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Biosynthese des Taxols: K lonierung und Expression
des Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase-Gens
aus Taxus baccata
vorgelegt von Diplom-Chemikerin Bärbel Görhardt
aus Berlin
Der Fakultät III – Prozesswissenschaften
der Technischen Universität Berlin zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Naturwissenschaften
- Dr. rer. nat.-
genehmigte Dissertation Promotionsausschuss: Vorsitzender: Prof. Dr. sc. techn. L.-G. Fleischer Berichter: Priv.-Doz. Dr. Rainer Zocher Berichter: Prof. Dr. U. Szewzyk
Tag der mündlichen Prüfung: 19.01.2001
Berlin 2000
D 83
2
Abstract Görhardt, Bärbel Biosynthese des Taxols: Klonierung und Expression des Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase-Gens aus Taxus baccata Taxol ist ein hochwirksames Antikrebsmittel gegen Brust- und Eierstockkrebs, das in geringen Mengen in der Rinde aller Taxus-Arten gefunden wird. Taxol stellt ein hoch funktionalisiertes cyclisches Diterpen dar, das durch chemische Synthese nur schwer zugänglich ist. Durch die begrenzte Verfügbarkeit von Taxol durch natürliche Ressourcen, ist es von großem biotechnologischem Interesse, die an der Biosynthese beteili gten Enzyme zu erforschen. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Klonierung und Expression des Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase-Gens aus der Europäischen Eibe Taxus baccata. Die Taxadien-Synthase stellt ein Schlüsselenzym in der Biosynthese des Taxols dar. Sie katalysiert die Cyclisierung des Diterpens Geranylgeranylpyrophosphat zu Taxa-4(5),11(12)-dien. Für die Charakterisierung des Taxadien-Synthase-Gens wurde dieses mittels PCR amplifiziert und in Escherichia coli kloniert. Die Sequenzanalyse des Gens ergab einen offenen Leserahmen von 3980 bp, bestehend aus 13 Exons und 12 Introns. Aus dem ORF lässt sich für die Taxadien-Synthase eine Größe von 98 kDa vorhersagen. Ein Sequenzvergleich mit verschiedenen pflanzlichen Isoprensynthasen zeigte eine hohe Übereinstimmung hinsichtlich der Intron/Exon-Struktur im C-terminalen Bereich, als auch das Vorhandensein eines, in allen verglichenen Isoprensynthasen vorhandenen, konservierten Motivs DDXXD. Interessanterweise weist die Isoprensynthase aus T. baccata höhere Ähnlichkeit im mittleren Bereich der Gen-Struktur zu der Linalool-Synthase, eine Hydroxylase, aus Clarkia concinna auf als zu den anderen Isoprencyclasen. Der N-terminale Bereich der Isoprensynthase-Gene zeichnet sich durch eine hohe Variabili tät aus, da dieser Bereich für das Signalpeptid codiert, das für den Transport der Synthasen in die jeweili gen Plastide zuständig ist. Für die Expression der rekombinaten Synthase in E. coli wurde mittels RT-PCR die entsprechende cDNA isoliert, und anschließend das Protein durch Affinitäts-Chromatographie an Nickel-Agarose angereinigt. Die Ausbeute an Taxadien-Synthase betrug 20 mg/l Kulturmedium. Durch Western Blot-Analyse mit Antikörpern sowohl gegen His5-Tag als auch gegen ein Peptid aus der Taxadien-Synthase und durch GC-MS-Analyse konnte das funktionale Enzym nachgewiesen werden. Mittels SDS-PAGE unter denaturierenden Bedingungen konnte für die rekombinante Taxadien-Synthase ein Molekulargewicht von 97 kDa bestimmt werden. Im Gegensatz dazu ist für das native Protein aus T. brevifolia eine Größe von 80 kDa beschrieben worden. Diese Diskrepanz lässt den Schluss zu, dass das rekombinante Protein (Preprotein) aus einem Transitpeptid für das Plastid und der eigentlichen Isoprensynthase besteht. Ein Vergleich der Aminosäure-Sequenzen der Taxadien-Synthasen aus T. baccata, T. brevifolia und T. chinensis zeigt, dass der Verwandtschaftsgrad der Synthasen aus T. baccata und T. brevifolia untereinander höher ist als zu der Taxadien-Synthase aus T. chinensis.
Inhaltsverzeichnis
3
Inhaltsverzeichnis
Abstract ............................................................................................................2
Abbildungsverzeichnis.....................................................................................5
Abkürzungsverzeichnis....................................................................................6
Einleitung .........................................................................................................8
Taxol - ein Zytostatikum aus der Eibe................................................................................8 Wirkungsmechanismus von Taxol ......................................................................................9 Gewinnung von Taxol ........................................................................................................10 Biosynthese von Taxol........................................................................................................11 Isoprenbiosyntheseweg und andere Cyclasen ...................................................................13 Ziel dieser Arbeit ...............................................................................................................15 Materialien und Methoden ............................................................................16
Materialien ................................................................ ................................ ...... 16 1. Chemikalien....................................................................................................................16 2. Enzyme und K its............................................................................................................17 3. weitere Materialen und Geräte......................................................................................17 4. Antiseren ........................................................................................................................18 5. M ikroorganismen...........................................................................................................18 6. Vektoren und Primer .....................................................................................................18 7. DNA-Sequenzierung ......................................................................................................19 8. Medien und Puffer .........................................................................................................19 Methoden ................................................................ ................................ ......... 23 Standardmethoden.............................................................................................................23 Präparation genomischer DNA aus Taxus baccata...........................................................23 Präparation von Gesamt-RNA aus Taxus baccata............................................................24 Isolierung von Plasmid-DNA .............................................................................................25 Kompetente Zellen .............................................................................................................25 Transformation von Plasmiden .........................................................................................26 Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen .....................................................26 PCR-Reaktion ....................................................................................................................27 Southern Blot .....................................................................................................................28 RT-PCR..............................................................................................................................28 Expression von rekombinanten Proteinen ........................................................................29 Northern Blot-Analyse der Expression .............................................................................30 Aff initätsreinigung an Nickel-Agarose..............................................................................30 Bestimmung der Proteinkonzentration.............................................................................31 Polyacrylamid-Gelelektrophorese.....................................................................................31 Immunologische Detektion der Taxadien-Synthase (Western Blot) ................................32 N-terminale Aminosäuresequenzierung der exprimierten Taxadien-Synthase...............33 Enzym-Assay......................................................................................................................33
Inhaltsverzeichnis
4
GC-MS-Messung................................................................................................................34 Anlegen einer λλ-Genbank von Taxus baccata ...................................................................34 Präparieren der Host-Bakterien........................................................................................36 Bestimmen des Titers der Genbank ..................................................................................36 Screenen der Genbank.......................................................................................................36 Ergebnisse.......................................................................................................38
Präparation von DNA aus Taxus baccata..........................................................................38 Amplifizierung des Taxadien-Synthase-Gens...................................................................39 Struktur des Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase-Gens aus T. baccata ................................. 39 Vergleich der Intronbereiche verschiedener Isoprensynthasen.......................................40 Southern Blot-Analyse des T. baccata-Genoms................................................................. 41 Rekombinante Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase aus Taxus baccata.................. 42 RT-PCR..............................................................................................................................42 Expression des rekombinanten Proteins...........................................................................43 Northern Blot-Analyse der Expression .............................................................................44 Reinigung des rekombinanten Proteins............................................................................44 Immunologische Detektierung der r ekombinaten Taxadien-Synthase aus Taxus baccata............................................................................................................................................46 N-terminale Aminosäuresequenzierung der Taxadien-Synthase aus T. baccata.............47 Molekulargewichtsbestimmung der rekombinanten Taxadien-Synthase........................47 Aktivitätstest ......................................................................................................................48 Vergleich der Taxadien-Synthasen aus T. baccata, T. brevifolia und T. chinensis...........50 Alignment der Aminosäuresequenz verschiedener Isoprensynthasen aus Pflanzen .......51 Anlegen einer T. baccata-Genbank....................................................................................55 Diskussion.......................................................................................................57
Gen-Struktur der Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase aus Taxus baccata ............................57 Rekombinante Taxadien-Synthase aus T. baccata............................................................58 Vergleich der Taxadien-Synthasen aus T. baccata, T. brevifolia und T. chinensis...........59 Genbank .............................................................................................................................60 Ausblick ..............................................................................................................................61 Literatur .........................................................................................................62
Danksagung.................................................................................................... 67
Lebenslauf ......................................................................................................68
Abbildungsverzeichnis
5
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Struktur von Taxol und anderen Taxanen 7
Abbildung 2: Cyclisierung von Geranylgeranylpyrophosphat zu Taxa-4(5),11(12)-dien 10
Abbildung 3a: Biosynthese des Taxols 11
Abbildung 3b: Bildung des Oxetanrings an Baccatin III 11
Abbildung 4: Isoprenbiosynthese und die darin involvierten Enzyme 13
Abbildung 5: Struktur des Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase aus T. baccata 39
Abbildung 6: Vergleich der Gen-Struktur verschiedener Isoprensynthasen 40
Abbildung 7: Southern Blot-Analyse von T. baccata 41
Abbildung 8: Northern Blot-Analyse der Expression 43
Abbildung 9: SDS-PAGE verschiedener Reinigungsschritte der Taxadien-Synthase 44
Abbildung 10: Western Blot-Analyse der rekombinanten Taxadien-Synthase 45
Abbildung 11: Molekulargewichtsbestimmung der Taxadien-Synthase aus T. baccata 46
Abbildung 12: GC-MS-Analyse des Taxadien-Synthase-Tests 48
Abbildung 13: C-Ring-Fragmentierung von Taxadien 48
Abbildung 14: Alignment der Aminosäuresequenz verschiedener Taxadien-Synthasen 49
Abbildung 15: Alignment verschiedener Isoprensynthasen aus Pflanzen 51
Abbildung 16: Phylogenischer Stammbaum verschiedener Isoprensynthasen aus Pflanzen 54
Einleitung
6
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
AK Antikörper
Amp Ampicilli n
AS Aminosäure
ATP Adenosintriphosphat
BCIP 5-Bromo-4-chloro-3-indoylphosphat
bidest entionisiertes Wasser
bp Basenpaare
BSA Rinderserumalbumin
Ci Curie
CoA Coenzym A
cpm counts pro Minute
CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid
DMAPP Dimethylallylpyrophosphat
DNA Desoxyribonucleinsäure
dNTP Desoxyribonukleotid
E. Escherichia
Gb Gigabasenpaare
GC Gaschromatographie
GTP Guanidintriphosphat
HMG-CoA 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coa
HMWM High molecular weight marker
IPP Isopentylpyrophosphat
IPTG Isopropylthiogalactosid
Kana Kanamycin
kb Kilobasenpaare
kDa Kilodalton
KLH keyhole limpet heamocyanin (Hämocyanin der Schlüsselloch-Napfschnecke)
LB Luria-Broth
LMWM Low molecular weight marker
Mb Megabasenpaare
MCS multiple Klonierungsstelle
Einleitung
7
mRNA messenger Ribonucleinsäure
MS Massenspektrometrie
NADPH Nicotinamidadenindinucleotidphosphat
NCI National Cancer Institute
NBT Nitro Blue Tetrazolium
OD optische Dichte
ORF offener Leserahmen
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PCR Polymerase-Ketten-Reaktion
pfu Plaque formende Einheit
PVDF Polyvinylidendifluorid
RNA Ribonucleinsäure
rpm Rotation pro Minute
RT Raumtemperatur
RT-PCR Reverse Transkriptase-Polymerase-Ketten-Reaktion
SDS Natriumdodecylsulfat
TBS Tris gepufferte Kochsalzlösung
TRIS Tris(hydroxymethyl)aminomethan
U unit (Enzymeinheit)
X-Gal 5-Chloro-4-bromo-3-indoyl-ß-D-galactopyranosid
Einleitung
8
O
OH
HO AcOH
OBz
OO
O
CO
CO
NHBz
NHtBOC
OH
OH
R2
R1
R1=Ac; R2=(1a)
Taxol
(1b) R1=H; R2=
Taxotére
(1c) R1=R2=H
R1=Ac; R2=H(1d) Baccatin III
10-Deacetylbaccatin III
Abbildung 1: Struktur von Taxol und anderen Taxanen
Einleitung
Die Taxa-4(5),11(12)-dien-Cyclase aus Taxus baccata katalysiert den ersten entscheidenden
Schritt zur Biosynthese des Taxols. Als erstes soll hier beschrieben werden was Taxol ist,
welche Wirkungsweisen Taxol aufweist.
Da die Taxadien-Synthase den Klassen der Terpencyclasen zuzuordnen ist, wird auch
vorgestellt, welche Cyclasen schon beschrieben sind und wie die Taxadien-Synthase darin
einzuordnen ist.
