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Aus dem Institut für Humangenetik
der Universität zu Lübeck
Direktorin: Prof. Dr. med. Gabriele Gillessen-Kaesbach
Molekulargenetische Ursachen
von
mentaler Retardierung
mit
Epilepsie
Inauguraldissertation
zur
Erlangung der Doktorwürde
der Universität zu Lübeck
- Aus der Sektion Medizin -
vorgelegt von
Charlotte Runge
aus Schleswig
Lübeck 2013
1. Berichterstatterin: Prof. Dr. med. Gabriele Gillessen-Kaesbach
2. Berichterstatter/Berichterstatterin: Priv.-Doz. Dr. med. Matthias Nitschke
Tag der mündlichen Prüfung: 31.10.2013
Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 31.10.2013
-Promotionskommission der Sektion Medizin-
Inhaltsverzeichnis
3
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ................................................................................................ 3
Verzeichnis der Abbildungen................................................................................ 6
Verzeichnis der Tabellen ...................................................................................... 6
Verzeichnis der Abkürzungen .............................................................................. 8
1. Einleitung ................................................................................................... 11
1.1. Epilepsie ............................................................................................. 11
1.2. Mentale Retardierung ......................................................................... 13
1.3. Syndromale Krankheitsbilder mit Epilepsie ......................................... 14
1.3.1. Das Angelman-Syndrom ................................................................. 14
1.3.2. Das Rett-Syndrom .......................................................................... 14
1.4. Bereits bekannte Gene – Differentialdiagnosen .................................. 15
1.4.1. Das CDKL5-Gen ............................................................................. 16
1.4.2. Das ARX-Gen ................................................................................. 17
1.4.3. Das SLC9A6-Gen ........................................................................... 18
1.4.4. Das TCF4-Gen ............................................................................... 19
1.5. Aufgaben und Zielsetzung .................................................................. 20
2. Material und Methoden ............................................................................... 21
2.1. Materialien .......................................................................................... 21
2.1.1. Patienten ........................................................................................ 21
2.1.2. Geräte ............................................................................................ 22
2.1.3. Chemikalien, Nukleotide, Enzyme .................................................. 22
2.1.4. Puffer, Medien, Lösungen ............................................................... 23
2.1.5. Verbrauchsmaterial ......................................................................... 23
2.1.6. DNA-Proben ................................................................................... 24
2.1.7. Computersoftware .......................................................................... 24
2.1.8. Internetressourcen .......................................................................... 24
2.2. Methoden ........................................................................................... 25
2.2.1. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ............................................. 25
2.2.2. Gelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte ...................... 27
2.2.3. Aufreinigung des PCR-Produktes ................................................... 28
2.2.4. Sequenzierung nach Sanger .......................................................... 29
2.2.5. Auswertung der Sequenzen ............................................................ 30
2.2.6. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) .............. 30
2.2.7. Auswertung der Kapillarelektrophorese .......................................... 32
2.2.8. Etablierung der PCR für das TCF4-Gen ......................................... 33
Inhaltsverzeichnis
4
3. Ergebnisse ................................................................................................. 35
3.1. Auswertung und Darstellung der Vorbefunde ..................................... 35
3.1.1. Anamnese und klinische Befunde ................................................... 35
3.1.2. Befunde im Elektroenzephalogramm .............................................. 39
3.1.3. Befunde der Magnetresonanztomographie des Schädels (cMRT) .. 40
3.1.4. Familienanamnese ......................................................................... 40
3.1.5. Im Vorfeld durchgeführte genetische Untersuchungen ................... 41
3.2. Molekulargenetische Analysen ........................................................... 42
3.2.1. Sequenzanalysen ........................................................................... 42
3.2.1.1. Sequenzanalysen des CDKL5-Gens............................................... 42
3.2.1.2. Sequenzanalysen des TCF4-Gens ................................................. 45
3.2.1.3. Sequenzanalysen des ARX-Gens ................................................... 47
3.2.1.4. Sequenzanalysen des SLC9A6-Gens ............................................. 47
3.2.2. Ergebnisse der MLPA-Untersuchungen .......................................... 49
4. Diskussion .................................................................................................. 51
4.1. Diskussion des Phänotyps .................................................................. 51
4.2. Diskussion der molekulargenetischen Befunde .................................. 52
4.2.1. Molekulargenetische Befunde im CDKL5-Gen ................................ 52
4.2.2. Molekulargenetische Befunde im TCF4-Gen .................................. 55
4.2.3. Molekulargenetische Befunde im SLC9A6-Gen .............................. 56
4.3. Diskussion der Methoden ................................................................... 57
4.4. Diskussion der auffälligen Befunde der Array-CGH-Analysen in den
Vorbefunden .................................................................................................. 59
4.5. Weitere Differentialdiagnosen ............................................................. 59
4.6. Ausblick .............................................................................................. 62
5. Zusammenfassung ..................................................................................... 63
6. Literaturverzeichnis .................................................................................... 64
7. Anhänge ..................................................................................................... 74
7.1. Informationsblatt zur Studie ................................................................ 74
7.2. Einwilligungserklärung der Studie ....................................................... 76
7.3. Fragebogen der Studie ....................................................................... 78
7.4. Reaktionsbedingungen ....................................................................... 80
7.4.1. Das CDKL5-Gen ............................................................................. 80
7.4.2. Das ARX-Gen ................................................................................. 81
7.4.3. Das SLC9A6-Gen ........................................................................... 84
7.4.4. Das TCF4-Gen ............................................................................... 86
7.5. MLPA-Ansätze.................................................................................... 88
Inhaltsverzeichnis
5
7.6. Wachstum und Entwicklung in der untersuchten Patientenkohorte ..... 89
7.7. Therapieresistente Epilepsien – Überblick .......................................... 92
7.8. Befunde im Elektroenzephalogramm und in der Magnetresonanztomographie
94
7.9. Ergebnisse der genetischen Untersuchungen .................................... 97
8. Danksagung ............................................................................................. 100
9. Lebenslauf ............................................................................................... 101
10. Erklärung .............................................................................................. 102
Eidesstattliche Versicherung ............................................................................ 102
Verzeichnis der Abbildungen
6
Verzeichnis der Abbildungen
Abbildung 1 PCR-Produkte von acht Proben auf 2%igem Agarose-Gel .......................43
Abbildung 2 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Exons 17 des CDKL5-Gens. ...44
Abbildung 3 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des CDKL5-Gens ..........................45
Abbildung 4 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Exons 0 des TCF4-Gens ........46
Abbildung 5 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Exons 19 des TCF4-Gens ......47
Abbildung 6 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Exons 15 des SLC9A6-Gens ..48
Abbildung 7 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Exons 1 des SLC9A6-Gens. ...48
Abbildung 8 Ausschnitt aus dem MLPA-Ergebnisbogen ...............................................50
Verzeichnis der Tabellen
Tabelle 1 PCR-Ansatz für das Exon 1 des SLC9A6-Gens ...........................................27
Tabelle 2 Schematische Darstellung des PCR-Programms für das Exon 1 des SLC9A6-
Gens ............................................................................................................................27
Tabelle 3 Sequenzieransatz für die Exons 1-16 des SLC9A6-Gens .............................29
Tabelle 4 Sequenzierprogramm für die Exons 1-16 des SLC9A6-Gens .......................30
Tabelle 5 Schematische Darstellung des PCR-Programms für MLPA ..........................32
Tabelle 6 Mikrozephalie, Kleinwuchs und Dystrophie in der untersuchten
Patientenkohorte ..........................................................................................................35
Tabelle 7 Sprachentwicklung in der untersuchten Patientenkohorte zum Zeitpunkt der
Datenerhebung ............................................................................................................37
Tabelle 8 Dysmorphiezeichen und respiratorische Auffälligkeiten in der untersuchten
Patientenkohorte ..........................................................................................................37
Tabelle 9 Dysmorphiezeichen ......................................................................................38
Tabelle 10 Synthetische DNA-Oligonuleotide ...............................................................80
Tabelle 11 Schematische Darstellung des PCR-Reaktionsansatzes für das CDKL5-Gen
....................................................................................................................................80
Tabelle 12 Schematische Darstellung des PCR-Programms für das CDKL5-Gen ........81
Tabelle 13 Sequenzieransatz für das CDKL5-Gen .......................................................81
Tabelle 14 Sequenzierprogramm für das CDKL5-Gen .................................................81
Tabelle 15 Synthetische DNA-Oligonukleotide .............................................................81
Tabelle 16 Schematische Darstellung des PCR-Reaktionsansatzes für das ARX-Gen 82
Tabelle 17 Schematische Darstellung des PCR-Programms für Exon 1&5 des ARX-
Gens ............................................................................................................................82
Verzeichnis der Tabellen
7
Tabelle 18 Schematische Darstellung des PCR-Programms für Exon 3 des ARX-Gens
....................................................................................................................................82
Tabelle 19 Schematische Darstellung des PCR-Programms für Exon 2a, 2b & 4 des
ARX-Gens ....................................................................................................................83
Tabelle 20 Sequenzieransatz für das ARX-Gen ...........................................................83
Tabelle 21 Sequenzierprogramm für das ARX-Gen .....................................................83
Tabelle 22 Synthetische DNA-Oligonukleotide .............................................................84
Tabelle 23 Schematische Darstellung des PCR-Reaktionsansatzes für Exon 2-16 des
SLC9A6-Gens ..............................................................................................................84
Tabelle 24 Schematische Darstellung des PCR-Programms für Exon 2-16 des SLC9A6-
Gens ............................................................................................................................85
Tabelle 25 Sequenzieransatz für das SLC9A6-Gen .....................................................85
Tabelle 26 Sequenzierprogramm für das SLC9A6-Gen ...............................................85
Tabelle 27 Synthetische DNA-Oligonukleotide und Bedingungen für die PCR – TCF4-
Gen ..............................................................................................................................86
Tabelle 28 Schematische Darstellung des PCR-Reaktionsansatzes für das TCF4-Gen
....................................................................................................................................86
Tabelle 29 Sequenzieransatz für das TCF4-Gen .........................................................87
Tabelle 30 Sequenzierprogramm für das TCF4-Gen ....................................................87
Verzeichnis der Abkürzungen
8
Verzeichnis der Abkürzungen
A Adenin
ACTH Adrenocorticotropes Hormon
a.d. aqua destillata
ARX Aristaless-Related Homeobox
ATP Adenosintriphosphat
bp Basenpaare
C Cytosin
CDKL5 Cyclin-dependent kinase-like 5
cDNA complementary DNA
CLB Clobazam
CLZ Clonazepam
cMRT craniale Magnetresonanztomographie
CT Computertomogramm
dATP 2‟-Desoxyadenosintriphosphat
dCTP 2‟-Desoxycytidintriphosphat
ddNTP 2‟,3‟-Didesoxyribonukleosidtriphosphat
del Deletion
dGTP 2‟-Desoxyguanosintriphosphat
DNA 2‟-Desoxyribonukleinsäure
dNTP 2‟-Desoxyribonukleosidtriphosphat
dTTP 2‟-Desoxythymidintriphosphat
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EEG Elektroenzephalogramm
ESM Ethosuximid
ExoSap Exonuklease / Shrimp Alkaline Phosphatase
FLB Felbamat
F-Primer forward primer (Vorwärts-Primer)
G Guanin
GTP Guanosintriphosphat
HPLC high performance liquid chromatography Wasser
Hz Hertz
kb Kilobasen (1000 bp)
LEV Levetiracetam
LGS Lennox-Gastaut-Syndrom
Verzeichnis der Abkürzungen
9
LM Lebensmonat
LTG Lamotrigin
M molar (mol / l)
Mb Mega-Basenpaare (106 bp)
MgCl2 Magnesiumchlorid
Min. Minuten
µl Mikroliter
MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
mRNA messenger RNA
MRT Magnetresonanztomographie
OXC Oxcarbazepin
PB Phenobarbital
PCR Polymerasekettenreaktion
PHT Phenytoin
PLP Pyridoxalphosphat
RNA Ribonukleinsäure
R-Primer reverse primer (Rückwärts-Primer)
RSP Risperidon
RUF Rufinamid
Sek. Sekunden
Ser Serin
SLC9A6 Sodium Like Channel 9A6
SNP Single Nucleotide Polymorphism
STM Sultiam
STP Stiripentol
T Thymin
Taq Thermus aquaticus
TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer
TCF4 Transcription Factor 4
TEMED NNNN-Tetramethylethylenediamine
Thr Threonin
TPM Topiramat
Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
UBE3A ubiquitin-protein ligase E3A Gen
UTR untranslated region
UV Ultraviolett
V Volt
Verzeichnis der Abkürzungen
10
VGB Vigabatrin
Vol. Volumen
VNS Vagusnervstimulator
VPA Valproinsäure
ZNS Zonisamid
Einleitung
11
1. Einleitung
1.1. Epilepsie
Zerebrale Anfälle sind die Folge einer plötzlichen Funktionsstörung des Gehirns.
Aufgrund unterschiedlicher Ursachen kommt es dabei zu abnormem Auftreten und
Ausbreiten oder zu unzureichender Hemmung hirnelektrischer Aktivität. Von einer
Epilepsie spricht man nach dem Auftreten zumindest eines epileptischen Anfalls sowie
einer andauernden Veränderung im Gehirn, welche weitere Anfälle wahrscheinlich
macht (Fisher et al., 2005).
Ätiologisch werden die Epilepsien in symptomatische und idiopathische Formen
unterteilt. Bei den symptomatischen Formen liegt eine organische Störung des Gehirns
zugrunde, bei der idiopathischen Form ist keine Strukturstörung erkennbar.
Symptomatische Krampfanfälle können durch Fieber, Trauma, Tumoren oder auch
durch akute Stoffwechselstörungen verursacht werden. Sowohl symptomatische als
auch idiopathische Epilepsien können im Rahmen einer syndromalen Erkrankung
auftreten (Lindsay et al., 2010).
Der Ausschluss einer symptomatischen Ursache im Rahmen einer Hirnschädigung,
eines Tumors, eines Traumas, einer Infektion oder einer Stoffwechselerkrankung macht
eine genetische Ursache wahrscheinlich (Todt, 2004). Mehr als die Hälfte aller
Epilepsien werden auf eine genetische Ursache zurückgeführt (Pal et al., 2010).
Die epileptischen Anfälle werden grob in fokale (partiell, herdbezogene) und primär
generalisierte Anfälle unterteilt. Fokale Anfälle gehen von einem Herd im Gehirn aus
und können unter Umständen sekundär generalisieren. Bei primär generalisierten
Anfällen hingegen betrifft die pathologische neuronale Aktivität den gesamten Cortex
und geht in der Regel mit einem Bewusstseinsverlust einher. Zu den generalisierten
Anfällen werden tonisch-klonische, atonische (Sturzanfälle), tonische (symmetrische
Versteifungskrämpfe), klonische (beidseitige rhythmische Muskelzuckungen) und
myoklonische Anfälle (beidseitige Zuckungen bei erhaltenem Bewusstsein) sowie
Absencen (Bewusstseinsunterbrechungen von wenigen Sekunden) gerechnet (Lindsay
et al., 2010).
Zum Zeitpunkt der Geburt ist das Gehirn noch unzureichend entwickelt und bei den
meisten Neugeborenen ist zu diesem Zeitpunkt lediglich der intakte Hirnstamm
funktionsfähig. In der normalen postnatalen Entwicklung durchläuft das Gehirn einen
komplexen Reifeprozess, der mit sehr hoher neuronaler Erregbarkeit verbunden ist.
Während seiner Entwicklung ist das Gehirn ständiger Synaptogenese, Apoptose und
Myelinisierung ausgesetzt.
Einleitung
12
Gerade das sich entwickelnde Gehirn ist besonders anfällig für Krampfanfälle. In der
neonatalen und frühkindlichen Periode können Krampfanfälle durch schwerwiegende
Gründe verursacht werden, welche zu altersspezifischen epileptischen
Enzephalopathien führen. Bei der frühkindlichen epileptischen Enzephalopathie – early
infantile epileptic encephalopathy (EIEE) – handelt es sich um eine progrediente
neurologische Erkrankung, welche sich in kognitiver und motorischer Einschränkung
äußert und häufig mit schwerer geistiger Behinderung einhergeht (Asher und Scaglia,
2012).
Die frühkindlichen epileptischen Enzephalopathien sind eine Gruppe von
Erkrankungen, welche auch als altersabhängige Enzephalopathien beschrieben
werden. Sie beginnen innerhalb der ersten Wochen bis Monate des Lebens
(frühkindlich – infantile) mit therapieresistenten Krampfanfällen, zeichnen sich durch
wiederkehrende spontan auftretende Krampfanfälle (Epilepsie) und führen zu
tiefgreifenden Entwicklungsverzögerungen und geistiger Behinderung
(Enzephalopathie), da wichtige Meilensteine der Entwicklung des Gehirns nicht erreicht
werden können (Zupanc, 2009).
Die EIEE ist eine seltene Epilepsieform, die aus therapieresistenten Krampfanfällen,
tonischen Spasmen oder häufiger partiellen Anfällen und einem spezifischen Muster im
Elektroenzephalogramm (EEG), welches in den ersten Lebensmonaten auftritt, besteht
(Asher und Scaglia, 2012). Sie stellt den gemeinsamen Endweg einer heterogenen
Gruppe von genetischen, metabolischen oder strukturell bedingten Erkrankungen dar.
Im Säuglingsalter treten vor allem sogenannte Blitz-Nick-Salaam-Krämpfe (BNS-
Krämpfe), die auch infantile Spasmen genannt werden, auf. Dabei kommt es zu
blitzartigen, unwillkürlichen Muskelzuckungen (Myoklonien) mit Hochreißen der Arme,
Nickbewegungen des Kopfes und dem orientalischem Salaam-Gruß ähnelnden
tonischen Anfällen. Die Spasmen können von autonomen oder fokalen Aspekten wie
Atempausen und Blickdeviation begleitet sein. Im EEG kann sich eine sogenannte
Hypsarrhythmie zeigen, die aus diffusen gemischten Krampfpotentialen besteht. Die
Kombination von BNS-Krämpfen und einer Hypsarrhythmie im EEG wird als West-
Syndrom bezeichnet.
60% der Kinder mit persistierenden BNS-Krämpfen entwickeln im Alter von etwa 3-12
Monaten das sogenannte Lennox-Gastaut-Syndrom, das sich durch tonische oder
atonische Krampfanfälle und ein zunehmend synchrones EEG mit generalisierten
„slow-spikes“ und „slow-waves“ bei 1,5-2 Hz auszeichnet.
Viele Patienten mit einer im frühen Kindesalter beginnenden Epilepsie zeigen
Rückstände in der geistigen und motorischen Entwicklung. Eine persistierende
Enzephalopathie beeinflusst die Ausbildung der neuronalen Netzwerke in hohem Maße
Einleitung
13
und abnorme Synaptogenese und eine ungünstige Entwicklung sind meist die Folgen.
Das klinische Bild kann mit einem Wachstumsstillstand des Gehirns, welches zu
Mikrozephalie und Hirnatrophie führt, einhergehen. (Zupanc, 2009).
1.2. Mentale Retardierung
Mentale Retardierung wird generell als eine Behinderung definiert, die durch
signifikante Einschränkungen der intellektuellen Funktionen und des adaptiven
Verhaltens mit Beginn vor dem 18.Lebensjahr und einem Intelligenzquotienten von 70
oder weniger gekennzeichnet ist (American Psychiatric Association, 1994; Schalock et
al., 2010; Salvador-Carulla et al., 2011). Milde Formen der mentalen Retardierung, bei
einem Intelligenzquotienten (IQ) von 50 bis 70, werden von moderater (IQ <50) und
schwerer (IQ < 35) mentaler Retardierung abgegrenzt. In den industrialisierten
Nationen liegt die Prävalenz bei etwa 2% und ist einer der häufigsten Gründe für
humangenetische Beratungen (Ropers, 2006). Im englischen Sprachgebrauch wurde
der Begriff der mentalen Retardierung weitgehend durch intellectual disability ersetzt.
Im deutschen Sprachgebrauch hat sich allerdings bislang keine äquivalent zu
gebrauchende Neuerung durchgesetzt.
Konventionell wird mentale Retardierung (MR) in syndromale und nicht-syndromale MR
unterteilt. Syndromale MR wird dadurch charakterisiert, dass neben der geistigen
Behinderung weitere Veränderungen wie Dysmorphien oder Fehlbildungen vorliegen.
Bei nicht-syndromalen Formen der mentalen Retardierung sind kognitive
Einschränkungen die einzige Manifestation (Chelly et al., 2006).
Mentale Retardierung ist beim männlichen Geschlecht häufiger als beim weiblichen
Geschlecht, was mit der X-chromosomalen Vererbung von Gendefekten, die eine
wichtige Rolle in der Ätiologie von geistiger Behinderung spielen, in Verbindung
gebracht wird.
Sowohl eine Epilepsie als auch mentale Retardierung können isoliert oder im Rahmen
eines übergeordneten Krankheitsbildes auftreten. Bei einem Teil der Patienten mit
Epilepsie, mentaler Retardierung und eventuell zusätzlichen Auffälligkeiten wie
Mikrozephalie, kraniofazialen Dysmorphiezeichen und Bewegungsstörungen wurde die
genetische Ursache identifiziert. Dazu gehören unter anderen das Angelman-Syndrom,
welches zum ersten Mal 1965 von Harry Angelman beschrieben wurde (Angelman,
1965) und das erstmalig von Andreas Rett 1966 beschriebene Rett-Syndrom (Rett,
1966).
Einleitung
14
1.3. Syndromale Krankheitsbilder mit Epilepsie
1.3.1. Das Angelman-Syndrom
Das Angelman-Syndrom ist ein neurogenetisches Syndrom, welches sich durch eine
schwere geistige Behinderung, ein schweres Sprachdefizit, Phasen mit
unangemessenem Lachen, eine Skoliose, eine Ataxie, erworbene Mikrozephalie und
eine Epilepsie auszeichnet (Clayton-Smith und Laan, 2003, Williams, 2005). Bei
Patienten mit dem Angelman-Syndrom verlaufen die pränatale Entwicklung und Geburt
normal, bei Neugeborenen und Kleinkindern können jedoch Schwierigkeiten bei der
Nahrungsaufnahme auftreten. Meist wird im Alter von 6-12 Monaten eine
Entwicklungsverzögerung offensichtlich, wenn ein reduzierter Muskeltonus, eine
Rumpfataxie und häufiges Lächeln auftreten (Fiumura et al., 2010). Die Entwicklung
schreitet nur verzögert fort, jedoch ohne den Verlust erworbener Fähigkeiten. Weitere
Kriterien für die Diagnose des Angelman-Syndroms umfassen eine schwere mentale
Retardierung, und Verhaltensauffälligkeiten wie Schlafstörungen (Bruni et al., 2004,
Dagli et al., 2011).
Im Schädel-MRT oder Schädel-CT können eine milde kortikale Atrophie und
Myelinisierungsdefizite auffallen. Die Diagnose wird häufig erst nach mehreren
Wiedervorstellungen beim Neuropädiater gestellt, da typische klinische Merkmale wie
Krampfanfälle oder ruckartige Bewegungen sich erst im Verlauf einstellen. Das EEG ist
bei Patienten mit Angelman-Syndrom besonders charakteristisch und für die
Diagnosestellung hilfreich (Williams, 2005).
Das für das Krankheitsbild verantwortliche UBE3A-Gen liegt auf dem Chromosom 15
im Bereich 15q11-q13 und kodiert für das zelluläre Ubiquitin-Ligase-Enzym. Es gibt vier
genetische Mechanismen (maternale Deletion, paternale uniparentale Disomie 15q11-
q12, Imprinting-Defekte und Mutationen im UBE3A-Gen), die alle mit der Expression
des UBE3A-Gens interferieren und für das Angelman-Syndrom ursächlich sind (Kishino
et al.,1997; Matsuura et al., 1997).
Bei 10-15% der Individuen mit der klinischen Diagnose Angelman-Syndrom kann die
molekulare Ursache nicht identifiziert werden (Williams, 2005).
1.3.2. Das Rett-Syndrom
Das Rett-Syndrom ist eine X-chromosomal dominant vererbte gravierende
Entwicklungsstörung, die mit Epilepsie und mentaler Retardierung einhergeht und
erstmals 1966 von Andreas Rett beschrieben wurde (Rett, 1966). Etwa 1 von 10 000
Mädchen und wahrscheinlich 1 von 100 000 lebend geborenen Jungen sind betroffen
(Kerr und Stephonson, 1986; Kozinetz et al., 1993; Hagberg und Hagberg, 1997).
Einleitung
15
Hierbei zeigen sich dem Angelman-Syndrom ähnliche Symptome wie Ataxie, eine
erworbene Mikrozephalie, häufiges Lachen, eine fehlende Sprache, Skoliose sowie
Krampfanfälle mit pathologischem EEG-Muster (Noh et al., 2012).
Mutationen im MECP2-Gen, welches für das Methyl-CpG binding protein-2 kodiert,
wurden bei Rett-Patienten erstmals 1999 erwähnt (Amir et al., 1999). Bis zu 95% der
Patienten mit klassischem Rett-Syndrom haben eine Mutation im MECP2-Gen, welche
normalerweise de novo auftritt. Beim atypischen Rett-Syndrom finden sich hingegen
nur bei 40-60% der Patienten MECP2-Veränderungen (Glaze et al., 2010,Armani et al.,
2012). Studien konnten zeigen, dass der Großteil der Mutationen im MECP2-Gen auf
dem väterlichen X-Chromosom entsteht. Ob ein Zusammenhang mit dem väterlichen
Alter besteht, ist bislang nicht geklärt (Zhu et al., 2010, Ravn et al., 2011). In vielen
Fällen, in denen keine Veränderung im MECP2-Gen dem beschriebenen Krankheitsbild
zugrunde liegt, ist die Ursache für die Erkrankung unklar.
Die Kleinkinder, fast ausschließlich Mädchen, entwickeln sich bis zum 6.-18.
