ap12 imunoquimioluminescência
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Trabalho realizado pelos acadêmicos de Medicina da UFBA Adriana Campos, Nivaldo Cardozo Filho, Sabrina Oliveira e Silvana Asfora, sob
orientação dos Professores Roberto Meyer, Ivana Nascimento, Robert Schaer, Cláudia Brodskyn, Songelí Freire e Denise Lemaire, do Laboratório de
Imunologia do Instituto de Ciências da Saúde da UFBA. Atualizado em setembro de 2003
Aula 12
Nesta aula serão abordados a imunoquimioluminescência,a imunofluorometria, além de um resumo dos principais
aspectos do radioimunoensaio.
-Exames feitos por quimioluminescência são basicamente
automatizados.
-Quantificam Ag ou Ac presentes no soro. São muito usados
para a dosagem de hormônios, marcadores tumorais e diversas
outras proteínas séricas.
-Vários soros podem ser testados e diferentes moléculas po-
dem ser quantificadas de uma só vez.
-A técnica se baseia na ligação Ag – Ac. Como no ELISA, um
dos dois reagentes é conjugado com uma substância que quan-
do ativada, emite luz visível. Então, a luz emitida é proporcio-
nal à concentração do reagente pesquisado.
-Os tipos mais utilizados são: competição e sanduíche.
Fase sólida em que uma microesfera de poliestireno é revestida com Ac monoclonal contra o Ag específico
Adição de soro do paciente
Quimioluminescência (como exemplo, um tipo sanduíche)
O conjunto é incubado com agitação intermitente
Lavagem para retirada de Ag não fixado:
Adição de Ac monoclonal, anti-Ag pesquisado, conjugado à enzima .
Lavagem para retirada de Ac conjugado à enzima, não fixado
O conjunto é incubado
Adição de substrato da enzima
O substrato quimioluminescente sofre hidrólise na presença da enzima, produzindo substâncias instáveis que culminam com emissão de luz
Incubação
O exemplo acima é o que acontece com o substrato luminescente AMPPD.Alternativamente a substância luminescente pode ser desestabilizada por uma súbita mudança do pH e da concentração do meio (éster de acridina)ou ainda um elemento, como por exemplo o rutênio, dissociado do Ag ou do Ac por uma descarga elétrica no final da reação, culminando com a emis-são de luz. A imunoluminescência pode atingir uma sensibilidade de 10 -15 a10-16g.
Os imunoensaios de quimioluminescência são realizados emaparelhos automatizados, onde todo o processo é guiado por computadores. São apresentados abaixo quatro desses equipa-mentos, usados no Laboratório de Imunologia do ICS-UFBA:
“Elecsys 1010”da “Roche” “Access”, da “Sanofi-Winthrop”
“Immulite”, da “DPC” “ACS 180”, da “Ciba-Corning”
-Este método é muito utilizado para dosagens de proteínas
séricas, hormônios, marcadores tumorais, anticorpos
específicos para alérgenos etc.
-O teste é basicamente automatizado.
-O resultado baseia-se na fluorescência emitida, mensurada
pelo fluorômetro.
-A fluorescência emitida é intensa, porém pouco duradoura.
-Utiliza-se Ac ou Ag conjugado com um fluorocromo.
- Fluorocromos como fluoresceína e rodamina podem ser
utilizados, entretanto lantanídeos como o európio são os mais
usados.
-Os tipos mais utilizados são: competição e sanduíche.
- Pode detectar 10-12 a 10-16 g.
+ +
Fase Sólida contendo Ac monoclonal contra Ag
Ag++
Padrão, controle e amostra
-Eu
Ac monoclonal marcado com Eu, contra um outro epítopo do Ag
-Eu
Incubação
++
Solução de amplificação: dissocia os ions európio do Ac marcado na solução, e com eles forma estruturas fluorescentes
++-Eu
Eu
Fluorimetriaexemplo: sanduíche, usando
o európio
Os ensaios do tipo apresentadoa seguir, se baseiam na poten-
cialização da emissão de luz vi-sível, a partir da dissociação
de lantanídeos.
Como referido anteriormente, as técnicas imunofluorimétricassão realizadas quase sempre em equipamentos automatizados.A seguir é apresentado o fluorômetro pertencente ao Laboratóriode Imunologia do ICS – UFBA.
Sistema automático de imunoensaios, por fluorimetria, marca “Wallac”, modelo “Autodelfia”.
Um resumo sobre radioimunoensaio
Uma outra técnica para imunodosagem e imunodiagnóstico é oradioimunoensaio (RIA). Esta técnica foi a primeira a ser desen-volvida para dosagem de hormônios e outras substâncias pre-sentes em pequenas concentrações em fluidos biológicos e tem como base a ligação Ag – Ac.Apesar de ainda usada, está sendo substituída pela imuno-fluorimetria, ELISA e imunoluminescência, tendo em vista queenvolve material radioativo. O princípio e as modalidades sãoos mesmos dos outros ensaios acima mencionados – a diferençaestá na substância indicadora de reação, que neste caso é umisótopo radioativo e em geral se utiliza o 125I.Trata-se de um ensaio de grande reprodutibilidade, especificida-de e sensibilidade (em torno de 10-12g), entretanto, tem comodesvatagens a manipulação de isótopo radioativo (125I é emis-sor de radiação gama), a validade curta do referido reagente ra-dioativo (o 125I tem meia vida de 58 dias) e a demora da execu-ção do teste, já que a leitura final de cada amostra deve levar 1 minuto (“counts per minute”).
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