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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE
MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
Aislamiento de Bacillus thuringiensis con actividad
entomopatógena a partir de suelo de cultivos de
brasicáceas en Menocucho, Laredo-Perú.
TESIS
PARA OPTAR EL TÍTULO DE
BIÓLOGO – MICROBIÓLOGO
AUTORA: Br. JULIO CÉSAR AGUSTIN JUNIOR PADILLA
MOZO.
ASESOR: Dr. HEBER MAX ROBLES CASTILLO
TRUJILLO-PERÚ
2015
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
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AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE
TRUJILLO QUE OTORGAN EL TITULO PROFESIONAL
DE BIOLOGO – MICROBIOLOGO
Dr. ORLANDO GONZÁLES NIEVES
Rector de la Universidad Nacional de Trujillo
Dr. RUBÉN VERA VÉLIZ
Vicerrector Académico de la Universidad Nacional de Trujillo
Dr. STEBAN ALEJANDRO ILICH ZERPA
Secretario General de la Universidad Nacional de Trujillo
Dr. JOSE MOSTACERO LEON
Decano de la Facultad de Ciencias Biológicas
Dr. WILLIAN ZELADA ESTRAVER
Secretario de la Facultad de Ciencias Biológicas
Dra. BERTHA SORIANO BERNILLA
Director de la Escuela Académico Profesional de Microbiología y
Parasitología
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DEL ASESOR
El que suscribe, Asesor de la presente Tesis titulada:
Aislamiento de Bacillus thuringiensis con actividad entomopatógena a partir de
suelo de cultivos de brasicáceas en Menocucho, Laredo-Perú.
CERTIFICA
Que ésta Tesis ha sido ejecutada de conformidad con su correspondiente proyecto
y con las debidas orientaciones brindadas al tesista.
Respecto al informe, éste ha sido revisado y acoge las observaciones y sugerencias
pertinentes, por lo que autorizo al Br. Julio César Agustin Junior Padilla Mozo
continuar con los trámites correspondientes.
____________________________________
Dr. Heber Max Robles Castillo
ASESOR
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PRESENTACIÓN
SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR:
En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de
Grados y Títulos de la Universidad Nacional de Trujillo, ponemos a vuestra
consideración y criterio el trabajo de investigación titulado: “Aislamiento de
Bacillus thuringiensis con actividad entomopatógena a partir de suelo de cultivos
de brasicáceas en Menocucho, Laredo-Perú”, con el propósito de obtener el Título
Profesional de Biólogo – Microbiólogo.
Esperando que vuestro criterio sea de comprensión por errores u omisiones
cometidos en la elaboración del presente trabajo, me someto a vuestro dictamen.
Trujillo, Diciembre 2015
____________________________________
Julio César Agustin Junior Padilla Mozo
Bachiller en Ciencias Biológicas
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MIEMBROS DEL JURADO
________________________________________
Ms.C. JUAN HÉCTOR WILSON KRUGG
PRESIDENTE
_______________________________________
Dr. HEBER MAX ROBLES CASTILLO
SECRETARIO
____________________________________
Dra. MANUELA LUJÁN VELÁSQUEZ
VOCAL
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APROBACIÓN
Los profesores que suscriben, miembros del jurado dictaminador, declaran
que la presente tesis ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales,
siendo aprobada por UNANIMIDAD.
________________________________________
Ms.C. JUAN HÉCTOR WILSON KRUGG
PRESIDENTE
_______________________________________
Dr. HEBER MAX ROBLES CASTILLO
SECRETARIO
____________________________________
Dra. MANUELA LUJÁN VELÁSQUEZ
VOCAL
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DEDICATORIA
A Dios, porque un día tuvo misericordia de este pecador que escribe, y me permitió conocerlo a través de Jesús, en su vida muerte y resurrección. A Él sea toda la Gloria siempre.
A mis Padres Julio y Esther, espero algún día pueda retribuirles todo aquello que han hecho por mí, gracias por todo el apoyo a lo largo de mi corta vida. Los amo.
A mis amados hermanos, Christian y Kristina, gracias por estar a mi lado todo este tiempo, el solo saber que están ahí, me ayuda a seguir adelante. A mi mami Ivonne, su ejemplo de vida me desafía siempre a mejorar en muchos ámbitos. Este trabajo es fruto de sus incontables atenciones y consejos. Gracias por todo su tiempo para mí.
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AGRADECIMIENTOS
Un gran agradecimiento al Dr. Heber Robles Castillo, por su asesoramiento, enseñanzas y consejos. Muchas gracias por abrirme las puertas del laboratorio de Biotecnología sin reservas, y poder así cumplir con el objetivo de este presente trabajo. Muchas gracias.
Gracias a los profesores Ms.C. Juan Wilson Krugg, Ms.C. Jaime Agreda Gaitán y Ms.C. Miguel Muñoz Ríos, por su asesoramiento y consejos incondicionales a lo largo del desarrollo de este trabajo.
Muchas gracias a mis amigos: Alonso Novoa, Walter Rojas, Luis Mendoza, Claudia Marcelo, Diana Periche y Meily Mezarina, muchas gracias por su amistad y caluroso apoyo en este trabajo. Su amistad es un gran regalo que recibí sin merecerlo, gracias por todo, amigos.