Lebensmonat scheinbar normal. Auf eine Phase, in der die Entwicklung stagniert,
folgen Rückschritte mit Verlust erworbener Fähigkeiten wie der expressiven Sprache
und motorischer Fertigkeiten. Zusätzlich entwickeln die Patienten stereotype
Handbewegungen, eine Mikrozephalie, Epilepsie, Autismus, intermittierende Hypo- und
auch Hyperventilationsepisoden sowie Lernschwierigkeiten und Gangstörungen (Kerr
und Stephonson, 1986). Jungen mit einer Mutation im MECP2-Gen können den
Phänotyp des Rett-Syndroms wie Mädchen (bei einem Karyotyp 47,XXY oder
somatischen Mosaik für die MECP2-Mutation) haben, einen Verlauf mit einer schweren
Enzephalopathie und Tod im Kindesalter haben oder weniger schwere Manifestationen
mit vorwiegend psychiatrischen Auffälligkeiten wie bipolare Störungen oder
Schizophrenie zeigen. Bei der dritten Gruppe werden Mutationen beschrieben, die nicht
bei Mädchen gefunden wurden. Es handelt sich um Mutationen, die bei Heterozygoten
wahrscheinlich sehr milde Auswirkungen haben (Moretti und Zoghbi, 2006).
Bei der Epilepsie bei Patienten mit Rett-Syndrom handelt es sich meist um generalisiert
tonisch-klonische und partiell-komplexe Anfälle, andere Anfallstypen wie fokal tonische
Anfälle wurden jedoch ebenfalls beobachtet (Zhu et al., 2010). Die Krampfanfälle
variieren je nach Mutation und sind mit dem klinischen Schweregrad des
Erscheinungsbildes assoziiert (Glaze et al., 2010).
1.4. Bereits bekannte Gene – Differentialdiagnosen
In den vergangenen Jahren wurden weitere Gene identifiziert, deren Veränderungen zu
einer Epilepsie mit mentaler Retardierung führen und daher eine wichtige
Einleitung
16
Differentialdiagnose zu den Krankheitsbildern Angelman-Syndrom und Rett-Syndrom
darstellen. Zu diesen Genen gehören die Gene CDKL5, ARX, TCF4 und SLC9A6.
1.4.1. Das CDKL5-Gen
Das CDKL5-Gen ist in der Chromosomenregion Xp22 lokalisiert und besteht aus 23
Exons, von denen die ersten drei Exons nicht kodierend sind (Kalscheuer et al., 2003).
Es kodiert für das cdkl5-Protein (cyclin-dependent kinase like 5). Die genaue Funktion
dieses Proteins ist bis heute weitgehend unklar, allerdings wird eine Interaktion mit dem
MECP2-Gen beschrieben. (Carouge et al., 2010).
De novo aufgetretene Mutationen und Deletionen im X-chromosomal vererbten CDKL5-
Gen wurden in den letzten Jahren bei etwa 80 Patienten im Zusammenhang mit dem
atypischen Rett-Syndrom beschrieben. (Rademacher et al., 2011)Einige Mutationen
wurden mehrfach beschrieben (Castrén et al., 2011). Bislang wurde keine Korrelation
zwischen dem Ort der Mutation und der Schwere des Krankheitsbildes identifiziert (Mei
et al., 2010). Beide Geschlechter können von Veränderungen im CDKL5-Gen betroffen
sein (Elia et al., 2008, Fichou et al., 2009; Sartori et al., 2009). Die Symptomatik und
der Schweregrad der Erkrankung ist bei Jungen und Mädchen identisch (Van Esch et
al., 2007; Erez et al., 2009; Liang et al., 2011). Etwa 5% der männlichen Patienten und
14% der weiblichen Patienten mit epileptischer Enzephalopathie einer Untersuchung
von Liang et al. trugen pathogene CDKL5-Veränderungen (Liang et al., 2011). Diese
Veränderungen gelten als Ursache für eine früh beginnende therapieresistente
Epilepsie mit BNS-Krämpfen, tonischen und tonisch-klonischen generalisierten
Anfällen, Mikrozephalie, einer schweren psychomotorischen Entwicklungsverzögerung
und Bewegungsstörungen (Melani et al., 2011).
Im Vergleich zum klassischen Rett-Syndrom manifestiert sich die Epilepsie bei
Patienten mit Veränderungen im CDKL5-Gen bereits im Alter von 2-3 Monaten meist in
Form von BNS-Krämpfen, die sich schließlich zu einer therapieresistenten oder schwer
behandelbaren Epilepsie entwickeln (Tao et al., 2004; Erez et al., 2009). In der
Zusammenschau der Literatur scheint es kein spezifisches EEG-Muster, das mit
Veränderungen im CDKL5-Gen assoziiert ist, zu geben (Buoni et al., 2006; Archer et
al., 2006; Pintaudi et al., 2008). Im kranialen CT bzw. MRT finden sich kortikale
Atrophie kombiniert mit hyperintensen Arealen der weißen Substanz im
Temporallappen, die mit Myelinisierungsstörungen zu vereinbaren sind (Bahi-Buisson
et al., 2008a). Liang et al. beschreiben eine milde Frontallappenatrophie (Liang et al.,
2011).
Einleitung
17
1.4.2. Das ARX-Gen
Das ARX-Gen kodiert für das Aristaless-related-homeobox-Protein. Der
Transkriptionsfaktor nimmt eine wichtige Rolle in der Embryogenese, speziell in der
Entwicklung des zentralen Nervensystems bei Proliferation und Differenzierung von
Interneuronen ein (Bienvenu et al., 2002, Kitamura et al., 2002). Es ist auf dem kurzen
Arm des X-Chromosoms (Xp22.13) lokalisiert und besteht aus fünf kodierenden Exons
(Strømme et al., 2002). Das arx-Protein setzt sich aus der Homeobox-Domäne sowie
der Aristaless-Domäne zusammen und enthält vier Polyalanin-Abschnitte. Die am
häufigsten identifizierte Mutation ist eine 24bp-Duplikation im Exon 2 und führt zu einer
Verlängerung des zweiten Polyalanin-Abschnitts (Kitamura et al., 2002, Suri, 2005). Die
Mutationen oder Deletionen treten familiär aber auch sporadisch auf. Gécz et al.
postulierten 2006, dass das eine Veränderung im ARX-Gen bei 9,5% der Patienten mit
X-chromosomaler mentaler Retardierung vorliege (Gécz et al., 2006).
Seit 2002 wurden zumindest zehn Formen von Entwicklungsstörungen im
Zusammenhang mit Mutationen im ARX-Gen beschrieben, die eine beeindruckende
Vielfalt des klinischen Erscheinungsbildes demonstrieren (Sherr, 2003, Gécz et al.,
2006, Shoubridge et al., 2010). Die intra- und interfamiliäre Pleiotropie sowie die
genetische Heterogenität sind ein Kennzeichen für ARX-Mutationen (Shoubridge et al.,
2010). Der Erbgang ist je nach Mutationsschweregrad X-chromosomal dominant oder
X-chromosomal rezessiv. Weibliche Trägerinnen der Mutationen sind vermutlich meist
phänotypisch unauffällig, in seltenen Fällen zeigen sie ein variables Erscheinungsbild
mit mentaler Retardierung, Epilepsie und Agenesie des Corpus Callosum sowie
Hyperreflexie (Scheffer et al., 2002, Marsh et al., 2009). Bei den männlichen
Betroffenen variiert das Erscheinungsbild und wird im Folgenden beschrieben.
Große Deletionen, Mutationen, die zum Abbruch des Proteins führen, und „missense“-
Mutationen in der Homeobox-Domäne verursachen die schwersten Phänotypen. Dazu
gehören Lissenzephalie mit abnormen Genitalien (X-linked lissencephaly with absent
corpus callosum and ambiguous genitalia - XLAG) (Kitamura et al., 2002), XLAG mit
Hydrozephalus und das Proud-Syndrom. Letzteres umfasst schwere mentale
Retardierung, eine therapieresistente Epilepsie, abnorme Genitalien sowie Agenesie
des Corpus callosum (Proud et al., 1992; Suri, 2005, Conti et al., 2011).
Andere Veränderungen im ARX-Gen führen zu Phänotypen wie das West-Syndrom,
welches aus BNS-Krämpfen, mentaler Retardierung und Hypsarrhythmie im EEG
besteht (Strømme et al., 2002) sowie mentale Retardierung, tonische Anfälle und
Dystonie ohne BNS-Krämpfe und das Ohtahara-Syndrom (frühkindliche epileptische
Enzephalopathie). Weiterhin ist das ARX-Gen ursächlich für das Partington-Syndrom.
Einleitung
18
Die klinischen Zeichen des Partington-Syndroms umfassen mentale Retardierung,
milde fokale Dystonien (meist der Hände) und eine Dysarthrie (Partington et al., 1988;
Turner et al., 2002).
1.4.3. Das SLC9A6-Gen
Das SLC9A6-Gen (Sodium Like Channel 9A6-Gen) besteht aus 16 Exons und ist auf
dem X-Chromosom im Bereich Xq26.3 lokalisiert. Das Gen kodiert für den
mitochondrialen Natrium-Wasserstoff-Ionentransporter NHE6, der unter anderem an
der Regulation des intrazellulären pH-Wertes beteiligt ist (Numata et al., 1998).
Mutationen im SLC9A6-Gen werden X-chromosomal vererbt und sind für das
Christianson-Syndrom und das X-chromosomale „Angelman-ähnliche-Syndrom“
verantwortlich. Über die Häufigkeit von Mutationen im SLC9A6-Gen gibt es bislang
keine genauen Daten.
Erstmals wurden Veränderungen im SLC9A6-Gen bei männlichen Patienten mit
geistiger Behinderung, Mikrozephalie, Epilepsie, Ataxie und Verhaltensauffälligkeiten,
die an das Angelman-Syndrom erinnerten, beschrieben (Gilfillan et al., 2008).
Mittlerweile wurden einige Familien mit männlichen Betroffenen aus mehreren
Generationen beschrieben (Christianson et al., 1999; Gilfillan et al., 2008, Garbern et
al., 2010). Seitdem haben sich drei unterschiedliche klinische Erscheinungsbilder
abgezeichnet (Strømme et al., 2011): Die häufigste Manifestationsform scheint ein X-
chromosomales an das Angelman-Syndrom erinnerndes Krankheitsbild zu sein. Die
zweite Form, auch als das Christianson-Syndrom bekannt, ist ebenfalls eine an das
Angelman-Syndrom erinnerndes Krankheitsbild (Christianson et al., 1999). Christianson
beschreibt bei den Patienten kraniofaziale Dysmorphiezeichen wie ein langes schmales
Gesicht mit einer langen Nase und eine Prognathie. Häufig wird über eingeschränkte
Augenbeweglichkeit berichtet, wobei vor allem Störungen der lateralen und vertikalen
Bewegungen vorliegen (Christianson et al., 1999). Hier zeigt sich bei älteren Patienten
ein etwas abweichender Phänotyp (Gilfillan et al., 2008, Schroer et al., 2010). Bei dem
dritten Phänotyp liegen eine kortikobasale Degeneration sowie Ablagerungen von Tau-
Proteinen einhergehend mit schwerer geistiger Behinderung und autistischem
Verhalten vor (Garbern et al., 2010).
Das klinische Erscheinungsbild der männlichen Betroffenen umfasst eine sekundäre
Mikrozephalie, Kleinwuchs, eine globale psychomotorische Entwicklungsretardierung
mit Ataxie einhergehend mit Muskelhypotonie und fehlender Sprachentwicklung
(Gilfillan et al., 2008). Die Patienten zeigen eine fröhliche Grundstimmung mit
Lachanfällen und häufigem spontanen Händeklatschen.
Einleitung
19
Die meist therapieresistente bzw. schwer behandelbare Epilepsie beginnt im zweiten
Lebensjahr und besteht aus tonisch-klonischen Anfällen und Absencen. Mit
Verschlechterung der Anfallssituation verlieren viele der Patienten bereits erworbene
Fähigkeiten. Bei weiblichen Trägerinnen einer Veränderung im SLC9A6-Gen zeigen
sich Verhaltensauffälligkeiten und Lernschwierigkeiten.
Im cMRT finden sich eine fokale Atrophie sowie eine Hypoplasie des Vermis im
Kleinhirn und im weiteren Verlauf eine progressive Kleinhirnatrophie (Gilfillan et al.,
2008; Schroer et al., 2010).
1.4.4. Das TCF4-Gen
Das TCF4-Gen (Transcription Factor 4-Gen) ist auf Chromosom 18 im Bereich 18q21
lokalisiert und kodiert für den basis helix-loop-helix (bHLH)-Transkriptionsfaktor 4. Das
Gen besteht aus 20 Exons.
Erstmals wurde das Pitt-Hopkins-Syndrom 1978 bei zwei nicht verwandten Patienten
mit geistiger Behinderung, einem breiten Mund und Hyperventilationsepisoden
beschrieben (Pitt und Hopkins, 1978). 2007 wurde die Haploinsuffizienz des TCF4-
Gens als eine Ursache für das Pitt-Hopkins-Syndrom erwähnt (Amiel et al., 2007;
Brockschmidt et al., 2007, Zweier et al., 2007).
Die Erkrankung wird autosomal dominant vererbt und beide Geschlechter können
gleichermaßen betroffen sein. Die bisher bekannten Fälle traten sporadisch auf und
wurden durch de novo-Mutationen verursacht (Amiel et al., 2007). Klinisch ähnelt das
Pitt-Hopkins-Syndrom dem Angelman-Syndrom und dem Rett-Syndrom hinsichtlich des
Verhaltens, der Schlafstörungen und der fröhlichen Grundstimmung (Takano et al.,
2010).
Patienten mit Pitt-Hopkins-Syndrom zeigen eine schwere psychomotorische
Retardierung mit fehlender Sprachentwicklung sowie charakteristische Gesichtszüge.
Sie haben ein grob wirkendes Gesicht mit tief liegenden Augen, einen breiten
Nasenrücken mit gebogener Nasenspitze, einen breiten Mund mit bogenförmiger
Oberlippe, weit auseinanderstehende Zähne und eine Prognathie. Die Ohren sind oft
antevertiert und dysplastisch. Mit steigendem Alter vergröbern die Gesichtszüge
zunehmend (Zweier et al., 2009).
Die Patienten entwickeln in der späten Kindheit Hyperventilationsepisoden mit darauf
folgenden Apnoen, die mit Zyanose einhergehen können (Zweier et al., 2007).
Zudem wurden bei einigen Patienten eine Epilepsie, eine sekundäre Mikrozephalie und
Wachstumsrückstand beschrieben. Im MRT wurden in manchen Fällen ein
hypoplastisches Corpus Callosum, auffällig gebogene Nuclei Caudati,
Ventrikelasymmetrien und Atrophie des frontalen bzw. parietalen Cortex beschrieben.
Einleitung
20
Muskelhypotonie und Obstipationsneigung sind ebenfalls zu finden (Zweier et al.,
2009). Zusätzlich wurden Muskelhypotonie, gastrointestinale Komplikationen und eine
fröhliche Grundstimmung mit Lachanfällen beschrieben (Peippo et al., 2006).
Zum Zeitpunkt des Beginns der Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit wurde davon
ausgegangen, dass das Pitt-Hopkins-Syndrom aufgrund der schweren mentalen
Retardierung, der Epilepsie und der Hyperventilationsepisoden eine wichtige
Differentialdiagnose zum Angelman- sowie zum Rett-Syndrom darstellte.
Whalen et al., definierten 2012 den Phänotyp des durch Veränderungen im TCF4-Gen
verursachte Pitt-Hopkins-Syndroms präziser mittels einer Analyse aller bisher in der
Literatur beschriebenen Patienten (79) und 33 neuer Patienten mit einer Veränderung
im TCF4-Gen. Demnach sind die wichtigsten Merkmale die bereits beschriebenen
charakteristischen Gesichtszüge, eine schwere motorische Entwicklungsverzögerung,
eine fehlende Sprache sowie stereotype Handbewegungen. Seltener sind
Hyperventilation, Angst oder Agitation, Hypotonie, Lächeln, ein ataktisches Gangbild
und Strabismus (Whalen et al., 2012).
1.5. Aufgaben und Zielsetzung
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Vorkommen von genetischen
Veränderungen in den Genen TCF4, CDKL5, SLC9A6 und ARX bei Patienten mit
unterschiedlichen Formen von Epilepsie und mentaler Retardierung in einer Gruppe
von 34 Patienten zu untersuchen. Mutationen in diesen Genen führen häufig zu
Phänotypen, die eine häufige Differentialdiagnose zum Rett-Syndrom und Angelman-
Syndrom bei Patienten mit Epilepsie und mentaler Retardierung darstellen.
Zunächst etablierte ich die Bedingungen für PCR und Sequenzierung des TCF4-Gens
für den diagnostischen Gebrauch.
In einem zweiten Schritt sollten Patienten mit Veränderungen in den genannten Genen
klinisch näher charakterisiert werden. Die Ergebnisse sollten zur Systematisierung und
zum besseren Verständnis des jeweiligen Krankheitsbildes beitragen.
Nach der Auswertung der klinischen Daten, MRT-Untersuchungen, EEG-
Untersuchungen, im Vorfeld durchgeführter Diagnostik und einer ausführlichen
Anamnese wurde festgelegt, in welchen Genen und in welcher Reihenfolge eine
Mutationsanalyse der Gene TCF4, CDKL5, SLC9A6 und ARX durchgeführt wird. Dazu
verwendete ich die von mir für das TCF4-Gen entwickelten PCR- und
Sequenzierungsbedingungen sowie die im Institut bereits etablierten
Untersuchungsmethoden für die Gene CDKL5, SLC9A6 und ARX.
Material und Methoden
21
2. Material und Methoden
2.1. Materialien
2.1.1. Patienten
Die im Rahmen dieser Arbeit untersuchte Kohorte setzt sich aus 34 Patienten mit
Epilepsie und mentaler Retardierung ohne bislang bekannte genetische Ursache
zusammen. Wir rekrutierten die Patienten über eine Anfrage an Sozialpädiatrische
Zentren, Epilepsiezentren und Neuropädiater in ganz Deutschland. Es wurden
Patienten mit einer Epilepsie und mentaler Retardierung gesucht, bei denen das
Angelman-Syndrom und das Rett-Syndrom ausgeschlossen worden war. Die Art der
Epilepsie war nicht näher eingeschränkt.
Die Patienten wurden aus Epilepsiezentren und von Pädiatern aus ganz Deutschland,
sowie aus England und Rumänien in diese Studie aufgenommen. Sie wurden entweder
im Institut für Humangenetik der Universität zu Lübeck oder in den zuweisenden
Ambulanzen vorgestellt, durch die behandelnden Ärzte evaluiert und dieser Studie
zugewiesen. Die Sorgeberechtigten der Patientinnen und Patienten wurden ausführlich
aufgeklärt und ein schriftliches Einverständnis wurde eingeholt (siehe 7.1 und 7.2).
Der Fragebogen diente der Systematisierung der klinischen Informationen über die
Patienten (siehe 7.3) und wurde von den betreuenden Ärzten ausgefüllt. Die
Informationen umfassen unter anderem Angaben zu Art und Beginn der Epilepsie,
EEG-Muster, das Vorhandensein morphologischer Veränderungen im Gehirn, klinische
Symptome wie Hyperventilationszustände, gastroösophagealer Reflux, häufige
Atemwegsinfektionen, Bewegungsstörungen und weitere Auffälligkeiten oder
Fehlbildungen.
Nach der Auswertung der klinischen Daten, cMRT-Untersuchungen, EEG-
Untersuchungen, im Vorfeld durchgeführter Diagnostik und einer ausführlichen
Anamnese wurde entschieden, bei welchen Genen und in welcher Reihenfolge eine
Mutationsanalyse durchgeführt wird.
Das Projekt wurde von der Ethik-Kommission der Universität zu Lübeck am 12.05.2009
genehmigt (Aktenzeichen 09-079).
Material und Methoden
22
2.1.2. Geräte
BioDocAnalyze Geldokumentationssystem Biometra, Göttingen
Biometra T Gradient Cycler Biometra, Göttingen
Biophotometer 6131 Eppendorf, Hamburg
Centrifuge 5414 C, 5804 Eppendorf, Hamburg
Discovery Autoclavable Pipetten
(0,5-1µl, 2-2µl, 20-200µl, 100-1000µl) ABIMED Labortechnik, Langenfeld
Elektronische Waage IP 65 Sartorius AG, Göttingen
0,5-10µl Finnpipetten 4510 Thermo Fisher Scientific, München
Gene Power Supply GPS 200/400 Pharmacia Biotech, Freiburg
HE 99x submarine electrophoresis unit Amersham Biosciences, Schweiz
3100-Avant Genetic Analyzer Applied Biosystems, USA
3130xl Genetic Analyzer Applied Biosystems, USA
Mastercycler PE 9600 Eppendorf, Hamburg
Mikrowellengerät Micro 700 Hitachi, Japan
Multipette Stream Eppendorf, Hamburg
Oberflächenheizplatte IKA Combing RCT IKA Labortechnik, Staufen
2700 Thermal Cycler Applied Biosystems, USA
2720 Thermal Cycler Applied Biosystems, USA
UV-Strahler Chroma 43 Vetter GmbH, Wiesloch
Vortexschüttler MS 2 Minishaker IKA Labortechnik, Staufen
2.1.3. Chemikalien, Nukleotide, Enzyme
Agarose (Pulver) StarLab, Ahrensburg
Aqua destillata Merck, Darmstadt
Borsäure Merck,Darmstadt
DMSO (Dimethylsulfoxid) Roche, Penzberg
Ethidiumbromid (10mg/ml) Merck, Darmstadt
Ficoll 400 Pharmacia Biotech, Freiburg
GC Rich PCR System Roche, Mannheim
HiDi™ Formamide Applied Biosystems, USA
HPLC Wasser Merck, Darmstadt
Illustra™ Sephadex™ G-50 GE Healthcare, München
Low DNA Mass Ladder Invitrogen, USA
MP Taq Core Kits 10 MP Biomedicals, Eschwege
SALSA MLPA Kits P075-A1, P189-B1 MLPA Holland, Niederlande
TaqPolymerase 5U/µl Roche, Penzberg
Material und Methoden
23
Titriplex III (EDTA) Merck, Darmstadt
Tris MP Biomedicals, Eschwege
Xylencyanol Serva, Heidelberg
2.1.4. Puffer, Medien, Lösungen
3x Ficoll-Probenpuffer 145 μM Bromphenolblau
186 μM Xylencyanol
15 % (w/v) Ficoll 400
1x TBE-Puffer 36gTris
18,3g Borsäure
2,47g Titriplex III
auf 4 l aqua dest.
2%ige Agarosegel-Lösung 100 ml 1xTBE-Puffer
2g Agarosepulver
5µl Ethidiumbromid
2.5x TerminatorMix 1.1 Applied Biosystems, USA
5x Sequenzierpuffer Applied Biosystems, USA
2.1.5. Verbrauchsmaterial
Acetate Folie für Microtest Well Plates Sarstedt, Nümbrecht
Combitips Plus (0,1ml, 0,5ml) Eppendorf, Hamburg
Domed 8 Cap Strips Thermo Scientific, UK
Finntip Pipettenspitzen (0,5-10µl) Thermo Scientific, UK
Multiply®µ Strip Pro 8er Kette Sarstedt, Nümbrecht
96-Well PCR Plate nonskirted 0,2ml Thermo Scientific, UK
Multiscreen 96-Well Plates Millipore, Irland
Micro Amp Optical 96-Well Reaction Plate
with Barcode Applied Biosystems, USA
Multitest Plate 96-Well Vee Bottom Sarstedt, USA
MultiScreen Filter Plates Millipore, Irland
Pipettenspitzen Finntip 10-300µl Thermo Scientific, UK
Pipettenspitzen (-2µl) Fisher Scientific, Schwerte
Pipettenspitzen (2-200µl) Sarstedt, Nümbrecht
Pipettenspitzen (200-400µl) Sarstedt, Nümbrecht
Material und Methoden
24
Pipettenspitzen (-2µl) Eppendorf, Hamburg
Tubes (- 0,5, - 1,5, - 2ml) Sarstedt, Nümbrecht
2.1.6. DNA-Proben
Die DNA der 34 Patienten wurde teilweise im Institut für Humangenetik der Universität
Lübeck sowie teilweise in den einsendenden Laboren aus Blutproben extrahiert.
Die Kontroll-DNA-Proben stammen aus dem Institut für Humangenetik der Universität
Lübeck.
2.1.7. Computersoftware
3100 Avant Data Collection 2.0 Applied Biosystems, USA
Gene Mapper 3.5 Applied Biosystems, USA
Microsoft Word 2010 Microsoft
Microsoft Excel 2010 Microsoft
SequencePilot Module MLPA 3.3 JSI Medical Systems
SeqScape 2.5 Applied Biosystems, USA
Sequencing Analysis 5.2 Applied Biosystems, USA
Seqworks 1.03 beta Sven Opitz
2.1.8. Internetressourcen
Ensembl www.ensembl.org
GeneReviews www.genetests.org
Human Genome Browser Gateway genome.ucsc.edu/cgi-bin/ hgGateway
MRC Holland www.mrc-holland.com
Mutation T@ster www.mutationtaster.org
National Center for
Biotechnology Information (NCBI) www.ncbi.nlm.nih.gov
Online Mendelian Inheritance in Man
(OMIM) www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/
Datenbank der Einzelnukleotid-
Polymorphismen dbSNP www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP
NCBI Map Viewer www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview
Oligonucleotide Properties Calculator www.basic.northwestern.edu/
biotools/oligocalc.html
Datenbank der Publikationen www.pubmed.com
Material und Methoden
25
2.2. Methoden
Die im Folgenden beschriebenen Methoden wandte ich im Rahmen dieser Arbeit im
Labor an. Zunächst soll auf gängige molekulargenetische Methoden eingegangen
werden, um danach die Etablierung der PCR für das TCF4-Gen zu beschreiben.
2.2.1. Die Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die Polymerasekettenreaktion (engl. polymerase chain reaction- PCR) ist eine von Kary
Mullis entwickelte Methode, welche dazu dient, sehr kleine Mengen spezifischer DNA-
Fragmente in vitro exponentiell zu amplifizieren (Mullis et al., 1986).