Taxol - ein Zytostatikum aus der Eibe Taxol ist ein hoch funktionalisiertes cyclisches Diterpen, das in sehr geringen Mengen in allen
Taxus-Arten gefunden wurde (Wani et al., 1971; Strobel et al., 1996). Als erstes wurde es aus
der Rinde der Pazifischen Eibe, Taxus brevifolia, isoliert (Wani et al., 1971). Im Rahmen
eines groß angelegten Screening-Programms des
National Cancer Institute (NCI, Maryland, USA) zur
Suche nach neuen Naturwirkstoffen sammelte der
Botaniker Arthur Barcley auch Proben aus der Rinde der
Pazifischen Eibe. 1964 wurde am Research Triangle
Institute (North Carolina, USA) im Labor von Wall und
Wani die cytostatische Wirkung von Extrakten dieser
Proben auf Leukämiezellen nachgewiesen. Zwei Jahre
später isolierten Wall und Wani diesen wirksamen
Bestandteil und gaben ihm den Namen Taxol1, in
Anlehnung an die Eibe (Gattung Taxus). 1971 gelang es
ihnen, die Struktur zu entschlüsseln. Abb. 1
Taxol erwies sich in klinischen Tests als hochwirksam
gegen Eierstock- und Brustkrebs (McGuire et al., 1989;
Rowinsky et al., 1990; Holmes et al., 1991; Rowinsky
und Donehower, 1991). Insbesondere bei der
Behandlung des Ovarialkarzinoms konnten mit
1 Taxol ist ein registriertes Warenzeichen von Bristol-Myers Squibb. Paclitaxel ist der generische Name. Aufgrund des höheren Bekanntheitsgrades wird hier jedoch weiterhin der Name Taxol verwendet.
Einleitung
9
Taxol Erfolge bei Patientinnen erzielt werden, bei denen andere Zytostatika versagt hatten.
Dabei zeigte sich Taxol in 30% der Fälle mit beherrschbaren Nebenwirkungen wirksam. Ein
Problem stellte jedoch die sehr geringe Wasserlöslichkeit von Taxol dar, deren Verbesserung
durch den Lösungsvermittler Cremaphor® bei der Behandlung eine akute
Überempfindlichkeit hervorruft, so dass eine Vorbehandlung mit Antihistaminen notwendig
ist. Neuere Forschungsansätze versuchen durch Einbinden von Taxol in Liposome die
Wasserlöslichkeit zu erhöhen und so die akute Toxizität zu erniedrigen (Sharma et al., 1993;
Balasubramanian et al., 1994). Seit 1993 ist Taxol zur Behandlung des fortgeschrittenen
Ovarialkarzinoms in den USA, seit 1994 auch in Deutschland zugelassen.
Wirkungsmechanismus von Taxol Ähnlich wie andere Cytostatika greift Taxol in den Mitosezyklus ein. Im Gegensatz jedoch zu
Substanzen wie Colchicin, Vinblastin und Vinchristin, welche das Gleichgewicht zwischen
Tubulindimeren und Mikrotubuli in Richtung Tubulindimere verschieben, stabili siert Taxol
die Mikrotubuli (Schiff et al., 1979; Schiff und Horowitz, 1980). Die Mikrotubuli bilden das
Cytoskelett der Zelle und sind u.a. bei der Zellteilung zur Ausbildung der mitotischen Spindel
in der Mitose nötig. Die Mikrotubuli werden aus zwei strukturell verwandten Proteinen von
jeweils 50 kDa, dem α- und dem β-Tubulin, die sich zu einem Tubulindimer zusammen
lagern, gebildet. In Gegenwart von GTP und Magnesiumionen wird jeweils die
α-Untereinheit eines Dimers mit der β-Untereinheit des nächsten verknüpft, so dass sich
Protofilamente ausbilden, die in alle Richtungen weiterwachsen, bis die Randfilamente zu
einem Mikrotubulus verschmelzen und das weitere Wachstum an den Enden des Tubulus
erfolgen kann. Hierbei entsteht ein Gleichgewicht zwischen Wachstum und Zerfall der
Mikrotubuli. Nach einer bestimmten Zeit erreichen Mikrotubulus und freies Tubulin ihre
sogenannte kritische Konzentration, bei denen die Zerfalls- und Wachstumsrate des
Mikrotubulus ausgeglichen ist, also kein weiteres Wachstum stattfindet. Ein normaler
Mikrotubulus aus Gehirntubulin besteht aus 13 Protofilamenten und hat einen Durchmesser
von ca. 24 nm.
Cytostatika wie Cholchicin binden an die β-Untereinheit des Tubulindimers und verhindern
so die Polymerisation zu den Mikrotubuli. Taxol dagegen stabili siert die Mikrotubuli, in dem
es die kritische Konzentration des Tubulins gegen null herabsetzt und außerdem die
Induktionszeit für die Polymerisation sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von GTP
und Magnesiumionen verkürzt. Die so gebildeten Mikrotubuli bestehen nur aus 12
Einleitung
10
Protofilamenten und haben einen Durchmesser von 22 nm und können deshalb nicht zur
Bildung der bei der Zellteilung erforderlichen mitotischen Spindel verwendet werden. Da die
unter dem Einfluss von Taxol gebildeten Mikrotubuli auch eine große Resistenz gegenüber
Depolymerisation durch Kälte oder Zugabe von Calciumionen zeigen, ist die so erzielte
Hemmung der Zellteilung außerordentlich effektiv. Gesunde Zellen besitzen einen
Kontrollmechanismus, der gewährleistet, dass die Zellteilung nur bei korrekter Ausbildung
der mitotischen Spindel weiter abläuft. Tumorzellen dagegen besitzen diesen
Kontrollmechanismus nicht, so dass eine Zelle ohne korrekte mitotische Spindel abstirbt oder
eine extreme Veränderung ihres Metabolismus erfährt (Nicolaou et al., 1994a).
Gewinnung von Taxol Da Taxol nur zu 0,02% des Trockengewichtes in der Rinde von Taxus brevifolia enthalten ist
(Wani et al., 1971), jedoch für die Behandlung eines Patienten 2 g benötigt werden, wurde
nach Alternativen zur Gewinnung von Taxol gesucht. Eine Variante ist die Totalsynthese von
Taxol im Labor. 1994 wurden unabhängig von einander durch Nicolaou und Mitarbeiter und
Holton und Mitarbeiter chemische Totalsynthesen von Taxol veröffentlicht, die aber für eine
Anwendung im großtechnischen Bereich zu aufwendig und zu ineffizient sind (Nicolaou et
al., 1994b; Holton et al., 1994). Seit 1993 wird Taxol kommerziell auf semisynthetischem
Weg ausgehend von den Vorstufen Deacetylbaccatin III oder Baccatin III hergestellt (Holton
et al., 1995). Diese werden aus nachwachsenden Eibennadeln extrahiert. Ebenfalls
halbsynthetisch wird Taxotère® produziert, ein Analogon, das sich strukturell an zwei Stellen
von Taxol unterscheidet und eine bessere Wasserlöslichkeit als dieses aufweist. (Taxotère ist
ein registriertes Warenzeichen von Rhône-Poulenc Rorer. Der generische Name ist
Docataxel.) (Guérnard et al., 1993) Abb. 1.
Eine andere Möglichkeit der Gewinnung von Taxol besteht in der Züchtung von
Pflanzenzellkulturen, welche gegenüber der intakten Pflanze den Vorteil der einfacheren
Extraktion der Metaboliten sowie einer leichteren Manipulation haben. (Yukimune et al.,
1996). Die Produktionsraten sind für eine ökonomische Nutzung immer noch zu gering, aber
wegen der leichten Handhabbarkeit der Zellkulturen sind diese sehr nützlich für die
Untersuchungen der Biosynthese von Taxanen.
Die Entdeckung von Stierle und Strobel 1993 ermöglichte eine weitere Variante der Taxol-
Gewinnung. Sie konnten einen endophyten Pilz von Taxus brevifolia isolieren, der
unabhängig von seiner Wirtspflanze Taxol und andere Taxane in sehr geringen Mengen
Einleitung
11
produziert (Stierle et al., 1993). Sie nannten den Pilz Taxomyces andreanae. Bei der im
Himalaja vorkommenden Eibe Taxus wallachiana fand man den Pilz Pestalopsis microspora
als Taxolproduzenten (Strobel et al., 1996). Eine Untersuchung an anderen Koniferenarten,
die in sumpfigen Gebieten wachsen, führte zur Entdeckung mehrerer Stämme von
P. microspora, die nachweislich Taxol produzieren. Der Wirt war aber nicht die Eibe, sondern
die Zypresse Taxodium distichum (Li et al., 1996). Die aus dem Anzucht-Medium der
einzelnen Stämme extrahierten Taxolmengen unterschieden sich sehr stark. Es wurde
vermutet, dass aufgrund eines unregelmäßigen sektorartigen Mycelwachstums eines
Hochproduzenten dieser genetisch instabil ist. Diese These würde die Theorie stützen, dass
die isolierten Pilze die Fähigkeit, Taxol zu synthetisieren, von der Eibe durch einen
horizontalen Gentransfer erworben haben.
Biosynthese von Taxol Taxol ist strukturell ein sehr komplexer Vertreter der Familie der Taxoide und durch ein
tricyclisches Triterpen-Taxan-Ringsystem gekennzeichnet. Nicht zuletzt sind 12 verschiedene
enzymatische Reaktionen in der Taxolbiosynthese involviert (Walker und Croteau, 2000a).
Als ersten entscheidenden Schritt in der Biosynthese des Taxols wurde die elektrophile
Cyclisierung von Geranylgeranylpyrophosphat über die kationischen Zwischenstufen des
Verticill en und Cembren zu Taxa-4(5),11(12)-dien charakterisiert (Koepp et al., 1995; Lin et
al., 1996) Abb. 2. Diese Reaktion wird von dem Enzym Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase
katalysiert und diese Synthase wurde zum ersten Mal von Hezari und Mitarbeiter 1995 aus
der Pazifischen Eibe Taxus brevifolia isoliert (Hezari, et al., 1995). Die Klonierung des
Taxadien-Synthase-Gens aus T. brevifolia gelang 1996 Wildung und Croteau.
1
+ +
1 23
45
1112
12 11
421+
53 A B C
Geranylgeranylpyrophosphat
Verticillyl-Kation
Taxenyl-Kation Taxa-4(5),11(12)-dien
OPP H H
H
H
HH
H
H
Abbildung 2: Cycli sierung von Geranylgeranylpyrophosphat zu Taxa-4(5),11(12)-dien in der Taxolbiosynthese
Einleitung
12
Der Schritt, der zu einer Umlagerung der Doppelbindung in die 4,20-Position (exo) führt,
wurde ebenfalls aufgeklärt (Hefner et al., 1996). Diese Umlagerung geht einher mit einer
α-Hydroxylierung an Position 5 Abb. 3a. Das verantwortliche Enzym stellte sich als
NADPH-abhängige P450-Oxygenase heraus.
Die Acetylierung von Taxa-4(20),11(12)-dien-5α-ol zu Taxa-4(20),11(12)-dien-5α-yl-acetat
durch eine O-Acetyltransferase wurde ebenfalls charakterisiert (Walker et al., 1999a)
(Abb. 3a). Auch das dazugehörige Gen der 5α-ol-Transacylase aus Taxus cuspidata ist
kloniert und in E. coli exprimiert (Walker et al., 2000b).
Welche Reaktionen zur Bildung des charakteristischen Oxetanrings führen, ist noch nicht
sicher, man geht jedoch davon aus, dass diese eine Epoxidierung der 4,20-Doppelbindung
beinhalten (Guéritte-Voegelein et al., 1987) Abb. 3b.
Späte Schritte der Taxol-Biosynthese (Acetylierungen und Benzylierungen) sind bisher nur
teilweise aufgeklärt. Für die Acetylierung von 10-Deacetylbaccatin III zu Baccatin III wurde
OH
H
H H
H
H
H
OAc
HOAc
O
HO
OH
OHO
OBz
HO
HOAc
O
HO
OH
OHO
OBz
AcO
HOAc
O
OH
OHO
OBz
R1O
R2O
Taxa-4(5),11(12)-dien Taxa-4(20),11(12)-dien-5α-ol Taxa-4(20),11(12)-dien-5α-yl acetat
10-Deacetylbaccatin III Baccatin III Taxol: R1=Ac
R2= N-Bz Phenylisoserinyl
Taxotére: R1=H
R2= N-tBOC Phenylisoserinyl Abbildung 3a: Biosynthese des Taxols a) Hydrolysierung von Taxadien zu Taxadien-5α-ol durch Taxadien-5α-Hydroxylase; b) Acetylierung von Taxadien-5α-ol durch Taxa-4(20),11(12)-dien-5α-ol-O-Acetyltransferase; c) Acetylierung von 10-DAB III zu Baccatin III durch 10-DAB III -10-O-Acetyltransferase und d) Verknüpfung der Seitenkette mit Baccatin III zu Taxol.
45
20 20
54
54
20
54
20
OH OAcO
OAc OAcO
4(20)-en-5α-ol 4(20)-en-5α-yl acetat 4(20)-epoxy-5α-yl acetat 4-acetoxy-oxetan
Abbildung 3b: Bildung des Oxetanr ings an Baccatin III
Einleitung
13
bereits das verantwortliche Enzym, eine spezifische O-Acetyltransferase, in Wurzeln von
Taxus baccata nachgewiesen (Zocher et al., 1996) und das entsprechende Gen aus Taxus
cuspidata funktionell in E. coli exprimiert (Walker und Croteau, 2000a).
Die für die Antitumoraktivität essentielle Phenylisoserin-Seitenkette wurde ebenfalls
eingehend untersucht. So wird zuerst Benzoylphenylisoserin mit dem Taxangrundkörper
kondensiert und die Seitenkette später modifiziert.
Isoprenbiosyntheseweg und andere Cyclasen Schon seit über zehn Jahren werden verschiedene Pflanzengene kloniert, die in der
Isoprenbiosynthese involviert sind. Die Grundlage aller Isoprenbiosynthesen ist die Synthese
von Isopentenylpyrophosphat (IPP) und dessen Isomer Dimethylallylpyrophosphat (DMAPP).