Un gran agradecimiento a mis hermanos de Gracia Urbana, Carlos, Bruno, Sam, Karen, Hansvan, y a Belsci y Ruth, muchas gracias por su preocupación por mi persona al realizar este trabajo.
Thanks to my friend, who is like a father, Dave Pascoe, muchas gracias por tu tiempo, consejos, regaños, aliento, ánimos,; gracias por todo amigo mío. Gracias a Dios por permitirme conocerte.
Muchas gracias a mi hermana y amiga Lizeth Lugo. No importa la distancia para ser buenos amigos, gracias Li. por los ánimos siempre en el Señor, gracias por la preocupación, tanto en mi vida académica como espiritual. Gracias a Dios por tu amistad.
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RESUMEN
La investigación se realizó con el objetivo de aislar Bacillus thuringiensis con
actividad entomopatógena a partir de suelo de cultivos de brasicáceas en
Menocucho, Laredo-Perú. Se recolectaron en total 15 muestras de suelo de 1 Kg
cada una, de 15 campos de cultivos disponibles de brasicáceas, en una superficie
de 0,1m2 y hasta 5 cm. de profundidad, en bolsas plásticas de primer uso. Las
muestras de suelo fueron diluías en 10 ml. de agua destilada estéril y luego fueron
tratadas con choque térmico (incubándose en un baño de agua a 80°C durante 12
minutos y luego a 5 minutos en baño de hielo) para la selección de bacterias
esporuladas. Después se realizaron diluciones seriadas hasta 10-5, luego se
sembraron las dos últimas diluciones por superficie en placas Petri conteniendo agar
soya tripticasa y se incubaron a 30°C durante 24 – 48 horas. Se observaron las
características macroscópicas de las colonias en medio de cultivo, para comprobar
si pertenecían al género Bacillus. Posteriormente se realizó una coloración Gram,
para observar sus características morfológicas y tintoriales. Para la identificación
de los cristales paraesporales se realizó una coloración simple con azul de
coomassie. Se logró aislar 21 colonias de Bacillus thuringiensis en tres de 15
campos de cultivo de brasicáceas, como cada una ellas presentaron las mismas
características morfológicas, culturales y forma de cristal, se seleccionó un cultivo
por cada campo, CBt-4, CBt-6 y CBt-9. Posterior a esto, se purificaron los cultivos
y se evaluó su actividad entomopatógena frente a Spodoptera frugiperda ,
obteniéndose un promedio de tasa de mortalidad de 65%, 48,5% y 71,7% para CBt-
4, CBt-6 y CBt-9 respectivamente, cada uno de ellos a 48 horas de exposición con
un fotoperiodo de 16:8.
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INDICE
Pág.
AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO…….…ii
DEL ASESOR…………………………………………………………………….iii
PRESENTACION………………………………………………………………...iv
MIEMBROS DEL JURADO……………………………………………………...v
APROBACIÓN…………………………………………………………………...vi
DEDICATORIA…………………………………………………………………vii
AGRADECIMIENTO…………………………………………………………..viii
RESUMEN……………………………………………………………………….ix
INDICE……………………………………………………………………..…......x
INTRODUCCIÓN………………………………………………………………... 1
MATERIAL Y MÉTODO………………………………………...……………… 9
1. MATERIAL DE ESTUDIO…………………………………………….....9
1.1.Material de estudio……………………...…………………………......9
1.2. Material Biológico…………………………………………………….9
2. MÉTODOS ………………………………………………………………..9
2.1.Toma de muestra de suelo de los cultivos de brasicáceas
………………………………………….. …………………………….9
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2.2.Aislamiento de Bacillus thuringiensis a partir de suelo
agrícola………………....…………………………………………….10
2.3. Identificación de los cultivos nativos de Bacillus thuringiensis…….10
2.3.1 Morfología de colonias sospechosas
…………………..……………………………………………10
2.3.2 Tinción Gram………………………………………………...10
2.3.3 Identificación del cristal parasporal de Bacillus thuringiensis
mediante una tinción simple con azul de
coomassie…………………………………….………………11
2.3.4 Obtención de cultivos puros de Bacillus thuringiensis……….11
2.4.Bioensayo de toxicidad en insecto susceptible……………………….11
RESULTADOS…………………………………………………………………..13
DISCUSIÓN…………………………………………………………………….. 19
CONCLUSIÓN…………………………………………………………………. 23
RECOMENDACIONES…………………………………………………………24
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS…………………………………………...25
ANEXOS………………………………………………………………………....30
ANEXO 1. Mapa de Ubicación de Menocucho, y aproximación de los campos
positivos para el aislamiento de Bacillus thuringiensis, distrito de Laredo, Perú.
ANEXO 2. Campo de cultivo de brasicáceas en Menocucho, Laredo-Perú.
ANEXO 3. Ficha de muestreo.
ANEXO 4. Diagrama para el aislamiento de Bacillus thuringiensis procedentes de
muestras de suelo de brasicáceas en Menocucho, Laredo-Perú.
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ANEXO 5. Diagrama de Bioensayo, de Bacillus thuringiensis frente a Spodoptera
frugiperda.
ANEXO 6. Cultivo puros de Bacillus thuringiensis aislados a partir de muestra de
suelo de cultivos de brasicáceas.