Der Ablauf einer PCR setzt sich üblicherweise aus den Schritten Denaturierung,
Annealing (Anlagerung der Primer) und Elongation bei drei unterschiedlichen
Temperaturstufen zusammen. Dazu werden eine geringe Menge der zu
vervielfältigenden DNA (Template-DNA), zwei einzelsträngige aus etwa 20 Basen
bestehende Oligonukleotid-Primer, freie Nukleotide (dATP, dCTP, dGTP und dTTP)
sowie eine hitzestabile DNA-Polymerase benötigt. Die gesamte Reaktion findet in
einem vollautomatisierten ThermoCycler statt.
Zunächst wird die genomische DNA durch Erhöhung der Temperatur auf 95°C in ihre
zwei Einzelstränge aufgetrennt (Denaturierung). Da die DNA zu Beginn der
Denaturierung noch in ihrer komplexen, hochmolekularen Struktur vorliegt, ist für den
initialen Schritt eine Zeit von fünf Minuten notwendig, damit auch GC-reiche Regionen
aufgetrennt werden.
Daraufhin erfolgt die Anlagerung der Primer an die ihnen komplementären DNA-
Einzelstränge. Bei den Primern handelt es sich um synthetisch hergestellte
Oligonukleotide aus etwa 20 Nukleotiden. Der Vorwärts-(F-)Primer und der Rückwärts-
(R-)Primer flankieren das zu vervielfältigende DNA-Fragment, wobei der F-Primer am
„sense“-Strang und der R-Primer am „antisense“-Strang bindet. Bei der Auswahl der
Primer gilt es einige Dinge zu beachten: Ihre Länge sollte bei etwa 20 Nukleotiden
liegen, sie sollten einen ausgeglichenen A/T- und G/C- Gehalt aufweisen und die
Schmelztemperatur eines F-und R-Primerpaares sollte nicht weiter als 5-10°C
auseinander liegen. Außerdem sollten „ungewöhnliche“ Basenfolgen wie polyA-
Sequenzen, polyT-Sequenzen und G/C-reiche Primer vermieden werden.
Für das Annealing wird die Temperatur im ThermoCycler auf die durch die
Zusammensetzung der Primer bestimmte Annealingtemperatur heruntergekühlt. Sie
liegt in der Regel um 55°C und damit knapp unter der errechneten Schmelztemperatur
der Oligonukleotide. Beim Annealing entsteht ein kurzer Abschnitt doppelsträngiger
DNA mit einem freien 3„-OH-Ende, was entsprechend verlängert werden kann.
Material und Methoden
26
Im dritten Schritt beginnt das hier verwendete Enzym Taq-Polymerase bei seinem
Aktivitätsoptimum von 72°C mit der Synthese von zwei komplementären DNA-Strängen
in 3„-Richtung (Elongation). Hierbei erkennt die Taq-Polymerase den Primer-DNA-
Komplex und synthetisiert den Gegenstrang ausgehend vom freien 3„-OH-Ende aus
den im Reaktionsansatz vorliegenden freien Nukleotiden (dATP, dCTP, dGTP und
dTTP) in 5„3„-Richtung. Die Desoxribonukleosidtriphosphate (dNTPs) dATP, dCTP,
dGTP und dTTP sollten hierbei in einem äquimolaren Verhältnis vorliegen. Eine
Pufferlösung sorgt für eine adäquate Reaktionsumgebung.
Die Elongationsdauer beträgt für 1000 Basenpaare etwa 60 Sekunden und hängt von
der verwendeten DNA-Polymerase ab. Die Taq-DNA-Polymerase stammt aus dem
thermophilen Bakterium Thermicus aquaticus und wird auch bei Temperaturen bis 95°C
nicht denaturiert oder inaktiviert. Die hier verwendete rekombinante, HPLC-gereinigte
Taq-DNA-Polymerase besitzt neben der 5„3„-DNA-Polymeraseaktivität eine 5„3„-
Exonukleasenaktivität, jedoch keine 3„5„ Exonukleaseaktivität. Die Fehlerrate des
Enzyms liegt mit einem Fehler bei 106 synthetisierten Basen relativ hoch, was in der
fehlenden 3„5„ Exonukleaseaktivität und damit der fehlenden postsynthetischen
Kontrolle (proof-reading-Mechanismus) begründet ist.
Der Zyklus aus Denaturierung, Annealing und Elongation wird üblicherweise 30-35 Mal
wiederholt. Dabei nimmt die amplifizierte DNA-Menge exponentiell zu.
Nach Beendigung des letzten Zyklus findet eine 7-minütige sogenannte Endelongation
statt, während der bis dahin eventuell unvollständige Produkte komplettiert werden.
Bei einem Großteil der PCR-Anwendungen liegt nach 30 Zyklen genügend Produkt für
die nachfolgenden Analyseschritte vor.
Da es sich bei der PCR um eine extrem empfindliche und für Kontamination anfällige
Methode handelt, ist es von äußerster Bedeutung, schon in diesem Schritt einen
Kontrollansatz (Negativprobe), der keine DNA enthält, mitzuführen.
Die PCR-Bedingungen für das Exon 1 des SLC9A6-Gens sind exemplarisch in Tabelle
1 und 2 gezeigt. Die PCR-Bedingungen für die übrigen Exons des SLC9A6-Gens sowie
für die Gene ARX, CDKL5 und TCF4 sind dem Anhang zu entnehmen.
Material und Methoden
27
Tabelle 1 PCR-Ansatz für das Exon 1 des SLC9A6-Gens
Konzentration Hersteller Volumen (in µl)
DNA 50 ng/µl 1,5
a.d. (HPLC) Merck 13,25
Puffer 5 x Roche 5
dNTPs Je 10 mM Qbiogene 0,5
GC-rich Resolution 5 M Roche 2,5
F-Primer 10 pmol/µl Biomers 1
R-Primer 10 pmol/µl Biomers 1
Taq-Polymerase 5 U/µl Roche 0,25
Ansatzvolumen 25
Tabelle 2 Schematische Darstellung des PCR-Programms für das Exon 1 des SLC9A6-
Gens
PCR-Schritt Temperatur in °C Zeit
30 Zyklen
Initialisierung 95°C 5 Min
Denaturierung
Annealing
Elongation
Elongation
95°C
60°C
72°C
30 Sek.
30 Sek.
1 Min.
72°C 20 Min.
Durchführung der PCR:
Die den Tabellen (s.o. sowie im Anhang) zu entnehmenden Reaktionsansätze wurden
in eine 96-Well Mikrotiterplatte gegeben. Dabei wurde die DNA vorgelegt und
anschließend wurde der Mix aus Primern, 10xPuffer, dNTPs und Taq-Polymerase
darauf pipettiert. Die Mikrotiterplatte wurde mit Deckelstrips verschlossen, in den
vorgeheizten ThermoCycler gestellt und das gewünschte PCR-Programm verwendet.
Die PCR-Bedingungen für das TCF4-Gen wurden im Rahmen der Laborarbeit für diese
Dissertation etabliert. Die PCR-Bedingungen für die übrigen Gene waren bereits
etabliert und konnten weitestgehend übernommen werden.
2.2.2. Gelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte
Die Agarose-Gelelektrophorese ist die einfachste und effektivste Methode, DNA-
Fragmente einer Größenordnung von 0,5-25 kb voneinander zu trennen und zu
identifizieren.
Die DNA wandert infolge der negativen Ladung ihrer Phosphatgruppen im elektrischen
Feld zur Anode. Aufgrund der Siebstruktur der Agarose bieten die Poren kleineren
Material und Methoden
28
Fragmenten weniger Widerstand. Somit durchlaufen große DNA-Fragmente
Agarosegele langsamer als kleine. Um die DNA-Fragmente im Agarosegel sichtbar zu
machen, wird während der Herstellung des Gels der Fluoreszenzfarbstoff
Ethidiumbromid hinzugegeben. Ethidiumbromid lagert sich an die DNA
beziehungsweise schiebt sich zwischen die Basen (Interkalation).
Die PCR-Produkte werden gemeinsam mit 3xFicoll in die Probentaschen des
Agarosegels gegeben. Als Größenmarker dient eine 100bp-DNA-Leiter (low mass
ladder), die bei jeder Elektrophorese aufgetragen wird.
Für die vorliegende Arbeit wurden die Agarosegele aus einer 2%igen Agaroselösung
hergestellt. Hierzu wurde das Agarosepulver mit dem 1x TBE-Elektrophoresepuffer
vermischt, im Mikrowellengerät aufgekocht und anschließend auf etwa 60°C abgekühlt.
Dann wurde die Lösung mit Ethidiumbromid versetzt. Aus der erkaltenden Lösung
wurden mithilfe eines Gelschlittens und Kämmen, die in einer als Form dienenden
Gelschale lagen, die Agarosegele gegossen. Die abgekühlten und fest gewordenen
Gele wurden in eine mit 1xTBE-Elektrophoresepuffer gefüllte Kammer gesetzt und die
Geltaschen wurden mit einem Mix aus 4µl DNA-Probe sowie 3µl 3xFicoll beladen. Die
Elektrophorese erfolgte unter konstanter Spannung von 120 V über 30 Minuten.
Im Anschluss wurde das Ergebnis der Elektrophorese unter UV-Licht mit dem
bioDocAnalyzer fotodokumentiert und die Qualität der PCR-Produkte ließ sich
beurteilen.
2.2.3. Aufreinigung des PCR-Produktes
Um in den der PCR folgenden Analyseschritten mit sauberen Produkten weiter zu
arbeiten, wurden die PCR-Produkte einer Aufreinigung unterzogen.
Die hierfür verwendete Lösung bereitet PCR-Produkte für die Sequenzierung vor,
indem aus der PCR noch vorhandene überschüssige dNTPs und Primer durch die in
der Lösung enthaltenen Enzyme hydrolysiert werden. Bei den Enzymen handelt es sich
um eine Exonuklease I und eine Shrimp Alkalische Phosphatase, die in einem Puffer
gelöst sind. Es sind zwei Inkubationsschritte notwendig. Im ersten Schritt findet bei
37°C für 15 Minuten die Aufreinigung statt und im zweiten Schritt werden die Enzyme
bei 80°C in 15 Minuten inaktiviert.
Für den Aufreinigungsschritt wurden 5µl PCR-Produkt, welches nach Bedarf verdünnt
wurde, und 2µl ExoSAP in eine 96-Well Mikrotiterplatte gegeben und für 30 Minuten im
ThermoCycler wie oben beschrieben behandelt.
Material und Methoden
29
2.2.4. Sequenzierung nach Sanger
Bei der DNA-Sequenzierung nach Sanger werden die aufgereinigten PCR-Produkte
zunächst denaturiert (Sanger et al.,1977). Zwar kann auch doppelsträngige DNA
verwendet werden, die Ergebnisse mit einzelsträngiger DNA sind jedoch weitaus
besser, da sie längere Sequenzen liefert. Nach der Denaturierung bindet am 3„-Ende
des zu sequenzierenden Abschnittes ein Primer, an welchem mittels einer DNA-
Polymerase ein zum DNA-Fragment komplementärer Strang synthetisiert wird. Dafür
werden einerseits im Reaktionsansatz enthaltene 2„-Desoxynukleotide (dNTPs) sowie
zusätzlich mit einer Fluoreszenzgruppe markierte sogenannte 2„3„-Didesoxynukleotide
(ddNTPs) eingebaut. Dem ddNTP fehlt die notwendige Hydroxylgruppe am dritten C-
Atom der Ribose, an welche üblicherweise das nächste Nukleotid geknüpft wird. Daher
bricht die Amplifikation nach jedem Einbau eines ddNTPs ab und am Ende der
Sequenzierreaktion liegen unterschiedliche lange DNA-Fragmente vor. Für die
basenspezifische Markierung werden vier verschiedene Fluoreszenzgruppen
verwendet.
Im automatischen Sequenziergerät wird eine Gelkapillare mit den Reaktionsprodukten
geladen. Ein Laser regt die markierten ddNTPs zur Fluoreszenz an. Das
Fluoreszenzmaximum für jeden der vier Farbstoffe liegt bei einer anderen Wellenlänge.
Diese Informationen werden digital aufgezeichnet und die ausgelesene Sequenz wird
gespeichert. Der DNA-Abschnitt wird in farbigen Peaks (Ausschlägen) dargestellt.
Nach der ExoSAP-Behandlung werden die zu sequenzierende DNA zusammen mit
dem Primer (Vorwärts- oder Rückwärts-Primer) in eine 96Well- Mikrotiterplatte
vorgelegt, der separat vorbereitete Mix dazu pipettiert und die Platte verschlossen in
den ThermoCycler gestellt.
Die Sequenzierbedingungen für das SLC9A6-Gen sind exemplarisch in den Tabellen 3
und 4 gezeigt. Die Sequenzierbedingungen für die Gene ARX, CDKL5 und TCF4 sind
dem Anhang zu entnehmen.
Tabelle 3 Sequenzieransatz für die Exons 1-16 des SLC9A6-Gens
Konzentration Hersteller Volumen (in µl)
ExoSAP-Produkt ca. 10 ng/µl 1
5x SeqPuffer Applied Biosystems 1,5
F- oder R-Primer 10 pmol/µl Biomers 0,5
2,5x Terminator Mix 1.1 Applied Biosystems 1
a.d. (HPLC) Biomers 6
Ansatzvolumen 10
Material und Methoden
30
Tabelle 4 Sequenzierprogramm für die Exons 1-16 des SLC9A6-Gens
PCR-Schritt Temperatur in °C Zeit
25 Zyklen
Initialisierung 96°C 1 Min.
Denaturierung
Annealing
Elongation
96°C
60°C
60°C
10 Sek.
5 Sek.
1 Min.
Im Anschluss an die Sequenzierung werden die Produkte mit 10µl HPLC-Wasser
verdünnt und 10µl des verdünnten Produktes werden über der Sephadexsäule
aufgereinigt.
Die Sephadexaufreinigung wird eingesetzt, um Nukleotide und Salze von DNA-
Fragmenten zu trennen und funktioniert nach dem Prinzip der Gelfiltration. Moleküle
von einer Größe bis zu 20bp können die Matrix aus Dextran- und
Epichlorhydrinmolekülen nicht passieren, die größeren Sequenzprodukte jedoch schon.
Hierfür wurden die Kammern einer Multiscreen-Filterplatte mit 45µl Sephadex™-G50-
Pulver sowie 300µl pro Kammer HPLC a.d. befüllt und für etwa 2 Stunden zum Quellen
bei Raumtemperatur gelagert. Danach wurde das überschüssige Wasser bei 2900
Umdrehungen/Minute abzentrifugiert und 10µl der verdünnten Sequenzprodukte über
der Sephadexsäule mittels Zentrifugation bei 2900 Umdrehungen/Minute für 5 Minuten
filtriert. Im letzten Schritt wurden 10µl HiDi™-Formamide in eine Micro Amp Optical
96Well- Messplatte vorgelegt und etwa 5µl aufgereinigte Sequenzprobe dazu pipettiert.
Die Proben wurden bei 12-18 Sekunden Injektionszeit im 3130xl Genetic Analyzer
mittels kapillarelektrophoretischer Auftrennung gemessen.
2.2.5. Auswertung der Sequenzen
Mithilfe der Programme „Sequencing Analysis“ und „Seq Scape“ erfolgte die
Auswertung der digitalisierten Sequenzdaten. Die Daten wurden mit den
Referenzsequenzen aus genetischen Datenbanken verglichen. Zusätzlich wurden die
Sequenzdaten manuell mit der jeweiligen Referenzsequenz abgeglichen. Von jedem
DNA-Abschnitt wurden die Vorwärts- und die Rückwärts-Sequenz ausgewertet.
2.2.6. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA)
MLPA wurde 2002 als neue vielseitig anwendbare Methode zur schnellen Analyse von
Duplikationen und Deletionen eingeführt (Schouten et al., 2002). Mithilfe MLPA lassen
sich in einem Ansatz Variationen in der Kopienzahl von bis zu 45 unterschiedlichen
Sequenzabschnitten erfassen und analysieren (Slater et al., 2003). Dabei wird die
Menge vorhandener bestimmter DNA-Abschnitte ins Verhältnis zur entsprechenden
Material und Methoden
31
Menge bei gesunden Testpersonen (Kontrolle) gesetzt. Bei MLPA werden nicht DNA-
Fragmente sondern die Sonden, welche den zu untersuchenden DNA-Fragmenten der
Proben komplementär sind, amplifiziert und quantifiziert. Ob die Sonden amplifiziert
werden, hängt davon ab, ob die Zielsequenzen der Sonden in der DNA-Probe enthalten
sind. Jede Sonde setzt sich aus zwei Oligonukleotiden zusammen, die an benachbarte
Lokalisationen der Zielsequenz hybridisieren. Die Sonden werden gebunden und
können danach amplifiziert werden. Alle gebundenen Sonden besitzen identische
Endsequenzen am 5„- und 3„-Ende, was die Benutzung von nur einem Primerpaar
während der nachfolgenden PCR erlaubt. Die Größe des Amplifikationsproduktes liegt
zwischen 130 und 480 Basenpaaren und ist spezifisch für jede Sonde (Schouten et al.,
2002).
Für die Untersuchung der Gene CDKL5 und ARX wurde das Kit SALSA®-MLPA®-Kit
P189-B1 und für das Gen TCF4 das SALSA®-MLPA®-Kit P075-A1 verwendet. Mittels
des SALSA®-MLPA®-Kits P075-A1 wurde außerdem das Gen FOXG1 untersucht und
mittels des SALSA®-MLPA®-Kits P 189-B1 zusätzlich das NTNG1-Gen.
Kurz zusammengefasst besteht die MLPA aus folgenden Schritten:
1. Denaturierung
2. Hybridisierung
3. Ligation
4. Amplifizierung / PCR
Um die zu untersuchenden Sequenzen zu amplifizieren, wird ein Mix von MLPA®-
Sonden zu den Proben gegeben. Jede Sonde ist zu einer bestimmten Zielsequenz
komplementär. Die Sonden bestehen aus zwei Teilen, nämlich zwei Oligonukleotiden,
welche sofort aneinander angrenzend hybridisieren, und jeweils eine der Sequenzen
enthalten, die vom Primerpaar erkannt wird. Nach der Hybridisierung an ihre
spezifischen Ziele werden die zwei „Hemi-Sonden“ durch zwei spezifische Ligase-
Enzyme gebunden. Das resultierende Produkt der Ligase-Reaktion enthält beide
Primersequenzen in einem Fragment und wird während der PCR exponentiell
vervielfältigt. Im Gegensatz zu diesem vollständigen Produkt enthalten Sonden, welche
in der Ligasereaktion nicht gebunden wurden, lediglich eine einzige Primersequenz. Sie
wurden folglich nicht exponentiell amplifiziert und erzeugen während der Messung im
Kapillarsequenzierer kein Fluoreszenzsignal. Daher ist die Entfernung der nicht-
gebundenen Sonden vor der Messung nicht notwendig.
Für die vorliegende Arbeit wurden 2µl der DNA-Proben (DNA-Gehalt 50ng/µl) in eine
Mikrotiterplatte vorgelegt, zunächst mit 3µl a.d. verdünnt und dann in verschlossener
Material und Methoden
32
Mikrotiterplatte fünf Minuten lang bei 98°C denaturiert. Für die Hybridisierungsreaktion
wurden je 1,5µl SALSA-Probemix (Sonden-Mix) und Pufferlösung hinzugefügt. Nach
einer einminütigen Inkubation bei 95°C wurden die Sonden bei 60°C 16 Stunden lang
hybridisiert.
Dann wurde bei 54°C 32µl des zuvor angesetzten Ligase-65 Mix auf die hybridisierten
Proben gegeben, für 15 Minuten bei 54°C inkubiert und anschließend die Ligase 5
Minuten lang bei 98°C hitzeinaktiviert.
In einer neuen Mikrotiterplatte wurden 10µl Polymerase-Mix, welcher Primer, dNTPs
und Polymerase enthält, vorgelegt, um danach den MLPA-Ligationsansatz hierauf zu
pipettieren. Der PCR-Ansatz wurde im ThermoCycler unter folgenden Bedingungen
behandelt:
Tabelle 5 Schematische Darstellung des PCR-Programms für MLPA
PCR-Schritt Temperatur in °C Zeit
35 Zyklen
Denaturierung
Annealing
Elongation
Elongation
95°C
60°C
72°C
30 Sek.
30 Sek.
1 Min.
72°C 20 Min.
Eine detaillierte Aufführung des MLPA-Ansatzes findet sich im Anhang in 7.5 MLPA-
Ansätze.
Im Anschluss an die PCR wurden 20µl MLPA-Produkt über der Sephadexsäule
(beschrieben unter 2.2.4 Sequenzierung) aufgereinigt und 1:5 mit a.d. verdünnt. 3µl des
aufgereinigten, verdünnten Produktes wurden für die Messung im 3100xl Genetic
Analyzer mit je 9µl mit HiDi® -Formamide verdünntem ROX 500 in eine Messplatte
gegeben. Nach der Denaturierung bei 98°C für 3-4 Minuten wurden die Proben im
Kapillarsequenziergerät aufgetrennt und die Analysedaten digitalisiert.
Die Auswertung erfolgt anhand der Signalhöhe des Ergebnisses des
Sequenziergerätes, was dem Vergleich des Gendosismusters der Patienten mit dem
gesunder Kontrollpersonen entspricht.
2.2.7. Auswertung der Kapillarelektrophorese
Mithilfe der Programme „Gene Mapper“ sowie „SequencePilot“ erfolgte die Auswertung
der digitalisierten Daten aus den kapillarelektrophoretischen Messungen der MLPA. Die
Analyse erfolgt anhand der Signalhöhe bzw. -fläche. Dabei werden die Gendosismuster
der Patienten mit denen gesunder Kontrollpersonen verglichen
Material und Methoden
33
2.2.8. Etablierung der PCR für das TCF4-Gen
Meine Aufgabe im Rahmen der Laborarbeit bestand neben der molekulargenetischen
Untersuchung der Gene CDKL5, ARX, SLC9A6 und TCF4 in der Etablierung der PCR-
Bedingungen für das TCF4-Gen.
Für die Entwicklung einer PCR-Routineanalytik müssen valide PCR-Methoden etabliert
werden. Dies setzt die Kenntnis relevanter DNA-Sequenzen voraus, welche in
Datenbanken zur Verfügung stehen. Das Prinzip des PCR-Verfahrens ist im Abschnitt
2.2.1 Die Polymerasekettenreaktion (PCR) beschrieben. Für das TCF4-Gen etablierte
ich die PCR-Bedingungen neu.
Häufig ist es problematisch, ein DNA-Fragment spezifisch, das heißt ohne die
Entstehung zusätzlicher unspezifischer Nebenprodukte, zu amplifizieren. Die Spezifität
und Effizienz der PCR hängen von etlichen Parametern wie Temperatur, Anzahl der
Zyklen, Reaktionsdauer und der verwendeten DNA-Polymerase ab. Von
entscheidender Bedeutung sind die Primer und ihre Hybridisierungstemperatur. Die
Grundvoraussetzung für eine erfolgreiche PCR ist das Design optimaler Primer
(Mülhardt, 2006). Bei der Etablierung der PCR-Bedingungen für das TCF4-Gen wurde
darauf geachtet, eine Primer-Länge von 18-30 Basen nicht zu überschreiten und ein
ausgewogenes Verhältnis von Guanidin und Cytosin (40-60%) zu Adenin und Thymin
einzuhalten. Ebenso sollten möglichst nicht mehr als vier gleiche Basen hintereinander
vorliegen. Durch optimale Primer-Länge und ein ausgewogenes Basen werden
Leserasterverschiebungen und Fehlhybridisierungen vermieden. Die
Schmelztemperatur eines Primerpaares sollte 55-80°C betragen, damit ausreichend
hohe Annealingtemperaturen möglich sind (Scheinert, 1997).
Schließlich sollten Primer möglichst wenig komplementär zueinander sein, um sich
nicht gegenseitig als Template zu dienen. Die Sequenz muss möglichst spezifisch für
das gewünschte PCR-Produkt sein, damit die Primer nur an der richtigen Stelle
hybridisieren. Diesem potentiellen Problem entgeht man über hohe
Annealingtemperaturen, wenn es der Aufbau der Primer erlaubt.
Die Schmelztemperatur gibt Auskunft darüber, bei welcher Temperatur fünfzig Prozent
des Primers nicht mehr an das Template bindet, jedoch nicht, ab wann der Primer
zuverlässig hybridisiert. Daher sollte die Hybridisierungstemperatur 5-10°C niedriger als
die errechnete Schmelztemperatur Tm gewählt werden.
Die Schmelztemperatur Tm errechnet sich nach folgender Gleichung:
Tm= 4x (Anzahl G bzw. C) + 2x (Anzahl A bzw. T)
Diese Gleichung gilt für kurze Primer von etwa 20 Basen, wie sie in der vorliegenden
Arbeit verwendet wurden (Mülhardt, 2006).
Material und Methoden
34
Die Primer wurden entsprechend der aufgeführten Kriterien ausgesucht. Zunächst
wurden die optimalen Annealingtemperaturen berechnet und die ersten PCRs mit
Kontroll-DNA durchgeführt. Außerdem wurde die PCR einiger Exons in Cyclern, die
Temperaturgradienten ermöglichen, durchgeführt, um die errechnete
Annealingtemperatur zu überprüfen und gegebenenfalls zu korrigieren. Die PCR-
Bedingungen, bei denen sich optimale Produkte ergaben, sind dem Abschnitt 7.4.4 im
Anhang zu entnehmen.
Ergebnisse
35
3. Ergebnisse
3.1. Auswertung und Darstellung der Vorbefunde
In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst die mittels eines Fragebogens erhobenen
klinischen Daten aus der Vorgeschichte der Patienten ausgewertet.
3.1.1. Anamnese und klinische Befunde
In die Studie wurden 13 (38,2%) Jungen und 21 (61,8%) Mädchen im Alter von 20
Monaten bis 49 Jahren aufgenommen. Auswahlkriterien für die Aufnahme in die Studie
waren eine schwer behandelbare oder therapieresistente Epilepsie und eine mentale
Retardierung. Die Art der Epilepsie wurde nicht näher eingegrenzt.