Für deren Bildung sind zwei verschiedene Synthesewege möglich. Ausgehend von
Acetoacetyl-CoA, Acetyl-CoA und H2O wird das daraus gebildete 3-Hydroxy-3-methyl-
glutaryl-CoA (HMG-CoA) durch eine Reduktase im Cytosol zu Mevalonsäure reduziert. Die
Mevalonsäure wird durch ATP-abhängige Reaktionen in IPP umgewandelt. Wahrscheinlicher
ist aber ein alternativer Biosyntheseweg, der in den Chloroplasten abläuft, bei dem IPP aus
Pyruvat und Glycerinaldehyd-3-phosphat gebildet wird Abb. 4.
Abbildung Abb. 4 gibt einen Überblick über die Verknüpfung der Isopreneinheiten durch die
jeweili gen, an den Reaktionen beteili gten Enzymen und deren Produkte.
1 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-coenzym A-Reductase
5 Geranylgeranylpyrophosphatsynthase 6 Hexaprenylpyrophosphat-Synthase - verwandtes Protein
4 Farnesylpyrophosphat-Synthase 3 Mevalonat-5-pyrophosphat-Decarboxylase 2 Mevalonsäurekinase
11 5-epi-Aristolochensynthase10 4s-Limonensynthase 9 s-Linanoolsynthase 8 Chrysanthemylpyrophosphatsynthase 7 Isopentenylpyrophosphatisomerase
15 Squalenepoxidase14 Squalensynthase
12 Vetispiradiensynthase13 (+) δ -Cardiensynthase
16 Oxidosqualencyclase (Cycloartenolsynthase)
20 ent-Copalylpyrophosphatsynthase A21 ent-Kaurensynthase
19 Casbensynthase18 Abietadiensynthase17 Geranylgeranylpyrophosphathydrogenase
26 Lycopencyclase (b)
24 Phytoendesaturase23 Phytoensynthase22 Taxadiensynthase
25 ζ -Carotendesaturase
30 Violaxanthindeeopxidase29 Zeaxanthinepoxidase
27 Lycopencyclase (e)28 β -Carotenhydroxylase
Einleitung
14
Aus Abb. 4 ist ersichtlich, dass sowohl die Abietadien-Synthase aus Tanne (Abies grandies,
LaFever et al., 1994) als auch die Casben-Synthase aus Rhizinus (Ricinus communis L, Mau
and West, 1994), die ent-Kauren-Synthase aus Kürbis (Curcurbita maxima L, Yamaguchi et
al., 1996) wie die Taxadien-Synthase der Familie der Diterpen-Synthasen zuzuordnen sind.
Alle diese Synthasen katalysieren die Cyclisierung von Geranylgeranylpyrophosphat zu
einem jeweils unterschiedlichen Produkt. Weitere Isoprencyclasen sind die Linalool-Synthase
und Limonen-Synthase; beide zu der Familie der Monoterpen-Synthasen gehörend und an der
Cyclisierung des Geranylphosphats beteili gt. Die Linalool-Synthase aus einer Kanadischen
Geranylgeranylpyrophosphat
Solanesylpyrophosphat
Kautschuk
HMG-CoA
Mevalonsäure
Mevalonsäure-5-phosphat
Mevalonsäure-5-pyrophosphat
Isopentylpyrophosphat (IPP)
Geranylpyrophosphat
Farnesylpyrophosphat
Alternativer Pathway in Chloroplasten
Pyruvat Glycerinaldehyd- 3-phosphat
+
?
Dimethylallylpyrophospat
Chrysanthemylpyrophosphat
tRNA
Cytokinin
Ergoline
Isoprene
Monoterpene LinaloolLimonen
z.B.:
IPP
Indolalkaloide
Sesquiterpene
Squalene
IPP
5 IPP
viele IPP
Triterpene
PhytolTocopheroleDiterpene Abietadien
Casbenent-KaurenTaxol
z.B.:
Phytoen
Zeaxaethin
Lycopen -Carotinα
Lutein
Ubichinon-45
Plastochinon
Violaxanthin
Abscisic Säure
Neoxanthin
Solanesyl-50-pyrophosphat Ubichinon-50
IPP
z.B.: 5-epi-AristolochenVetispiraden
-Cardinenδ(+)
-Carotinζ
-Carotinβ
1
2
4,5
3
5
4,5
6?
6?
7 8
9,10
11,12,13
x 2 14
17
x 2 23
18,19,20,21,
22
24
25
26
28
17
26,27
30
29
28+
2626
z.B.: Cycloartenolvia 2,3-Oxidosqualen
15,16
Abbildung 4: Isoprenbiosynthese und die dar in involvierten Enzyme Rot markiert ist der für diese Arbeit wichtige Weg der Biosynthese des Taxols ausgehend von Geranylgeranylpyrophosphat. Diese Abbildung wurde der Veröffentli chung von Scolnik und Bartley, 1996 entnommen.
Einleitung
15
Wildblume (Clarkia breweri) wurde 1998 isoliert (Cseke et al., 1998). Mittlerweile sind auch
verschiedene Limonen-Synthasen aus unterschiedlichen Pflanzen bekannt (Yuba et al., 1996;
Colby et al., 1993 und Adam et al., 1996). Eine weitere Familie sind die Sesquiterpen-
Synthasen, welche die Cyclisierung des Farnesylpyrophosphates katalysieren. Vertreter dieser
Familie sind die 5-epi-Aristolochen-Synthase aus Tabak (Nicotiana tabacum; Facchini and
Chappel, 1992), Vetispiraden-Synthase aus Ägyptischem Bilsenkraut (Hyoscyamos muticus;
Back and Chappel, 1995) und die (+)-δ-Cardinen-Synthase aus Baumwolle (Gossypium
hirsutum L; Davis et al., 1998).
Ein Vergleich der verschiedenen Terpencyclasen auf Aminosäurebasis zeigt Bereiche, die
hoch konserviert sind. Vor allem das aspartatreiche Motiv DDXXD ist sowohl für alle
Terpencyclasen als auch für die Farnesyldiphosphat-Synthase beschrieben worden; und es
wird vermutet, dass dieses Motiv für die Bindung des Komplexes aus zweiwertigen
Metalli onen und der jeweili gen Prenyleinheit verantwortlich ist (Starks et al., 1997). Allen
Isoprencyclisierungen geht eine Katalysierung der Ionisation und elektrophilen Reaktion des
Allyl-Diphosphatesters voraus. Wahrscheinlich ist diese Reaktion die Basis der evolutionären
Entwicklung dieser Klasse von Enzymen (Cane und Kang, 2000).
Ziel dieser Arbeit
Einen wichtigen Beitrag zur Aufklärung des Biosyntheseweges des Taxols leistet die
strukturelle und funktionelle Charakterisierung der an der Synthese beteili gten Enzyme. Ein
Schlüsselenzym der Biosynthese des Taxols stellt die Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase dar.
Ziel dieser Arbeit war es, das Gens der Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase aus Taxus baccata
zur Aufklärung der Struktur mittels PCR zu amplifizieren, zu klonieren und in E. coli zu
exprimieren. Des Weiteren sollten Homologievergleiche mit bekannten Taxadien-Synthasen
und anderen Isoprensynthasen aus Pflanzen durchgeführt werden.
Materialien und Methoden
16
Materialien und Methoden
Materialien
1. Chemikalien
Gebräuchliche Chemikalien in p.a. Qualität wurden von den Firmen Sigma, Deisenhofen;
Merck, Darmstadt und Fluka, Neu-Ulm bezogen.
Acrylamid Life Technologies, Karlsruhe
Agarose Sigma, Deisenhofen
Antipain, Leupeptin, Pepstain Sigma, Deisenhofen
Bactotrypton Becton Dickinson, Heidelberg
BCIP/NBT-Tabletten Sigma, Deisenhofen
Benzamidin Sigma, Deisenhofen
Bromphenolblau Serva, Heidelberg
BSA Sigma, Deisenhofen
Coomassie Brill ant Blue Serva, Heidelberg
DTT AppliChem GmbH, Darmstadt
EDTA Merck, Darmstadt
Glycin Sigma, Deisenhofen
Hefeextrakt Becton Dickinson, Heidelberg
HMWM Sigma, Deisenhofen
Imidazol Merk, Darmstadt
IPTG AppliChem GmbH, Darmstadt
isoPropanol Merck, Darmstadt
Mercaptoethanol Merck, Darmstadt
NAOH Merck, Darmstadt
Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) Amresco, Biometra, Göttingen
Ponceau S Sigma, Deisenhofen
PMSF Serva, Heidelberg
SDS Fluka, Neu-Ulm
TEMED Serva, Heidelberg
Tris-HCl Sigma, Deisenhofen
Tween-20 Merk, Darmstadt
Materialien und Methoden
17
X-Gal AppliChem GmbH, Darmstadt
2. Enzyme und K its
DNase I Sigma, Deisenhofen
Restriktionsenzyme Life Technologies, Karlsruhe
T4-DNA-Ligase Life Technologies, Karlsruhe
Tag-DNA-Polymerase Life Technologies, Karlsruhe
DNeasy Plant Mini/Maxi-Kit Qiagen, Hilden
RNeasy Plant Mini-Kit Qiagen, Hilden
RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden
Plasmid-Midi/Maxi-Kit Qiagen, Hilden
Gel-Extraktions-Kit Qiagen, Hilden
QIAprep-Spin-Kit Qiagen, Hilden
Enhanced Avian RT-PCR Kit Sigma, Deisenhofen
QIAexpressionistâ Qiagen, Hilden
Lambda DASHâ II /BamHI Vector Kit Stratagene, Heidelberg
Gigapackâ III XL Packaging Extract Stratagene, Heidelberg
3. weitere Materialen und Geräte
Mikrotiterplatten Dynatech, Denkendorf
Nitrocellulose(BA85)-Membran Schleicher&Schuell, Dassel
PVDF-Membran Schleicher&Schuell, Dassel
Spannungsquelle Life Technologies, Karlsruhe
Gel-Apparaturen Hoefler,
Fastblot-Apparatur Biometra, Göttingen
Tankblot-Apparatur Werkstatt, TU Berlin
Liquid Scintill ation Counter 1409 Wallac, Turku, Finnland
Tischzentrifuge Heraeus Christ,
Kühlzentrifuge Sorvall, Newton, Conneticut, USA
Rotoren GSA und SS34 DuPont, Boston, USA
Transill uminator Herolab
Agarosegelelektrophorese Werkstatt, TU Berlin
Materialien und Methoden
18
PCR-Cycler Uno Thermoblock II Biometra, Göttingen
Spektralphotometer Kontron Instruments,
clean bench Weidner, Hamburg
Microelisa Auto Reader MR 580 Dynatech, Denkendorf
Peptid Sequenzer
ProciseTM Protein Sequencing System Applied Biosystem (Perkin Elmer), Norwalk,
USA
4. Antiseren
Polyklonales Antiserum aus Kaninchen gegen Taxadien-Synthase aus Taxus baccata.
5. M ikroorganismen
E. coli XL1-Blue (Bullock et al., 1987)
E. coli M15[pREP4] (Zamenhofer and Vill arejo, 1972)
E. coli P2392 (Kretz and Short, 1989)
6. Vektoren und Primer
Vektoren
pBlueskript pBBSK+ (Stratagene)
pCR®2.1-TOPO (Invitrogen)
pQE31 (Qiagen)
PCR-Primer
Start- und Stopcodons sind fett und Restriktionsschnittstellen kursiv markiert.
TBC1A 5’-ATGGCTCAGCTCTCATTTAAT (TIBMOL, Berlin)
TBC2A 5’-TCATACTTGAATTGGATCAAT (TIBMOL, Berlin)
TBC1B 5’-GGAATTCCATGGCTCAGCTCTCATTTAAT (metabion, Ebersberg)
TBC2B 5’-AGGGCCCTCATACTTGAATTGGATCAAT (metabion, Ebersberg)
TBC3 5’-CGGGATCCTTAGAAA TGGCAAAA TTGGACTTCAAT (metabion,Ebersberg)
TBC4 5’-GGAATTCAGCATAAGTCCTTAAGTACTCTTCAAA (metabion, Ebersberg)
Materialien und Methoden
19
Sequenzierungsprimer
Reverse Primer 5’-AACAGCTATGACCAT (Stratagene)
T7 Primer 5’-AATACGACTCACTATAG (Stratagene)
TBS1 5’-GCAACACTAGATGAATTG (TIBMOL, Berlin)
TBS2R 5’-CTCCGCCAATCGGTGTCG (TIBMOL, Berlin)
TBS3 5’-GCAAGTTTGCATACACTC (metabion, Ebersberg)
TBS3A 5’-GCCACTAGAATTGCCTTC (metabion, Ebersberg)
TBS4 5’-CCAAGAACGGGCAGATGA (metabion, Ebersberg)
TB4A 5’-CTACTTTCCAAGAACGGG (metabion, Ebersberg)
TBS5 5’-CTCACCTATATAGAGTCT (metabion, Ebersberg)
TBS6 5’-AGATCCACCACGCTTCTC (metabion, Ebersberg)
TBS7 5’-GCGTTGGGGATCAATCTT (metabion, Ebersberg)
TBS8R 5’-GTCTGCTGCCGCAGAAA C (metabion, Ebersberg)
TBS9R 5’-TTACTCAAA GATGGCATT (metabion, Ebersberg)
pQE/forward 5’-CGGATAACAATTTCACACAG (TIBMOL, Berlin)
pQE/reverse 5’-GTTCTGAGGTCATTACTGG (TIBMOL, Berlin)
cTBCycS1 5’-GGGGATCTGTGGCACCAC (metabion, Ebersberg)
cTBCycS2R 5’-GCTCAAGGATACAAGCTC (metabion, Ebersberg)
cTBCycS3R 5’-AAGGACTTGTAAA CAACC (metabion, Ebersberg)
7. DNA-Sequenzierung
Die Sequenzierung der DNA wurde von der Firma Martin Meixner, Berlin durchgeführt. Zum
Einsatz kam dabei ein ABI373 DNA sequencing system von Applied Biosystem unter der
Verwendung von BigDye-Terminator cycle sequencing-Kit von Perkin-Elmer.
