr Tris

• 55 gr Boric asid 900ml distile su içinde çözülür.

• Üzerine 40ml 0,5M pH=8 EDTA eklenir.

• 1 Litreye tamamlanır.

Etidyum-bromür

• EtBr bir interkalasyon ajandır.

• DNA’nın içine kendini çok küçük bir

çizgi halinde yerleştirir orda kalır

• UV ışığının altında parlak bir bant

halinde görülmesini sağlar.

• Ayrıca EtBr, DNA’ya bağlanıp onun

ağırlığını ve sertliğini değiştirdiği gibi

onun hareket kabiliyetini de etkiler.

NOT

• Etidyum bromid güçlü bir mutajen/karsinojendir ve orta düzeyde toksiktir. Etidyum

bromid içeren jellere ve solüsyonlara elle dokunurken mutlaka eldiven giyilmelidir

• Ağırlığı bilinen DNA parçaları içerir.

• DNA’ların büyüklüğünü saptamayı kolaylaştırır.

• 100Bp

• 50Bp

500 bp

100 bp

150bp

50bp

Mark e r

Stoktan Marker hazırlanması;

• 10ml-boya

• 10ml-stok

• 80ml-dH2O

NOT

• -20 de saklıyoruz!....

Bromofenol mavi kullanıyoruz.

Yürütme tamponun üç görev vardır;

• Örneğin yoğunluğunu artırarak DNA nın

kuyuya eşit bir şekilde dağılmasını sağlar

• Örneğe renk katar ve yükleme işlemini

kolaylaştırır

• Elektrik alanında tahmin edilebilir bir hızda

anoda doğru hareket eden örneğe renk

vermek

Yürütme Tamponu

AGAROZ JEL ELEKTROFOREZ AŞAMALARI

ANALİZ

RFLP PCR

Protein moleküllerini, farklı özelliklerine göre birbirinden

ayırmayı sağlayan elektroforez yöntemidir.

Not: Genellikle moleküller önce izoelektrik noktalarına ve

ardından büyüklüklerine göre ayrılırlar.

Bu metotta;

1. boyutta yüke bağlı IEF ve 2. boyutta MA’a bağlı elektroforez kullanılır.

İlk basamak agaroz veya poliakrilamid jel gibi büyük porlu bir ortamda

gerçekleştirilir. Bir pH gradiyenti elde etmek için amfolitler eklenir.

2. boyut için lineer veya gradyent şekilli bir poliakrilamid sıklıkla

kullanılır.

İki Boyutlu PAGE Jel Elektroforezi (2D PAGE)

Güneştutar L.Y., Rodop M.C., ‘’New approaches in electrophoresis’’ Journal of Engineering and Natural

Sciences, 27, 151-160, 2009

2D-PAGE, ilk olarak 1975 yılında O’Farrel ve Klose tarafından

tanımlanmıştır.

Bu yöntemde boyamadan sonra jel üzerinde çok sayıda proteinin varlığını

gösteren noktalar belirir.

Bu noktaların yorumlanabilmesi veya diğer noktalarla karşılaştırılabilmesi için

bilgisayar desteğine ihtiyaç duyulur. Çok sayıda proteinin varlığını

gösterebilen bir yöntemdir.

Protein analizlerinde oldukça güçlü bir yöntem olmasına karşın, deneyin

tamamlanması oldukça uzun bir zaman alır.

Her örneğin ayrı bir jelde yürütülmesi diğer bir dezavantajıdır.

Bu nedenle, birden fazla sayıda protein örneği ile çalışılacağı zaman,

miktarlarının belirlenmesinde ve miktar karşılaştırılmasında her zaman aynı

sonuçları elde etmek mümkün olmayabilir.