ANEXO 7. Observación microscópica a 1000 aumentos. Bacilos Gram positivos,
pertenecientes a cultivo puro de Bacillus thuringiensis.
ANEXO 8. Tabla del número de larvas muertas de Spodoptera frugiperda durante
el bioensayo frente a Bacillus thuringiensis, por grupo evaluado.
ANEXO 9. Actividad entomopatógena de Bacillus thuringiensis sobre larvas 1 y 2
de Spodoptera frugiperda.
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INTRODUCCIÓN
Actualmente sigue existiendo una gran necesidad de contar con herramientas
seguras y efectivas para el control de plagas como alternativa ante los
insecticidas químicos. Esto estimula considerablemente el interés en usar
patógenos como agentes contra estas plagas1. Es por esto que el control
biológico ha sido fuertemente apoyado, principalmente a través del uso de la
bacteria Bacillus thuringiensis (Eubacteriales, Bacillaceae), el cual, debido a
su trayectoria exitosa, es el principal ingrediente activo en biopesticidas
alrededor del mundo2, 3. El éxito de esta bacteria como control biológico se
debe a su producción de inclusiones proteínicas cristalinas en el momento de
la esporulación, las cuales son tóxicas para muchos organismos,
especialmente insectos.
Bacillus thuringiensis (Bt) es un bacilo Gram positivo, de flagelo perítrico,
que mide aproximadamente de 3 a 5 µm. de largo por 1,2 µm de ancho,
poseyendo la característica de desarrollar espora de resistencia elipsoidales
que no deforma la estructura bacteriana4. Es un microorganismo
quimiorganotrofo, anaerobio facultativo y con actividad de catalasa5. Los
diferentes aislamientos de Bt presentan en general características bioquímicas
comunes. Poseen la capacidad de fermentar glucosa, fructosa, trealosa,
maltosa y ribosa, y de hidrolizar gelatina, almidón, glucógeno, esculina y N-
acetil-glucosamina. Sin embargo, Bt tiene como característica principal
durante el proceso de esporulación la producción de una inclusión parasporal
formada por uno o más cuerpos cristalinos de naturaleza proteica, los cuales
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son tóxicos para distintos invertebrados, especialmente larvas de insectos6. A
estas proteínas se les denominaron Cry (del inglés, Crystal) y constituyen la
base del insecticida biológico más difundido a nivel mundial.
B. thuringiensis pertenece a la familia Bacillaceae y se ubica dentro del grupo
1 del género Bacillus; forma parte del grupo de Bacillus cereus, el que incluye
a B. anthracis, B. mycoides, así como también a los más recientemente
descritos B. pseudomycoides y B. weihenstephanensis. Se encuentra
estrechamente relacionado con los dos primeros, de los que no logra
distinguirse por completo debido a que no existen suficientes diferencias en
sus características morfológicas y bioquímicas.
Genéticamente, Bt continúa siendo similar a B. cereus un agente causante de
la intoxicación alimentaria y con B. anthracis, el agente causante del ántrax
en los mamíferos7. La diferencia está en los detalles: sólo Bt forma cristales
paraesporales durante la esporulación, convirtiéndolo en un patógeno
facultativo de insectos, mientras que carece de las distintivas toxinas de
mamíferos activos. Las toxinas contra los insectos son codificadas por los
genes en elementos genéticos móviles, plásmidos, por lo que las cepas de Bt
que han perdido estos plásmidos son indistinguibles de B. cereus. Aunque,
normalmente Bt está asociado con las poblaciones de insectos, tanto Bt
como B. cereus, tienen una gran cantidad de hábitats, tales como el filoplano,
suelo, agua y productos de ventas agrícolas (granos). Para muchas de las
cepas aisladas de Bt, no siempre se le ha demostrado toxicidad para ninguna
especie de insectos, esto debido a su íntimo crecimiento junto a B. cereus.
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El consenso en la actualidad es denominar a Bt, como un entomopatógeno
facultativo8.
La actividad insecticida de Bt se atribuyen mayormente a un grupo de
proteínas llamadas δ-endotoxinas o ICP’s (“insecticidal crystal proteins”)
conformado por proteínas Vip ("vegetative insecticidal protein") secretadas
durante la fase vegetativa de algunas cepas, y por proteínas Cry ("crystal") y
Cyt ("cytotoxic") presentes en las estructuras cristalinas paraesporales9.
Siendo las más estudiadas por dicha actividad insecticida, las Cry. Existen
más de 500 proteínas Cry identificadas hasta la fecha y se presentan en
diversas combinaciones en las diferentes cepas conocida10.
Como se mencionó, los genes Cry que codifican para las proteínas Cry están
contenidos en plásmidos, ADN extracromosómico circular que se replica y
transcribe independientemente del ADN cromosómico. Esto, permite una
amplia variedad de arreglos y combinaciones dando lugar a una gran
diversidad de cepas con distintos espectros de acción9. Las toxinas Cry
presentan individualmente un restringido espectro de acción, lo cual les
confiere gran especificidad de acción y seguridad para su uso11. Las toxinas
Cry se diferencian entre sí en su secuencia aminoacídica; existen alrededor de
72 tipos de ellas descritas actualmente, y se dividen en subtipos, siendo las
más diversas Cry 1 con 256 subtipos, Cry 2 con 72, Cry 8 con 49 y Cry 7 con
3110,12 .