8. Medien und Puffer
LB-Medium 10 g NaCl, 5 g Hefeextrakt, 10 g Bactotrypton auf 1 l H2O. Festes Medium
enthielt 2 % Agar. Zur Selektion auf ampicilli nresistente (und kanamaycinresistente)
Plasmide wurde Ampicilli n (100 µg/ml) (und Kanamycin [25 µg/ml]) zugegeben. Das
Medium wurde bei 121 °C 20 min autoklaviert.
LB Top Agar 0,7% (w/v) Agarose auf 1 l LB-Medium
Materialien und Methoden
20
TBS-Tween 25 mM Tris-HCl pH 7,4, 16 g NaCl, 0,4 g KCl, 2 ml TWEEN 20 auf 2 l H2O
Puffer1 50 mM Glucose, 10 mM EDTA pH 8,0; 25 mM Tris-HCl pH 8,0
Puffer2 0,2 N NaOH, 1% SDS
Puffer 3 3 M KOAc pH 5,5
Blotpuffer A 14,4 g Glycin, 3,0 g Tris-HCl, 200 ml Ethanol (techn.) auf 1 l H2O
Blotpuffer B 14,4 g Glycin, 3,0 g Tris-HCl, 100 ml Methanol (techn.) auf 1 l H2O
20 x SSC 3,6 M NaCl, 0,2 M NaH2PO4•H2O, 0,02 EDTA, pH 7,7
Elektrophoresepuffer 28,8 g Glycin, 6,0 g Tris-HCl, 4,0 g SDS auf 2 l H2O
50 x TAE 242 g Tris-HCl, 57,1 ml Eisessig, 100 ml EDTA, pH 8,0 auf 1 l H2O
5 x TBE 54 g Tris-HCl, 27,5 g Borsäure, 20 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0 auf 1 l H2O
Hybridisierungspuffer 5x SSPE, 5x Denhardts-Lsg., 0,5% SDS
Waschpuffer 1 2x SSPE, 0,1% SDS
Waschpuffer2 1x SSPE, 0,1% SDS
Waschpuffer3 0,1x SSPE, 0,1% SDS
Aufschlusspuffer 50 mM NaH2PO4 pH 8,0, 300 mM NaCl, 10% Glycerin, 1 mM
ß-Mercaptoethanol, 10 mM Imidazol, 0,7 µg/ml Pepstain, 30 µg/ml Chymostatin, 50 µg/ml
Antipain
Waschpuffer 50 mM NaH2PO4 pH 8,0, 300 mM NaCl, 10% Glycerin, 1 mM
ß-Mercaptoethanol, 20 mM Imidazol
Materialien und Methoden
21
Elutionspuffer 50 mM NaH2PO4 pH 8,0, 300 mM NaCl, 10% Glycerin, 1 mM
ß-Mercaptoethanol, 250 mM Imidazol
Assaypuffer 25 mM Hepes pH 8,0, 10% Glycerin
Bradford-Reagenz 100 mg Coomassie Brill ant Blue, 50 ml Ethanol p.a., 100 ml 85%ige
Phosphorsäure auf 1 l H2O
Auftragspuffer 50 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 100 mM DTT, 0,1% Bromphenolblau,
10% Glycerin
Coomassie Brillant Blue-Lösung 1 g/l Coomassie Brill ant Blue in 50% Methanol und 10%
Essigsäure
Ponceau S-Lösung 1 mg/ml Ponceau S, 5 % Essigsäure in H2O
TBF1 100 mM RbCl, 50 mM MnCl2, 30 mM Natriumacetat, 10 mM CaCl2, 15% Glycerin,
pH 5,8; steril filtrieren
TBF2 10mM MOPS, 10 mM RbCl, 75 mM CaCl2, 15% Glycerin, mit KOH auf pH 6,8
einstellen und steril filtrieren
SM-Puffer 50,0 ml 1 M Tris-HCl pH 7,5; 5,8 g NaCl, 2,0 g MgSO4•7H2O, 5,0 ml 2%ige
Gelatine auf 1 l H2O
1,2% FA-Gel (130 ml) 1,56 g Agarose, 13 ml 10x FA-Gelpuffer, auf 117 ml RNase-freies
Wasser
10x FA-Gelpuffer 200 mM MOPS, 50 mM Natriumacetat, 10 mM EDTA, pH 7,0 mit
NaOH einstellen
1x FA-Laufpuffer 100 ml 10x FA-Gelpuffer, 20 ml 37% (=12,3 M) Formaldehyd, 880 ml
RNase-freies Wasser
Materialien und Methoden
22
5x RNA Ladepuffer 16 µl gesättigte Bromphenolblau-Lösung 80 µl 500 mM EDTA,
pH 8,0, 720 µl 37%iges Formaldehyd, 2 ml Glycerin, 3,084 ml Formamid, 4 ml 10x FA-
Gelpuffer auf 10 ml mit RNase-freies Wasser
Materialien und Methoden
23
Methoden
Standardmethoden
Standardmethoden wie Restriktionsanalyse, Agarose-Gelektrophorese, Southern/Northern
Blot-Analyse und Ligation wurden nach Sambrook et al. (1989) durchgeführt.
Präparation genomischer DNA aus Taxus baccata
Methode 1
Eine in dem Labor der Arbeitsgruppe Zocher etablierte Methode zur Isolierung und
Reinigung von chromosomaler DNA ist die Beschreibung von E. M. Möller (Möller et al.,
1992). Durch eine CTAB-Fällung sollen die von Pilzen und Pflanzen vermehrt produzierten
Polysaccharide abgetrennt werden, da diese nur eine inakzeptable Quantität an Isolierung von
DNA erlauben.
100 mg frisch geernteter Wurzeln von T. baccata wurden in flüssigem Stickstoff
schockgefroren und fein zermörsert. Das Homogenat wurde in 500 µl TES-Puffer
aufgenommen, und nach der Zugabe von 50-100 µg Proteinase K wurde der Ansatz 1 h bei
60 °C unter gelegentlichem Schütteln inkubiert. Nach Zugabe von 140 µl 5 M NaCl-Lösung
und 65 µl 10%iger CTAB-Lösung wurde für weiterer 10 min bei 65 °C inkubiert.
Anschließend wurden 700 µl Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) zugegeben, gemischt und für
30 min auf Eis inkubiert. Es folgte eine Zentrifugation für 10 min bei 13.000 rpm und 4 °C.
Der Überstand wurde in ein frisches Eppendorftube überführt und 225 µl 5 M NH4Ac-Lösung
zugegeben, für 30 min auf Eis inkubiert und bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde
abgenommen, und zur Präzipitation der DNA wurden 500 µl isoPropanol gegeben. Nach einer
sofortigen Zentrifugation (5 min bei 13.000 rpm) wurde der Überstand verworfen, das Pellet
zweimal mit 70%igem Ethanol gewaschen und anschließend getrocknet. Die DNA wurde in
50 µl TE-Puffer aufgenommen.
Methode 2
Die Präparation der genomischen DNA erfolgte mit einem DNeasy Plant Kit der Firma
Qiagen laut Angaben des Herstellers.
Dazu wurden entsprechende Mengen frisch geernteter Wurzeln der Europäischen Eibe in
flüssigem Stickstoff schockgefroren und in einem Mörser zu feinem Pulver zerrieben. Die
Materialien und Methoden
24
weitere Aufarbeitung erfolgte analog der Anleitung des Kits.
Methode 3
Als 3. Methode zur DNA-Präparation wurde die Methode von Ziegenhagen und Mitarbeiter
modifiziert (Ziegenhagen et. al., 1993).
200 mg frisch geerntete Nadeln von T. baccata-Setzlingen wurden mit flüssigem Stickstoff
schockgefroren und in einem Mörser fein zermahlen. In 1 ml Extraktionsmedium wurde das
Homogenat vorsichtig aufgetaut und anschließend unter mehrmaligem Mixen für 20 min bei
65 °C inkubiert. Nach dem Abzentrifugieren (10.000 rpm für 10 min bei RT) wurde dem
Überstand 1/3 Vol. 5 M Natriumacetat pH 5,2 zugefügt und nach dem Vermischen 30 min auf
Eis inkubiert. Die Suspension wurde bei 10.000 rpm für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Zu dem
Überstand wurden 0,6 Vol isoPropanol zugegeben, vermischt und die DNA für 30 min bei
-20 °C die DNA gefällt. Nach abermaligem Zentrifugieren (10.000 rpm, 10 min, 4 °C) wurde
der Überstand verworfen und die DNA 10 min luftgetrocknet. Die DNA wurde in 200 µl 1x
TAE für 30 min bei RT gelöst und nach Zugabe von 2 µl RNase bei 37 °C für 1 h inkubiert.
Nach Zugabe von 200 µl Phenol wurde die Lösung ausgiebig gemischt, 10 min bei RT und
10.000 rpm zentrifugiert. Zu dem Überstand wurden je 100 µl Phenol und Chloroform
gegeben und nach Vermischen wieder zentrifugiert. Ein erneuter Extraktionsschritt erfolgte
mit 200 µl Chloroform. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt wurde der Überstand mit
300 mM Natriumacetat pH 5,2 eingestellt und die DNA mit 2,5 Vol EtOH durch Inkubation
bei –80 °C für 1 h gefällt. Anschließend wurde ein letztes Mal zentrifugiert (10.000 rpm,
10 min, 4 °C), die DNA für 10 min luftgetrocknet und das Pellet in 1x TAE aufgenommen.
Präparation von Gesamt-RNA aus Taxus baccata
Für die Präparation von Gesamt-RNA aus T. baccata wurde der RNeasy Plant Mini Kit der
Firma Qiagen verwendet. Dabei wurde beachtet, dass RNA durch ubiquitär vorkommende
RNasen sehr rasch abgebaut werden und somit einige zusätzlichen Maßnahmen erforderlich
waren. Dafür wurde nach Sambrook et al., 1989 und nach dem Manual der Firma Qiagen
verfahren.
Verwendet wurden frisch geerntete Nadeln von T. baccata-Setzlingen, die von Dr. Ewald,
Institut für Forstpflanzenzüchtung, Bundesforschungsanstalt für Forst- und Holzwirtschaft,
Waldsieversdorf, freundlicherweise zur Verfügung gestellt wurden. Diese wurden nach
Zugabe von flüssigem Stickstoff fein zermörsert. Die weitere Aufarbeitung erfolgte nach
Anleitung des Kits.
Materialien und Methoden
25
Isolierung von Plasmid-DNA
Plasmid-DNA in größerem Maßstab wurde über Midi-(50 ml Kulturvolumen) bzw. Maxi-
(150 ml Kulturvolumen) Säulen der Firma Qiagen laut Manual präpariert. Plasmid-DNA zum
Sequenzieren wurde aus 4 ml Kulturen mit Hilfe des „QIAprep-spin“-Kits nach Vorschrift der
Firma Qiagen gewonnen.
Zur schnellen Isolierung von Plasmid-DNA aus einer großen Anzahl von Klonen wurde das
Protokoll von Birnboim und Doly (1979) verwendet. Dazu wurden die E. coli-Einzelkolonien
in je 2 ml LBAmp (LBAmp/Kana) über Nacht bei 37 °C und 250 rpm angezogen. Die Zellen
wurden abzentrifugiert und in 100 µl Puffer1 durch vortexen resuspensiert. Nach 5 Minuten
Inkubation bei Raumtemperatur wurden 200 µl Puffer2 zugegeben, durch Umschwenken
vorsichtig durchmischt und fünf Minuten auf Eis gestellt. Nach Zugabe von 150 µl Puffer3
wurde weitere fünf Minuten auf Eis inkubiert, eine Minute abzentrifugiert und der Überstand
jeweils mit 400 µl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) extrahiert. Die wässrige
Phase wurde mit 800 µl Ethanol versetzt und fünf Minuten abzentrifugiert. Das DNA-Pellet
wurde mit 50 µl 70%-Ethanol gewaschen, getrocknet und anschließend in 50 µl 0,5 mM
EDTA aufgenommen.
Kompetente Zellen
E coli XL1-Blue
Kompetente Zellen wurden in Anlehnung an ein Protokoll von Hanahan et al. (1983)
präpariert. Dazu wurde eine Einzelkolonie des E. coli-Stammes XL1-Blue über Nacht in 2 ml
LB-Medium bei 37 °C und 250 rpm angezogen.
100 ml LB-Medium wurden mit 50 µl der Vorkultur angeimpft und bis zu einer optischen
Dichte von OD600 = 0,3 bei 37 °C und 250 rpm wachsen gelassen. Die Zellen wurden bei 4 °C
und 2.500 rpm 10 min abzentrifugiert und das Pellet dann in 50 ml 0,1 M CaCl2 (steril)
resuspensiert. Nach 20 min auf Eis wurde erneut 15 min bei 4 °C und 2.500 rpm
abzentrifugiert. Das entstandene Pellet wurde in 10 ml 0,1 M CaCl2 / 15% Glycerin
resuspensiert, in Aliquots von je 250 µl geteilt und sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren.
Die Zellen wurden bei -80 °C gelagert.