Güneştutar L.Y., Rodop M.C., ‘’New approaches in electrophoresis’’ Journal of Engineering and Natural

Sciences, 27, 151-160, 2009

Zaman çizelgesi,

Örnek hazırlanması :2-3 saat

IPG strip rehidrayonu : 22 saat

IFG run : 24 saat

sDs- PAGE : 19 saat

Jel boyama : 13 saat

Toplam : 4 gün

O’Farrell E. coli üzerindeki bir çalışmasında teorik

olarak 7000 polipeptid lekesi tanımlanabileceğini ileri

sürmüştür; ancak, metottaki bazı sınırlamalar nedeniyle

otoradyografi kullanılarak 1100 leke saptanır.

Coomassie boyası kullanılarak yaklaşık 400 polipeptid

saptanabilir. O’Farrell metodunda 1. boyut için β-

merkaptoetanol, 2. boyut için ise SDS kullanılır. Diğer

yazarlar her iki boyut için de SDS kullanmaktadır.

İki boyutlu jel elektroforezi 1975’den beri laboratuvarlarda sıklıkla

kullanılan bir yöntem olmasına rağmen, kanser teşhisinde rutin olarak

kullanılan bir belirteç haline gelememiştir.

Bununla birlikte son yıllarda, 2D-PAGE veya 2D-DIGE’nin kütle

spektrometresiyle birlikte kullanılması, biyolojik belirteçlerin tayininde bu

yöntemlerin önemini daha da artırmıştır.

LMD yöntemi (laser microdissection, LMD) ile dokudan oldukça küçük

bir kesit alınarak (örneğin 1mm2 lik yüzeyden 1µm kalınlıkta) istenilen

hücre grubu elde edilir. LMD yöntemi ile elde edilen hücreler, 2D-PAGE

veya 2D-DIGE ile görüntülenirler.

Güneştutar L.Y., Rodop M.C., ‘’New approaches in electrophoresis’’ Journal of Engineering and Natural

Sciences, 27, 151-160, 2009

Şekil 5. Mide kanserli bir hastadan alınan normal (N) ve tümör dokularından (T) izole

edilmiş epitel hücrelerin 2D-elektroforez profilleri görülmektedir. A ve B noktaları

elektroforezin ardından kesilmiş, tripsin ile yıkılarak kütle sprekrometrsinde Ca11 proteini

tanımlanmıştır. Mide kanserlerinde Ca11 proteininin gen anlatımı azalır.

Güneştutar L.Y., Rodop M.C., ‘’New approaches in electrophoresis’’ Journal of Engineering and Natural

Sciences, 27, 151-160, 2009

İki Boyutlu Floresan Jel Elektroforezi

(2D DIGE)

DIGE, örneğe iki boyutlu jel elektroforezi uygulanmadan önce floresan bir madde ile

işaretlenmesi esasına dayanır. Örneğin 3 farklı floresan boya ile işaretlenebildiği bu

yöntemde, genellikle Cyber boyalar (Cy2, Cy3, Cy5) kullanılır. İşaretlenmiş örnek daha

sonra jel üstüne konularak ayrışması sağlanır. Elektroforezin sonunda jel, kullanılan

boyaların eksitasyon dalga boyunda ışıkla uyarılarak, jel üzerinde protein örnekleri

görüntülenir ve analiz edilir. DIGE analizinin yapılabilmesi için, CeCyder, Delta 2D,

Progeness ve REDFİN gibi bilgisayar programlarından yararlanılır. Bu yöntemin en

büyük avantajlarından biri, birden fazla protein örneğinin çok küçük miktarlarının tek

bir jel üzerinde doğru olarak görüntülenebilmesini sağlayacak duyarlılıkta olmasıdır.

Cyber boyaların duyarlılığını örnek vermek gerekirse, Cy2 boya ile 0.075 ng, Cy3 ve

Cy5 boyaları ile 0.025 ng’lık çok küçük protein miktarlarını ölçme duyarlılığına

sahiptirler.