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Al momento de formación de la espora bajo condiciones de stress, Bt inicia
la síntesis de uno o más cristales protéicos13. Estas inclusiones cristalinas se
generan por fuera de la espora (paraesporales) y pueden presentar distintas
morfologías, permitiendo su clasificación en bipiramidales, cúbicos,
aplanados, esféricos, rectangulares y romboidales14.
Una vez que el insecto ingiere los cristales producidos por Bt, la toxicidad
característica de estas estructuras depende de un proceso complejo que
requiere tres etapas que son: solubilización de proteínas Cry, procesamiento
proteolítico de la pro-toxina a la forma activa y la inserción irreversible de la
toxina a la membrana intestinal15.
En el intestino medio del insecto, las proteínas Cry se encuentran inactivas
en forma de pro-toxina. El pH altamente alcalino junto con enzimas digestivas
produce la proteólisis de la pro-toxina10. Bajo su forma activa, las toxinas Cry
pueden acceder a las células epiteliales, insertándose a través de interacciones
univalentes con la caderina16. Luego, una cascada de señalización
dependiente de magnesio es responsable de la formación de poros en la
membrana celular de las células epiteliales, como resultado de la agregación
de proteínas Cry17. La formación de poros líticos en la membrana
inmediatamente produce cambios fisiológicos importantes y perniciosos a
nivel del intestino del insecto, hecho éste que provoca su muerte18. Estos
acontecimientos descritos concluyen en una parálisis intestinal y posterior
inhibición de la absorción de nutrientes produciendo muerte por inanición o
septicemia. Además del efecto directo e indirecto de la toxina, la muerte
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también puede darse por parte de las esporas una vez que comienzan a
germinar dentro del insecto19, 20.
El aislamiento de Bt puede proceder de una gran variedad de hábitats, siendo
el más común el suelo agrícola, sin embargo también se reportan aislamientos
de muestras de pastos, barredura de silos, insectos muertos y ambientes
acuáticos21, 22. En ambientes naturales, Bt se encuentra frecuentemente
enmascarado por la presencia de otras especies relacionadas que muestran
mayor capacidad para competir por los nutrientes del suelo23. Para lograr
mayor eficiencia en el aislamiento es necesario recurrir a estrategias
selectivas que permitan reducir en número aquellas especies no deseadas que
comparten un hábitat común.
La identificación, basada únicamente en pruebas bioquímicas
convencionales, no permite diferenciar entre B. thuringiensis, y otras
especies del grupo de B. cereus. La demostración de la presencia de
inclusiones cristalinas parasporales es una prueba fundamental en la
identificación de B. thuringiensis24. Existen varios métodos para el
aislamiento de Bt. Uno de ellos, y el más utilizado, es el método de selección
con acetato de sodio, basado en la inhibición de la germinación de esporas de
Bt en presencia de acetato, pre-tratamiento con calor en seco para eliminar de
forma eficaz las esporas de otros microorganismos distintos de Bt24, 25, a partir
de larvas o insectos, entre otros26.
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El método de identificación más utilizado es la visualización de los cristales
de proteínas Cry al microscopio27. Debido a que los métodos mencionados
resultan poco prácticos a la hora de identificar a Bt, se están intentando
desarrollar nuevas herramientas de identificación y caracterización a nivel
molecular basadas en genes distintos al gen de ARNr 16S. Algunos autores
han logrado caracterizar distintas cepas de Bt a partir de la identificación de
genes específicos (genes cry) por la técnica de PCR (“Polymerase Chain
Reaction”) 28.
Se ha logrado también diferenciar al grupo Bacillus cereus sensu lato, al que
pertenece Bt, con el método de Multiplex PCR29. Existen trabajos que
permitieron la tipificación de distintos aislados de Bt basados en técnicas
derivadas de PCR como ERIC–PCR ("Enterobacterial Repetitive Intergenic
Consensus") y de fingerprinting como REP–PCR ("Repetitive Element
Palindromic") 30.
Cuando nos preguntamos acerca de la producción de un biopesticida en base
a Bt resulta muy importante que las cepas utilizadas para producirlo sean
autóctonas, ya que un Bt de origen nativo incide positivamente en su
efectividad como biopesticida, y esto debido a que una cepa nativa estará
adaptada a las condiciones ambientales donde será utilizada como agente de
control biológico. Es de mencionar que lo anterior no es el pináculo del
propósito, porque sumado a ello, durante la búsqueda de cepas autóctonas
también pueden encontrarse nuevas proteínas Cry que tengan un a diferente
actividad insecticida y así generar un banco de cepas con el fin de disponer
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de un potencial genético necesario para permitir un manejo apropiado de la
generación de resistencia hacia Bt31,32.Actualmente varios grupos de trabajo
se encuentran enfocados en la búsqueda de nuevas cepas de Bt con nuevas
proteínas o actividad insecticida. Por ejemplo, se han reportado varios
trabajos en países como México33 Irán, Turquía, Siria34 entre otros, donde ya
se han caracterizado nuevas cepas de Bt.
En Perú existen plagas agrícolas de importancia económica como las plagas
de la papa (“polilla de la papa” Phtorimaea aperculella), caña de azúcar,
algodón, maíz (“gusano mazorquero” Heliotis zea), brasicáceas, camote,
hortalizas, cítricos y frutales. Existen también enfermedades por insectos
vectores de los géneros Anopheles, Culex, y la mosca negra del género
Simulium, responsables de enfermedades endémicas en Perú35, plagas que
normalmente son tratadas sólo con controladores químicos.