Materialien und Methoden
26
E. coli M15[pREP4]
Das Protokoll zur Präparation von kompetenten M15[pREP4]-Zellen wurde dem Handbuch
des QIAexpressionistTM -Kits entnommen. Eine Einzelkolonie der E. coli-Zellen wurde über
Nacht in 10 ml LBKana (25 µg/ml)-Medium bei 37 °C und 250 rpm angezogen. 100 ml
vorgewärmtes LBKana-Medium wurden mit 10 ml Übernachtkultur in einem 250 ml-Kolben
angeimpft und bis zu einer optischen Dichte von OD600= 0.5 bei 37 °C und 250 rpm wachsen
gelassen. Die Kultur wurde 5 min auf Eis gestellt und anschließend die Zellen 5 min bei 4 °C
und 2.500 rpm abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 30 ml kaltem TBF1-Puffer resuspensiert
und die Kultur für weitere 90 min auf Eis gestellt. Nach einer weiteren Zentrifugation (5 min,
4 °C und 2.500 rpm) wurde das Pellet in 4 ml eiskaltem TFB2-Puffer aufgenommen, in
200 µl-Portionen aliquotiert und sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die
kompetenten Zellen wurden bei -80 °C gelagert.
Transformation von Plasmiden
Ligationsansätze und Plasmid-DNA wurden in Anlehnung an ein Protokoll der Firma Life
Technologies transformiert. Dazu wurden 100 µl kompetente Zellen zu 10 µl eines
Ligationsansatzes bzw. zu 1 µl Plasmid-DNA gegeben und mindestens 20 min auf Eis
inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz für 2 min auf 37 °C erwärmt, kurz auf Eis gestellt
und nach Zugabe von 500 µl LB-Medium nochmals 45-60 min bei 37 °C inkubiert. Pro LB-
Platte wurden 100 µl eines solchen Ansatzes mit einem Drigalski-Spatel ausplattiert und über
Nacht bei 37 °C angezogen. Sollten die Kolonien auf Blau-Weiß-Färbung selektiert werden
(ß-Galaktosidase-Aktivität durch α-Komplementation), wurden pro LB-Platte zusätzlich je
10 µl 1 M IPTG und 25 µl 4% X-Gal in DMF ausplattiert.
Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen
Nach Auftrennung der DNA durch Gelelektrophorese in einem Agarose-Gel wurde das
gewünschte Fragment mit Hilfe eines Skalpells ausgeschnitten. Die weitere Aufarbeitung
erfolgte mit einem Gel-Extraktions-Kit der Firma Qiagen laut Herstellerangaben.
Materialien und Methoden
27
PCR-Reaktion
Die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ist eine routinemäßig angewendete Methode zur
Amplifizierung eines DNA-Abschnittes mit Hilfe einer hitzestabilen DNA-Polymerase. Die
drei Schritte der Reaktion sind die DNA-Denaturierung bei 94 °C, Bindung und
Hybridisierung eines Primer-Paares am 3’- und am 5’-Ende des zu amplifizierenden
Abschnittes bei einer niedrigen Temperatur und schließlich die Synthese der neuen DNA
durch die hitzestabile DNA-Polymerase bei 72°C. Diese Reaktionsfolge wird 20-30 mal
wiederholt, so dass der gewünschte DNA-Abschnitt in expotenziell steigender Menge
synthetisiert wird. Die optimalen Reaktionsbedingungen (Inkubationszeit und -temperatur,
Konzentration der einzelnen Komponenten) sind von der jeweili gen Primer-Template-
Kombination abhängig und müssen für jede Reaktion optimiert werden.
Es wurde zuerst zeitabhängige Denaturierungsversuche zur Thermostabili tät der T. baccata-
DNA durchgeführt. So wurde 1 µg DNA in 20 µl H2O für 15, 30, 45 und 60 Sekunden bei
92 °C und 94 °C inkubiert.
Zur Amplifizierung des gesamten Cyclase-Gens wurde folgendes Programm verwendet:
94 °C, 25 s; 49 °C, 4,5 min; 72 °C, 2 min für 5 Zyklen
94 °C, 35 s; 49 °C, 4,5 min, 72 °C, 2 min für 25 Zyklen und
72 °C, 10 min für die Extension.
Für eine Reaktion wurden folgende Mengen eingesetzt:
500 ng Template-DNA; je 140 pmol Primer (TBC1A und TBC2A); 1 µl 10 mM dNTP-Mix
(Life Technologies); 10 µl PCR-Mix (Life Technologies); 100 µmol MgCl2; 2 µl DMSO;
5 units Taq-DNA-Polymerase, mit H2O auf 100 µl auffüllen.
Zur Amplifizierung eines 800 bp großen Fragments der Taxadien-Synthase (AS 754-770)
wurde eine anderes Programm gewählt:
94 °C, 25 s (initial hot start); 92 °C, 20 s; 48 °C, 1 min; 72 °C, 30 s für 10 Zyklen,
94 °C, 45 s; 48 °C, 1 min; 72 °C, 30 s für 20 Zyklen und
72 °C, 10 min für die Extinktion.
Materialien und Methoden
28
Folgende Mengen wurden für eine Reaktion eingesetzt:
300 ng Template-DNA, je 80 pmol Primer (TBC3 und TBC4); 1 µl 10 mM dNTP-Mix (Life
Technologies), 10 µl PCR-Mix (Life Technologies), 150 µM MgCl2, 5 units Taq-DNA-
Polymerase, mit H2O auf 100 µl auffüllen.
Zur Überprüfung der PCR-Reaktionen wurden 10 µl des Reaktionsansatzes nach der Reaktion
entnommen und auf einem Agarose-Gel aufgetrennt. Zur Isolierung des gewünschten
Produktes wurde der gesamte Ansatz auf ein Agarose-Gel aufgetragen, aufgetrennt und die
Bande mit der erwarteten Größe wurde aus dem Gel ausgeschnitten und eluiert. Das Produkt
konnte dann kloniert werden.
Southern Blot
Zur Analyse des T. baccata Genoms auf Vorhandensein eines Gens, das die Taxadien-
Synthase codiert, wurden 10 µg chromosomaler DNA mit den Restriktionsenzymen BamHI
und HincII geschnitten und darauf hin über ein 0,8%iges Agarose-Gel in 1x TAE-Puffer bei
20 V über Nacht aufgetrennt. Die aufgetrennte DNA wurde mittels Kapill ar-Transfer in 20x
SSC auf Nylonmembran (Hybond-N, Amersham, Braunschweig) geblottet und anschließend
mittels UV-Licht auf der Membran fixiert.
Das 800 bp-Fragment aus dem Plasmid TBCyc800SK wurde mit α-[32P]-dCTP und α-[32P]-
dATP auf eine spezifische Aktivität von durchschnittlich 1x109 cpm / 25 ng DNA gelabelt
(Random Primer DNA Labelli ng System, Life Technologies). Die Hybridisierung wurde in 5x
SSPE, 5x Denhardt’s Lösung und 0,1% SDS bei 65 °C über Nacht durchgeführt. Die Blots
wurden mit steigender Stringenz (2x 10 min Waschpuffer 1 bei RT, 1x 15 min Waschpuffer 2
bei 65 °C, 2x 10 min Waschpuffer 3 bei 65 °C) gewaschen und anschließend die Signale
mittels Autoradiographie detektiert.
RT-PCR
Für die Amplifizierung der cDNA der Taxadien-Synthase wurde die Zwei-Schritt-RT-PCR-
Strategie angewandt. Im Gegensatz zur Ein-Schritt-Strategie werden die Synthese des ersten
Stranges und die Primer-spezifische cDNA-Synthese nacheinander in zwei verschiedenen
Ansätzen durchgeführt. Diese Methode hat sich bei sehr großen DNA-Abschnitten bewährt.
Zur Synthese des cDNA-Klons der Taxadien-Synthase wurde ein Enhanced Avian RT-PCR
Kit der Firma Sigma verwendet und nach dessen Anleitung vorgegangen:
Materialien und Methoden
29
Schritt 1: 0,1 µg Gesamt-RNA
je 500 µM dNTP
3,5 µM Oligo(dT)23
mit H20 auf 16,5 µl auffüllen.
Der Ansatz wurde vermischt, kurz zentrifugiert und für 10 min bei 70 °C inkubiert.
Anschließend wurde der Ansatz auf Eis gestellt und 2 µl 10x Puffer, 0,5 U RNase-Inhibitor
und 1 U Reverse Transkriptase zugegeben. Eine Vorinkubation erfolgte bei 25 °C für 15 min,
im Anschluss daran wurde der Ansatz 50 min bei 42 °C inkubiert.
Schritt 2: 1x AccuTaq Puffer
je 200 µM dNTPs
1 µl cDNA-Synthese Ansatz
je 100 pM Primer TBC1B und TBC2B
0,05 U AccuTaq LA DNA Polymerase Mix
mit H2O auf 50 µl auffüllen.
Folgendes Programm zeigte bestmögliche Ausbeute: 94 °C 3 min (initial hot start); 94 °C
45 s; 54 °C, 1 min; 72 °C, 3 min für 40 Zyklen und 10 min, 72°C.
10 µl des Reaktionsansatzes wurden zur Kontrolle über ein Agarose-Gel aufgetrennt. Zur
Isolierung des gewünschten Produktes wurde der gesamte Ansatz über ein Gel aufgetrennt,
ausgeschnitten, eluiert und kloniert.
Expression von rekombinanten Proteinen
Sowohl für die Expression als auch für die anschließende Aufreinigung des exprimierten
Proteins wurde nach Anleitung des Kits QiaExpressionistâ der Firma Qiagen verfahren. Eine
M15[pREP4]-Einzelkolonie, die das gewünschte Plasmid trug, wurde für eine Vorkultur in
10 ml LBAmp/Kana bei 37 °C über Nacht angezogen. 500 ml LBAmp/Kana wurden mit 10 ml
Vorkultur angeimpft und 2 h bei 37 °C und 250 rpm wachsen gelassen. Anschließend wurde
mit 1 mM IPTG induziert und für ca. 20 h bei 16 °C und 250 rpm inkubiert. Die Zellen
wurden je nach Verwendung nach dem Zentrifugieren (GSA-Rotor, 30 min bei 4.000 rpm)
entweder gleich weiter verarbeitet oder bei -20 °C tiefgefroren.
Materialien und Methoden
30
Northern Blot-Analyse der Expression
Zur Überprüfung, ob das gesuchte Protein in ausreichendem Maße unter den oben
angegebenen Bedingungen exprimiert wurde, war es wichtig, die Expression auf
Vorhandensein von mRNA für die Taxadien-Synthase zu untersuchen. Dazu wurde als erstes
eine Wachstumskurve der exprimierten Zellen erstellt und die geeignete Verdünnung
bestimmt.
109 Zellen der Expressionskultur wurden durch Zentrifugation (8000 rpm für 5 min) bei 4 °C
in der log-Phase geerntet. Zur Präparation von Bakterien-RNA wurde der RNeasy Mini Kit
der Firma Qiagen verwendet und nach Protokoll verfahren. Dabei wurde beachtet, dass RNA
durch ubiquitär vorkommende RNasen sehr rasch abgebaut wird und somit einige
zusätzlichen Maßnahmen erforderlich waren. Dafür wurde nach Sambrook et al, 1989 und
nach dem Manual der Firma Qiagen verfahren.
Für den Blot wurde die RNA auf einem 1,2%igen Formaldehyd/Agarose-Gel (130 ml)
aufgetrennt. Dazu wurde zu 4 Vol. RNA 1 Vol. 5x RNA loading buffer gegeben, 5 min bei
65 °C inkubiert, auf Eis gestellt und anschließend auf das mit 1x FA-Laufpuffer für 30 min
equili brierte Gel aufgetragen. Das Gel wurde mit 5-7 V pro cm Laufstrecke in 1x
FA-Laufpuffer laufen gelassen, zur Hydrolysierung der OH-Gruppen für 30 min in 0,05 N
NaOH equili briert und anschließend mit RNase-freiem Wasser 3x 20 min gewaschen.
Die RNA wurde über Nacht auf eine Nylonmembran (Hybond-N, Amersham, Braunschweig)
in 20x SSC mittels Kapill ar-Transfer geblottet und durch UV-Licht auf der Membran fixiert.
Das 800 bp-Fragment aus dem Plasmid TBCyc800SK wurde mit α-[32P]-dCTP und α-[32P]-
dATP auf eine spezifische Aktivität von durchschnittlich 1x109 cpm / 25 ng DNA gelabelt
(Random Primer DNA Labelli ng System, Life Technologies). Die Hybridisierung wurde in 5x
SSPE, 5x Denhardt’s Lösung und 0,1% SDS bei 65 °C über Nacht durchgeführt. Die Blots
wurden mit steigender Stringenz (2x 10 min Waschpuffer 1 bei RT, 1x 15 min Waschpuffer 2
bei 65 °C, 2x 10 min Waschpuffer 3 bei 65 °C) gewaschen und anschließend die Signale
mittels Autoradiographie detektiert.