Die Schwangerschaft verlief bei 25/33 Müttern (76%) komplikationslos, bei 8/33(24%)
traten Komplikationen auf. Zu den Komplikationen gehörten Gestationshypertonie,
Plazentainsuffizienz, ein pathologisches Cardiotokogramm (CTG) in der 28.
Schwangerschaftswoche, ein Pneumothorax, bei zwei Müttern vorzeitige
Wehentätigkeit mit drohender Frühgeburt, Harnwegsinfekte der Mutter sowie
Komplikationen aufgrund einer Prothrombin-Mutation (Faktor-II-Mutation) bei einer
Mutter.
Die Entbindung erfolgte bei 21/31 (67,8%) Patienten spontan vaginal. 10/31 (32,2%)
wurden per Sectio entbunden, zwei Kaiserschnitte davon wurden sekundär aufgrund
eines pathologischen CTG während der Geburt durchgeführt, eine weitere Sectio wurde
aufgrund des Verdachts auf eine intrauterine Infektion bei grünem Fruchtwasser
durchgeführt.
In der Neugeborenen- und Säuglingszeit traten bei 16/30 (53,3%) Patienten
Fütterungsprobleme auf, bei 14/30 (46,7%) Patienten nicht. Bei 11 der Patienten mit
Fütterungsproblemen lag eine muskuläre Hypotonie vor, eine Patientin hatte
Fütterungsprobleme aufgrund einer Kiefer-Gaumen-Spalte.
Der Muskeltonus war bei insgesamt 17/29 (58,6%) Patienten erniedrigt (hypoton), bei
11/29 (38%) normal und eine Patientin (3,4%) hatte eine muskuläre Hypertonie.
Tabelle 6 Mikrozephalie, Kleinwuchs und Dystrophie in der untersuchten
Patientenkohorte
primär sekundär nein keine Angabe
Mikrozephalie 1/27 (3,7%) 9/27 (33,3%) 17/27 (63%) 7/34
Kleinwuchs 0/26 3/26 (11,5%) 23/26 (88,5%) 8/34
Dystrophie 0/25 3/25 (12%) 22/25 (88%) 9/34
Ergebnisse
36
Tabelle 6 bietet eine Zusammenfassung zu Mikrozephalie, Kleinwuchs und Dystrophie
der Patienten. Dazu wurden die Körpermaße zum Zeitpunkt der Geburt und die
Körpermaße zum Zeitpunkt der Datenerhebung ausgewertet. Im Anhang findet sich
eine detaillierte Tabelle mit den Körpermaßen zum Zeitpunkt der Geburt sowie zum
Zeitpunkt der Datenerhebung.
Liegen der frontookzipitale Kopfumfang unterhalb der 3.Perzentile oder mehr als zwei
Standardabweichungen unterhalb des Altersdurchschnitts für Geschlecht und
ethnologischer Herkunft sowie ein Missverhältnis zwischen Gesichts- und Hirnschädel
vor, spricht man von Mikrozephalie (Hay Jr et al., 2007).
Ein kleiner Kopfumfang kann mit einer verzögerten Entwicklung und Wachstum des
Gehirns einhergehen. In dem Zusammenhang können Symptome wie eine
Entwicklungsverzögerung oder neurologische Auffälligkeiten wie beispielsweise
Krampfanfälle und Spastiken auftreten (Hay Jr et al., 2007).
Kleinwuchs wird als eine Körpergröße unter der 3.Perzentile definiert (Zabranski, 2007).
Dystrophie beschreibt in diesem Zusammenhang eine Gedeihstörung aufgrund der
Grunderkrankung der Patienten. Bei keinem der Patienten liegt eine primäre, also
konnatale Dystrophie vor, eine sekundäre im Verlaufe der Erkrankung wird von 3 (12%)
entwickelt. Ursächlich dafür können beispielsweise eine unkontrollierte Anfallssituation
oder Hypalimentation sein.
18/33 (54,4%) Patienten konnten frei laufen. Auffällig ist, dass diejenigen Patienten, die
das freie Laufen erlernten, es mit durchschnittlich 24 Monaten und damit etwa 12
Monate später als gesunde Kinder erlernten.
12/28 (43%) der Patienten entwickelten stereotype Handbewegungungen wie
„Waschbewegungen“, Händereiben oder sie führten Hände und Finger häufig zum und
in den Mund.
17/30 (57%) Patienten hatten eine Bewegungsstörung. Bei sechs Patienten wurde
diese als eine Ataxie, bei zwei als eine Dyskinesie, bei vier Patienten als eine Dystonie
und bei zwei weiteren als eine Spastik beschrieben.
Bei Dystonien und Dyskinesien handelt es sich um repetititve, unwillkürliche
Muskelkontraktionen, die entweder Rumpf, Körper oder Extremitäten in bestimmte
Haltungen zwingen oder zu abnormen Bewegungsabläufen führen. Die
Bewegungsstörungen werden häufig bei Patienten mit Veränderungen in den Genen
CDKL5,ARX,TCF4 und SLC9A6 beschrieben.
Bei 11/31 (35,5%) Patienten wird von einem Verlust erworbener Fähigkeiten berichtet.
Dazu gehören eine Verschlechterung des Gangbildes, ein Verlust der aktiven Sprache
oder Verlernen von Greifen und freiem Sitzen.
Tabelle 7 bietet einen Überblick über die sprachliche Entwicklung der Patienten.
Ergebnisse
37
Tabelle 7 Sprachentwicklung in der untersuchten Patientenkohorte zum Zeitpunkt der
Datenerhebung
Häufigkeit Prozent
Expressive Sprache
Keine 20/31 64,5%
Einzelne Wörter 8/31 25,8%
Mehrwortsätze 3/31 9,7%
Keine Angabe 3/34
Sprachverständnis
Sehr eingeschränkt bis fehlend 18/30 60%
Einzelne Aufforderungen 9/30 30%
Gut 3/30 10%
Keine Angabe 4/34
In Tabelle 8 sind Angaben über die Häufigkeit von Dysmorphiezeichen,
Hyperventilationszuständen und Neigung zu Infekten der Luftwege zusammengefasst.
Tabelle 8 Dysmorphiezeichen und respiratorische Auffälligkeiten in der untersuchten
Patientenkohorte
Ja Nein Keine Angabe
Dysmorphiezeichen 6/28 (21,4%) 22/28 (78,6%) 6/34
Organfehlbildungen 0/28 28/28 (100%) 6/34
Hyperventilationszustände 2/31 (6,4%) 29/31 (93,6%) 3/34
Häufige Luftwegsinfekte 10/32 (31%) 22/32 (69%) 2/34
Bei 6/28 Patienten wurde von den untersuchenden Ärzten über Dysmorphiezeichen
berichtet. Fünf dieser Patienten werden ausführlicher beschrieben.
Patientin 2 hat einen leichten Hypertelorismus, eine breite Mundspalte, breite
Zahnzwischenräume und lange dünne, spitz zulaufende Finger (sogenanntes
„Tapering“). Diese Merkmale wären mit den Auffälligkeiten bei Pitt-Hopkins-Syndrom,
das häufig durch Mutationen im TCF4-Gen verursacht wird, zu vereinbaren.
Bei Patientin 6 liegt eine milde Syndaktylie der zweiten und dritten Zehe beidseits vor.
Dieser Befund ist auch bei dem gesunden Onkel und bei dem Cousin der Patientin
väterlicherseits beschrieben. Die Anomalie hat somit mit hoher Wahrscheinlichkeit
keinen Krankheitswert.
Bei Patient 9 werden tiefliegende Augen mit dichten, geschwungenen Wimpern, ein
kurzes Philtrum, eine milde Retrognathie, prominente Schneidezähne und spitz
zulaufende Finger beschrieben.
Ergebnisse
38
Patient 13 hat eine hohe, vorgewölbte Stirn, kleine, tiefliegende Augen und leicht
splitternde Fußnägel.
Bei der Patientin 14 wurden eine prominente Stirn, tief liegende Augen und ein
Telekanthus beschrieben. Sie hatte einen hohen, schmalen Gaumen, weit
auseinanderstehende, relativ kleine Zähne und eine dünne Oberlippe. Außerdem
standen die Ohren etwas ab, die Nase war relativ kurz und sie hatte ein langes
Philtrum. Die Mamillen waren invertiert.
Tabelle 9 fasst die zum Zeitpunkt der Datenerhebung beschriebenen
Dysmorphiezeichen zusammen.
Tabelle 9 Dysmorphiezeichen
Bei 2/31 Patienten wird über Hyperventilationszustände berichtet.
Hyperventilationsepisoden werden im Zusammenhang mit dem Pitt-Hopkins-Syndrom
beschrieben. 10/31 (31%) Patienten hatten häufige Infekte der oberen Atemwege.
Alle 34 Patienten dieser Studie haben eine Epilepsie, bei 27/32 (84,4%) handelt es sich
um therapieresistente Anfälle. Fünf Patienten haben eine Epilepsie, welche nach vielen
Therapieversuchen schließlich auf eine Behandlung anspricht. Die Anfälle bestehen bei
ihnen aus myoklonischen Anfällen, die teilweise auch nachts auftreten, tonischen
Anfällen sowie fokalen und komplex fokalen Anfällen mit sekundärer Generalisierung.
Bei zwei dieser Patienten entwickelte sich die Epilepsie im ersten Lebensjahr, bei den
weiteren drei Patienten traten die ersten Anfälle nach dem zweiten Lebensjahr auf. Alle
Pat. Dysmorphiezeichen
2 leichter Hypertelorismus, breite Mundspalte, breite Zahnzwischenräume, lange
dünne Finger mit angedeutetem Tapering.
4 auffällig breiter Mund
6 Mikrozephalie, milde Syndaktylie 2-3 beidseits an den Füßen, auch beim Bruder
und Neffen des Vaters
9 tiefliegende Augen mit dichten geschwungenen Wimpern, kurzes Philtrum, milde
Retrognathie, prominente obere Schneidezähne, Finger spitz zulaufend
13 hohe vorgewölbte Stirn, kleine, tiefliegende Augen.
Die Fußnägel splittern leicht.
14 Prominente Stirn, tief liegende Augen, Telekanthus, hoher, schmaler Gaumen,
weit auseinanderstehende, relativ kleine Zähne, dünne Oberlippe, etwas
abstehende Ohren, insbesondere rechts. Nase relativ kurz, Philtrum lang.
Invertierte Mamillen.
Ergebnisse
39
fünf Patienten werden mit Valproat therapiert, bei zwei Patienten wird zusätzlich
Sultiam bzw. Ethosuximid gegeben.
10/32 Patienten mit einer therapieresistenten Epilepsie haben BNS-Krämpfe in ihrer
Anamnese. Bei ihnen begann die Epilepsie im Alter zwischen zwei Lebensmonaten und
zwei Lebensjahren. Sieben dieser Patienten entwickelten im Verlauf eine komplexe
Epilepsie, die sich aus verschiedenen Anfallsarten zusammensetzt, wie zum Beispiel
die Epilepsie von Patient 13. Er entwickelte im 4.Lebensmonat BNS-Anfälle, die in ein
Lennox-Gastaut-Syndrom übergingen. Zum Zeitpunkt der Anamnese lag eine
multifokale Epilepsie mit komplex-fokalen, einfach-fokalen, generalisierten tonisch-
klonischen Anfällen sowie Nickanfällen vor. Teilweise traten die Anfälle im Schlaf auf,
teilweise waren sie tonisch einhergehend mit Zyanose sowie Hypersalivation. Das EEG
zeigte bei diesem Patienten einen temporalen Fokus auf der linken Seite, einzelne fokal
beginnende Anfälle sowie eine multifokale hypersynchrone Aktivität in Form von „sharp-
waves“, links und rechts „spike-polyspike-waves“ mit wiederholter Generalisierung.
Die Tabelle im Abschnitt 7.7. Therapieresistente Epilepsien - Überblick zeigt eine
Zusammenschau der Merkmale der Epilepsien der Patienten, bei denen eine
therapieresistente Epilepsie besteht.
21/30 (70%) Patienten hatten eine schwere mentale Retardierung, 8/30 (27%) eine
moderate und bei einem Patienten wurde eine milde mentale Retardierung
beschrieben. Von den Patienten mit therapieresistenter Epilepsie haben 19/27 eine
schwere mentale Retardierung. Schwer behandelbare bzw. therapieresistente
Epilepsien können für eine Entwicklungsverzögerung und mentale Retardierung
verantwortlich sein.
Die Patienten mit therapieresistenten Epilepsien wurden alle mit einer unterschiedlich
aufgebauten Kombinationstherapie behandelt. Dabei wurden auch Antiepileptika
zweiter Wahl hinzugezogen, nachdem die Medikamente erster Wahl bei der
betreffenden Epilepsieform nicht anschlugen. Die Medikation der Patienten mit
therapieresistenter Epilepsie sowie der Grad der mentalen Retardierung ist der Tabelle
im Abschnitt 7.7. Therapieresistente Epilepsien - Überblick zu entnehmen.
3.1.2. Befunde im Elektroenzephalogramm
Die EEG-Befunde wurden im Rahmen der regelmäßigen Untersuchungen durch die
betreuenden Ärzte erhoben und schriftlich übermittelt. Sie sind der Tabelle im Abschnitt
7.8. Befunde im Elektroenzephalogramm und in der Magnetresonanztomographie zu
entnehmen.
Ergebnisse
40
Die Befunde reichten von unauffälligen Befunden ohne epilepsietypische Aktivität über
leicht abnorme interiktale Grundrhythmen zu schweren Allgemeinveränderungen und
pathologischen Wach-, Dösigkeits- und Schlafableitungen.
Die EEG-Befunde der fünf Patienten, deren Epilepsie nicht therapieresistent ist, sind
bei drei Patienten unauffällig oder zeigen leichte Allgemeinveränderungen. Dazu gehört
ein zu langsamer oder diskontinuierlicher Grundrhythmus. Die anderen zwei Patienten
mit einer auf Valproat ansprechenden Epilepsie haben links fokale, fronto-zentrale
epilepsietypische Muster bei einer komplex-fokalen Epilepsie mit linkshemisphärischen
Dämmerattacken und teilweiser sekundärer Generalisierung sowie pathologische
Wach-, Dösigkeits- und Schlafableitungen mit generalisierten „polyspike-wave“-
Paroxysmen mit klinischen Myoklonien.
Auch die EEG-Befunde der Patienten mit einer therapieresistenten Epilepsie sind
vielfältig.
Die EEG-Befunde stellen eine Bandbreite von Mustern dar. Bislang sind in der Literatur
für die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Krankheitsbilder wenige EEG-Muster
beschrieben. Lediglich für Patienten mit Veränderungen im CDKL5-Gen sind
mittlerweile genauere Untersuchungen vorhanden. Melani et al. berichten davon, dass
Patienten mit Veränderungen im CDKL5-Gen besonders lang andauernde Anfälle, die
sich als tonisch-klonische Anfälle mit tonisch-klonisch-myoklonischen Manifestationen
darstellen, haben (Melani et al., 2011)
3.1.3. Befunde der Magnetresonanztomographie des Schädels (cMRT)
Bei Untersuchungen im cMRT ergaben sich bei 10/30 (33,3%) Patienten keine
Auffälligkeiten. 20/30 (66,7%) haben hingegen pathologische Befunde. Davon zeigen
11/20 eine Atrophie des Gehirns, die teilweise global oder supratentoriell ist. Drei
Patienten haben komplexe Hirnfehlbildungen. Die cMRT-Befunde sind im Anhang im
Abschnitt 7.8 zusammengefasst.
Eine Atrophie der weißen und grauen Substanz, eine Hypoplasie oder Agenesie des
Corpus callosum oder Myelinisierungsstörungen geben Hinweise auf ein
übergeordnetes Krankheitsbild.
3.1.4. Familienanamnese
Bei vier Patienten wurde von Auffälligkeiten in der Familienanamnese berichtet.
Die Mutter von Patient 9 war an einer juvenilen myoklonischen Epilepsie erkrankt und
zudem besteht eine Epilepsie bei mehreren der Familienmitglieder. Der Patient 9 hatte
eine auf Valproat ansprechende idiopathische, atypische generalisierte Epilepsie mit
myoklonischen Anfällen sowie einzelnen fiebergebundenen komplex fokalen Anfällen.
Ergebnisse
41
Laut Symptomatik der Mutter und des Patienten kann ein Zusammenhang zwischen
ihren Symptomen und den Symptomen des Patienten bestehen. Es werden autosomal
dominante, autosomal rezessive sowie multifaktorielle Vererbungsmuster im
Zusammenhang mit juveniler myoklonischer Epilepsie beschrieben (Gardiner, 2005;
Alfradique und Vasconcelos, 2007). Im Falle des Patienten 9 ist eine genetische
Erkrankung wahrscheinlich. Da jedoch keine weiteren Informationen zu den übrigen
Familienmitgliedern vorliegen, ist es schwierig, eine genaue Aussage über einen
möglichen Erbgang und die genetische Grundlage zu treffen.
Die Mutter von Patientin 14 hatte drei Fehlgeburten. Bei den Feten lagen Fehlbildungen
vor. Die Patientin hat zwei gesunde Geschwister. Im Rahmen der Diskussion wird
genauer auf die Patientin eingegangen.
Der Großvater väterlicherseits der Patientin 18 erkrankte im neunten Lebensjahr an
einer nicht näher beschriebenen Epilepsie. Es ist nicht sehr wahrscheinlich, dass die
Erkrankung des Großvaters dieselbe Ursache hat wie die der Patientin.
Zwei Cousins ersten Grades von Patientin 26 sowie ein Kind in der weiteren
Verwandtschaft hatten eine ähnliche Symptomatik wie die Indexpatientin. Da die
Verwandtschaft in Serbien lebte, konnte leider kein näherer Kontakt aufgenommen
werden. Die Patientin hat komplex fokale und sekundär generalisierte Anfälle, die
medikamentös nicht kontrolliert sind.
3.1.5. Im Vorfeld durchgeführte genetische Untersuchungen
Bei 22/34 (64,7%) Patienten wurde im Vorfeld eine Chromosomenanalyse
durchgeführt, welche bei 9/22 einen unauffälligen männlichen Chromosomensatz 46,XY
und bei 13/22 einen unauffälligen weiblichen Chromosomensatz 46,XX ergab. Damit
wurden größere chromosomale Aberrationen als Ursache für die klinische Symptomatik
im Vorfeld ausgeschlossen.
Ein Angelman-Syndrom wurde bei 8/9 Patienten im Vorfeld ausgeschlossen, bei 25/34
Patienten wurde in dieser Rubrik des Fragebogens keine Angabe gemacht.
Bei 11/14 Patienten wurde das MECP2-Gen auf Veränderungen, die zum Rett-
Syndrom führen, untersucht. Bei 3/14 Patienten wurde die Untersuchung im Hinblick
des Rett-Syndroms nicht durchgeführt und bei 20/34 Patienten liegen keine Angaben
vor.
Außerdem wurde bei 20/34 (59%) Patienten eine Array-CGH-Untersuchung
durchgeführt. Mittels Array-CGH-Analyse lassen sich Chromosomenveränderungen
nachweisen, die so klein sind, dass sie in der konventionellen Chromosomenanalyse
nicht erkannt werden können. Dabei werden Verluste von Chromosomenanteilen
(Deletionen) sowie Hinzugewinne derselben (Duplikationen) genomweit detektiert.
Ergebnisse
42
17/20 Array-CGH-Analysen waren unauffällig, bei drei Analysen wurden auffällige
Befunde erhoben. Bei Patient 5 fand sich in der Chromosomenregen 10q21.1 eine
74,11 kb große Deletion. Die Karyotypformel nach ISCN lautet arr10q21.1.(55,351,192-
55,276,981)x1 (nach NCBI 36/hg18). Die Veränderung liegt ebenfalls bei der
phänotypisch unauffälligen Mutter vor.
Bei Patientin 8 fand sich in der Array-CGH-Analyse eine 133,3 kb große Deletion in der
Chromosomenregion Xq13.3. Die Karyotypformel lautet arrXq13.2(74,016,050-
74,149,351)x1 (nach NCBI 36/hg18). Ob die Eltern untersucht wurden, ist nicht
bekannt.
Bei Patient 12, der an einer fokalen Epilepsie mit sekundärer Generalisierung leidet,
fand sich eine Auffälligkeit, die ebenso bei der klinisch unauffälligen Mutter besteht. Da
keine näheren Informationen zu dem Befund der Array-CGH-Untersuchung vorliegen,
lassen sich lediglich Vermutungen anstellen. Es besteht die Möglichkeit, dass die
Veränderung auf dem X-Chromosom lokalisiert ist. Insbesondere in diesem Fall könnte
die Veränderung für das Krankheitsbild des Sohnes ursächlich sein.
3.2. Molekulargenetische Analysen
3.2.1. Sequenzanalysen
Die Reihenfolge der Sequenzanalysen der Gene CDKL5, TCF4, ARX und SLC9A6
wurde nach der Auswertung der klinischen Daten, cMRT-Untersuchungen, EEG-
Untersuchungen, im Vorfeld durchgeführter Diagnostik und einer ausführlichen
Anamnese der Patienten festgelegt.
Zur Orientierung diente die Auswertung des Fragebogens (siehe Abschnitt 3.1.). Eine
zusammenfassende Übersicht über die erhobenen Befunde im Rahmen der
genetischen Untersuchungen bietet die Tabelle Ergebnisse der genetischen
Untersuchungen im Abschnitt 7.9. im Anhang.
3.2.1.1. Sequenzanalysen des CDKL5-Gens
Das CDKL5-Gen wurde zunächst bei Patienten mit sich früh manifestierenden BNS-
Krämpfen, tonischen und tonisch-klonisch generalisierten Anfällen, Mikrozephalie sowie
Bewegungsstörungen untersucht. Als Beispiel dient hier Patientin 11, bei der sich die
Epilepsie im 3. Lebensmonat manifestierte und zunächst aus BNS-Krämpfen bestand.
Später veränderte sich die Epilepsie zu tonischen und myoklonischen Anfällen. EEG-
Befunde zeigten bei der Patientin eine Hypsarrhythmie. Die Patientin hat eine
Mikrozephalie und eine dystone und spastische Bewegungsstörung.
Ergebnisse
43
Im Laufe der genetischen Untersuchungen wurden die 20 kodierenden Exons des
CDKL5-Gens bei allen 34 Patienten mittels PCR amplifiziert und anschließend
sequenziert, sofern Mutationen im CDKL5-Gen nicht im Vorfeld ausgeschlossen
worden waren (Pat.1, 3, 8, 10, 27).
In der vorliegenden Arbeit wird Bezug auf das CDKL5-Transkript ENST00000379989
der Datenbank ensembl.org genommen.
Überprüft wurde die Spezifität der PCR durch Agarose-Gelelektrophorese wie
beispielhaft für die Exons 6-8 des CDKL5-Gens in Abbildung 1 gezeigt.
Abbildung 1 PCR-Produkte von acht Proben auf 2%igem Agarose-Gel
M: Längenstandard (100 bp DNA-Ladder); ▼:Leerkontrolle
Nach der 30minütigen elektrophoretischen Auftrennung der PCR-Produkte bei 120 mA
sind die Fragmente, welche die Exons 6,7 und 8 beinhalten, erkennbar. Ihre Länge
beträgt zwischen 200 und 400bp, wie am Längenstandard M zu erkennen. Die Länge
der Fragmente, in denen die Exons 6,7 und 8 enthalten sind, liegt entsprechend bei
290, 297 und 282 bp wie durch die Primer festgelegt wurde.
Bei den Patienten 18, 20 und 23 zeigte sich im Exon 17 im CDKL5-Gen in der
Sequenzierung die Veränderung c.2372A>C. Bei Probe 18 liegt sie in heterozygoter,
bei den Proben liegt sie 20 und 23 in homozygoter Form vor. Dabei handelt es sich um
den bekannten Einzelnukleotid-Polymorphismus (single nucleotide polymorphism, SNP)
rs35478150. Diese Veränderung ist eine Missense-Veränderung, da der
Basenaustausch zum Codon CCA anstelle von CAA führt. Dadurch wird im Protein die
Aminosäure Glutamin durch Prolin ersetzt. Die Veränderung c.2372A>C hat jedoch laut
SNP-Datenbank keine Auswirkungen auf die Funktion des Proteins und kommt auch
bei gesunden Kontrollen vor.
Abbildung 2 zeigt den entsprechenden Ausschnitt aus dem Chromatogramm.
Ergebnisse
44
Abbildung 2 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Exons 17 des CDKL5-Gens.
Links: Der Sequenzausschnitt der Proben 18, 20 und 23 zeigt den Basenaustausch c.2372A>G
im Exon 17 des CDKL5-Gens.
Rechts: Der Ausschnitt zeigt die Wildtyp-Sequenz.
Exon 14 des CDKL5-Gens bei dem Patienten 9 (männlich) ließ sich mittels PCR, trotz
unterschiedlicher PCR-Bedingungen nicht amplifizieren.
Bei der Patientin 35 zeigte sich die Veränderung IVS17-1G>A (c.2277-1G>A) im Intron
16 des CDKL5-Gens in heterozygotem Zustand. Abbildung 3 zeigt den entsprechenden
Ausschnitt aus dem Elektropherogramm.
Die Patientin wurde 2009 von Dr. med. Tilman Polster (Neuropädiatrie, Epilepsie-
Zentrum Bethel) klinisch untersucht. Bei der Patientin besteht eine schwere
psychomotorische Retardierung und eine therapieresistente Epilepsie.
Während der Schwangerschaft kam es zu frühzeitiger Wehentätigkeit, die Geburt
erfolgte per Sectio in der 38+5 Schwangerschaftswoche. Das Geburtsgewicht betrug
3940 g (90.-95.Pz.), die Geburtslänge 55 cm (96.Pz) und der Kopfumfang 36 cm
(90.Pz.). Bereits nach der Geburt bestanden Fütterungsprobleme. Zeitgleich mit dem
Beginn der Epilepsie im dritten Lebensmonat fiel eine Entwicklungsverzögerung auf.