En nuestro país, las grandes agroindustriales están apostando por Bt, no sólo
en el uso de productos comerciales a base de este microorganismo, sino
también en su aislamiento y caracterización mediante biología molecular.
Esta situación promueve constantemente a la realización de estudios que
permitan establecer la búsqueda de Bt nativos, desde su aislamiento,
caracterización, producción y utilización como controlador de plagas
agrícolas y vectores de enfermedades endémicas, como una alternativa eficaz
a los controladores químicos.
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Es de esta manera que, el presente trabajo tiene como objetivo, el aislamiento
de cultivos de Bacillus thuringiensis con actividad entomopatógena, a partir
de muestras de suelo de cultivos de brasicáceas en Menocucho, Laredo-Perú.
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MATERIAL Y MÉTODO
1. MATERIAL DE ESTUDIO.
1.1. Material de estudio
Muestras de suelo de cultivos de brasicáceas en Menocucho, Laredo-
Perú.
1.2. Material biológico
Larvas del estadio 1 y 2 de Spodoptera frugiperda proporcionado por el
área de control Biológico de SENASA (SERVICIO NACIONAL DE
SANIDAD AGRARIA)
2. MÉTODO. (ANEXO 3)
2.1. Toma de muestra de suelo de los cultivos de brasicáceas (ANEXO 1)
Las muestras de suelo se recolectaron de los campos de
cultivos en dónde no se habían realizado aplicaciones previas de
bioinsecticidas a base de B. thuringiensis para el control de las plagas
agrícolas, esto se verificó mediante una encuesta hacia los agricultores de la
zona muestreada. (Anexo 3)
Se muestreó 15 campos de cultivos de brasicáceas (10 de
Brassica oleracea var. capitata L. y 5 de Brassica oleracea var. botrytis L.),
aproximadamente 1 kilogramo por campo (10 submuestras de 100 gramos
por cada campo) en bolsas de primer uso, en una superficie de 0,10 m2 y
hasta 5 cm. de profundidad. Se clasificó con una etiqueta y una ficha de
muestreo del campo de procedencia. Posteriormente se transportó al
laboratorio de Biotecnología de la Universidad Nacional de Trujillo para su
procesamiento.
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2.2. Aislamiento de Bacillus thuringiensis a partir de suelo agrícola
(ANEXO 4)
Previamente cada muestra de suelo de los cultivos se
homogenizó, para luego pesar 1 g. y ser disuelto en 10 ml. de Agua destilada
estéril (método descrito por la OMS). Posteriormente se llevó el resultante
a shock térmico (12 minutos a 80 °C seguido de 5 minutos a baño de hielo)
con el fin de seleccionar microorganismos formadores de esporas.
Se procedió a realizar diluciones seriadas con agua destilada
estéril, hasta una dilución de 10-5. Seguidamente se sembró por superficie
las dos últimas diluciones obtenidas en placas Petri conteniendo agar soya
tripticasa y se incubaron a 30°C durante 48 a 72 horas.
2.3. Identificación de los cultivos nativos de Bacillus thuringiensis
2.3.1. Morfología de colonias sospechosas
Tras la incubación se examinaron las colonias,
seleccionando mediante observación a simple a aquellas colonias típicas del
género Bacillus: grandes, blanquecinas, opacas, aplanadas, de bordes
irregulares.
2.3.2. Tinción Gram (ANEXO 7)
Una vez seleccionadas las colonias aisladas de la
placa Petri con agar soya tripticasa, se realizó una tinción Gram y se observó
a 1000 aumentos en microscopio óptico simple. Se observaron bacilos Gram
positivos, grupo al cual pertenece B. thuringiensis.
2.3.3. Identificación del cristal parasporal de Bacillus
thuringiensis mediante una tinción simple con azul de coomassie
De las colonias de bacilos Gram positivos, se preparó un
frotis sobre una lámina portaobjeto, secándose a temperatura ambiente.
Luego la muestra fijada se cubrió con la solución de azul de coomassie
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(0.25% azul brillante, en 50% de etanol y 7% de ácido acético) durante 3
min. Se retiró el exceso de colorante con pequeños chorros de agua destilada
y se dejó secar el frotis a temperatura ambiente. Se observó a 1000 aumentos
en microscopio óptico simple, describiéndose cristales parasporales y
determinando la positividad de la muestra. Así se confirmó que se trataba
de B. thuringiensis.
2.4. Obtención de cultivos puros de Bacillus thuringiensis (ANEXO 6)
Una vez que se identificó los cristales paraesporales
de Bacillus thuringiensis mediante la observación por microscopio, se
procedió a sembrar por estría las colonias seleccionadas, en frascos de vidrio
de 10 ml. de capacidad con agar soya tripticasa inclinado y se incubó a 30°C
durante 48 horas. Posteriormente se conservó a 4°C, hasta su posterior uso.