Aff initätsreinigung an Nickel-Agarose
Durch die Klonierung der Taxadien-Synthase in den pQE31-Vektor von Qiagen trägt das
rekombinante Protein eine 6xHis-Sequenz am N-Terminus. Die Affinität der 6xHis-Sequenz
zu Ni2+-Ionen wurde zur Aufreinigung des exprimierten Proteins an Ni-Agarose genutzt. Es
wurde ein QIAexpressionistÒ -Kit der Firma Qiagen verwendet. Nach der Expression der
Materialien und Methoden
31
Taxadien-Synthase wurden die Zellen bei -20 °C tiefgefroren und am nächsten Tag in
flüssigem Stickstoff zermörsert. Da das gesuchte Protein sich in der löslichen Phase befand,
wurde in nicht-denaturierenden Medien gearbeitet. Das Homogenat wurde in 4 ml
Aufschlusspuffer pro Gramm Zellen aufgenommen und nach Zugabe von 1 µg/ml DNaseI 1 h
auf Eis gerührt. Nach 30 minütiger Zentrifugation bei 10.000 rpm in einem SS34-Rotor wurde
der Überstand mit 1 ml Ni-NTA-Agarose-Suspension je 4 ml Proteinlösung versetzt und 2 h
bei 4 °C vorsichtig geschüttelt. Anschließend wurde die Suspension in eine Säule (∅ 1 cm,
l=5 cm) mit Fritte gegeben, der Durchlauf aufgefangen und mit 2x 4 ml Waschpuffer
gewaschen. Das Protein wurde mit 4x 0,5 ml Elutionspuffer eluiert.
Bestimmung der Proteinkonzentration
Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte nach der Methode von Bradford (1976).
10 µl der zu bestimmenden Probe wurden mit 100 µl Bradford-Reagenz in einer
Mikrotiterplatte pipettiert und die Absorption bei 570 nm gemessen. Durch Vergleich mit
Standardproteinmengen (BSA) erfolgte die Bestimmung der Konzentration.
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Die Durchführung der Polyacrylamid-Gelelektrophorese erfolgte nach der Methode von
Laemmli (1970). Es wurden 10% Gele verwendet. Als Marker diente zum einen ein Low
Molecular Weight Marker (Dalton Mark VII -L), der sich aus den Proteinen BSA (66 kDa),
Ovalbumin (45 kDa), Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase (36 kDa), Carbanhydrase
(29 kDa), Trypsinogen (24 kDa), Trypsininhibitor (20,1 kDa) und α-Lactalbumin (14,2 kDa)
zusammensetzte und zum anderen ein High Molekular Weight Marker (Dalton Mark V), der
folgende Zusammensetzung hatte: Myosin (205 kDa), ß-Galaktosidase (116 kDa),
Phosphorylase G (97 kDa), Eialbumin (45 kDa) und Carbanhydrase (29 kDa). Die Gele liefen
im Elektrophoresepuffer, die Färbung erfolgte mit Coomassie Brilli ant Blue - Lösung
Materialien und Methoden
32
Immunologische Detektion der Taxadien-Synthase (Western Blot)
Es wurden folgende Antikörper für die Detektierung der Taxadien-Synthase verwendet:
A) polyklonaler Antikörper gegen Taxadien-Synthase aus T. baccata
Mit Hilfe des Programms RASMOL wurde an Hand der Aminosäuresequenz eine 3D-
Struktur modelli ert und außenliegende Bereiche postuliert. Das Peptid mit der Sequenz 754RLTNDTKTYQAEKARGQ770 wurde dann von der Firma BioTeZ Berlin-Buch GmbH
synthetisiert, über die Carboxylgruppe an KLH (Hämocyanin der Schlüsselloch-
Napfschnecke) gekoppelt und zur Immunisierung eines Kaninchens eingesetzt.
B) Penta•His Antibody, BSA-frei der Firma Qiagen, Hilden.
Für die Immundetektion mit Antikörpern gegen die Taxadien-Synthase wurde eine
Proteinfraktion nach der Ni-NTA-Agaroseaufreinigung über ein 10%iges Acrylamidgel
aufgetrennt und über Nacht auf eine Nitrocellulosemembran (BA85, Schleicher&Schuell) im
Tankverfahren mit Blotpuffer A (I=20 mA) geblottet. Der erfolgreiche Transfer wurde mittels
Ponceau S-Färbung kontrolli ert. Die Membran wurde für 30 min in TBS/3% BSA abgesättigt
und anschließend 3x 20 min mit TBS/Tween gewaschen. Die Inkubation mit dem ersten
Antikörper (gegen Taxadien-Synthase) erfolgte für 1 h mit einer 1:1000 Verdünnung in
TBS/3% BSA bei 37 °C. Danach wurde 3x 20 min mit TBS/Tween gewaschen und eine
weitere Stunde die Membran mit dem anti-rabbit-Antikörper (konjugiert mit alkalischer
Phosphatase, Sigma, 1:10.000 Verdünnung) bei 37 °C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen
á 20 min mit TBS/Tween wurden mit BCIP/NBT (Sigma) in 10 ml H2O die immunreaktiven
Proteine angefärbt.
Zur Kontrolle der erfolgreichen Klonierung der Taxadien-Synthase wurde auch eine
Immunreaktion auf die 6xHis-Sequenz durchgeführt. Dazu wurde ein Penta•His-Antikörper
der Firma Qiagen verwendet. Eine Enzymfraktion der Ni-NTA-Agarose-Aufreinigung wurde
über ein 10%-Mini-Gel aufgetrennt. Der Western Blot erfolgte in einer Fastblotapparatur für
1 h in dem Blotpuffer B. Die weitere Behandlung des Blots erfolgte nach der Anleitung der
Firma Qiagen.
Materialien und Methoden
33
N-terminale Aminosäuresequenzierung der exprimierten Taxadien-Synthase
Für die N-terminale Aminosäuresequenzierung wurde eine Taxadien-Synthase-haltige
Fraktion der Ni-Agarose-Aufreinigung auf einem 10 %igen Acrylamidgel aufgetrennt und
über Nacht auf eine, zuvor mit Methanol equili brierte, PVDF-Membran (Schleicher&Schuell)
geblottet. Der Blot erfolgte in einer Tankapparatur in dem Blotpuffer A über Nacht bei 4 °C
und 20 mA. Der Transfer der Proteine wurde mittels Ponceau S–Färbung kontrolli ert. Die
entsprechenden Proteinbanden wurden ausgeschnitten und sequenziert.
Enzym-Assay
1 g frische Zellen der Übernachtexpression (18 h) wurden in flüssigem Stickstoff tiefgefroren
und fein zermörsert. Das Homogenat wurde in 4 ml Assay-Puffer resuspensiert und nach
Zugabe von 1 µg/ml DNaseI 1 h auf Eis gerührt. Die Suspension wurde bei 10.000 rpm in
einem SS34-Rotor für 30 min bei 4 °C zentrifugiert. 2,5 ml des Überstandes wurden über eine
mit 20 ml Assay-Puffer equili brierte PD10-Säule gegeben, um die Probe zu entsalzen. Die
Proteinfraktion wurde mit 3,5 ml Assay-Puffer eluiert und ca. 500 µl für den Enzymtest
eingesetzt:
490 µl entsalzte Probe
4 µl Geranylgeranylpyrophosphat (1 mg/ml in Methanol, Sigma)
1µl 3H-Geranylgeranylpyrophosphat (10-30 Ci/mmol; NEN Life Science)
5 µl 100 mM MgCl2
Nach dem Vortexen der Lösungen wurde bei 32 °C für 1 h inkubiert und anschließend mit 2x
1 ml Hexan extrahiert. Die Hexanphasen wurden vereinigt, über eine mit Kieselgel 60 gefüllte
Pasteurpipette gegeben und nach Zugabe von 4 ml Szintill ationsflüssigkeit die Radioaktivität
bestimmt. Als Negativprobe wurde statt der exprimierten Taxadien-Synthase die
Proteinfraktion des E. coli-Stamms mit dem Plasmid ohne Insert verwendet.
Für die GC-MS-Messung wurde der Test mit nicht radioaktiv markiertes
Geranylgeranylpyrophosphat durchgeführt. Nach der Kieselgelsäule wurde die Probe im
Stickstoffstrom auf 200 µl eingeengt und 1 µl davon für die GC-MS-Messung eingesetzt.
Materialien und Methoden
34
GC-MS-Messung
Gaschromatograph: HP6890, Hewlett Packard
Säule: HP-S MS, 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm
Injektion: 1 µl splitlos
Trägergas: Helium
Injektortemp: 200°C
Säulenvordruck: 180 kPa
Temp.-Programm: 40°C, 3 min – 20°C/min – 320°C, 3 min
Massenspektrometer: MSD 5973, Hewlett Packard
Temp. der Transferleitung: 280°C
Temp. der Quelle: 230°C
Ionisierungstechnik: EI, 70eV
Aufnahmemodus: TIC/SCAN
Flow: 1,5 ml/min
Anlegen einer λλ-Genbank von Taxus baccata
Für eine λ-Genbank wird mit Restriktionsenzymen verdaute genomische DNA definierter
Größe (9-23 kb) statt des durch Restriktionsverdau entfernten Mittelstücks mit den
verbleibenden beiden Armen der λ-Phagen-DNA ligiert. Die beiden λ-Phagen-Arme besitzen
zusammen nur 72% der normalen Größe des Genoms, und diese ist zu gering für eine
Verpackung in einen λ-Partikel. Durch die Ligation mit der Fremd-DNA wird nun eine
ausreichende Größe erreicht, und diese kann in einen λ-Phagen verpackt werden. Man erhält
eine statistische Verteilung des Genoms des Fremdorganismus, das in der λ-Genbank
verpackt ist (Stryer, 1988; Kaiser und Murray, 1985).
Es wurde nach den Anleitungen des Lambda DASH II â /BamHI Vector Kits und des
Gigapackâ III XL Packaging Extract gearbeitet. Dazu wurde als erstes ein Testverdau von
T. baccata-DNA mit dem Restriktionsenzym Sau3AI durchgeführt, um die optimalen
Bedingungen für einen Hauptverdau zu bestimmen. Dieser wurde durch ein 0,3% Agarose-
Gel kontrolli ert. Durch verschiedene Zeit- und Konzentrationsreihen wurde folgender Ansatz
als bestmöglichster Restriktionsverdau ermittelt:
1 µg DNA
100 µl Reakt 4 (Life Technologies)
698 µl 10 mM Tris-HCl pH 8.0
Materialien und Methoden
35
1,8 U Sau3AI (Life Technologies)
Der Ansatz wurde 1 h bei 37 °C inkubiert und anschließend 15 min bei 70 °C inaktiviert. Der
Verdau wurde durch ein 0,3%iges Agarose-Gel kontrolli ert. Die restriktionsgeschnittene
DNA wurde durch Ethanolfällung konzentriert und einer Gradientenzentrifugation
unterzogen. Dazu wurde die Probe auf einen 25-5%igen NaCl-Gradienten in 3 mM EDTA
pH 8.0 (Polycarbonat-Röhrchen, Beckmann, Ultra-Clear) aufgetragen und 5 h bei 35.000 rpm
(SW41-Rotor) zentrifugiert. Das Zentrifugenröhrchen wurde am Boden mit einer Kanüle
vorsichtig eingestochen und der Inhalt durch Aliquotieren (je 300 µl) aufgefangen. Die
Aliquots wurden mit Bidest 1:1 verdünnt und über ein 0,3%iges Agarose-Gel kontrolli ert. Die
Fraktionen, die die geeigneten Größen der DNA aufwiesen (10-20 kb), wurden vereinigt, mit
EtOH gefällt, gründlich mit 70%igem EtOH gewaschen, getrocknet und in 5 µl 10 mM Tris
pH 8,0 aufgenommen. Bei 4 °C über Nacht wurde mit folgenden Ansätzen die Ligation der
Insert-DNA mit den Phagen-Armen durchgeführt:
A) 1 µl λ DASH II x BamHI B) 1 µl λ DASH II x BamHI
1 µl Insert-DNA 1,5 µl Insert-DNA
0,5 µl 10x Puffer 0,5 µl 10x Puffer
0,5 µl rATP 0,5 µl rATP
0,5 µl Ligase (2 U) 0,5 µl Ligase (2 U)
2,5 µl H20 2,5 µl H20
Das Verpacken des Konstrukts in die Phagenhülle wurde mit dem Gigapackâ III XL
Packaging Extract durchgeführt, welcher eine hohe Verpackungsrate für sehr große Inserts
(≥14 kb) aufweist.
Dazu wurden je 2 µl der Ligationsansätze mit einem Aliquot des Verpackungsextrakts gut
vermischt, die Ansätze kurz zentrifugiert und 2 h bei RT inkubiert. Anschließend wurden
500 µl SM-Puffer und 20 µl Chloroform zugegeben und gevortext. Nach einer weiteren
kurzen Zentrifugation wurde der Überstand in ein frisches Eppendorftubes überführt und die
Genbank bei 4 °C gelagert.
Materialien und Methoden
36
Präparieren der Host-Bakterien
E. coli P2392-Zellen wurde nach Anleitung des Herstellers Stratagene präpariert. Eine
Impföse mit dem Glycerinstock wurde auf LB-Medium ausplatiert und über Nacht bei 37 °C
inkubiert. Eine Einzelzelle wurde in LB-Medium mit 10 mM MgSO4 und 2% Maltose 4-6 h
bei 37 °C und 250 rpm bis zu einer optischen Dichte von OD600 = 1,0 wachsen gelassen. Die
Zellen wurde bei 4 °C und 2000 rpm für 10 min pelletiert. Die Zellen wurden mit steriler
10 mM MgSO4-Lösung aufgenommen und eine OD600 = 0,5 eingestellt.
Bestimmen des Titers der Genbank
Für das Screenen der Genbank ist es erforderlich, dass die Agar-Platten mit ausreichend hoher
Anzahl von Plaques (lysierte Bakterienzellen = Zellen, in die eine Phage ihr Genom
geschleust und nach Vervielfältigen dieser zerstört werden) bedeckt sind. Die Anzahl sollte
jedoch nicht zu hoch sein, um ein Überdecken verschienener λ-Klon-DNA zu vermeiden.