Nach dem ersten Anfall traten über eine Zeitspanne von neun Monaten täglich 5-7
Anfälle auf. Die Anfälle bestanden aus unterschiedlichen fokalen Anfällen tonischer und
klonischer sowie generalisiert tonisch-klonischer Symptomatik.
Die Patientin entwickelte eine muskuläre Hypotonie und stereotype Handbewegungen.
Sie ist schwer psychomotorisch retardiert. Die Epilepsie ist unter der Gabe von
Lamotrigin und Oxcarbazepin therapieresistent.
Im Alter von 4 ½ Jahren zeigte das Mädchen keinerlei Sprachentwicklung. Freies
Laufen ist seit dem Alter von 3 8/12 Jahren möglich. Es besteht eine Gangataxie.
Ergebnisse
45
In der Kernspintomographie finden sich links eine frontale kortikale Dysplasie sowie
bilateral eine verzögerte Myelinisierung. Das EEG zeigt eine generalisierte und links
frontale und links zentrale intermittierende Verlangsamung sowie multifokale
epilepsietypische Potentiale in Form von „sharp-waves“ und „poly-spikes“.
Im Vorfeld wurden molekulargenetische Untersuchungen im Hinblick auf ein Angelman-
Syndrom sowie ein Rett-Syndrom durchgeführt, welche sich unauffällig zeigten. Eine
Array-CGH Untersuchung zeigte sich ebenfalls unauffällig. Die Familienanamnese ist
unauffällig.
Abbildung 3 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des CDKL5-Gens
Links: Sequenzausschnitt mit der heterozygoten Austausch17-1G>A bei Probe 35
Mitte: Sequenzausschnitt des Intron 16-Exon 17-Überganges bei der Mutter der Patientin.
Rechts: Sequenzausschnitt des Intron 16-Exon 17-Überganges bei dem Vater der Patientin.
Um die Relevanz der bei der Patientin 35 gefundenen Veränderung zu klären, wurde
bei den Eltern das Exon 17 des CDKL5-Gens einschließlich der Exon-Intron-Übergänge
sequenziert. Bei den Eltern der Patientin zeigte die Sequenzanalyse des Exon 17 des
CDKL5-Gens keine Abweichung von der Wildtypsequenz. Der Austausch 17-1G>A ist
somit bei der Patientin de novo entstanden.
3.2.1.2. Sequenzanalysen des TCF4-Gens
Bei Patienten mit Hyperventilationsepisoden, postnataler Wachstumsretardierung,
kraniofazialen Dysmorphien sowie stereotypen Bewegungen der Hände und
Auffälligkeiten im MRT des Schädels wurde zunächst eine Analyse des TCF4-Gens
durchgeführt.
Der Phänotyp von Patient 4 erinnert an Patienten mit Mutationen im TCF4-Gen. Neben
einer früh beginnenden Epilepsie hat er eine breite Mundspalte und breite
Zahnzwischenräume, führt Waschbewegungen der Hände aus und steckt häufig die
Ergebnisse
46
Hände oder Finger in den Mund. Mehrmals am Tag treten bei ihm
Hyperventilationsepisoden auf.
Die 20 kodierenden Exons des TCF4-Gens wurden bei allen 34 Patienten der Studie
mittels PCR amplifiziert und anschließend sequenziert. In der vorliegenden Arbeit wird
Bezug auf das TCF4-Transkript ENST00000398339 der Datenbank esembl.org
genommen.
Bei 34 der 34 sequenzierten Proben (100%) wurde im Exon 0 des TCF4-Gens der
Einzelnukleotid-Polymorphismus rs611326 mit der Veränderung c.28G>C, gefunden.
Hierbei handelt es sich um eine Normvariante. Alle Patienten waren homozygot für das
Allel c.28G>C Mittlerweile wird jedoch in der Datenbank dbSNP die Base Cytosin
anstelle von Guanin als Referenz angeben. Abbildung 4 zeigt den entsprechenden
Ausschnitt aus dem Elektropherogramm sowie die Angaben der Datenbanken.
Abbildung 4 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Exons 0 des TCF4-Gens
Links: Sequenzausschnitt mit dem SNP c.28G>C in homozygotem Zustand.
Rechts: Der Ausschnitt aus dem Exon 0 des TCF4-Gens zeigt die Sequenz aus der Datenbank
db SNP.
Bei 20 der 34 Patienten (59%) wurde im Exon 19 die Veränderung c.2226A>G, bekannt
als SNP rs8766 gefunden. 6 Patienten (18%) sind homozygot für die Veränderung und
14 Patienten (41%) sind heterozygot für das Allel c.2226A>G.
Bei der Veränderung handelt es sich um eine stille Mutation. Somit führt sie zu keiner
Änderung in der Aminosäuresequenz des Proteins. Die Sequenzausschnitte sind
Abbildung 5 zu entnehmen.
Ergebnisse
47
Abbildung 5 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Exons 19 des TCF4-Gens
Links: Der Sequenzausschnitt der homozygoten SNP-Variante G/G im TCF4-Gen.
Mitte: Der Sequenzausschnitt der heterozygoten SNP-Variante A/G im TCF4-Gen.
Rechts: Der Ausschnitt zeigt die Variante A/A in homozygotem Zustand.
3.2.1.3. Sequenzanalysen des ARX-Gens
In der vorliegenden Arbeit wurde die DNA aller 13 männlichen Patienten auf Mutationen
und Deletionen im ARX-Gen hin untersucht, da heterozygote Frauen keinen
erkennbaren Phänotyp zeigen. Patienten mit Mutationen und Deletionen im ARX-Gen
zeigen eine große klinische Variabilität. Daher wurden keine besonderen Kriterien für
die Wahrscheinlichkeit für eine ARX-Veränderung ausgearbeitet. Bei den
Untersuchungen mittels PCR und anschließender Sequenzierung zeigte sich keine
Abweichung vom Wildtyp des ARX-Gens.
3.2.1.4. Sequenzanalysen des SLC9A6-Gens
Bislang gibt es nur wenige beschriebene männliche Patienten Veränderungen im
SLC9A6-Gen. Der Phänotyp und seine Variabilität sind bislang noch wenig bekannt.
Den Patienten mit Veränderungen in den anderen untersuchten Genen sind die globale
psychomotorische Entwicklungsretardierung mit Ataxie, eine Mikrozephalie und eine
meist therapieresistente bzw. schwer behandelbare Epilepsie sowie eine fehlende
Sprachentwicklung gemeinsam. Für die Wahrscheinlichkeit für eine SLC9A6-
Veränderung wurden keine besonderen Kriterien ausgearbeitet.
Die 16 kodierenden Exons des SLC9A6-Gens wurden bei 32 Patienten dieser Studie
mittels PCR und Sequenzierung untersucht.
Das Exon 14 ließ sich bei der Patientin 31 mittels PCR nicht amplifizieren.
Im Exon 15 des SLC9A6-Gens des Patienten 23 zeigte sich der bekannte
Einzelnukleotid-Polymorphismus c.1755C>T (rs2307131). Durch den Basenaustausch
entsteht das Codon AGT anstelle von AGC. Es gibt keine Veränderung in der
Ergebnisse
48
Aminosäuresequenz des Proteins, da es sich um eine stille Mutation handelt. In
Abbildung 6 ist der entsprechende Ausschnitt aus dem Chromatogramm dargestellt.
Abbildung 6 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Exons 15 des SLC9A6-Gens
Links: Sequenzausschnitt mit dem homozygoten SNP c.1755C>T bei Patient 23.
Rechts: Der Ausschnitt aus dem Exon 15 des SLC9A6-Gens zeigt die Wildtyp-Sequenz.
Im Exon 1 des SLC9A6-Gens zeigte sich bei der Patientin 14 der Basenaustausch
c.25G>T in heterozygotem Zustand. Die Abbildung 7 zeigt den entsprechenden
Ausschnitt aus dem Chromatogramm.
Abbildung 7 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Exons 1 des SLC9A6-Gens.
Links: Der Sequenzausschnitt der Probe 14 zeigt die Veränderung c.25G>T im Exon 1 des
SLC9A6-Gens.
Mitte: Der Ausschnitt zeigt die Sequenz der Mutter, die ebenfalls die Veränderung c.25G>T im
Exon 1 des SLC9A6-Gens trägt.
Rechts: Der Ausschnitt zeigt die Wildtyp-Sequenz des Vaters im Exon 1 des SLC9A6-Gens.
Der Basenaustausch im Exon 1 führt zu dem Codon TCA anstelle von GCA in der
Wildtypsequenz. Im Protein wird deshalb an der Position 9 die Aminosäure Alanin
durch Serin ersetzt (p.A9S). Um die Relevanz der gefundenen Veränderung beurteilen
zu können, wurde Exon 1 des SLC9A6-Gens bei den Eltern der Patientin sequenziert.
Ergebnisse
49
Bei der Mutter fand sich im Exon 1 des SLC9A6-Gens ebenfalls die Veränderung
c.25G>T(p.A9S). Bei dem Vater zeigte sich im Exon 1 des SLC9A6-Gens keine
Abweichung von der Wildtypsequenz. Außerdem wurden Untersuchungen zur X-
Inaktivierung bei der Patientin und ihrer Mutter durchgeführt. Bei der Patientin zeigte
sich ein Inaktivierungsmuster von 69:31 und bei der Mutter ein X-Inaktivierungsmuster
von 60:40. Sowohl bei der Patientin als auch bei der Mutter zeigte sich keine relevante
Verschiebung des X-Inaktivierungsmusters im Blut.
3.2.2. Ergebnisse der MLPA-Untersuchungen
Im Anschluss an die Sequenzanalysen wurden alle DNA-Proben mit der MLPA-
Methode auf Duplikationen und Deletionen in den Exons der Gene CDKL5, ARX und
TCF4 hin untersucht. Zum Zeitpunkt der Laborarbeit lag kein MLPA-Kit für das
SLC9A6-Gen vor.
Bei den Proben 8, 9 und 33 war die DNA-Qualität für das MLPA-Kit P189-B1 (CDKL5-
und ARX-Gen) nicht ausreichend und es konnte auch nach erneuter Verdünnung der
Stock-DNA kein Ergebnis für diese drei Proben erzielt werden. Bei der Probe 4 lag
dieses Problem ebenfalls bei der Anwendung des MLPA-Kits P075-A1(TCF4-Gen) vor.
Im MLPA-Kit P075-A1 sind neben den Sonden für das TCF4-Gen auch Sonden für das
FOXG1-Gen enthalten. Veränderungen im FOXG1-Gen sind für die kongenitale
Variante des Rett-Syndroms verantwortlich. Bei der Patientin 32 zeigte sich eine
Deletion des FOXG1-Gens. Im Bereich des TCF4-Gens zeigte sich keine Veränderung.
Die Abbildung 8 zeigt den entsprechenden Ausschnitt aus dem Elektropherogramm.
Bei der Mutter und dem Vater zeigten die Untersuchungen ein unauffälliges Ergebnis,
somit liegt bei den Eltern keine Deletion im FOXG1-Gen vor. Damit ist die Deletion bei
der Patientin de novo aufgetreten. Parallel zu den Untersuchungen im Rahmen dieser
Arbeit wurde im Institut für Humangenetik in Kiel bei der Patientin 32 eine Array-CGH-
Analyse durchgeführt, in welcher sich ebenfalls bei der Patientin eine 1,894451 Mb
große Deletion in der Chromosomenregion 14q12 zeigte. Die Deletion enthält das Gen
FOXG1.
Ergebnisse
50
Abbildung 8 Ausschnitt aus dem MLPA-Ergebnisbogen
Oben: Die Sonden für das FOXG1-Gen wurden bei Probe 32 nicht amplifiziert. Die fehlenden
Sonden sind durch die blauen Balken markiert.
Unten links: Bei der Mutter wurden alle Sonden des TCF4-Gens sowie des FOXG1-Gens
amplifiziert.
Unten rechts: Beim Vater der Patientin 32 wurden ebenfalls alle Sonden des TCF4-Gens sowie
des FOXG1-Gens amplifiziert.
Diskussion
51
4. Diskussion
Im Rahmen der Dissertation habe ich mich mit der Frage beschäftigt, wie häufig
Veränderungen in den Genen CDKL5, ARX, TCF4 und SLC9A6 für schwer
behandelbare oder therapieresistente frühkindliche Epilepsien und mentale
Retardierung ursächlich sind. Hierzu untersuchte ich die DNA-Proben von 34 nicht
verwandten Patienten mit frühkindlicher Epilepsie und mentaler Retardierung. Bei einer
Patientin wurde eine in der Literatur bislang nicht beschriebene de novo Mutation im
CDKL5-Gen identifiziert. Bei einer weiteren Patientin wurde mittels MLPA eine Deletion
des Gens FOXG1 identifiziert, die ebenfalls in einer diagnostisch durchgeführten Array-
CGH-Untersuchung nachgewiesen wurde.
4.1. Diskussion des Phänotyps
Die 34 Patienten wurden aus Epilepsiezentren und von Pädiatern aus ganz
Deutschland, sowie aus England und Rumänien in diese Studie aufgenommen. Neben
der Einsendung einer Blutprobe oder bereits extrahierter DNA wurde der im Anhang
enthaltene Fragebogen ausgefüllt. Die Patienten wurden von Ärzten und
Humangenetikern untersucht und beurteilt. Sieben Patienten wurden im Institut für
Humangenetik der Universität Lübeck untersucht und in die Studie aufgenommen.
Die Kriterien für die Aufnahme waren eine frühbeginnende schwer behandelbare oder
therapieresistente Epilepsie und mentale Retardierung unterschiedlicher Ausprägung.
Die Art der Epilepsie wurde nicht näher eingegrenzt. Dadurch entstand eine sowohl
phänotypisch als auch ätiologisch heterogene Kohorte. Weitere Einschränkungen
hätten faziale Dysmorphiezeichen, respiratorische Auffälligkeiten oder
Bewegungsstörungen sein können. Es wurden jedoch bewusst keine weiteren
Einschränkungen für die Aufnahme in die Studie gewählt, um herauszufinden, ob es
weitere Symptome oder Zeichen bei Patienten mit den untersuchten Krankheitsbildern
gibt. Außerdem sollte herausgefunden werden, ob es bislang unbekannte Symptome,
die mit dem Phänotyp assoziiert sind, gibt. Die Patienten, bei denen im Rahmen meiner
Dissertation eine Genveränderung diagnostiziert wurde, zeigen einen Phänotyp, der mit
den neuesten Erkenntnissen der Literatur vereinbar ist.
In der Zusammenschau der Befunde des Fragebogens wird ersichtlich, dass der
Phänotyp vorwiegend neurologisch und weniger dysmorphologisch definiert wurde. Der
Stellenwert der dysmorphologischen Zeichen nimmt bei den untersuchten Patienten
eher eine kleine Rolle ein. Manchmal zeigt sich jedoch aufgrund des hohen
Wiedererkennungswertes ein starker Hinweis auf ein Krankheitsbild.
Diskussion
52
4.2. Diskussion der molekulargenetischen Befunde
In dieser Arbeit wurden die kodierenden Anteile der Gene CDKL5, TCF4 und SLC9A6
bei allen Patienten sowie das ARX-Gen bei allen männlichen Patienten im Hinblick auf
Mutationen, Deletionen und Duplikationen hin untersucht. Um größere exonale
Duplikationen und Deletionen auszuschließen, wurden im Anschluss die
Sequenzierung MLPA-Untersuchungen der Gene CDKL5, ARX und TCF4 durchgeführt.
Für das Gen SLC9A6 stand zum Zeitpunkt der Laborarbeit kein kommerziell
erhältliches MLPA-Kit zur Verfügung.
4.2.1. Molekulargenetische Befunde im CDKL5-Gen
Bei der Untersuchung des CDKL5-Gens konnte im Exon 17 bei insgesamt drei von 29
untersuchten Proben der Einzelnukleotid-Austausch c.2372A>C (p.Q791P), in der
Datenbank dbSNP unter der Nummer rs35478150 geführt wird, identifiziert werden. Der
Einzelnukleotid-Polymorphismus wurde von Tao bereits bei gesunden Kontrollpersonen
in der Literatur beschrieben (Tao et al., 2004) und hat mit hoher Wahrscheinlichkeit
keine klinische Relevanz.
In der japanischen Population wird der Polymorphismus mit einer Häufigkeit von 0,012
für die Variante A/C heterozygot angegeben. Eine Untersuchung im Raum Houston,
Texas, ergab eine Häufigkeit von 0,012 für die Variante A/A homozygot (NCBI db SNP,
2009a). Bislang fehlen Angaben zu großen Populationsstudien in der europäischen
Bevölkerung. Der Polymorphismus liegt in der untersuchten Gruppe häufiger vor als er
in den Populationsstudien ermittelt wurde. Daraus lässt sich schließen, dass das
Kollektiv bezüglich des genetischen Hintergrundes verschieden ist. Am ehesten ist dies
mit der geringen Fallzahl sowie der europäischen Population zu begründen.
Bei Patient 9 ließ sich das Exon 14 im CDKL5-Gen mittels PCR nicht amplifizieren. Mit
der MLPA-Untersuchung konnte aufgrund der mangelhaften DNA-Qualität kein
Untersuchungsergebnis und damit eine Kontrolle des Befundes erzielt werden. Leider
war es nicht möglich, eine neue Blutprobe des Patienten zu erhalten.
Es gibt zwei mögliche Ursachen für die nicht mögliche Amplifikation des Exons 14 bei
Patient 9. Die erste Möglichkeit besteht in einer hemizygoten Deletion des Exon 14 im
CDKL5-Gen. Diese Vermutung ließe sich mittels der MLPA-Methode bestätigen. Dann
wären alle Sonden für das Exon 14 des CDKL5-Gens deletiert. Leider stand uns keine
neue Blutprobe zur Verfügung, um diese Hypothese zu bestätigen.
Andererseits könnte eine Sequenzvariation im Bereich der Primerbindungsstelle
vorliegen. Somit könnte der PCR-Primer nicht binden und es entstünde kein PCR-
Produkt. Würde hingegen ein anderer Primer mit einer anderen Bindungsstelle
Diskussion
53
verwendet werden, wäre ermittelbar, ob dann ein PCR-Produkt entsteht. Auch diese
Möglichkeit ließe sich mittels MLPA-Methode bestätigen. Exon 14 würde dargestellt
werden, da die Sonden für das Exon 14 anders als für die Primer für die PCR liegen.
Aus den Vorbefunden des Patienten 9 geht hervor, dass bei ihm zum Zeitpunkt der
Datenerhebung eine seit dem zweiten Lebensjahr bestehende unter Valproat
kontrollierte myoklonische Epilepsie mit einzelnen fiebergebundenen Anfällen und eine
moderate mentale Retardierung besteht. Bei der Mutter besteht eine juvenile
myoklonische Epilepsie und zwei Cousinen mütterlicherseits sowie ein Kind einer der
Cousinen sind ebenfalls an Epilepsie erkrankt.
Typische Merkmale von Patienten mit pathogenen Veränderungen im CDKL5-Gen sind
jedoch die früh, meist vor dem sechstem Lebensmonat beginnende Epilepsie, die sich
zu einer komplexen überwiegend therapieresistenten epileptischen Enzephalopathie
entwickelt, Bewegungsstörungen, eine schwere geistige Behinderung, Hypotonie und
stereotype Handbewegungen (Evans et al., 2005, Pintaudi et al., 2008, Russo et al.,
2009, Tao et al., 2004, Weaving et al., 2004). Der Phänotyp von Patienten 9 ist mit
einer pathogenen Veränderung im CDKL5-Gen wenig vereinbar und eine Veränderung
im CDKL5-Gen als Ursache für das klinische Bild des Patienten ist eher als
unwahrscheinlich anzunehmen.
Bei Patientin 35 zeigte sich in der Sequenzanalyse des CDKL5-Gens der heterozygote
Austausch eines Basenpaares im Intron 16, ein Basenpaar entfernt von Exon 17.
Bislang wurde diese Veränderung nicht in der Literatur beschrieben. Jedoch wurden
bereits sehr ähnliche Sequenzvariationen als sogenannte Splice-Site-Mutationen im
CDKL5-Gen nachgewiesen (Weaving et al., 2004; Evans et al., 2005; Archer et al.,
2006). Die in der Literatur beschriebenen Veränderungen liegen wie die bei Patientin
35 identifizierte Veränderung jeweils ein Basenpaar vor Beginn eines Exons des
CDKL5-Gens. Das Onlineprogramm "Mutation T@ster" klassifiziert diese Veränderung
als mutmaßlich pathologisch aufgrund der Veränderung innerhalb der Splice-Site, die
wahrscheinlich zu einem cdkl5-Protein führt, in welchem das Exon 17 fehlt,
(http://www.mutationtaster.org/).
In der Zusammenschau mit dem klinischen Phänotyp (siehe 3.2.1.1) und den
erhobenen unauffälligen Befunden bei den Eltern der Patientin ist davon auszugehen,
dass es sich bei der Veränderung IVS17-1G>A (c.2277-1G>A) im CDKL5-Gen um eine
pathogene Mutation handelt, welche bei der Patientin 35 de novo entstanden ist und als
Ursache für ihre Symptomatik anzusehen ist.
Wie bei vielen Patienten, von denen in der Literatur berichtet wurde, wurde bei der
Patientin 35 zunächst ein Rett-Syndrom ausgeschlossen und hinsichtlich des
Angelman-Syndroms kein pathologischer Befund erhoben. Die Patientin zeigt mit der
Diskussion
54
frühbeginnenden therapieresistenten Epilepsie, der schweren psychomotorischen
Retardierung, einer muskulären Hypotonie, stereotypen Handbewegungen, keinerlei
Sprachentwicklung und einer Gangataxie die typischen Symptome von Patienten mit
CDKL5-Mutationen (Evans et al., 2005, Pintaudi et al., 2008, Russo et al., 2009, Tao et
al., 2004, Weaving et al., 2004). Castrén et al. zeigten, dass Patienten mit CDKL5-
Mutationen eine in den ersten sechs Lebensmonaten beginnende Epilepsie aufweisen
wie es bei Patientin 35 zutrifft. Dies unterscheidet sie von Patienten mit einem durch
MECP2-Mutationen verursachten Rett-Syndrom (Castrén et al., 2011).
Bei einigen Patienten mit CDKL5-Mutationen wurden wie bei unserer Patientin
Veränderungen im Schädel-MRT beschrieben (Córdova-Fletes et al., 2010, Liang et al.,
2011). Andere Autoren beschreiben, dass Patienten mit CDKL5-Mutationen keine
Veränderungen im MRT des Schädels aufweisen (Archer et al., 2006, Artuso et al.,
2010 Erez et al., 2009). Bei Patientin 35 besteht aufgrund der MRT-Befunde der
Verdacht auf eine fokale kortikale Dysplasie links.
Die Beschreibungen des elektroklinischen Bildes von Patienten mit pathogenen
Veränderungen im CDKL5-Gen sind in der Literatur vielfältig. Sie umfassen infantile
Spasmen (Kalscheuer et al., 2003), eine myoklonische Enzephalopathie (Buoni et al.,
2006) und eine in drei Stadien verlaufende Enzephalopathie (Bahi-Buisson et al.,
2008b). Die Patientin entwickelte im dritten Lebensmonat eine Epilepsie mit
unterschiedlichen fokalen Anfällen tonischer und klonischer sowie generalisiert tonisch-
klonischer Symptomatik. Von einem ähnlichen Bild berichten Melani et al., die
elektroklinische Befunde im ersten Lebensjahr von Patienten mit CDKL5-Mutationen
untersucht haben (Melani et al., 2011). Das Langzeit-EEG der Patientin 35 zeigte im
Alter von 3 ½ Jahren eine generalisierte und links frontal bzw. links zentral
intermittierende Verlangsamung, multifokale epilepsietypische Potentiale in Form von
Sharp-Waves und Polyspikes.
Im Alter von vier Jahren zeigt sich bei ihr ein Bild aus infantilen Spasmen, Absencen,
tonische Anfälle mit Nickbewegungen des Kopfes sowie längere tonische Anfälle. Das
interiktale EEG der Patientin 35 zeigt im Alter von 4 Jahren eher generalisierte
Auffälligkeiten bei häufigen infantilen Spasmen. Ein klares Bild mit drei Phasen in der
Entwicklung der epileptischen Enzephalopathie ist bei der Patientin bislang nicht
beschrieben.
Bahi-Buisson et al. beschrieben zwölf Patienten mit initial normaler Hintergrundaktiviät
und sich im Alter von sechs Monaten bis drei Jahren anschließender Verschlechterung
im EEG (Bahi-Buisson et al., 2008b.)
Liang et al. identifizierten bei 5% der männlichen und 14% der weiblichen Patienten mit
epileptischer Enzephalopathie pathogene Veränderungen im CDKL5-Gen (Liang et al.,
Diskussion
55
2011). Die Patienten dieser Studie wurden wie bei Liang et al. aufgrund ihrer
epileptischen Enzephalopathie bestehend aus therapieresistenter oder schwer
behandelbarer Epilepsie und moderater bis schwerer Entwicklungsverzögerung
untersucht.
4.2.2. Molekulargenetische Befunde im TCF4-Gen
Bislang wurden über 100 pathogene TCF4- Veränderungen in der Literatur mit
beschrieben, es sind jedoch keine genauen Daten zur Prävalenz oder Inzidenz
vorhanden. Rosenfeld et al. untersuchten während einer 17-monatigen Untersuchung
13186 Proben von Patienten mit geistiger Behinderung mittels Array-CGH und konnten
insgesamt sieben Personen identifizieren, die eine Deletion, welche das TCF4-Gen
einschloss, trugen. Davon ausgehend schätzen die Autoren die Häufigkeit des Pitt-
Hopkins-Syndroms für den US-Bundesstaat Washington auf 1:34000-1:41000
(Rosenfeld et al., 2009).
Bei der Untersuchung des TCF4-Gens wurde in dieser Studie bei 20/34 Patienten
(59%) im Exon 19 der Einzelnukleotid-Austausch c.2226A>G (rs8766) nachgewiesen.