2.5. Bioensayo de toxicidad en insecto susceptible (ANEXO 5)
Para la determinación de su actividad
entomopatógena, se trabajó con larvas del estadio 1 y 2 de Spodoptera
frugiperda procedentes del criadero de insectos del Servicio Nacional de
Sanidad Agraria del Perú (SENASA) las cuales fueron alimentadas con
hojas de Lactuca sativa, en un ambiente con 25-27ºC y un ciclo de luz:
oscuridad de 16:8 horas. (ANEXO 9)
Se propagaron los cultivos puros obtenidos, en
frascos de vidrio de mayor capacidad (120 ml.) con agar soya tripticasa
inclinado y se incubó a 30°C durante 24-72 horas Se reactivó con agua
destilada y la solución se sometió a choque término, método descrito en el
punto 2.2 para la obtención de esporas y la eliminación de células
vegetativas. Se realizó un conteo de esporas utilizando cámara de Neubauer,
para así conocer la concentración de su aplicación.
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Se evaluó 3 grupos en este bioensayo (uno por cada
cultivo de Bt seleccionado); cada grupo estaba conformado por 60 larvas del
estadio 1 y 2 divididas en 3 pocillos de 20 larvas cada uno y un grupo control
para cada grupo evaluado. Una vez conocida la concentración, se aplicó la
suspensión de esporas en el alimento de las larvas mediante la técnica de
aspersión, dejando un tiempo de exposición de 2 a 3 días; al grupo control
por cada cultivo evaluado, se le asperjó agua destilada estéril en el alimento
de las larvas.
Luego del tiempo de exposición, se registró el número
de larvas vivas y muertas, y se obtuvo el porcentaje de mortalidad con la
siguiente fórmula:
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RESULTADOS
De 15 muestras de suelo procesada, fueron obtenidas 21 colonias de Bacillus
thuringiensis, en 3 campos de cultivo, de un total de 258 colonias del Bacillus sp.
(Tabla 1).
Las colonias aisladas se obtuvieron del campo N° 4, 6 y 9, todas ellas
procedentes del suelo de cultivos de Brassica oleracea var. capitata L (“repollo”).
Siendo el campo N° 9 el de mayor porcentaje de aislamiento (47,6%) seguido del
campo N° 6 (38,1%) y finalmente el N°4 (14,3%). Los tres campos descritos se
encontraban próximos a cultivos de Fragaria sp. (“fresa”), no presentaron similares
condiciones de humedad de suelo al tacto, siendo el campo N° 4 el de mayor
humedad, y el N° 9 el de menor.
En la Figura 1 se observa las características macroscópicas del Género
Bacillus a simple vista, colonias grandes, blanquecinas, opacas, aplanadas y con
bordes irregulares, y en la Figura 2 se observa las características macroscópicas a
100 aumentos de Bacillus thuringiensis, ambas sembradas en agar soya tripticasa e
identificadas posteriormente con una coloración Gram, como bacilos Gram
positivos. (ANEXO 4)
La observación de una coloración con azul de Coomassie, a través del
microscopio de óptico simple a 1000 aumentos, demostraron la presencia de células
vegetativas de forma bacilar, formación de esporas y cuerpos de inclusión
parasporal, a las 48 horas de incubación (Figura 3), mostrando predominantemente
una morfología bipiramidal.
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Las 21 colonias de Bacillus thuringiensis obtenidas, presentaron las mismas
características morfológicas, culturales, tintoriales y forma de cristal, por lo cual,
para la evaluación de su actividad entomopatógena, se seleccionó un cultivo
representativo por cada campo positivo a Bacillus thuringiensis, los cuales se
denominaron CBt-4, CBt-6 y CBt-9.
Los 3 cultivos seleccionados presentaron actividad entomopatógena: Campo
N°4, 6 y 9 (CBt-4, CBt-6 y CBt-9 respectivamente). Durante el bioensayo frente a
Spodoptera frugiperda, en promedio de 3 grupos evaluados CBt-4, presentó un 60%
de mortalidad a las 24 horas y un 65 % a las 48 h.; CBt-6, un porcentaje de 43,5%
a las 24h. y 48,5% a las 48h.; finalmente CBt-9 presentó un 71,7% de mortalidad
a las 24 y 48 horas, siendo éste último el de una rápida respuesta entomopatógena
(Tabla 2). No se registró ninguna muerte de larvas en el grupo control.
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Tabla 1. Aislados de Bacillus thuringiensis provenientes de muestras de
suelo de los cultivos de brasicáceas en Menocucho, Laredo – Perú.
Campo (N°) de
cultivo
Brasicácea NC(Bt) Código
1 R 12(0) ---------------
2 R 17(0) ---------------
3 R 25(0) ---------------
4 R 31(3) CBt-4
5 B 22(0) ---------------
6 R 13(8) CBt-6
7 B 10(0) ---------------
8 R 8(0) ---------------
9 R 29(10) CBt-9
10 R 9(0) ---------------
11 B 18(0) ---------------
12 B 21(0) ---------------
13 B 18(0) ---------------
14 R 15(0) ---------------
15 R 8(0) ---------------
*R, repollo; B, brócoli.
**NC, número de colonias de Bacillus sp; Bt, Número de colonias de Bacillus thuringiensis
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Figura 1. Observación de las características macroscópicas de colonias del
Bacillus sp. a simple vista.
Figura 2. Observación microscópica de las características de la colonia de
Bacillus thuringiensis, a 400 aumentos. Se observa la característica particular
de bordes irregulares de Bacillus thuringiensis a las 18 horas de incubación.