Deshalb ist es wichtig, vorher den Titer der Genbank zu bestimmen.
Verschiedene Verdünnungen der Genbank in SM-Puffer wurden mit den vorbereiteten Host-
Bakterien (OD600=0,5 in 10 mM MgSO4) für 15 min bei 37 °C inkubiert. Die Phagen haben so
Zeit, an den Zellen zu haften. Nach Zugabe von 3 ml 48 °C warmen Top-Agar wurde diese
Lösung sofort auf vorgewärmten LB-Platten ausplattiert, kurz antrocknen gelassen und über
Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Plaques wurden ausgezählt und auf Plaque-formende
Einheiten pro Millili ter (pfu/ml) hochgerechnet.
Screenen der Genbank
Zum Screenen der Genbank nach einem λ-Klon, der ein Teil oder das gesamte Gen der
Taxadien-Synthase trägt, wurde ein Abklatsch der lysierten Bakterienkulturen auf eine
Membran gezogen und diese, nach Fixieren der Nucleinsäuren, mittels einer radioaktiv
markierten Sonde, die ein Teil der Sequenz der Taxadien-Synthase trägt, hybridisiert.
λ-Klone, die DNA der Taxadien-Synthase enthalten, geben so ein radioaktiv markiertes
Signal, das mit Hilfe eines Röntgenfilms detektiert werden kann. Positive Klone wurden
anschließend aus der Agar-Platte ausgestochen, angezogen und eine weiteres Mal gescreent.
Diese Prozedur wurde so lange wiederholt, bis die Probe sauber war, das heißt, dass jedem
Plaque ein positives Signal zugeordnet werden konnte. Nach folgendem Protokoll wurde
verfahren:
Materialien und Methoden
37
200 µl der Genbank wurden mit 600 µl zuvor angezogener Hostbakterien (P2392, OD600=0,5)
15 min bei 37°C inkubiert, mit 6,5 µl Top-Agar vermischt und auf einer Petrischale
(∅ 135 mm) ausplattiert. Nach dem Trocknen wurde diese dann über Nacht bei 37°C
inkubiert. Auf die lysierte Bakterienkultur wurde eine Nitrocellulosemembran gelegt (BA 85,
Schleicher&Schuell, 0,45 µm, ∅ 132 mm), diese mit einer in Tinte getauchte Kanüle zur
Markierung an verschiedenen Seiten durchstochen und nach 2 min vorsichtig abgezogen. Die
Petrischalen wurden mit Parafilm verschlossen und bei 4°C gelagert. Die Membran wurde
in folgender Reihenfolge gewaschen: 2 min in Denaturierungspuffer, 5 min in
Neutralisierungspuffer und 30 s in 0,2 M Tris-HCl pH 7,5, 2x SSC. Nach dem Trocknen der
Membran wurde durch 2-minütige UV-Bestrahlung die Nucleinsäuren auf dieser fixiert.
Als Sonde diente das 800 bp große Insert aus dem Plasmid TBCyc800SK, dass mit α-[32P]-
dCTP und α-[32P]-dATP auf eine spezifische Aktivität von durchschnittlich 1x109 cpm / 25
ng DNA gelabelt wurde (Random Primer DNA Labelli ng System, Life Technologies). Die
Hybridisierung wurde in 5x SSPE, 5x Denhardt’s Lösung und 0,1% (w/v) SDS bei 65 °C über
Nacht durchgeführt. Die Blots wurden mit niedriger Stringenz (2x 10 min Waschpuffer 1 bei
RT und 1x 10 min Waschpuffer 2 bei 50 °C) gewaschen und anschließend die Signale mittels
Autoradiographie detektiert. Diese wurden mit den Kulturplatten verglichen und potentielle
Plaques mit sterilen Pasteurpipetten ausgestochen. Die Agarstücke wurden in 500 µl
SM-Puffer equili briert und diese Lösung wurde für ein weiteres Screening eingesetzt.
Ergebnisse
38
Ergebnisse
Präparation von DNA aus Taxus baccata Für die Isolierung der DNA aus Taxus baccata standen verschiedene Methoden zur Auswahl.
Es war vor allem für die PCR und Präparation der Genbank wichtig, dass die DNA völli g
intakt war und auch keinerlei Verunreinigung mehr aufwies. Koniferen-Arten enthalten unter
anderem sehr viele Harze und Polysaccharide, vor allem in den Nadeln, die sehr schwer
abzutrennen sind. Deshalb wurden als Ausgangsmaterial für die DNA-Präparation Wurzeln
von T. baccata-Setzlingen gewählt.
Verschiedene Methoden wurden ausprobiert, doch nur durch eine konnte ein
zufriedenstellender Reinigungsgrad erreicht werden (siehe Tabelle 1). Die Präparation der
DNA mit dem DNeasy Plant Maxi/Mini Kit (Qiagen) lieferte hochreine DNA ohne
Degradationsanzeichen, die sich sehr gut mit Restriktionsenzymen schneiden ließ. Leider war
die Ausbeute sehr gering (20 µg DNA/ 1 g Wurzeln).
Die DNA-Präparationsmethode nach E. M. Möller und Mitarbeiter, bei der vor allem durch
die CTAB-Fällung die Polysaccharide abgetrennt werden, erwies sich als nicht geeignet
(Möller et al., 1992). Die durch diese Methode präparierte DNA wies eine bräunliche
Verfärbung auf und ließ sich nur schwer von verschiedenen Restriktionsenzymen schneiden.
Die dritte Methode, nach der Anleitung von Ziegenhagen und Mitarbeiter, war ungeeignet für
die Isolierung von genomischer DNA aus T. baccata, da diese nach der Präparation eine
ziemliche Degradierung aufwies (Ziegenhagen et al., 1993).
Deshalb wurde sowohl für die PCR und die Southern Blot-Analyse als auch für das Anlegen
der Genbank die DNA aus T. baccata mit Hilfe des DNeasy Plant Kits isoliert, auch wenn die
Ausbeute nicht zufriedenstellend war.
Möller et al. DNeasy Plant K it Ziegenhagen et al.
Ausbeute µg DNA/1 g Wurzeln
60 µg 20 µg 30 µg
visuelle Beschaffenheit der DNA
Bräunliche Verfärbung der DNA
in Ordnung Degration der DNA nach Auftrennung
über ein Agarose-Gel
Restriktionsverdau mit BamHI und HincII
ließ sich nicht von BamHI und HincII
schneiden
DNA ließ sich gut schneiden
Restriktionsverdau nicht durchgeführt
Tabelle 1: Vergleich verschiedener Methoden zur DNA-Präparation aus T. baccata
Ergebnisse
39
Amplifizierung des Taxadien-Synthase-Gens Als Grundlage für die Auswahl der Primer für die Amplifizierung eines genomischen Klones
der Taxadien-Synthase aus T. baccata wurde die Sequenz der cDNA der Taxadien-Synthase
aus T. brevifolia gewählt (Wildung und Croteau, 1996). Der Primer für den N-terminalen
Bereich begann mit dem Startcodon ATG und enthielt weitere 12 Basen, die den
Sequenzanfang der Taxadien-Synthase aus T. brevifolia repräsentieren. Der C-terminale
Primer repräsentiert die 21 Basen des Endes des cDNA-Klons, einschließlich des Stopcodons
TGA. Für die Wahl des Temperaturprogramms war die geringe Thermostabili tät der
T. baccata-DNA zu berücksichtigen. Vorversuche zeigten, dass die DNA aus T. baccata bei
längerer Inkubation (> 30 s) bei 94 °C degradiert wurde (Daten nicht gezeigt, siehe auch
Materialien und Methoden S. 26). Deshalb wurde für die ersten fünf Cyclen eine kürzere
Denaturierungszeit als für die restlichen 25 Cyclen gewählt (siehe Materialien und Methode
S. 26).
Der Reaktionsansatz wurde über ein 0,8%iges Agarose-Gel aufgetrennt, die PCR-Produkte
ausgeschnitten und aus dem Gel eluiert. Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden in einen
T-Vektor (pCR®2.1-TOPO, Clontech) kloniert. Die Transformation der Ligationsansätze
erfolgte in E. coli XL1-Blue und die positiven Klone wurden über eine Blau-Weiß-Selektion
bestimmt.
Struktur des Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase-Gens aus T. baccata Die Sequenzierung beider Stränge von vier Klonen des Taxadien-Synthase-Gens aus
T. baccata, pTBCyc4.0 (Klon 1-4), die alle identisch waren, ergab für das Taxa-4(5),11(12)-
dien-Synthase-Gen aus T. baccata einen ORF von 3980 bp. Durch Vergleiche mit der cDNA
der Taxadien-Synthase aus T. brevifolia und Exon/Intron-Schranken konnte der codierende
Bereich des Gens, bestehend aus 13 Exons und 12 Introns, mit einer Gesamtgröße von
1437 bp, bestimmt werden Abb. 5. Alle Intronbereiche beginnen und enden mit den für das
Spleißen wichtigen Sequenzen GT/AG, wie sie von Häger und Mitarbeiter auch für Pflanzen
beschrieben wurden (Häger et al., 1996). Das konservierte Motiv DDXXD, das für alle
Isoprensynthasen beschrieben ist, befindet sich zwischen Intron IX und X.
Aus dem ORF von 3980 bp lässt sich für das Taxadien-Synthase-Protein eine Größe von
98 kDa vorhersagen.
Ergebnisse
40
Vergleich der Intronbereiche verschiedener Isoprensynthasen In der Literatur ist für einige Isoprensynthasen die Gen-Struktur beschrieben worden. Ein
Vergleich der Lage der Intronbereiche dieser Isoprensynthasen mit der Taxadien-Synthase aus
T. baccata ist in Abb. 6 gezeigt. Die Lage der Introns ist durch vertikale Striche verdeutlicht.
Als Bezugspunkt wurde das Motiv DDXXD gewählt. Für den Vergleich wurden die
5-epi-Aristolochen-Synthase aus Capsicum annuum und Nicotiana tabacum, die Limonen-
Synthase aus Perilla frutescens und die Casben-Synthase aus Ricinus communis ausgewählt.
Alle vier Synthasen katalysieren eine Cyclisierung von Isoprenen. Im Gegensatz dazu ist
Linalool-Synthase aus Clarkia concinna keine Cyclase, sie katalysiert die Hydroxylierung
von Geranyldiphosphat und die Umlagerung einer Doppelbindung (Jia, J.-W. et al., 1999).
Wie aus der Abbildung ersichtlich ist, lässt sich die Struktur der Taxadien-Synthase aus
T. baccata mit den verschiedenen Terpensynthasen vergleichen. Im C-terminalem Bereich
sind hohe Homologien zwischen den Synthasen zu finden. Die Lage der Introns und die
Größe der vier letzten Exons stimmen gut überein. Das Exon 12 der Linalool-Synthase ist
geringfügig größer als die entsprechenden Exons der anderen Synthasen, aber auch die Lage
der vier Intronbereiche ist identisch. Die Größe der Exons und die Lage der Introns im
N-terminalen Bereich sind nicht in diesem Maße konserviert. Interessanterweise sind sich im
mittleren Bereich (Exon 3-9 der Taxadien-Synthase) die Taxadien-Synthase aus T. baccata
und die Linalool-Synthase aus Clarkia concinna, obwohl keine Isoprencyclase, wesentlich
ähnlicher als die anderen Cyclasen. Nur die N-terminalen Bereiche aller Isoprensynthasen
sind völli g verschieden. Die Gen-Struktur der Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase, dass heißt, die
Lage der Intronbereiche und Größe der Exons ist der der Linalool-Synthase ähnlicher als der
der anderen Isoprensynthasen.
32488
313190
nt
17887
21598 83
113112130
215181
113110
99106
210100
139118
249100
300
0 3980
I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII
34242588
TBCyc800
Intron
DDXXD
Abbildung 5: Struktur des Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase-Gens aus Taxus baccata. Die Zahlen in den Kästchen geben die Anzahl der Nucleotide für das jeweili ge Exon an, die Introns sind mit römischen Ziffern markiert. TBCyc800 wurde als Sonde für Southern Blots mittels PCR ampli fiziert und umfasst die Intronbereiche IX – XI und die Exonbereiche 9-11.
Ergebnisse
41
Southern Blot-Analyse des T. baccata-Genoms Für die Southern Blot-Analyse des T. baccata-Genoms auf das eventuelle Vorhandensein
mehrerer Kopien des für die Taxadien-Synthase codierenden Gens, wurde genomische DNA
mittels der Restriktionsenzyme BamHI und HincII fraktioniert, über ein Agarose-Gel
aufgetrennt, auf eine Membran geblottet und mit einer radioaktiv markierter Sonde
hybridisiert. Es wurde mit höchster Stringenz gewaschen (2x 10 min Waschpuffer 3 bei
65 °C). Die Sonde wurde mittels PCR-Reaktion amplifiziert und repräsentiert eine 800 bp
große Sequenz (Position 2588-3424) aus T. baccata (TBCyc800), die den für Terpencyclasen
konservierten Bereich mit dem DDXXD-Motiv und die Introns IX, X und XI enthält Abb. 5.