Klasik elektroforez yönteminde kullanılan gümüş boyalarının duyarlılığı ise, 1 ng’lık

protein örneğini görüntüleyecek kadardır.

Güneştutar L.Y., Rodop M.C., ‘’New approaches in electrophoresis’’ Journal of Engineering and Natural

Sciences, 27, 151-160, 2009

IPG strip rehydration

1. Boyut: IEF run

IPG yıkamaları

Equilibration buffer I

Equilibration buffer II

2. BOYUT: SDS-PAGE

JEL boyaması (Sypro ruby)

Görüntüleme (470 nm)

Örnek Hazırlanması

Örnek Hazırlanması

Uygun protokolün seçilmeli

Taze hazırlanmış doku yada hücreler

Proteaz inhibitörleri

Soğuk zincir

Uzun dönem saklama

Kontaminayon

Eldivenler (keratin)

Non –protein binding sarf malzemeler

Örneğin çözünür hale

getirilmesi

Solubilitation/denaturation buffer

Öncesinde proteinler çeşitli

özelliklerine göre ayrılabilirler

Rotofor,

Kromatografi sitemleri

İZOELEKTİK NOKTA

pH Gradient

Amfolitler: (carrier ampholyte) tüp jeller

Amfoterik moleküllerin karışımı ve örnek ile muamelesi

İmmobilize amfolitler: IPG stripler

Akilamit jele kovalent olarak bağlanırlar

immobilised pH gradient (IPG): Jel plastik bir yüzeyde

IPG strip

Avantajları:

Mekanik olarak güçlüler

pH gradiyenti yer değiştirmez

Daha yüksek miktarda örnek yüklenmesine izin vermektedir

(dehydrated strip)

Dezavantajları:

Membran/hydrofobik proteinlerin görüntülenmesi kötü

olabilir.

Bazı büyük proteinler kaybolabilir.

IEF run

Islak wicks her bir stripin altına,

elektrodun üstüne yerleştirilir.

Başlangıç için ortam sıcakllığı

oda sıcaklığına ayarlanır.

Program özellikleri:

Number of gel: (1-10)

Max voltage:5000 V

Vhold:125 V

Duration: 24 hrs 00 min

Max current: 80 µa/strip

Volt hours: 80,000 Vh

SDS PAGE Run

Tri/Tricine/d buffer

IPG strip

MW (gel worm)

Agarose overlay

silikon spacer

Gasket

Şartlar:

Number of gel: (1-10)

Max voltage: 500 V

Max power: 1600 mW/gel

4ºC (setting 10)

19 hrs

Boyama

Coomassie staining

Orta seviyede sensitivite (36-47 ng)

Specifik değil

Kantitatif değil

Silver staining

Yükek sensitivite (0.5-1.2 ng)

Zaman alıcı

Specifik değil

Negatif boyamada bazı pot benzeri noktalar oluşur.

Fluorecent dye

(SYPRO ruby)

Çok hassas (1-2 ng)

Specifik ve Kantitatif

Pahalı!....

Görüntüleme

UV detection (300 nm)

Mavi ışık (470 nm) 5 min

Fuji imager

PdQuet (BioRad

Densitometry)

Görüntü analizi

Örnekler üçlü

çalışılır

Master jel yapılır

(soft ware)

Differential

ekspresyon analizi

Gradient type (Bio-Rad)

Broad pH range (pH 3-10)

Medium pH range (pH 4-7)

Narrow pH range (pH I)

Boyama yöntemleri

SYPRO Ruby stain Coomassie stainingSilver staining

Farkı görebiliyormusunuz

Spot analiziPDQuest

Easy to use with wizard directed user

interface

Match original gel image and cutter

İmage to account for tearing, shrinking,

swelling of gel during storage

Unprecedented integration for 2D

excision

Qantity One

ID excision tool for cutting

Entire lanes from a gel

Select band from a lane

EXQuest Calibration Wizard

Easy to use calibration for ultimate

precision