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Figura 3. Observación microscópica a 1000 aumentos, coloración azul de
coomassie a un cultivo de Bacillus thuringiensis (CBt-9) de 48 horas de incubación.
Se observa morfología bipiramidal de los cuerpos parasporales (Cp), de las esporas
(E) y de células vegetativas (Cv).
Cv
Cp
E
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Tabla 2. Promedio del porcentaje de mortalidad de Spodoptera frugiperda
frente a las 3 colonias por campo seleccionadas de Bacillus thuringiensis en un
periodo de 24-48 horas de exposición y un fotoperiodo de 16:8.
Cultivo de
Bacillus
thuringiensis
Concentración
(Esporas/ml)
(x)
Porcentaje de mortalidad
(%)
(x)
24 h 48h
CBt-4 7,61 x 106 60 65
CBt-6 7,12 x 106 43,5 48,5
CBt-9 6,84 x 106 71,7 71,7
*24 y 48h, tiempo de exposición.
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DISCUSIÓN
Desde que se descubrió el potencial y efectividad como controlador
biológico de B. thuringiensis, éste ha sido aislado de diferentes partes del mundo,
(razón por la cual se le considera ubicuo). El aislamiento de B. thuringiernsis a
partir de muestras ambientales es una tarea dificultosa debido, fundamentalmente,
a la baja proporción en que se encuentra ésta especie en relación a otras especies
del grupo B. cereus que comparten el mismo hábitat7, 8.
La aplicación de tratamiento térmico controlado aplicado en la primera fase
del procesamiento de las muestras favoreció el enriquecimiento selectivo de bacilos
esporulados. Este tratamiento contribuyó a la eliminación de los microorganismos
en la fase de crecimiento vegetativo, favoreciendo la selección de dichos bacilos.
La siembra por diluciones seriadas en agar soya tripticasa, permitió el aislamiento
de colonias bien diferenciadas y la selección de aquellas que mostraban morfología
circular, irregular de color crema y textura parecida a la cera, para posteriormente
colorear con azul de coomassie, y así confirmar la presencia de cristales
parasporales e identificarlos como Bacillus thuringiensis.
En este estudio, B. thuringiensis fue aislado de muestras de suelo y sólo se
obtuvo presencia en 3 de 15 campos de cultivos de brasicáceas. Para Bullé (2003)
la presencia de B. thuringiensis en suelo agrícola, para una buena fuente de
aislamiento, oscila entre un 25-60% de las muestras procesadas, por lo cual, el 8,1%
obtenido en los campos de brasicáceas en Menocucho, Laredo-Perú nos permite
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describir, a estos campos de cultivo, como una fuente baja para el aislamiento de
esta bacteria. Pero, de acuerdo al trabajo de Ammouneh (2007)34, sobre el
aislamiento a partir de suelo agrícola (cultivos de vegetales) en Siria, con un
porcentaje de 13,2% en la presencia de Bt nativos, describe que las condiciones
para el crecimiento de Bt en suelo agrícola, depende de su interacción con las otros
bacilos del mismo Grupo, ya que es muy frecuente aislar un mayor porcentaje de
Bacillus cereus que de Bt, sin saber a ciencia a cierta, si Bt (al ser un
entomopatógeno facultativo) ha perdido la capacidad de producir cristales
parasporales y así terminar siendo descrito como B. cereus.
El éxito de aislamiento de Bt es variante en diferentes partes del mundo, hay
muchos factores asociados a ello, entre los cuales se puede mencionar a las
condiciones ambientales y las propiedades del suelo, el cual crea un ambiente
complejo que puede afectar la diversidad y densidad de la población microbiana.
Pocos estudios sobre el aislamiento de Bt han caracterizado las propiedades del
suelo, lo cual hace mucho más dificultoso que se pueda asociar directamente este
factor a la presencia de esta bacteria31.
Del 8,1% de Bt obtenidos (3 cultivos puros) en este estudio, cada uno de
ellos demostró con éxito su actividad entomopatógena frente a un huésped
susceptible como lo es Spodoptera frugiperda, siendo los porcentajes de mortalidad
relativamente altos comparados con otros estudios. Según Ibarra (2003), de 300
colonias de Bt obtenidas, menos del 1% presentaron actividad insecticida frente a
larvas Lepidópteros29. Los 3 cultivos puros de Bt obtenidos presentaron un
porcentaje de mortalidad mayor al 45%, lo cual, según Jouzani (2008) son cultivos
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potenciales para su caracterización molecular, y así identificar, si el porcentaje de
mortalidad de estos Bt se debe a la interacción de nuevos genes y toxinas aún no
descritas. Se requiere mencionar que Bt también posee otros factores de virulencia,
tales como β-endotoxinas, α-exotoxinas, hemolisinas, enterotoxinas, quitinasas y
fosfolipasas; y puede ser que algunas de ellas, trabajen en conjunto con las delta
endotoxinas (Cry) y así presentar el porcentaje de mortalidad obtenido en el
bioensayo que se realizó frente a Spodoptera frugiperda31.