18% der Patienten haben die Variante G/G homozygot und 41% haben die Variante
A/G heterozygot.
Angaben zur Häufigkeit in der europäischen Population des SNPs fehlen bislang. In
einer gemischten afroamerikanischen-kaukasischen Population wird der
Polymorphismus mit einer Häufigkeit von 0,133 für die homozygote Variante A/A
angeben, die heterozygote Variante A/G hat eine Häufigkeit von 0,469. Der
Polymorphismus ist damit in der im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Gruppe in der
heterozygoten Variante A/G etwas seltener als in der gemischten Population. Allerdings
liegen Daten zu mehreren Populationen vor, in denen die Varianten in unterschiedlicher
Verteilung vorkommen. Die Populationen sind jedoch nicht näher beschrieben (NCBI db
SNP, 2009b). Der Einzelnukleotid-Polymorphismus wurde 2007 von Brockschmidt et al.
bei einer Patientin mit einer 0,5 Mb umfassenden Mikrodeletion auf Chromosom
18q21.2, welche das 5„-Ende des TCF4-Gens umfasste, in heterozygoter Form
nachgewiesen. Bei den gesunden Eltern lag die heterozygote Variante A/G
beziehungsweise die homozygote Variante A/A vor (Brockschmidt et al., 2007). Die
Veränderung hat keine klinische Relevanz, da es sich um eine stille Mutation handelt
und sie in der gesunden Kontrollpopulation vorkommt.
Zwei Patienten (Patient 2 und 4) dieser Gruppe erfüllten die von Zweier et al.
definierten Kriterien für das Pitt-Hopkins-Syndrom-Screening. Wenigstens zwei der drei
folgenden Auffälligkeiten sollten zutreffen: schwere mentale Retardierung,
Auffälligkeiten bei der Atmung sowie die für ein Pitt-Hopkins-Syndrom typischen
Diskussion
56
fazialen Dysmorphiezeichen (Zweier et al., 2007). Bei beiden Patienten wurden die
häufigen Ursachen für das klinische Erscheinungsbild ausgeschlossen, eine pathogene
TCF4-Veränderung tragen beide ebenfalls nicht. Dies stützt die Aussage von
Kalscheuer et al. (Kalscheuer et al., 2008). Die Autoren nehmen an, dass TCF4-
Mutationen in einem weitaus variableren Phänotyp resultieren als bis heute bekannt ist.
Die Variabiliät erkläre sich in der zugrunde liegenden Veränderung des TCF4-Gens und
des resultierenden Proteins. Bei einem zumindest teilweise funktionellen Protein treten
weniger schwere Auswirkungen auf den Phänotyp auf.
Zudem wurden kürzlich homozygote sowie compound-heterozygote Veränderungen in
den Genen CNTNAP2 und NRXN1 als mögliche Ursache für eine dem Pitt-Hopkins-
Syndrom ähnelnde schwere Entwicklungsverzögerung mit früh beginnender Epilepsie
identifiziert (Strauss et al., 2006; Jackman et al., 2009; Zweier et al., 2009), die
autosomal rezessiv vererbt wird.
4.2.3. Molekulargenetische Befunde im SLC9A6-Gen
Mutationen im SLC9A6-Gen wurden bislang nur bei männlichen Patienten beschrieben.
Dabei sind Frauen gesunde Anlageträgerinnen oder sie haben Lernschwierigkeiten und
Verhaltensauffälligkeiten (Christianson et al., 1999; Gilfillan et al., 2008). Angaben über
die Häufigkeit von Patienten mit Mutationen im SLC9A6-Gen bei Patienten mit
Epilepsie gibt es bislang nicht. Fichou identifizierte einen männlichen Patienten mit der
Variante c.25G>T und dem daraus resultierenden Aminosäuretausch Alanin zu Serin
im Protein (Fichou et al., 2009). Bei Alanin an der Position 9 des Proteins handelt es
sich um eine höchst konservierte Aminosäure bei Säugern, was für die wichtige Rolle in
der Proteinfunktion spricht (Fichou et al., 2009).
Die bei der Patientin 14 im Exon 1 des SLC9A6-Gens gefundene maternal vererbte
Missense-Veränderung c.25G>T führt zum Aminosäureaustausch p.A9S im gebildeten
Protein. Das Vorhersageprogramm "Mutation T@ster" nimmt keine Beeinträchtigung
der Proteinfunktion an und die Veränderung wird als Polymorphismus eingestuft.
Um die Relevanz der gefundenen Veränderung bei der Patientin 14 im SLC9A6-Gen
weiter abzuklären, wurde zunächst das Exon 1 bei den Eltern der Patientin sequenziert,
wobei sich bei der gesunden Mutter ebenfalls die Veränderung c.25.G>T(p.A9S) fand.
In seltenen Fällen kann es vorkommen, dass Veränderungen auf dem X-Chromosom,
die üblicherweise nicht zu einer klinischen Symptomatik bei Frauen führen, eine
klinische Bedeutung bekommen. Dies geschieht im Falle eines verschobenen X-
Inaktivierungsmusters. Sowohl bei der Patientin als auch bei der Mutter zeigte sich
keine relevante Verschiebung des X-Inaktivierungsmusters im Blut.
Diskussion
57
Nach der Synopse der erhobenen Befunde im SLC9A6-Gen sowie der Untersuchung
des X-Inaktivierungsmusters ist davon auszugehen, dass es sich bei der Veränderung
c.25G>T im SLC9A6-Gen um einen Polymorphismus handelt, der für die Symptomatik
der Patientin nicht ursächlich ist.
Bei der Patientin 31 ließ sich das Exon 14 im SLC9A6-Gen mittels PCR nicht
amplifizieren. Eine homozygote Deletion des Exons 14 ist als höchst unwahrscheinlich
anzunehmen. Homozygote Deletionen im SLC9A6-Gen wurden in der Literatur bislang
nicht beschrieben. Um der Ursache für diesen Befund auf den Grund zu gehen, könnte
man theoretisch eine quantitative PCR-Untersuchung oder eine hochauflösende Array-
CGH-Untersuchung durchführen. Eine Alternative wäre das Design anderer Primer für
Exon 14 bzw. für den Intron-Exon Übergang, um Veränderungen in der
Primerbindungsstelle auszuschließen. Leider war es im Rahmen der Arbeit nicht
möglich, diesen Fragen nachzugehen.
4.3. Diskussion der Methoden
In dieser Arbeit habe ich mehrere molekulargenetische Untersuchungsmethoden wie
PCR mit anschließender Sequenzierung sowie Sequenzanalyse und MLPA angewandt.
Die DNA-Sequenzierung erfasst Mutationen in den untersuchten Genabschnitten, sie
umfasst jedoch keine quantitative Beurteilung des Genmaterials und damit keine
Duplikationen oder Deletionen in heterozygotem Zustand. Im Anschluss wurden die
MLPA-Untersuchungen durchgeführt, bei der es sich um eine Methode zur relativen,
quantitativen Darstellung von bis zu 50 Nukleinsäurefragmenten in nur einem Ansatz
handelt. Mit ihr werden Duplikationen, Deletionen und heterozygot vorliegende
Punktmutationen erfasst. Bei der PCR mit anschließender Sequenzierung und MLPA
handelt sich generell um gut etablierte und verlässliche Methoden, die lange
Anwendung in der Praxis finden.
Mögliche Mutationen in regulatorischen Elementen der Gene wurden nicht untersucht
und können daher nicht ausgeschlossen werden. Außerdem wurden die 5„-und 3„-
untranslatierten Regionen (UTR) nicht auf Veränderungen gescreent.
Eine alternative Herangehensweise zur Identifikation von Deletionen ganzer Exons
oder Gene wäre die quantitative PCR von jedem Exon oder die Array-CGH-Methode.
Als problematisch gestaltete sich die Anfälligkeit der MLPA-Methode für
Verunreinigungen. Die zu untersuchende DNA wurde teilweise im hiesigen Institut für
Humangenetik aus Vollblut extrahiert, teilweise wurde die bereits extrahierte DNA
eingesendet. In den verschiedenen Einsende-Laboren werden unterschiedliche
Reagenzien zur Extraktion der DNA verwendet. Gerade bei in externen Laboren
Diskussion
58
extrahierter DNA gestaltete sich die Durchführung der MLPA-Methode als schwierig
und führte dazu, dass es teilweise leider nicht möglich war, Befunde zu erheben.
Bei etwa 80-90% der klinisch diagnostizierten, komplexen durch genetische
Veränderungen verursachten Krankheiten wird heute die zugrunde liegende Gen-
Variation nicht gefunden, da im Rahmen der bislang üblichen „Gen-für-Gen“-
Sequenzierung nach Sanger wegen der hohen Kosten und des großen Zeitaufwandes
häufig nur wenige Gene untersucht werden können.
Die Methode der üblichen „Gen-für-Gen“-Sequenzierung nach Sanger stößt an
Kapazitätsgrenzen bei einer Syntheselänge von über 1000-1200 bp nach dem
spezifischen Primer. Im Rahmen des Humanen Genom Projektes wurde die
sogenannte „Shot-Gun“-Sequenzierung entwickelt, mit der es möglich ist, längere
Fragmente zu sequenzieren (Venter et al., 2003). Das Prinzip der „Parallel“-
Sequenzierung, welches bei der „Shot-Gun“-Sequenzierung angewandt wird, gilt auch
bei der Hochdurchsatz-Sequenzierung („Next Generation Sequencing“), die in jüngster
Zeit entwickelt wurde. Sie ermöglicht die gleichzeitige Sequenzierung aller kodierenden
Sequenzen der menschlichen Gene innerhalb von nur sieben Tagen, was auch als
Exom-Sequenzierung bezeichnet wird. (Biskup, 2010).
Zur Diagnostik von Erkrankungen, die Veränderungen in unterschiedlichen Gene
ausweisen, bietet sich die gleichzeitige Sequenzierung mehrerer für diese Krankheit in
Betracht kommender Gene an. Dazu werden im Rahmen der Hochdurchsatz-
Sequenzierung Diagnostik-Panels genutzt, mit denen sämtliche für eine Krankheit in
Frage kommenden Gene zugleich auf einer Sequenzierplattform gezielt sequenziert
und anschließend ausgewertet werden (Zhang et al., 2011). So gibt es inzwischen
bereits ein Diagnostik-Panel zur Identifikation genetischer Ursachen von Epilepsie
(Biskup, 2010) und mentaler Retardierung. Diese Technik stand bei Beginn meiner
Dissertation noch nicht zur Verfügung. Sie bietet sich für die Patienten dieser Studie an,
da es sich um eine unspezifische heterogene Gruppe handelt.
Für die „Whole-Exome“- und „Whole-Genome“-Sequenzierung ist jedoch zu bedenken,
dass durch die noch schnellere Hochdurchsatz-Sequenzierung auch neue, bis jetzt
nicht zu beantwortende Fragen aufkommen können. Dazu gehören die
Sequenzvariationen, die gefunden werden, deren Bedeutungen bislang nicht bekannt
sind sowie belastende Zufallsbefunde mit schwerwiegenden Konsequenzen für
Patienten und ihre Angehörigen. Es besteht ebenso die Möglichkeit, dass trotz der
Hochdurchsatz-Sequenzierung vieler Gene die Ursache für die Erkrankung nicht
gefunden wird.
Mittlerweile etabliert sich das „Next Generation Sequencing“ auch in der Praxis zur
Sequenzierung neuer Gene sowie genomweiter Resequenzierungs- oder
Diskussion
59
Methylierungs-Analysen. Deshalb weckt diese neue Methode Hoffnung auf höhere
Aufklärungsquoten genetisch bedingter Erkrankungen und ist zudem auf eine
effizientere, kostengünstigere und schnellere Art und Weise als bislang möglich. Die
Wahrscheinlichkeit, dass die genetische Ursache von Epilepsien mit Hilfe dieser
Methoden gefunden wird, erhöht sich dadurch deutlich.
4.4. Diskussion der auffälligen Befunde der Array-CGH-Analysen in den
Vorbefunden
Bei drei Patienten lagen auffällige Array-CGH-Analysen aus Untersuchungen in
auswärtigen Laboren vor. Bei Patient 5 und seiner phänotypisch gesunden Mutter ist
ein Abschnitt von etwa 74kb auf dem Chromosom 10 deletiert. In diesem Abschnitt ist
das PCDH15-Gen enthalten. Veränderungen des Gens sind mit der autosomal-
rezessiven Form des Usher-Syndroms Typ I assoziiert. Das Usher-Syndrom geht mit
einer früh einsetzenden Innenohrschwerhörigkeit und einem später einsetzenden
Verlust des Sichtfeldes einher. Damit ist der Befund aus der Array-CGH-Untersuchung
nicht ursächlich für das klinische Erscheinungsbild des Patienten, bei dem eine
myoklonische Epilepsie seit dem zweiten Lebensjahr, eine schwere mentale
Retardierung, häufige Lachanfälle und der Verlust erworbener Fähigkeiten im
Vordergrund stehen.
Bei Patientin 8 wurde mit der Array-CGH-Untersuchung eine etwa 130kb große
Deletion auf dem X-Chromosom nachgewiesen. Ob die Veränderung bei dem Vater
oder der Mutter des Patienten ebenfalls vorliegt, ist nicht bekannt. In dem deletierten
Bereich liegt das Gen KIAA2022. Cantagrel et al. beschreiben zwei miteinander
verwandte männliche Patienten mit einer Inversion auf die X-Chromosom, bei denen
sich einer der beiden Bruchpunkte innerhalb des KIAA2022-Gens befindet. Neben
anderen Auffälligkeiten zeigten die beiden Patienten eine Entwicklungsverzögerung,
infantilen Autismus, eine schwere mentale Retardierung sowie eine fehlende
Sprachentwicklung. Die Konduktorinnen dieser familiären Inversion werden als klinisch
unauffällig beschrieben (Cantagrel et al., 2004). Dass ein Zusammenhang dieser
Deletion und der klinischen Symptomatik der Patientin besteht, ist zum jetzigen
Zeitpunkt als unwahrscheinlich anzunehmen.
4.5. Weitere Differentialdiagnosen
Bei 2 von 34 untersuchten Patientinnen und Patienten mit einer schwer behandelbaren
oder therapieresistenten Epilepsie und mentaler Retardierung konnte die zugrunde
liegende genetische Ursache im Rahmen meiner Arbeit gefunden werden.
Diskussion
60
Viele der Gene, deren Veränderung zu den in dieser Arbeit beschriebenen
Krankheitsbildern führen, sind bislang nicht bekannt. Zudem gibt es viele Gene, die
oder deren Produkte miteinander agieren.
Pathogene Veränderungen bzw. Deletionen des FOXG1-Gens sind für die kongenitale
Variante des Rett-Syndroms verantwortlich (Ariani et al., 2008; Bahi-Buisson et al.,
2010; Le Guen et al., 2011; Kortüm et al., 2011).
Zum klinischen Erscheinungsbild gehören laut Kortüm et al. postnatale
Wachstumsverzögerung mit Mikrozephalie, eine schwere geistige Behinderung mit
verzögerte oder ausbleibender Sprachentwicklung, Defiziten im Sozialverhalten,
Bewegungsstörungen wie Stereotypien und Dyskinesien, Epilepsie, Schlafstörungen,
Episoden mit häufigem Weinen, wiederholte Aspirationen sowie ein gastro-
ösophagealer Reflux. Die Untersuchung des FOXG1-Gens bietet sich bei Patienten mit
mentaler Retardierung, erworbener Mikrozephalie, frontaler Pachygyrie oder
Hypoplasie des Corpus Callosum (Kortüm et al., 2011) sowie nach Ausschluss von
Veränderungen im MECP2-Gen und im CDKL5-Gen an (Philippe et al., 2010). Die
EEG-Ableitungen zeigen ein multifokales Muster mit „spikes“ und „sharp waves“ mit
gelegentlicher paroxysmaler Aktivität (Ariani et al., 2008). Der klinische Phänotyp
überschneidet sich teilweise mit dem des Angelman-Syndroms, des Rett-Syndroms,
des Pitt-Hopkins-Syndroms und den SLC9A6-assoziierten Syndromen. Dennoch
unterscheidet sich die Symptomatik durch Dyskinesien, Auffälligkeiten im MRT und
darin, dass es keine Rückschritte in der Entwicklung sowie keine respiratorischen
Arrhythmien gibt, vom Rett-Syndrom (Kortüm et al., 2011; Le Guen et al., 2011). Die
Tatsache, dass bei einer der Patientinnen während der Untersuchungen für die
vorliegende Arbeit die Deletion des FOXG1-Gens mittels Array-CGH-Analyse
identifiziert wurde und durch MLPA bestätigt wurde, zeigt, dass Veränderungen im
FOXG1-Gen bzw. Deletionen des Gens bei männlichen und weiblichen Patienten mit
den charakteristischen Merkmalen auf jeden Fall differentialdiagnostisch in Betracht
kommen.
Unlängst wurde die Haploinsuffizienz des MEF2C-Gens (Le Meur et al., 2010) durch
Deletion als Ursache für ein ähnliches Krankheitsbild mit schwerer mentaler
Retardierung, Fehlen der expressiven Sprache, muskuläre Hypotonie, stereotypen
Handbewegungen, kraniofazialen Dysmorphiezeichen und einer Epilepsie identifiziert.
MEF2C kodiert für ein Protein, welches in der Neurogenese eine wichtige Rolle der
Regulation der exzitatorischen Synapsen einnimmt (Barbosa et al., 2008). Im Rahmen
einer weiteren Dissertation, die im Institut für Humangenetik Lübeck verfasst wurde,
wurde die DNA der Patienten dieser Studie mittels Sequenzierung und MLPA auf
Diskussion
61
Veränderungen im MEF2C-Gen hin untersucht. In dieser Kohorte fand sich keine
Veränderung im MEF2C-Gen.
Wie bereits in Abschnitt 4.2., der Diskussion der molekulargenetischen Befunde,
erwähnt, wurden homozygote bzw. heterozygote Veränderungen der Gene CNTNAP2
sowie NRXN1 als Ursache für das Pitt-Hopkins-like Syndrom 1 bzw 2 identifiziert
(Gregor et al., 2011). Im Gegensatz zum Pitt-Hopkins-Syndrom liegen keine
charakteristischen fazialen Dysmorphiezeichen vor. Die Patienten sind meist schwer
geistig behindert und haben in der Regel eine eingeschränkte Sprachentwicklung.
Ebenso werden bei zwei Patienten mit heterozygoten Defekten des CNTNAP2-Gens
Verlust der Sprache und der Rückschritte der motorischen Entwicklung mit Beginn der
Epilepsie beschrieben (Gregor et al., 2011). Es besteht eine Diskrepanz zwischen der
schweren Sprachentwicklungsstörung und der relativ milden Verzögerung der
motorischen Entwicklung im Vergleich zu Patienten mit klassischem Pitt-Hopkins-
Syndromen oder auch Patienten mit Veränderungen im CDKL5-Gen. Bei allen
Patienten mit heterozygoten CNTNAP2- Veränderungen besteht eine früh beginnende
Epilepsie (Strauss et al., 2006; Jackman et al., 2009; Zweier et al., 2009). Im Vergleich
zu Patienten mit Veränderungen der im Rahmen dieser untersuchten Arbeit haben die
Patienten keine Mikrozephalie, sondern sind in Relation zum Gesamtkörpermaß eher
makrozephal (Strauss et al., 2006). Dieser Aspekt stellt somit einen wichtigen
differentialdiagnostischen Faktor dar. Ebenso sind Auffälligkeiten in der Atmung, fokale
zerebrale Malformationen sowie Verhaltensauffälligkeiten wie autistische Züge und
stereotype Bewegungen beschrieben.
Eine weitere Differentialdiagnose ist das durch pathogene Veränderungen im ZEB2-
Gen verursachte Mowat-Wilson-Syndrom, welches Gemeinsamkeiten mit dem Pitt-
Hopkins-Syndrom aufweist. Dazu gehören schwere mentale Retardierung und ähnliche
charakteristische Gesichtszüge. Variable Symptome sind Corpus-Callosum-Agenesie,
Epilepsie, angeborene Herzfehler, Mikrozephalie, Kleinwuchs, Hypotonie und Morbus
Hirschsprung (Garavelli und Mainardi, 2007).
Eine wichtige Rolle nimmt außerdem die Array-CGH-Analyse als Screeningmethode
ein. Bei 20/34 der Patienten wurde im Vorfeld bzw. während der Studie eine Array-
CGH-Analyse durchgeführt. Mittels Array-CGH-Analyse werden häufig Veränderungen
gefunden, die bislang nicht als für ein Erkrankungsbild ursächlich beschrieben wurden.
In den deletierten oder duplizierten Regionen sind meist so viele Gene enthalten, dass
ein Zusammenhang der Veränderung mit den Symptomen wahrscheinlich ist. So findet
sich bei Kindern mit mentaler Retardierung und unauffälliger konventioneller
Chromosomenanalyse in etwa 10% eine Mikroaberration, die den Phänotyp erklärt
(Sagoo et al., 2009). Mittels Array-CGH-Untersuchungen wurden Kandidatengene
Diskussion
62
identifiziert, deren Veränderung ein ähnliches Krankheitsbild verursachen wie
Mutationen in den Genen CDKL5, ARX, TCF4 und SLC9A6.
4.6. Ausblick
Betrachtet man diese Studie rückblickend, so fällt auf, dass die Kohorte mit 34
Patienten zu anderen großen Untersuchungen in diesem Bereich im Vergleich recht
klein ist. Aus Kapazitätsgründen war es jedoch nicht möglich, eine größere Gruppe zu
untersuchen. Es ist denkbar, dass mehr ursächliche Mutationen in einer nach
strengeren Kriterien definierten Kohorte gefunden worden wären. Darauf wurde
bewusst verzichtet, um herauszufinden, ob die in der Literatur beschriebenen
Phänotypen variabler sind als bisher angenommen. Dazu ist eine Kohorte notwendig,
für die die Einschlusskriterien nicht so strikt gehalten sind, bislang nicht bekannte
Merkmale der Krankheitsbilder zu identifizieren.
Epilepsie ist ein häufiges Krankheitsbild in der humangenetischen Sprechstunde und
für mehr als die Hälfte der Epilepsien wurde bereits eine genetische Ursache gefunden
(Pal et al., 2010). Dennoch sollte bedacht werden, dass die genetischen Ursachen für
Epilepsie sehr heterogen und vielfältig sind. Während der experimentellen Phase
meiner Dissertation erhöhte sich die Zahl der Gene, deren Veränderungen eine
Epilepsie verursachen, beträchtlich. Die Einführung des „Next-Generation-Sequencing“
wird in nächster Zeit zu deutlich höheren Aufklärungsquoten beitragen.
Zudem ist davon auszugehen, dass viele weitere Gene in nächster Zeit identifiziert
werden, die im Zusammenhang mit Epilepsie und geistiger Behinderung stehen.
Bei dieser Kohorte würden sich Untersuchungen mit einem sogenannten „Epilepsie-
Panel“ mittels „Next-Generation-Sequencing“ geradezu anbieten, da es sich um eine
unspezifische heterogene Gruppe handelt.
Zusammenfassung
63
5. Zusammenfassung
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Häufigkeit von Mutationen, Deletionen und
Duplikationen in den Genen CDKL5, ARX, TCF4 und SLC9A6 bei Patienten mit
frühbeginnender Epilepsie und mentaler Retardierung zu untersuchen. Zudem sollte
nach Möglichkeit das klinische Erscheinungsbild von Patienten mit Veränderungen in
den untersuchten Genen genauer definiert werden.
Grundlage der Untersuchungen waren DNA-Proben von 34 Patienten mit Epilepsie und
mentaler Retardierung. Die Patienten zeigten neben der frühbeginnenden Epilepsie
und der mentalen Retardierung verschiedene Auffälligkeiten. Viele der Patienten hatten
eine muskuläre Hypotonie, Fütterungsprobleme in der Säuglingszeit und entwickelten
später Bewegungsstörungen wie Ataxie und Dyskinesien und stereotype
Handbewegungen. Die Epilepsie war meist schwer behandelbar bzw. therapieresistent.
Die EEGs waren überwiegend hochgradig pathologisch und wiesen auf ein
übergeordnetes Krankheitsbild hin. Die kranialen MRTs zeigten sich ebenfalls zu einem
Großteil auffällig, wenn auch unspezifischer.
Die klinischen, radiologischen und genetischen Vorbefunde der Patienten wurden im
Rahmen dieser Arbeit ausgewertet und bewertend zusammengefasst. Anschließend
wurden die DNA-Proben der Patienten mittels Sanger-Sequenzierung und MLPA auf
Mutationen, Deletionen und Duplikationen in den Genen CDKL5, ARX, TCF4 und hin
untersucht. Die kodierenden Abschnitte des SLC9A6-Gens wurden bei allen Proben nur
mittels Sanger-Sequenzierung analysiert.
In dieser Studie wurde bei einer Patientin eine pathogene Mutation im CDKL5-Gen
gefunden. Durch die MLPA-Untersuchung wurde bei einer weiteren Patientin eine
Deletion des FOXG1-Gens identifiziert. Beide Phänotypen der Patienten sind mit den in
der Literatur beschriebenen Phänotypen vereinbar.
Anhand der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit ist zu betonen, dass bei der
Untersuchung von DNA auf Veränderungen in den oben genannten Genen darauf
geachtet werden sollte, dass häufige Ursachen für eine schwere mentale Retardierung
und eine frühbeginnende Epilepsie im Vorfeld ausgeschlossen werden sollten. Dazu
gehören das Rett-Syndrom sowie das Angelman-Syndrom.
Veränderungen in den analysierten Genen stellen insgesamt eine seltene Ursache für
frühbeginnende Ursache für Epilepsie und mentale Retardierung dar.
