basistechnieken van de recombinant-dna-technologie

basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

door Peter RoelsMonitoraat Wetenschappen

K.U. Leuven

Deel 1

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

• DNA-dubbelhelix• inleiding: 3 pijlers• restrictiefragment-lengtepolymorfisme• Southern-vlektechniek• genkloning• polymerase-kettingreactie• DNA-sequentiebepaling

basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

• DNA-dubbelhelix• inleiding: 3 pijlers• restrictiefragment-lengtepolymorfisme• Southern-vlektechniek• genkloning• polymerase-kettingreactie• DNA-sequentiebepaling

basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

DNA-dubbelhelix

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

DNA-dubbelhelix

5’ TGA 3’3’ ACT 5’

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

• DNA-dubbelhelix• inleiding: 3 pijlers• restrictiefragment-lengtepolymorfisme• Southern-vlektechniek• genkloning• polymerase-kettingreactie• DNA-sequentiebepaling

basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

3 pijlers in derecombinant-DNA-technologie

• complementaire basenparing• restrictie-enzym of restrictie-endonuclease• DNA-polymerase

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

complementaire basenparing

steeds:adenine – thymine(2 H-bruggen)

guanine – cytosine(3 H-bruggen)

van groot belang in biologische werking, o.a.:- DNA-replicatie- RNA-synthese

cruciaal in vele technieken!

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

complementaire basenparing

temperatuur

absorbantie

DENATURATIE

ds DNA

es DNA

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

complementaire basenparing

temperatuur

absorbantie

Ts

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

complementaire basenparing

temperatuur

absorbantie

Ts < Ts< Ts

GC-gehalte

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

complementaire basenparing

temperatuur

absorbantie

RENATURATIE

es DNA

ds DNA

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

complementaire basenparing

• ook tussen niet perfect complementaire strengen is renaturatie (hybridisatie) mogelijk

• algemene regel:- smelttemperatuur van deze dubbelhelix lager naarmate aantal complementaire basen afneemt - hoe meer de strengen complementair aan elkaar, hoe hoger de temperatuur van het medium vóór denaturatie

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

restrictie-enzymen

• herkent en knipt welbepaalde sequentie van nucleotiden (4 tot 8 bp)

• herkenningssequentie is palindroom

5’...GAATTC...3’3’...CTTAAG...5’

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

restrictie-enzymen

...G AATTC...

...CTTAA G...

• herkent en knipt welbepaalde sequentie van nucleotiden (4 tot 8 bp)

• herkenningssequentie is palindroom

• vaak met vorming “kleverige eindjes”

5’...GAATTC...3’3’...CTTAAG...5’

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

DNA-polymerase

• maakt vanaf aparte nucleotiden DNA-streng aan op enkelstrengse matrijs

• steeds dubbelstrengs DNA nodig als start

3’...CTTAAG... 5’5’...GA 3’

• steeds aangroei nieuwe DNA-streng aan 3’-uiteinde

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

DNA-polymerase

• maakt vanaf aparte nucleotiden DNA-streng aan op enkelstrengse matrijs

• steeds dubbelstrengs DNA nodig als start

3’...CTTAAG... 5’5’...GA 3’ ATTC...

• steeds aangroei nieuwe DNA-streng aan 3’-uiteinde

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

• DNA-dubbelhelix• inleiding: 3 pijlers• restrictiefragment-lengtepolymorfisme• Southern-vlektechniek• genkloning• polymerase-kettingreactie• DNA-sequentiebepaling

basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP)

• digestie van DNA met restrictie-enzym

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP)

• digestie van DNA met restrictie-enzym

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP)

• digestie van DNA met restrictie-enzym

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP)

• digestie van DNA met restrictie-enzym• gelelektroforese (met agarosegel)

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

gelelektroforese: opzet stalen

1 2 3

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

gelelektroforese: opzet stalen 1 2 3

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

-

+

gelelektroforese: spanning

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

-

+

gelelektroforese: spanning

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

-

+

gelelektroforese: spanning

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

-

+

gelelektroforese: visualisatie

1000

500

300

200

100

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

-

+

gelelektroforese: visualisatie

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP)

• digestie van DNA met restrictie-enzym• gelelektroforese (met agarosegel)• interpretatie

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

gelelektroforese: interpretatie 1 2 3

400

50

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

gelelektroforese: interpretatie

5’…CAACTG…3’3’…GTTGAC…5’

5’…CAATTG…3’3’…GTTAAC…5’

5’…CAATT 3’3’…G 5’

5’ G…3’3’ TTAAC…5’

1 2 3

400

50

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

gelelektroforese: interpretatie 1 2 3

400

50

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

gelelektroforese: interpretatie

5’…CGGTCTAGGTG…3’3’…GCCAGATCCAC…5’

5’…CGGGGTG…3’3’…GCCCCAC…5’

5’…CGGTCTAGGTG…3’3’…GCCAGATCCAC…5’

1 2 3

400

50

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

gelelektroforese: interpretatie 1 2 3

400

50

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

gelelektroforese: interpretatie 1 2 3

400

50

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

resultaat na digestie van totaal genomisch DNA

1 2 3

400

50

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

• DNA-dubbelhelix• inleiding: 3 pijlers• restrictiefragment-lengtepolymorfisme• Southern-vlektechniek• genkloning• polymerase-kettingreactie• DNA-sequentiebepaling

basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

Southern-vlektechniek

nylondrager

blotting

autoradiogram

+ sonderadiografie

5’…AACTCAGCTG … 3’

5’ … AACTC 3’

5’ AGCTG … 3’

3’ GAGTCG 5’

3’ GAGTCG 5’

3’ GAGTCG 5’

agarosegel

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

Southern-vlektechniek:afkomst sonde (probe)

• uit gekende aminozuursequentie van eiwit (degeneratie code!)

• uit mRNA, na omzetting in cDNA• sonde gebruikt in een ander, verwant

organisme (voldoende complementair!)

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

• DNA-dubbelhelix• inleiding: 3 pijlers• restrictiefragment-lengtepolymorfisme• Southern-vlektechniek• genkloning• polymerase-kettingreactie• DNA-sequentiebepaling

basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

5’ GAATTC 3’3’ CTTAAG 5’

genkloningspecifieke amplicatie van DNA-fragment

lacZ-gen (enzym katalyseert omzetting “X-gal” naar blauwe kleurstof)

ampicillineresistentiegenpUC18

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

genkloningspecifieke amplicatie van DNA-fragment

5’ GAATTC GAATTC 3’3’ CTTAAG CTTAAG 5’

5’ GAATTC 3’3’ CTTAAG 5’

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

genkloningspecifieke amplicatie van DNA-fragment

5’ GAATTC GAATTC 3’3’ CTTAAG CTTAAG 5’

GAATTCCTTAAG

GAATTCCTTAAG

5’ GAATTC 3’3’ CTTAAG 5’

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

genkloningspecifieke amplicatie van DNA-fragment

+ ampicilline+ X-gal

bacterie – plasmide = niet-AB-resistent

plasmide zonder donor-DNA = blauw

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

genkloningspecifieke amplicatie van DNA-fragment

blotting radiografie

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

genkloningspecifieke amplicatie van DNA-fragment