Los últimos proyectos para el aislamiento de cultivos de Bt nativos con un alto
potencial de actividad entomopatógena, incluyen dentro de las muestras procesadas
(suelo y hojas), a las larvas o insectos adultos con características típicas de infección
por Bt (cese de la ingesta de alimento, poca movilidad, diarrea, oscurecimiento de
tejido y muerte); esto, según los últimos estudios es recomendable para el éxito del
aislamiento de Bt con dicha actividad, sin embargo, la desventaja de esta inclusión
(y a su vez limitación de Bt en general), es la corta permanencia de las proteínas
Cry en el ambiente34.
El 100% de cultivos muestreados presentaron como plaga a Plutella xylostella
(Orden: Lepidóptera), pero no se observó en ninguno de los campos individuos con
sintomatología de infección por este microorganismo, esto se relaciona con el bajo
porcentaje de presencia de Bt en Menocucho, Laredo-Perú (sólo un 8,1%) 33.
En conjunto, los resultados presentados nos permiten afirmar, que a partir de las
muestras de suelo de campos de cultivos de Brassica oleracea var. capitata L. se
puede aislar Bt con actividad entomopatógena, sin embargo la proporción es baja
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comparada con el aislamiento a partir de las mismas muestras en otros campos, tales
como: suelo de maíz, caña de azúcar y frutales32.
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ENUNCIADO RESUMEN
Se aisló 21 colonias de Bacillus thuringiensis a partir de suelo de cultivos
de Brassica oleracea var. capitata L en Menocucho, Laredo – Perú, de las
cuales 3 de ellas (CBt-4, CBt-6 y CBt-9) fueron evaluadas su capacidad
entomopatógena, mostrando un promedio de porcentaje de mortalidad a
Spodoptera frugiperda mayor al 45% a las 48 horas de exposición.
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RECOMENDACIONES
Se deben realizar estudios posteriores (caracterización molecular) a los
cultivos obtenidos, para identificar aquellos genes y toxinas en la actividad
entomopatógena que presentaron estos 3 cultivos identificados, cultivos que
causaron un promedio en la tasa de mortalidad mayor al 45% frente a
Spodoptera frugiperda.
Se debe realizar un estudio de campo, donde se evalué la actividad
entomopatógena de estos tres cultivos puros de Bacillus thuringiensis frente
a otras larvas de Lepidópteros plagas, en condiciones no controladas.
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ANEXOS
ANEXO 1. Mapa de Ubicación de Menocucho, y aproximación de los
campos positivos para el aislamiento de Bacillus thuringiensis, distrito de
Laredo, Perú
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Anexo 2. Campo de cultivo de brasicáceas en Menocucho, Laredo-Perú.
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Anexo 3. Ficha de muestreo.
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Facultad de Ciencias Biológicas
Escuela Académico Profesional de Microbiología y Parasitología
Laboratorio de Biotecnología
N° de la Muestra:________
Código:________
Cultivo:
Uso de insecticida:
Punto de muestreo:
Fecha y hora de muestreo:
Cantidad de muestra
Número de submuestras:
Profundidad del muestreo:
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Anexo 4 . Diagrama para el aislamiento de Bacillus thuringiensis procedentes
de muestras de suelo de brasicáceas en Menocucho, Laredo-Perú.
Toma de muestra
Pesado de la
muestra (1 gramo) Dilución (10 ml. De
Agua destilada
estéril)
Homogenización y choque
térmico (80°C por 12 minutos)
Baño de hielo
Realización de
diluciones seriadas
Siembra por superficie en
medio agar soya tripticasa
Incubación a 30 °C
por 24-48 horas.
Lectura
Coloración Gram
Coloración Azul de
Coomassie
Obtención de Cultivo Puro
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Anexo 5. Diagrama de Bioensayo, de Bacillus thuringiensis frente a
Spodoptera frugiperda
Propagación de cultivos
puros, en frascos de vidrio de
mayor capacidad (120ml) con
agar soya tripticasa
Reactivación con 10 ml.
Agua destilada estéril
Obtención de la
suspensión de Bt
Homogenización y choque
térmico (80 por 12 minutos)
Baño de hielo
Recuento de esporas en
Cámara de Neubauer a 400
aumentos en microscopio
simple.
Aplicación por aspersión
de concentración de Bt
conocida
Exposición 24 a 48 horas.
Fotoperiodo 16:8 a
Temperatura ambiental
Lectura Tasa de
Mortalidad
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Anexo 6. Cultivo puros de Bacillus thuringiensis aislado a partir de muestra
de suelo de cultivos de brasicáceas.
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Anexo 7. Observación microscópica a 1000 aumentos. Bacilos Gram
positivos, pertenecientes a cultivo puro de Bacillus thuringiensis.
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Anexo 8. Tabla del número de larvas muertas de Spodoptera frugiperda
durante el bioensayo frente a Bacillus thuringiensis, por grupo evaluado.
*G1, G2, G3. Grupo de evaluación de bioensayo 1, 2,3 respectivamente.
Cultivo representativo
de Bt
Larvas muertas (N°)
CBt-4 11 11 14 13 12 14
CBt-6 10 7 9 10 9 9
CBt-9 15 13 15 15 13 15
24 H 48 H
G1
H
G2
H
G3
H
G1
H
G2
H
G3
H
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Anexo 9. Actividad entomopatógena de Bacillus thuringiensis sobre larvas
1 y 2 de Spodoptera frugiperda.
Larva viva
Larva muerta
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