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Anhänge
74
7. Anhänge
7.1. Informationsblatt zur Studie
INFORMATIONSBLATT
für Eltern zum Forschungsprojekt
„Molekulargenetische Ursachen von mentaler Retardierung mit Epilepsie“
Sehr geehrte Eltern,
bei Ihrem Kind bestehen eine geistige Behinderung und eine Epilepsie. Trotz
umfangreicher Diagnostik wurde die Ursache dieser Symptomatik bislang nicht
gefunden. In jüngster Zeit wurden einige neue Gene gefunden, deren Veränderungen
eine geistige Behinderung und eine Epilepsie verursachen. Es handelt sich um die
Gene SLC9A6, FOXG1, TCF4, ARX und CDKL5. Im Rahmen der hier aufgeführten
Studie werden wir bei Patienten mit geistiger Behinderung und Epilepsie ungeklärter
Ursache eines oder mehrere der o.g. Gene auf Veränderungen hin untersuchen. Dabei
ist es möglich, dass bei einem Teil dieser Patienten eine Genveränderung gefunden
wird und somit ein besseres Verständnis für das jeweilige Krankheitsbild möglich ist.
Wir würden uns freuen, wenn Sie durch die molekulargenetische Analyse einer DNA-
Probe von Ihrem Kind und ggf. von Ihnen zur Durchführung dieser Studie beitragen
würden. Bevor Sie sich entscheiden, an diesem Forschungsprojekt teilzunehmen,
sollten Sie dieses Informationsblatt aufmerksam lesen und eventuell verbleibende
Fragen mit Ihrem Arzt in Ruhe besprechen.
Für die Studie werden lediglich Blutproben (ca. 5-10 ml Blut) von Ihrem Kind und ggf.
von Ihnen benötigt. Das Risiko einer Blutentnahme ist aus medizinischer Sicht gering.
Gelegentlich kann es zu einem Hämatom (blauer Fleck), zu einer Thrombophlebitis
(oberflächliche Venenentzündung) oder ganz selten zu einer Nervenverletzung
kommen. Die bei Ihnen und Ihrem Kind entnommenen Proben werden kodiert, so dass
für die beteiligten Wissenschaftler im Labor keine Rückschlüsse auf die Person möglich
sind (sogenannte Pseudonymisierung). Die Kodierung und Lagerung der Proben
erfolgen am Institut für Humangenetik. Es ist eine Befristung der Nutzung sowohl der
Proben als auch der daraus gewonnenen Daten auf 25 Jahre vorgesehen.
Neben der Asservierung (Lagerung) und Untersuchung der DNA-Proben ist auch eine
möglichst detaillierte Erfassung klinischer Daten Ihres Kindes (einschließlich
fotographischer Aufnahmen in einzelnen Fällen) vorgesehen.
Anhänge
75
Sollten weitere Personen aus Ihrer Familie betroffen sein, würden wir gerne Kontakt zu
ihnen aufnehmen. Für das Projekt wären dann ein Stammbaum sowie Blutproben von
weiteren Familienmitgliedern sehr wünschenswert. Durch die Teilnahme leisten Sie und
Ihre Angehörigen möglicherweise einen großen Beitrag, dass die Ursachen von
geistiger Behinderung mit Epilepsie besser aufgeklärt und verstanden werden.
Eine Veröffentlichung der Forschungsergebnisse in Fachzeitschriften oder auf
Kongressen unter Verwendung vollständig anonymisierter Daten soll nach Abschluss
der Untersuchungen erfolgen. Es werden alle Richtlinien des Datenschutzes dafür
eingehalten. Trotz aller Sorgfalt bei unseren wissenschaftlichen Arbeiten möchten wir
betonen, dass Untersuchungen im Rahmen von Forschungsprojekten grundsätzlich
nicht den Qualitätsanforderungen genügen können, die routinemäßig durchgeführte
Tests erfüllen müssen. Sollten sich bei diesen Untersuchungen sichere Ergebnisse zum
Krankheitsbild Ihres Kindes ergeben, so haben Sie das Recht auf eine eingehende
Beratung. Daher können Sie ausdrücklich angeben, ob Sie in einem solchen Fall eine
Kontaktaufnahme von unserer Seite wünschen oder nicht. Aus dem Projekt entstehen
weder für Sie noch für Ihre Krankenkasse Kosten.
Die Teilnahme an dieser Studie ist freiwillig. Sie können jederzeit Ihr Einverständnis zur
Teilnahme widerrufen, ohne dass dadurch Nachteile für Sie oder Ihr Kind entstehen.
Nach Beendigung Ihrer Teilnahme werden keine weiteren Daten bei Ihnen oder Ihrem
Kind erhoben. Alle bisherigen Daten werden unwiderruflich anonymisiert, d. h. sie
können nicht mehr anhand der Daten identifiziert werden. Die gesammelten Daten
setzen sich zusammen aus den Namen, den Geburtsdaten, der Adresse, dem
einsendenden Arzt und dem medizinischen Befund Ihres Kindes. Für die Beteiligung
Ihres Kindes an dieser Studie möchten wir Ihnen sehr herzlich danken. Für Rückfragen
stehen wir Ihnen telefonisch oder persönlich gerne zur Verfügung.
Mit freundlichen Grüßen
Prof. Dr. med. G. Gillessen-Kaesbach Dr. med. Irina Stefanova
Ärztin für Kinderheilkunde und Humangenetik Ärztin
Anhänge
76
7.2. Einwilligungserklärung der Studie
EINWILLIGUNGSERKLÄRUNG
zur Aufbewahrung und Verwendung von genetischem Untersuchungsmaterial für
Forschungszwecke
Den beigefügten Text (Informationsblatt zum Forschungsprojekt „Molekulargenetische
Ursachen von mentaler Retardierung mit Epilepsie“) habe ich gelesen, zur Kenntnis
genommen und eine Kopie erhalten. Ich bin über das Vorhaben, eine Probe von mir
und meinem Kind für die Erforschung genetischer Ursachen von mentaler Retardierung
in Kombination mit einer Epilepsie zu verwenden, durch Herrn/Frau
………………………………………………………… ausführlich aufgeklärt worden. Ich
stimme der Nutzung von pseudonymisierten Proben von mir und meinem Kind für
wissenschaftliche Zwecke freiwillig zu. Ich stimme auch der Veröffentlichung der in der
Studie erhobenen Daten in vollständig anonymisierter Form zu. Ferner bin ich damit
einverstanden, dass die Ärzte am Institut für Humangenetik Einsicht in für die Studie
relevante medizinische Vorbefunde meines Kindes erhalten dürfen.
Kodierung und Lagerung der Proben erfolgen im Institut für Humangenetik und
unterliegen der ärztlichen Schweigepflicht sowie den Richtlinien des Datenschutzes.
Dritte erhalten keinen Einblick in Originalunterlagen. Mir ist bekannt, dass ich meine
Zustimmung sowohl zur Aufbewahrung der Proben als auch der daraus gewonnenen
Daten jederzeit ohne Angabe von Gründen widerrufen kann, ohne dass mir oder
meinem Kind dadurch Nachteile im Hinblick auf die Behandlung oder das Verhältnis zu
den behandelnden Ärzten entstehen. In diesem Falle werden sowohl die DNA-Proben
als auch die daraus gewonnenen personenbezogenen Daten umgehend vernichtet.
Die Blutproben von mir und meinem Kind stelle ich für die Erforschung genetischer
Ursachen von mentaler Retardierung und Epilepsie unter Schutz eines Pseudonyms
zur Verfügung und erlaube die Nutzung für 25 Jahre.
Sollten sich aus der Analyse der pseudonymisierten Probe ein für die Gesundheit
meines Kindes wichtiger Befund ergeben, so ist eine Kontaktaufnahme seitens der
Ärzte des Institutes für Humangenetik
□ erwünscht
□ nicht erwünscht.
Anhänge
77
Ort und Datum …………………………………………………..
Name/Vorname …………………………………...Geburtsdatum d. Kindes …………..……
Name/Vorname …………………………………...Geburtsdatum d. Mutter …………...……
Name/Vorname …………………………………...Geburtsdatum d. Vaters ………………...
Adresse der Eltern und des Kindes: ………………………………………………………….
…………………………………………………………………………………………………….
…………………………………………………………………………………………………….
Unterschrift d. Mutter…..………..…….Unterschrift d. Vaters …...…………………………
…………….…………………………………………………..…………………………………
Name oder Stempel des Arztes/der Ärztin Unterschrift des/der behandelnden
Arztes/Ärztin
Anhänge
78
7.3. Fragebogen der Studie
FRAGEBOGEN
zur Erfassung klinischer und diagnostischer Daten
bei Patienten mit Epilepsie und mentaler Retardierung
zum Projekt „Molekulargenetische Ursachen von mentaler Retardierung mit Epilepsie“
Name des Patienten………………………………………………………………………
Geburtsdatum……………………………….…… Geschlecht: □ männlich □ weiblich
Betreuender Arzt / Einsender ……………………………………………………………
Schwangerschaft
Erkrankungen der Mutter oder andere Komplikationen……………………………….
Medikamenteneinnahme……………………Alkohol, Nikotin, Drogen:……………….
Entbindung
Art der Entbindung………………………SSW bei Entbindung……….……………….
Gewicht……………….…Länge…………………………………………………………..
KU…………...……………APGAR………………………………………………………..
Neugeborenen- und Säuglingszeit
Fütterungsprobleme? □ nein □ ja Muskeltonus? □ normal □ herabgesetzt □ erhöht
Sonstiges………………………………………..…………………………………………
Entwicklung
Motorisch:
Ist freies Laufen möglich? □ nein □ ja und zwar seit ………………………………….
Expressive Sprache: □ keine □ einzelne Wörter □ Mehrwortsätze □………………..
Sprachverständnis: □ schlecht □ einzelne Aufforderungen □ gut □………………….
Wachstum: aktuelle Körpermaße vom (Datum ) oder mit (Alter) ……………………
Gewicht…………………………… Größe……………………………………Kopfumfang
…………………………………..
War/ist ein Verlust erworbener Fähigkeiten feststellbar? □ nein □ ja
Mentale Retardierung: □ mild □ moderat □ schwer
Epilepsie:
besteht seit:……………………………………………………………………………...
Art der Anfälle…………………………………………………………………………...
Therapieresistent? □ nein □ ja
Therapie………………………………………………………………………………….
Bestehen kraniofaziale Dysmorphiezeichen? □ nein □ ja und zwar ..…………….
Anhänge
79
Besteht/bestand ein gastro-ösophagealer Reflux? □ nein □ ja
Bestehen Organfehlbildungen? □ nein □ ja und zwar ............................................
Bestehen stereotype Handbewegungen? □ nein □ ja
Besteht eine Bewegungsstörung? □ nein □ ja und zwar ….……………………….
Bestehen Hyperventilationszustände? □ nein □ ja
Leidet/litt der Patient an häufigen Luftwegsinfekten? □ nein □ ja
Sonstiges: ……………………………………………………………………………….
Familienanamnese
Gibt es Familienmitglieder, die eine ähnliche Symptomatik aufweisen?
□ nein □ ja und zwar …………………………………………………………………...
Im Vorfeld durchgeführte Diagnostik
Chromosomenanalyse (Befund)………………………………………………………
Im Hinblick auf Angelman-Syndrom: □ nicht durchgeführt
□ unauffällig
□ auffälliger Befund
Im Hinblick auf Rett-Syndrom: □ nicht durchgeführt
□ unauffällig
□ auffälliger Befund
Array-CGH-Analyse (od. SNP-Array) …………………………………………......…
Weitere molekular- oder zytogenetische Diagnostik: ………………………………
EEG (Befund) ……..……………………………………………………………………
MRT (Befund) …………………………………………………………………………..
Stoffwechseldiagnostik …..……………………………………………………………
Weitere Diagnostik ………………..……………………………………………………
Anhänge
80
7.4. Reaktionsbedingungen
7.4.1. Das CDKL5-Gen
Tabelle 10 Synthetische DNA-Oligonuleotide
Exon Vorwärts-(F-)Primer
5‘3„
Rückwärts-(R-)Primer
5‘3„
Ann.-
Temperatur
Produkt-
länge (bp)
3 gttcccaccaaccagtgag ggagagtgagacccaaattg 60°C 360
4 gagaagcaatgtcagtatagcag tcagataaggaatgctcaacctg 60°C 219
5 acactctggcttcttgctactctgtcc agtgtctgaccagctagatcc 60°C 265
6 gaagtactcaaagcagaaggtga aagaatcgggcaaatgtgcac 60°C 290
7 gctctgtattggatgaattattctag gacagtaacatgtgaaatactcttaac 60°C 297
8 ctaattagatgctattacagtgatc actcaaaagaatgttcctctacc 60°C 282
9 gcccatgcgagaacagtcattaca gcaaatgacaatagaatcagcag 60°C 280
10 agccttcttttcacatggaac gaacaatgactcaaatactgcag 60°C 389
11 tctgcaacactcacaagcacg gcaggctatggtcacatgtag 60°C 237
12 gactttgtaatgttcttaacgatc ctaattgcatcatttaagcagcc 60°C 281
13-I ttgtgtgtcagctattgaggg ggtatgttgttgttggtgagatc 60°C 284
13-II tgcacaccaaaacctaccaagc gcttttggccttggtcctgtagg 65°C 329
13-III gagtcggcatagctatattgacac gaatggctactgtccatgtgc 65°C 351
13-IV aacgctggactcacgtcgaac accctcatcacatccctcgtac 58°C 357
14 ctggttatggtcctagttctacc cttatttgtgggagactgggt 60°C 292
15 cataggcaatattgtcatcaatgtg aggcgacagtgtaggtgagaag 60°C 277
16 gaaaagtccatcagtgacttac ggacactaaaaagctcatccaga 58°C 247
17 ttcttcccggctataggaacc actttgattgccaagtgcaaagtg 60°C 301
18 ctcctcttgggtgtggttgc ctcaggacagttactggagag 60°C 254
19 acccagtcacctcacctctaag ccagctgttcagagtaggaag 60°C 387
20 actctggtcaatgggatgtgg gtttcattcagtagtctagggtc 60°C 253
21 tcactgtcaccttggcttcag gtgtggcctgaacatctgcat 60°C 368
22 agaatgcatgtggccttctgctc aaggaaaactcaacctcagcg 65°C 329
Tabelle 11 Schematische Darstellung des PCR-Reaktionsansatzes für das CDKL5-Gen
Konzentration Hersteller Volumen (in µl)
DNA 50 ng/µl 1,0
a.d. (HPLC) Merck 18,9
Puffer 5 x Qbiogene 2,5
dNTPs Je 10 mM Qbiogene 0,5
F-Primer 10 pmol/µl Biomers 1
R-Primer 10 pmol/µl Biomers 1
Taq-Polymerase 5 U/µl Qbiogene 0,1
Ansatzvolumen 25
Anhänge
81
Tabelle 12 Schematische Darstellung des PCR-Programms für das CDKL5-Gen
PCR-Schritt Temperatur in °C Zeit
35 Zyklen
Initialisierung 95°C 5 Min
Denaturierung
Annealing
Elongation
Elongation
95°C
Je nach Exon
72°C
30 Sek.
30 Sek.
1 Min.
72°C 20 Min.
Tabelle 13 Sequenzieransatz für das CDKL5-Gen
Konzentration Hersteller Volumen (in µl)
ExoSAP-Produkt ca. 10 ng/µl 2
5x SeqPuffer Applied Biosystems 1,5
F- oder R-Primer 10 pmol/µl Biomers 0,5
2,5x Terminator Mix 1.1 Applied Biosystems 1
a.d. (HPLC) Biomers 5
Ansatzvolumen 10
Tabelle 14 Sequenzierprogramm für das CDKL5-Gen
PCR-Schritt Temperatur in °C Zeit
25 Zyklen
Initialisierung 98°C 4 Min
Denaturierung
Annealing
Elongation
96°C
50°C
60°C
20 Sek.
15 Sek.
4 Min.
7.4.2. Das ARX-Gen
Tabelle 15 Synthetische DNA-Oligonukleotide
Exon Vorwärts-(F-)Primer
5‘3‘
Rückwärts-(R-)Primer
5‘3‘
Ann.-Temperatur Produkt-
länge (bp)
1 ggcagaaaggcacaaagatcgc gccctgatttggatgtttggtg 55°C 397
2a gtggagaaagaggccaaggcg ctgcgggtggtggcaccggcacc 64°C-62°C-60°C 630
2b aagtcgtaccgcgagaacg cacccttgctcacccaaactac 64°C-62°C-60°C 721
3 aaatagttggcactccagggg gagagagagagatgggtt 58°C 294
4 aacaacctgaggccaaagagg ctttgacccaacctcagagactg 64°C-62°C-60°C 606
5 tgacctggaaccggttccctg ccaaatggaaacagaggaccagc 55°C 742
Anhänge
82
Tabelle 16 Schematische Darstellung des PCR-Reaktionsansatzes für das ARX-Gen
Exon 1 & 5 Exon 3 Exon 2a,2b,&4
Konzentration Hersteller Volumen (in µl)
DNA 50 ng/µl 1,0 2 2
a.d. (HPLC) Merck 16,3 17,9 7
Puffer 10x Qbiogene 2,5 2,5 5
dNTPs Je 10 mM Qbiogene 0,5 0,5 0,5
GC-rich resolution Je 5 M Roche - - 8
F-Primer 10 pmol/µl Biomers 1 1 1
R-Primer 10 pmol/µl Biomers 1 1 1
DMSO Roth 2,5 - -
Taq-Polymerase 5 U/µl Qbiogene 0,2 0,1 0,5
Ansatzvolumen 25 25 25
Tabelle 17 Schematische Darstellung des PCR-Programms für Exon 1&5 des ARX-Gens
PCR-Schritt Temperatur in °C Zeit
35 Zyklen
Initialisierung 95°C 5 Min
Denaturierung
Annealing
Elongation
Elongation
95°C
55°C
72°C
30 Sek.
30 Sek.
30 Min.
72°C 7 Min.
Tabelle 18 Schematische Darstellung des PCR-Programms für Exon 3 des ARX-Gens
PCR-Schritt Temperatur in °C Zeit
30 Zyklen
Initialisierung 95°C 5 Min
Denaturierung
Annealing
Elongation
Elongation
95°C
58°C
72°C
30 Sek.
30 Sek.
30 Min.
72°C 10 Min.
Anhänge
83
Tabelle 19 Schematische Darstellung des PCR-Programms für Exon 2a, 2b & 4 des ARX-
Gens
PCR-Schritt Temperatur in °C Zeit
3 Zyklen
3 Zyklen
30 Zyklen
Initialisierung 98°C 3 Min
Denaturierung
Annealing
Elongation
Denaturierung
Annealing
Elongation
Denaturierung
Annealing
Elongation
Elongation
98°C
64°C
72°C
40 Sek.
1 Min.
1 Min. 30 Sek.
98°C 40 Sek.
62°C 1 Min.
72°C 1 Min. 30 Sek.
98°C 40 Sek.
60°C 1 Min.
72°C 1 Min. 30 Sek.
72°C 10 Min.
Tabelle 20 Sequenzieransatz für das ARX-Gen
Konzentration Hersteller Volumen (in µl)
ExoSAP-Produkt ca. 10 ng/µl 2
5x SeqPuffer Applied Biosystems 1,0
F- oder R-Primer 10 pmol/µl Biomers 0,5
2,5x Terminator Mix
1.1
Applied Biosystems 2
a.d. (HPLC) Biomers 4,5
Ansatzvolumen 10
Tabelle 21 Sequenzierprogramm für das ARX-Gen
PCR-Schritt Temperatur in °C Zeit
25 Zyklen
Initialisierung 98°C 4 Min
Denaturierung
Annealing
Elongation
96°C
50°C
60°C
20 Sek.
15 Sek.
4 Min.
Anhänge
84
7.4.3. Das SLC9A6-Gen
Tabelle 22 Synthetische DNA-Oligonukleotide
Exon Vorwärts-(F-)Primer
5‘3„
Rückwärts-(R-)Primer
5‘3„ Ann.-Temperatur
Produkt-
länge (bp)
1 gcgcctgtgggtgcgtgtgacctg gaacgtaggccgagcagggcc 60°C 628
2 gagctacagggaactaccgtaag gttgtacagacatatccatttc 55°C 486
3 gcacagtaatgttcttgcctttg gaacagcccatttctgaagtgtc 55°C 284
4 gcatttcatattagcatagcatag cttattacctacgtgaatattg 55°C 299
5 ggattagtcacaaagtactac gtatctaatcatgaattctac 55°C 322
6 ctctcagagtcatctactgag gcctcattcttccaaatgtttc 55°C 298
7 cttgctagccagatacattgcagg gggcaccaaaccctatgcagaac 55°C 524
8 ctgagatttctgtgttagagaagc gatccacttggagcaaaattg 55°C 305
9 cagacaaagcctataatctactgtg gtaaaaaagacttctattttg„ 55°C 252
10 cgtctccacatttgctcccttc gtattcttatgaaccacatac 55°C 352
11 caccatcttgagtgtatagtc gttacatcaagctggcacacgc 55°C 257
12 gaacgtgctttcttgctctg ctggaaagatatccctcaaagtc 55°C 439
13 gtagttgcctgacaatgtatatg ggttgaagtttatagtagattgttttc 55°C 198
14 gcagcctgagtaatagaggtg gtttccttttccacagcactgatg 55°C 442
15 gccctttgctgtcctccgaag cagtgactcatccacagagcag 55°C 289
16 ggactttagactttatcctgagg catgcactgggacttttaggtag 55°C 492
Tabelle 23 Schematische Darstellung des PCR-Reaktionsansatzes für Exon 2-16 des
SLC9A6-Gens
Konzentration Hersteller Volumen (in µl)
DNA 50 ng/µl 1,0
a.d. (HPLC) Merck 18,9
Puffer 5 x Qbiogene 2,5
dNTPs Je 10 mM Qbiogene 0,5
F-Primer 10 pmol/µl Biomers 1
R-Primer 10 pmol/µl Biomers 1
Taq-Polymerase 5 U/µl Qbiogene 0,1
Ansatzvolumen 25
Anhänge
85
Tabelle 24 Schematische Darstellung des PCR-Programms für Exon 2-16 des SLC9A6-
Gens
PCR-Schritt Temperatur in °C Zeit
35 Zyklen
Initialisierung 94°C 5 Min
Denaturierung
Annealing
Elongation
Elongation
94°C
55°C
72°C
30 Sek.
30 Sek.
1 Min.
72°C 7 Min.
Tabelle 25 Sequenzieransatz für das SLC9A6-Gen
Konzentration Hersteller Volumen (in µl)
ExoSAP-Produkt ca. 10 ng/µl 1
5x SeqPuffer Applied Biosystems 1,5
F- oder R-Primer 10 pmol/µl Biomers 0,5
2,5x Terminator Mix 1.1 Applied Biosystems 1
a.d. (HPLC) Biomers 6
Ansatzvolumen 10
Tabelle 26 Sequenzierprogramm für das SLC9A6-Gen
PCR-Schritt Temperatur in °C Zeit
25 Zyklen
Initialisierung 96°C 1 Min.
Denaturierung
Annealing
Elongation
96°C
60°C
60°C
10 Sek.
5 Sek.
1 Min.
Anhänge
86
7.4.4. Das TCF4-Gen
Tabelle 27 Synthetische DNA-Oligonukleotide und Bedingungen für die PCR – TCF4-Gen
Tabelle 28 Schematische Darstellung des PCR-Reaktionsansatzes für das TCF4-Gen
Konzentration Hersteller Volumen (in µl)
DNA 50 ng/µl 1,
a.d. (HPLC) Merck je nach Taq-Menge
Puffer 5 x MP Biomedicals 2,5
dNTPs Je 10 mM MP Biomedicals 0,5
F-Primer 10 pmol/µl Biomers 0,7
R-Primer 10 pmol/µl Biomers 0,7
Taq-Polymerase 5 U/µl MP Biomedicals je nach Exon
Ansatzvolumen 25
Exon Vorwärts-(F-)Primer
5‘3„
Rückwärts-(R-)Primer
5‘3„
Taq-
Menge
(in µl)
Ann.-
Temperatur
Produkt-
länge (bp)
0 cgaacagtgcccattctcttg gccatggtggccatgggagatc 0,05 55°C 354
1 ccagactaccagtaccatcttctaac ctaatttctgtgtttttagtagagac 0,05 58°C 255
2 ccagtctccaaaaatccgattgtg cctactggtttctagctgaagtg 0,05 55°C 254
3 ctctaagctgtttggtaacagtatg gccaaaaacatacaattgag 0,05 60°C 342
4 ggcaacaggagattaatttgaaac gagaaacacaccttctgtttgtc 0,05 60°C 237
5 ggaggggagaagttttggtagtgg cagaacctctgtctaggacatgg 0,05 60°C 275
6 gagcagtagatgtctgttacctg gtttaaaatgcatcatctaatttag 0,05 55°C 235
7 gtactaacaatcagttgggagg gaagtctccaggctgacaactgag 0,05 60°C 352
8 gtggtatcatctagaagtctttg gataaacgtgctgctctgggcg 0,1 60°C 252
9 cttcttatataagaatggagcttg ctgccccatctgtgacattaag 0,05 55°C 259
10 ggcagtcattttcaagtatatg gagtccttgtgtatatgcatgg 0,05 58°C 312
11 cattgtaaaatagagagttgtgag tgcctaattgctattcagttatg 0,05 55°C 330
12 gtgagtaaatggaccaggaatag gactatatactggaagcttcag 0,1 60°C 331
13 gcgttgacaacttcgtagtttag gagtttccacctacaaaatcagg 0,05 60°C 249
14 catcattgccattgccatttcc ggagagtaaaggagactgaac 0,05 60°C 253
15 catgtatttagaaacacagtgtg gcaacaatagtatctatatctg 0,05 55°C 385
16 catcaggtcctcttggcctctgg agggatgaacaccaagaggctgg 0,05 64°C 301
17 gtctgctggcagccttgcaatc gaatagtttcttcccgttctgttc 0,05 60°C 324
18 gaagaaaacaaagtaatgtagacacc ggaaacaattctttggaatgatgc 0,05 60°C 435
19 gtcagacacgcaagaagagtgc ctgtcaatttgggtgaaattcac 0,1 60°C 317
Anhänge
87
Tabelle 29 Sequenzieransatz für das TCF4-Gen
Konzentration Hersteller Volumen (in µl)
ExoSAP-Produkt ca. 10 ng/µl 1
5x SeqPuffer Applied Biosystems 1,5
F- oder R-Primer 10 pmol/µl Biomers 0,5
2,5x Terminator Mix 1.1 Applied Biosystems 0,5
a.d. (HPLC) Biomers 6,5
Ansatzvolumen 10
Tabelle 30 Sequenzierprogramm für das TCF4-Gen
PCR-Schritt Temperatur in °C Zeit
25 Zyklen
Initialisierung 96°C 1 Min.
Denaturierung
Annealing
Elongation
96°C
60°C
60°C
10 Sek.
5 Sek.
1 Min.
Anhänge
88
7.5. MLPA-Ansätze
Hersteller Volumen (in µl)
Hybridisierungsansatz
DNA 50 ng/µl 2
a.d. (HPLC) Merck 3
SALSA Proben-Mix MRC-Holland 1,5
MLPA-Buffer MRC-Holland 1,5
Ansatzvolumen 8 µl
Ligase-Mix
a.d. (HPLC) Merck 25
Ligase-65 Buffer A MRC-Holland 3
Ligase-65 Buffer B MRC-Holland 3
Ligase-65 MRC-Holland 1
Ansatzvolumen Je 32 µl Mix
Polymerase-Mix
a.d. (HPLC) Merck 5,5
SALSA PCR-Primer MRC-Holland 2
SALSA Enzym-Dilution
Buffer
MRC-Holland 2
SALSA Polymerase MRC-Holland 0,5
Ansatzvolumen Je 10 µl Mix
PCR-Ansatz
a.d. (HPLC) Merck 26
10x SALSA PCR-Buffer MRC-Holland 4
MLPA-Ligationsansatz 10
Polymerase-Mix 10
Ansatzvolumen 50 µl
Anhänge
89
7.6. Wachstum und Entwicklung in der untersuchten Patientenkohorte
bei Entbindung bei Datenerhebung
Pat. Geburtsdatum Geschlecht SSW Gewicht Größe Kopfumfang Alter Gewicht Größe Kopfumfang
1 02.01.1997 ♀ 42 3200 g
(- 1SD)
49 cm
(-1,5 SD)
37cm
(+1,3 SD)
11
Jahre
Keine
Angabe
141 cm
(-0,6 SD)
53 cm
(+0,5 SD)
2 09.02.1996 ♀ 34 2090 g
(-0,4 SD)
42 cm
(-1,2 SD)
keine Angabe 12,5
Jahre
41 kg
(-0,6 SD)
144 cm
(-1,7 SD)
51,5 cm
(-0,9 SD)
3 10.07.2002 ♂ 40+3 3340 g 52 cm 37 cm 5
Jahre
16,5 kg 110 cm 48,5 cm
4 11.05.1997 ♂ Termin 3200 g 52 cm keine Angabe 11
Jahre
29 kg
10.Perze
ntile
133 cm
3.Perz.
3. Perz.
5 23.03.2006 ♂ 41+3 4170 g 52 cm 36,5 cm 3,5
Jahre
15 kg 104 cm 46,7 cm
6 12.10.2007 ♀ 36+6 2880 g 52 cm 34,5 cm 21 LM 15kg
(>97.Pz.)
91 cm
(97.Pz.)
44 cm
(Mikrozephalie)
7 26.11.1979 ♀ 41+4 3950 g 56 cm 38 cm 30
Jahre
65 kg 169 cm keine Angabe
8 07.11.2006 ♀ 40 3050 g 51 cm 32 cm 3
Jahre
18,2 kg 103 cm 49,2 cm
9 27.05.2002 ♂ 40 3110 g 49 cm 37 cm 7
Jahre
30kg
(+0,9 SD)
118 cm
(-1,8SD)
52 cm
10 02.09.1999 ♀ 36 2770 g 48 cm 31 cm 10
Jahre
30 kg 137 cm 50 cm
11 29.11.1990 ♀ 36 keine
Angabe
keine
Angabe
keine Angabe 19
Jahre
25 kg 155cm Mikrozephalie
Anhänge
90
bei Entbindung bei Datenerhebung
Pat. Geburtsdatum Geschlecht SSW Gewicht Größe Kopfumfang Alter Gewicht Größe Kopfumfang
12 09.03.2007 ♂ 40+1 3830 g 51 cm 38 cm 2,5
Jahre
14 kg 91 cm 50 cm
13 16.12.2003 ♂ 41+2 3640 g 53 cm 36 cm 6 Jahre 19,9 kg 109 cm 51,3 cm
14 23.10.2006 ♀ 41 3990 g
(-1,2 SD )
55 cm
(+1,2 SD)
36 cm
(+0,8 SD)
4 Jahre 17,6 kg
(+0,5 SD)
105 cm
(+0,3SD)
48 cm
(-1,7 SD)
15 26.08.2007 ♂ 39 2780 g 51 cm 35 cm 3 Jahre keine
Angabe
keine
Angabe
keine Angabe
16 12.06.2006 ♀ 41 3060 g 53 cm 33 cm 4 Jahre keine
Angabe
keine
Angabe
keine Angabe
17 22.01.2005 ♀ keine
Angabe
3070 g 51 cm 34 cm 6 Jahre 13 kg keine
Angabe
keine Angabe
18 17.08.2007 ♀ 36 2756 g 48,5 cm 32 cm 3 Jahre keine
Angabe
keine
Angabe
keine Angabe
20 14.08.1980 ♀ Termin keine
Angabe
keine
Angabe
keine Angabe 29
Jahre
47 kg keine
Angabe
keine Angabe
21 04.04.2001 ♂ 39 3400 g 50 cm 34,5 cm 8 Jahre 27,2 kg 125,6 cm 51,7 cm
22 05.07.1994 ♂ 41 3420 g 52 cm 36 cm 15
Jahre
50 kg 184 cm 57 cm
23 09.12.2002 ♂ 38+1 3470 g 53 cm 35 cm 7 Jahre
27 kg 120 cm 52 cm
24 11.12.2007 ♂ 41+2 3260 g 52 cm 34,5 c 3 Jahre keine
Angabe
keine
Angabe
keine Angabe
Anhänge
91
bei Entbindung bei Datenerhebung
Pat. Geburtsdatum Geschlecht SSW Gewicht Größe Kopfumfang Alter Gewicht Größe Kopfumfang
25 10.11.1962 ♀ 14 d
vor
Termin
2450 g 49 cm 35 cm 41 Jahre 44 kg 150 cm keine Angabe
26 08.04.1999 ♀ Termin keine
Angabe
keine
Angabe
keine Angabe 12 Jahre 30 kg 136 kg keine Angabe
27 23.09.2008 ♀ 38+3 2890 g 49 cm 35 cm 15
Monate
8,7
kg
75 cm 45 cm
28 22.09.2009 ♂ Termin
+9
keine
Angabe
keine
Angabe
keine Angabe 20
Monate
keine
Anga
be
keine
Angabe
absteigend
29 21.04.2009 ♀ 38 3790 g 52 cm 35 cm 7 Monate 8,35
kg
75 cm 43 cm
30 15.04.2003 ♂ keine
Angabe
keine
Angabe
keine
Angabe
keine Angabe 9 Jahre 30 kg 119 cm 50cm
31 16.09.2006 ♀ 36 2350 g 45 cm keine Angabe 3 Jahre 16 kg 101 cm 50 cm
32 25.04.2002 ♀ keine
Angabe
3200 g keine
Angabe
keine Angabe 7 Jahre 18 kg 116 cm 43,5 cm
33 14.08.2009 ♀ 36 2790 g 51 cm 35 cm 21
Monate
8,9
kg
66 cm 43 cm
34 09.08.1993 ♀ 40 3600 g keine
Angabe
keine Angabe 17 Jahre 60 kg 170 cm 53 cm
35 27.10.2005 ♀ 38+5 3940 g 55 cm 36 cm 4 Jahre 16 kg 116 cm keine Angabe
SSW: Schwangerschaftswoche; d: Tage
Anhänge
92
7.7. Therapieresistente Epilepsien – Überblick
Pat Geburtsdatum
Alter zum
Zeitpunkt der
Evaluation
Epilepsiebeginn Art der Anfälle Medikation Mentale
Retardierung
1 02.01.1997 14 Jahre 3.LM
BNS-Krämpfe, seit 11.Lebensjahr tägliche
Krampfanfälle, besonders in
Einschlafphase
ACTH, LEV, VNS schwer
3 10.07.2002 5 Jahre 5.LM Myoklonien im Gesichtsbereich, tonische
Anfälle, BNS-Anfälle CLZ, VPA, ACTH schwer
4 11.05.1997 11 Jahre 2.LM Im 2.LM zyanotischer Kramfanfall, mit 11
Jahren tägliche Krampfanfälle STM, FLB, RUF, VNS schwer
5 23.03.2006 3 Jahre 23.LM Myoklonien keine Angabe schwer
6 12.10.2007 21 Monate 1.LM Tonische Anfälle mit Spasmen PB, ACTH, STM, TPM, LEV,
Dexamethason, VPA, VGB, Folsäure schwer
7 26.11.1979 30 Jahre 5.LM Hypomotorische Anfälle, asymmetrisch
tonische Anfälle OXC, LTG, CLB mild
10 02.09.1999 10 Jahre 2.LJ BNS-Anfälle, fokale Anfälle ZNS, VPA, LTG, STM, LEV schwer
11 29.11.1990 19 Jahre 3.LM BNS-Anfälle, tonische, myoklonische
Anfälle LEV,VPA, LTG schwer
12 09.03.2007 30 Monate 5.LM Fokal mit sekundärer Generalisierung LEV, ZNS moderat
15 26.08.2007 3 Jahre 4.LM Tonische Anfälle, Myoklonien VPA, ESM moderat
16 12.06.2006 4 Jahre 1.LM Komplex fokale, tonische Anfälle, tonisch-
klonische Anfälle LEV,ZNS,CLB schwer
17 22.1.2005 6 Jahre 2.LJ Zuckungen keine Angabe k.A.
18 17.08.2007 3 Jahre keine Angabe Tonische Anfälle, Myoklonien, tonisch-
klonische Anfälle mit Zyanose PB, OXC, ketogene Diät schwer
20 14.08.1980 29 Jahre 4.LM BNS-Anfälle RUF, LEV, ZNS schwer
Anhänge
93
Pat Geburtsdatum
Alter zum
Zeitpunkt der
Evaluation
Epilepsiebeginn Art der Anfälle Medikation Mentale
Retardierung
21 04.04.2001 8 Jahre 9.LM
BNS-Anfälle, myoklonische Anfälle,
Absencen, tonische Anfälle (Lennox-
Gastaut-Syndrom)
CLB, LTG, RSP schwer
22 05.07.1994 15 Jahre 4.LM BNS-Anfälle, tonische, tonisch-klonische
Anfälle, Absencen, atypische Absencen
PLP, STM, VGB, VPA, LTG, OXC,
CBZ, PB, PHT, TPM, LEV, RUF, STP,
ACTH
schwer
23 09.12.2002 7 Jahre 4.LM Myoklonien, Grand-Mal-Anfälle, Absencen VPA, LEV, ESM, LTG, STM, TPM,
CLB, Brom, ZNS schwer
24 11.12.2007 3 Jahre 7.-8.LM Tonische Anfälle VPA, STM, VGB schwer
25 10.11.1962 49 Jahre 3.LM Tonisch-klonische, tonische, komplex-
partielle Anfälle CLB, CBZ, STP schwer
26 08.04.1999 12 Jahre 18.LM Komplex fokale, sekundär generalisierte
Anfälle
CBZ,VPA,OXC,TPM, LTG, LEV, PHT,
LCM moderat
27 23.09.2008 15 Monate 8.LM BNS-Anfälle PLP, CLB, VPA,STM, VGB, TPM,
Dexamethason moderat
28 22.09.2009 20 Monate 2.LM Multifokale Anfälle PTH, PB, CBZ, TPM, VGB, LEV, CLZ,
PLP, Folsäure k.A.
29 21.04.2009 7 Monate 3.LM Fokale Anfälle VPA, VGB schwer
30 15.04.2003 9 Jahre 19.LM Fokale, sekundär generalisierte Anfälle TPM, RUF, LEV schwer
31 16.09.2006 3 Jahre 7.LM Komplex fokale, sekundär generalisierte
Anfälle VPA, PB moderat
32 25.04.2002 7 Jahre 6.LM Fokal, sekundär generalisiert TPM, CBZ, OXC schwer
33 14.08.2009 21 Monate 5.LM BNS-Krämpfe STM, PLP, VGB, Dexamethason, LEV k.A.
34 09.08.1993 17 Jahre 7.-8.LM Tonisch-klonische, fokale Anfälle TPM, OXC schwer
35 27.10.2005 5 Jahre 3.LM BNS-Krämpfe LTG,OXC schwer
Anhänge
94
7.8. Befunde im Elektroenzephalogramm und in der Magnetresonanztomographie
Pat. Geburtsdatum EEG cMRT
1 02.01.1997 Zerebrale Anfallsbereitschaft; komplex fokale Epilepsie mit schlafgebunden
Anfällen
Unauffälliger Befund
2 09.02.1996 Links fokale, fronto-zentrale epilepsietypische Muster Unauffälliger Befund
3 10.07.2002 Pathologisches iktales EEG mit Dämmerattacken und Versivanfällen des Kopfes
bei generalisierter „poly-spike"-Aktivität mit ausgeprägten interiktalen, multifokalen
und links temporal betonten, epilepsietypischen Mustern
Globale Hirnatrophie, fleckförmige
Marklagerläsionen, Arachnoidalzyste
4 11.05.1997 Mittelgradige Allgemeinstörung, flache polymorphe Thetawellen 5-7Hz, über lange
Strecken keine epilepsietypischen Muster. Anfall mit generalisiert irregulären
„spike-slow-waves“, linksseitige „polyspike-waves“, rechts eher mehr polymorphe
höhere Delta-Wellen
Keine Angabe
5 23.03.2006 Keine Angabe Atrophie der weißen und grauen Substanz
6 12.10.2007 Irreguläre generalisierte „sharp-waves“ und „poly-spike waves“ Komplexe massive supratentorielle Atrophie,
bilaterale Polymikrogyrie, Verkalkungen entlang
Sulcus centralis
7 26.11.1979 Bifrontale sharp-waves, fraglich links frontal betont Glioseareal im Gyrus frontalis superior, Zustand
nach Entzündung/Trauma
8 07.11.2006 Pathologische Wach-,Dösigkeits- und Schlafableitung mit generalisierten „poly-
spike-wave“-Paroxysmen mit klinischen Myoklonien
Unauffällig
9 27.05.2002 Leicht abnormes EEG durch relativ raschen und relativ weit nach vorn reichenden
Grundrhythmus. Kein pathologischer Befund, keine epilepsietypische Aktivität.
Unauffällig
10 02.09.1999 Generalisierte „sharp-wave-Komplexe“ Unauffällig
11 29.11.1990 Lennox- Gastaut- Syndrom („spike-waves-Varianten“) Pachygyrie, inkomplette Lissenzephalie,
Balkendysgenesie
12 09.03.2007 Keine Angabe
Supratentorielle Hemiatrophie
Anhänge
95
Pat. Geburtsdatum EEG cMRT
13 16.12.2003 Links temporaler Fokus, einzelne fokal beginnende Anfälle; multifokale
hypersynchrone Aktivität mit „sharp-waves“, „spike-poly-spike-waves“ beidseits mit
wiederholter Generalisierung
Inkomplette Rotation der Hippocampi beidseits
14 23.10.2006 Unauffällig Myelinisierungsdefizit
15 26.08.2007 Parietookzipital diskontinuierlicher EEG Status im Schlaf, 70% der Zeit im Wachen,
Grundrhythmus für das Alter zu langsam, leichte Allgemeinveränderung
Hirnatrophie
16 12.06.2006 Keine Angabe Mäßig ausgeprägte Hirnrindenatrophie, bifronto-
temporo-parietal, zunehmende Markatrophie,
erweiterte innere Liquorräume
17 22.01.2005 Keine Angabe Keine Angabe
18 17.08.2007 Keine Angabe Reduzierte Myelinisierung, Hirnatrophie fronto-
parietal
20 14.08.1980 Delta-Herd rechts temporal , seltener links temporal Hirnatrophie, nicht ätiologisch einzuordnen
21 04.04.2001 Fokale und generalisierte „sharp-waves“ und Allgemeinveränderung Betonte äußere Liquorräume, o.p.B.
22 05.07.1994 Lennox- Gastaut-Syndrom mit „sharp-slow-waves” Unauffällig
23 09.12.2002 Generalisierte „sharp-wave“-Komplexe Unauffällig
24 11.12.2007 Keine Angabe Unauffällig
25 10.11.1962 Unregelmäßige Grund-/Hintergrundaktivität, „spike-waves“, „sharp-waves“
bifrontozentral
Frontal betonte Volumenminderung des
Großhirns und Kleinhirnatrophie
26 08.04.1999 Rechts temporaler bis frontaler Herdbefund Unauffällig
27 23.09.2008 Hypsarrhythmie Milde Atrophie
28 22.09.2009 Multifokale posteriore Prädominanz Progressive cerebrale Atrophie
29 21.04.2009 Epilepsietypische Potentiale Komplexe Hirnfehlbildung, Polymikrogyrie
30 15.04.2003 Isolierte rechts fokale epilepsietypische Muster ohne herdförmige Verlangsamung
bei noch normaler Grundaktivität
Keine Angabe
31 16.09.2006 2 Foci unabhängig, links und rechts temporo-posterior Myelinisierungsverzögerung bitemporal betont
Anhänge
96
Pat. Geburtsdatum EEG cMRT
32 25.04.2002 Pathologische Verlangsamung, „sharp-waves“ temporal beidseits Hirnatrophie, erweiterte äußere und innere
Liquorräume
33 14.08.2009 Hypsarrhythmie Unauffällig
34 09.08.1993 Keine Angabe Keine Angabe
35 27.10.2005 Interiktales EEG zeigte eher generalisierte Auffälligkeiten, nicht lokalisierbar Verdacht auf fokale kortikale Dysplasie links
frontal
Anhänge
97
7.9. Ergebnisse der genetischen Untersuchungen
Sequenzanalysen MLPA
Pat. CDKL 5 TCF 4 ARX SLC9A6 CDKL5/ARX TCF4/FOXG1
1 unauffällig Exon 0: c.28G>C (rs611326),
Exon 19: c.2226A>G (rs8766)
nicht
durchgeführt unauffällig unauffällig unauffällig
2 unauffällig Exon 0: c.28G>C (rs611326),
Exon 19: c.2226A>G(rs8766)
nicht
durchgeführt unauffällig unauffällig unauffällig
3 unauffällig Exon 0: c.28G>C (rs611326),
Exon 19: c.2226A>G (rs8766) unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig
4 unauffällig Exon 0: c.28G>C(rs611326),
Exon 19: c.2226A>G (rs8766) unauffällig unauffällig unauffällig
keine Auswertung
möglich
5 unauffällig Exon 0: c.28G>C (rs611326) unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig
6 unauffällig Exon 0: c.28G>C (rs611326) nicht
durchgeführt unauffällig unauffällig unauffällig
7 unauffällig Exon 0: c.28G>C (rs611326) nicht
durchgeführt unauffällig unauffällig unauffällig
8 unauffällig Exon 0: c.28G>C(rs611326),
Exon 19: c.2226A>G (rs8766)
nicht
durchgeführt unauffällig
keine Auswertung
möglich unauffällig
9 Exon 14 nicht amplifizierbar Exon 0: c.28G>C(rs611326),
Exon 19: c.2226A>G (rs8766) unauffällig unauffällig
keine Auswertung
möglich unauffällig
10 unauffällig Exon 0: c.28G>C (rs611326) nicht
durchgeführt unauffällig unauffällig unauffällig
11 unauffällig Exon 0: c.28G>C (rs611326) nicht
durchgeführt unauffällig unauffällig
keine Auswertung
möglich
Anhänge
98
Sequenzanalysen MLPA
Pat. CDKL 5 TCF 4 ARX SLC9A6 CDKL5/ARX TCF4/FOXG1
12 unauffällig Exon 0: c.28G>C(rs611326),
Exon 19: c.2226A>G (rs8766) unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig
13 unauffällig Exon 0: c.28G>C (rs611326) unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig
14 unauffällig Exon 0: c.28G>C(rs611326),
Exon 19: c.2226A>G (rs8766)
nicht
durchgeführt
Exon 1
c.25G>T(p.A9S) unauffällig unauffällig
15 unauffällig Exon 19: c.2226A>G (rs8766) unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig
16 unauffällig Exon 0: c.28G>C (rs611326) nicht
durchgeführt unauffällig unauffällig unauffällig
17 unauffällig Exon 0: c.28G>C (rs611326) nicht
durchgeführt unauffällig unauffällig unauffällig
18 Exon 17: c.2372A>C
(rs35478150) Exon 0: c.28G>C (rs611326)
nicht
durchgeführt unauffällig unauffällig unauffällig
20 Exon 17: c.2372A>C
(rs35478150) Exon 0: c.28G>C (rs611326)
nicht
durchgeführt unauffällig unauffällig unauffällig
21 unauffällig Exon 0: c.28G>C(rs611326),
Exon 19: c.2226A>G (rs8766) unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig
22 unauffällig Exon 0: c.28G>C(rs611326),
Exon 19: c.2226A>G (rs8766) unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig
23 Exon 17: c.2372A>C
(rs 35478150) Exon 0: c.28G>C (rs611326) unauffällig
Exon 15: c.1755C>T
(rs 2307131) unauffällig unauffällig
24 unauffällig Exon 0: c.28G>C(rs611326),
Exon 19: c.2226A>G (rs8766) unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig
25 unauffällig Exon 0: c.28G>C (rs611326) nicht
durchgeführt unauffällig unauffällig unauffällig
Anhänge
99
Sequenzanalysen MLPA
Pat. CDKL 5 TCF 4 ARX SLC9A6 CDKL5/ARX TCF4/FOXG1
26 unauffällig Exon 0: c.28G>C(rs611326),
Exon 19: c.2226A>G (rs8766)
nicht
durchgeführt unauffällig unauffällig unauffällig
27 unauffällig Exon 0: c.28G>C(rs611326),
Exon 19: c.2226A>G (rs8766)
nicht
durchgeführt unauffällig unauffällig unauffällig
28 unauffällig Exon 0: c.28G>C(rs611326),
Exon 19: c.2226A>G (rs8766) unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig
29 unauffällig Exon 0: c.28G>C (rs611326) nicht
durchgeführt unauffällig unauffällig unauffällig
30 unauffällig Exon 0: c.28G>C(rs611326),
Exon 19: c.2226A>G (rs8766) unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig
31 unauffällig Exon 0: c.28G>C(rs611326),
Exon 19: c.2226A>G (rs8766)
nicht
durchgeführt
Ex. 14 kein PCR-
Produkt unauffällig unauffällig
32 unauffällig Exon 0: c.28G>C(rs611326),
Exon 19: c.2226A>G (rs8766)
nicht
durchgeführt unauffällig unauffällig FOXG1-Deletion
33 unauffällig Exon 0: c.28G>C(rs611326),
Exon 19: c.2226A>G (rs8766)
nicht
durchgeführt unauffällig
keine Auswertung
möglich unauffällig
34 unauffällig Exon 0: c.28G>C(rs611326),
Exon 19: c.2226A>G (rs8766)
nicht
durchgeführt nicht durchgeführt unauffällig unauffällig
35 IVS17-1G>A
(c.2277-1G>A) Exon 0: c.28G>C (rs611326)
nicht
durchgeführt nicht durchgeführt unauffällig unauffällig
Danksagung
100
8. Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich herzlich bei allen bedanken, die an der Entstehung
dieser Arbeit beteiligt waren.
Mein großer Dank gilt Frau Professor Gillessen-Kaesbach für die Überlassung des
Themas, die Bereitstellung des Arbeitsplatzes und für die Ermöglichung dieser Arbeit.
Ebenso möchte ich meiner Betreuerin Frau Dr. Irina Hüning, geb. Stefanova, für die
engagierte Betreuung danken, dafür dass sie immer als Ansprechpartnerin erreichbar
war und mir vielmehr als nur das Fachgebiet der Dissertation eröffnet hat.
Allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Institutes für Humangenetik der Universität
Lübeck danke ich für die herzliche Aufnahme und die Unterstützung.
Besonderer Dank gilt Frau Heike Böttger und Frau Sabine Purmann, die mich während
der experimentellen Phase in die Labortechniken einführten und mir mit kompetenter
Unterstützung und unermüdlicher Geduld bei allen Problemen zu Seite standen.
Ich danke allen betreuenden Ärzten der im Rahmen dieser Arbeit untersuchten
Patienten für die Übersendung der Proben und der klinischen Daten.
Meiner Familie danke ich von Herzen für die Ermöglichung meines Medizinstudiums
und die Unterstützung während dieser Arbeit.
Ich danke dem Evangelischen Studienwerk Villigst e.V. für die Unterstützung meines
Studiums und insbesondere Herrn Prof. Knut Berner für die Ermutigung diese Arbeit
aufzunehmen.
Lebenslauf
101
9. Lebenslauf
Erklärung
102
10. Erklärung
Das Projekt wurde von der Ethik-Kommission der Universität zu Lübeck am 12.05.2009
genehmigt (Aktenzeichen 09-079).
Eidesstattliche Versicherung
Ich versichere ausdrücklich, dass ich die Arbeit selbstständig und ohne fremde Hilfe
verfasst, andere als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel nicht benutzt und
die aus den benutzten Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen einzeln
nach Ausgabe (Auflage und Jahr des Erscheinens), Band und Seite des benutzten
Werkes kenntlich gemacht habe.
Ferner versichere ich, dass ich bisher nicht oder gleichzeitig andernorts einen
Zulassungsantrag gestellt habe oder die Dissertation vorgelegt habe. Ich habe mich
bislang keinem anderen Promotionsverfahren unterzogen.
Unterschrift: ………………………………………………..
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