Die Primer wurden in Anlehnung der Taxadien-Synthase-Sequenz aus T. baccata ausgewählt,
für die PCR-Reaktion siehe Materialien und Methoden. Das Autoradiogramm (Abb. 7) zeigt
Signale für Fragmente in der Größe von 4,4 kb (BamHI-Verdau) und 2,7 kb für den HincII -
Verdau. Die Fragmente für den HincII -Verdau korrelieren mit den Schnittstellen für dieses
Enzym in der Taxadien-Synthase aus Taxus baccata. Ein 200 bp großes Fragment ist bei der
42 78 126 72 47 82 97
153 88 125 73 46 82 98
84 87 132 73 46 83 98
86 91 126 73 46 83 96
DDXXD
10083477033387238407259104108
Ricinus communis Casbene synthase
Taxadiene synthaseTaxus baccata
Nicotiana tabacum L046805-epi-aristolochene synthase
5-epi-aristolochene synthaseCapsicum annuum AJ005588
Perilla frutescens AB005744Limonene synthase
*
17584437233397838427766123 Linalool synthaseClarkia concinna AF067602
Abbildung 6: Vergleich der Gen-Struktur verschiedener Isoprensynthasen. Die Lage der Introns ist durch vertikale Striche gekennzeichnet. Die jeweili ge Sequenz ist unter der angegebenen Accession number der EMBL-Datenbank entnommen. *Die Struktur der Casben-Synthase ist der Veröffentli chung von Mau und West, 1994 entnommen.
Ergebnisse
42
Auftrennung des HincII -Verdaus durch ein 0,8%iges Agarose-
Gel nicht mehr sichtbar. BamHI schneidet nicht innerhalb der
Taxadien-Synthase. Das 4,4 kb große Fragment lässt den
Schluss zu, dass sowohl kurz vor als auch nach dem Gen eine
Schnittstelle für BamHI sein muss. Es konnte eine zusätzliche
Bande für den BamHI-Verdau in der Größe von 3,3 kb
detektiert werden.
Abbildung 7: Southern Blot-Analyse von Taxus baccata: A) Autoradiogramm des Blots: Je 10 µg BamHI und HincII geschnittene DNA wurde über ein 0,8 %iges Gel aufgetrennt, auf eine Membran geblottet, mit [α32P]-dCTP markierter TBCyc800-Sonde hybridisiert, mit hoher Stringenz gewaschen und mittels Autoradiographie die Signale detektiert. B) Schnittstellen der Enzyme HincII und BamHI im Taxadien-Synthase-Gen von T. baccata.
Rekombinante Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase aus Taxus baccata
RT-PCR Für die Amplifizierung der cDNA der Taxadien-Synthase wurde Gesamt-RNA aus Wurzeln
von T. baccata isoliert und eine Zwei-Schritt-RT-PCR-Methode nach Anleitung der Firma
Sigma gewählt, da diese sich bei sehr großen DNA-Fragmenten bewährt hat. Nach der
Synthese des ersten Stranges erfolgte die Primer-spezifische Amplifizierung der cDNA. Die
Primer wurden anhand der Sequenz des genomischen Klons ausgesucht. Zur besseren
Klonierung des PCR-Produktes in den Expressionsvektor wurden zusätzliche
Restriktionsschnittstellen an die Primersequenz angefügt. Der Primer für den N-terminalen
A
Bam
HI
Hin
c II
kb
0.83
1.4
1.6
2.0
3.6
5.2
21.5
B
0 3980
Hin
cII
834
Hin
cII
10663786
Hin
cII
Bam
HI
Bam
HI
Ergebnisse
43
Bereich begann mit der ApaI-Schnittstelle, gefolgt von dem Startcodon ATG und 12 weiteren
Basen, die den Anfang der Taxadien-Synthase aus T. baccata repräsentieren. Der C-terminale
Primer enthielt die EcoRI-Schnittstelle, das Stopcodon TGA und die 12 letzten Basen der
Taxadien-Synthase. Für die Bedingungen der RT-PCR-Reaktion siehe Materialen und
Methoden S. 27.
Ein 2589 bp großes PCR-Produkt konnte amplifiziert werden. Dieses wurde mit den
Restriktionsenzymen (ApaI und EcoRI) geschnitten und in den mit denselben
Restriktionsschnittstellen ausgestatteten pBBSK+-Vektor kloniert. Nach der Transformation
der Ligationsansätze in den E. coli-Stamm XL1-Blue wurde auf LBAmp selektiert und von fünf
verschiedenen positiven Klonen beide Stränge sequenziert. Die Umklonierung erfolgte in den
pQE31-Vektor, da diesem vor der MCS ein His-tag vorgeschaltet ist, der die Aufreinigung
des exprimierten Proteins an Nickel-Agarose ermöglicht. Nach der Umklonierung wurden die
Plasmide in den E. coli-Stamm M15[pREP4] transformiert, auf LBAmp/Kana selektiert und
abermals positive Klone doppelsträngig sequenziert. Das Plasmid pcTBCyc2.6 enthält den
ORF der Taxadien-Synthase aus T. baccata.
Expression des rekombinanten Proteins Für die Anzucht wurde eine Transformation des pcTBCyc2.6 in E. coli M15[pREP4] auf
LBAmp/Kana-Platten ausgestrichen, eine Einzelkolonie über Nacht angezogen und 10 ml dieser
Vorkultur in 500 ml LBAmp/Kana in Schikane-Kolben bis zu einer OD600=0,6 wachsen gelassen.
Die Induktion erfolgte mit 0,1 mM IPTG und die Expression bei 16 °C über Nacht. Eine
Zeitabhängigkeit der Expression ergab, dass nach 16 h das gesuchte Protein in der höchsten
Konzentration auftrat (Daten nicht gezeigt). Als Negativkontrolle diente die Transformation
des Vektors pQE31 ohne Insert in M15[pREP4]-Zellen. Die Anzucht erfolgte unter den
selben Bedingungen.
Ergebnisse
44
Northern Blot-Analyse der Expression
Zur Kontrolle, ob das gesuchte Protein unter den oben angegebenen Bedingungen exprimiert
wurde, sollte eine Northern Blot-Analyse durchgeführt werden. Dazu wurde direkt nach der
Expression aus den Zellen Gesamt-RNA präpariert und 5 µg über ein 1,2%iges
Formaldehyd/Agarose-Gel aufgetrennt. Als
Sonde diente das radioaktiv markierte 800 bp
große Fragment TBCyc800 der Taxadien-
Synthase (siehe oben). Die ebenfalls
exprimierten Proteine des Plamids pQE31
dienten als Negativkontrolle. Das Waschen des
Blots erfolgte mit hoher Stringenz (2x 10 min
Waschpuffer 3 bei 65 °C).
Wie aus Abb. 8 ersichtlich, hybridisiert ein
2,6 kb großes RNA-Fragment der exprimierten
Proteine des Plasmids pcTBCyc2.6 mit der
radioaktiv markierten Sonde TBCyc800. Bei
der Negativkontrolle, das Plasmid ohne Insert,
konnten keine Signale detektiert werden.
Reinigung des rekombinanten Proteins Zur Aufreinigung der Taxadien-Synthase aus T. baccata wurde die Reinigung an Nickel-
Agarose gewählt. Diese Reinigungsmethode basiert auf der Tatsache, dass zweiwertige
Nickelionen von Histidinresten in Proteinen komplexiert werden. Dies kann zur
Proteinreinigung genutzt werden, indem das rekombinante Protein mit sechs aufeinander
folgenden Histidinresten versehen wird und an einem mit Nickelionen beladenen
Säulenmaterial durch Affinitäts-Chromatographie gereinigt wird. Es bestehen zwei
pcT
BC
yc2.
6
pQE
31
9,49
7,46
4,40
2,37
1,35
0,24
kb
Abbildung 8: Nor thern Blot-Analyse der Expression Als Vergleich sind je 5 µg RNA aus M15[pREP4]-Zellen nach der Expression der Plasmide pcTBCyc2.6 und pQE31 über ein 1,2%-Gel aufgetrennt und mit der radioaktiv markierten Sonde TBCyc800 hybridisiert.
Ergebnisse
45
Möglichenkeiten ein Protein auf diese Weise zu reinigen: Die eine Variante ist, das Protein
nativ zu reinigen. Dafür muss sich das zu reinigende Protein nach dem Zellaufschluss in der
löslichen Phase befinden. Sollte dies nicht der Fall sein, evtl. membrangebunden oder in
inclusion bodies vorliegend, kann man unter denaturierenden Bedingungen arbeiten.
Im Fall der rekombinanten Taxadien-Synthase aus T. baccata lag diese in nativer Form nach
der Expression vor. Die über Nacht nach der Expression tiefgefrorenen Zellen wurden mit
flüssigem Stickstoff gemörsert, in Natriumhydrogenphosphat-Puffer aufgenommen und nach
einem DNaseI-Verdau die nicht löslichen Bestandteile abzentrifugiert. Die Bindung an
Nickel-Agarose erfolgte im Anschluss unter Schütteln bei 4 °C. Nach Einfüllen in eine Säule
wurde durch Zugabe von steigenden Mengen
Imidazol zuerst unspezifisch gebundenes
Fremdprotein und später das gesuchte Protein
vom Säulenmaterial eluiert. Als Kontrolle
wurden die Proteine des pQE-Vektors in
gleicher Weise behandelt.
Abb. 9 zeigt ein 10%iges Acrylamid-Gel auf
dem die verschiedenen Reinigungsschritte
dargestellt sind. In Spur 4 ist der nicht an
Nickel-Agarose gebundene Durchlauf von
pcTBCyc2.6 aufgetrennt. Spur 3 zeigt einen
Waschschritt mit 20 mM Imidazol in
Natriumhydrogenphosphat-Puffer und Spur 2
zeigt die aufgetrennten Proteine von
pcTBCyc2.6, die an Nickel-Agarose gebunden
haben und die mit 250 mM Imidazol in
Natriumhydrogenphosphatpuffer von der Säule
eluiert wurden. Spur 1 zeigt im Vergleich dazu
die aufgetrennten Proteine der Elution von pQE31-Proteinen, die unspezifisch an Nickel-
Agarose gebunden waren. M1 und M2 sind Markerproteinmischungen. In Spur 2 ist eine
Proteinbande mit der für die Taxadien-Synthase zu erwartenden Größe von ca. 97 kDa zu
sehen. Diese Proteinbande konnte in den unten beschriebenen Untersuchungen als Taxadien-
Synthase aus T. baccata charakterisiert werden. Die Ausbeute an Taxadien-Synthase betrug
nach 16 stündiger Expression 10 mg pro 500 ml Kulturmedium.
66 kDa
116 kDa
97 kDa
45 kDa
205 kDa
29 kDa
M1 2M21 43
Abbildung 9: SDS-PAGE (10% Trenngel) verschiedener Reinigungsschr itte der rekombinaten Taxadien-Synthase aus T. baccata: M1 und M2 sind Marker; 4 Durchlauf, 3 Waschschritt mit 20 mM Imidazol, 2 Eluat pcTBCyc2.6 mit 250 mM Imidazol, 1 Eluat pQE31 mit 250 mM Imidazol. Die Färbung des Gels erfolgte mit Coomassie Brill ant Blue.
Ergebnisse
46
Immunologische Detektierung der r ekombinaten Taxadien-Synthase aus Taxus baccata Zur Detektierung der in E. coli exprimierten Taxadien-Synthase aus T. baccata wurden zum
einen angereinigte Proteinfraktionen der Expression auf die Reaktion mit den gegen die
N-terminale Histidinsequenz gerichteten Antikörpern und zum anderen auf die Reaktion
gegen eine Peptidsequenz der Taxadien-Synthase gerichteten Antikörpern im Western Blot-
Verfahren getestet. Die Antikörper gegen die Histidinsequenz sind kommerziell von der
Firma Qiagen zu beziehen. Für die Antikörpergewinnung gegen die Taxadien-Synthase wurde
für diese mit Hilfe des Programms RASMOL auf Grundlage der Aminsäuresequenz eine
3D-Struktur modelli ert und außenliegende Bereiche ermittelt. Einen solchen Bereich stellt das
Peptid mit der Sequenz 754RLTNDTKTYQAEKARGQ770 dar Abb. 14. Dieses Peptid wurde
synthetisiert, an KLH gekoppelt und zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt. Für die
Antikörper gegen die Taxadien-Synthase wurde eine Verdünnung von 1:1000 und für die
Antikörper gegen His5-Sequenz 1:2000 in TBS/Tween gewählt. Die Verdünnung des Anti-
Rabbit-Antikörpers betrug in beiden Fällen 1:5000 in TBS/Tween. Als Negativkontrolle
wurde eine Nickel-Agarose-gereinigte Proteinfraktion des in E. coli exprimierten pQE31-
Vektors verwendet.
In Abb. 10 sind die Western Blots der Proteinfraktionen von pcTBCyc2.6 und pQE31 nach
Reaktion mit den Antikörpern gegen His5 (C) oder Taxadien-Synthase (B) gezeigt, und in (A)
ist die Auftrennung der Proteinfraktionen pcTBCyc2.6 und pQE31 über ein 10%iges
Acrylamidgel zu sehen. Eine ca. 97 kDa großes Protein reagierte sowohl mit den His5- als
auch mit den Taxadien-Synthase-Antikörpern.
66 kDa
116 kDa
97 kDa
45 kDa
pcT
BC
yc2.
6
pQE
31
pcT
BC
yc2.
6
pcT
BC
yc2.
6
pQE
31
pQE
31
A B C205 kDa
Abbildung 10: Western Blot-Analyse der Taxadien-Synthase aus Taxus baccata A) 10%ige SDS-PAGE einer Taxadienfraktion und einer pQE-Fraktion mit Marker, Coomassie Brill ant Blue gefärbt. B) Western Blot Analyse mit AK gegen die Taxadien-Synthase. C) Western Blot Analyse mit AK gegen His-Tag.
Ergebnisse
47
N-terminale Aminosäuresequenzierung der Taxadien-Synthase aus T. baccata Proteinfraktionen des Plasmids pcTBCyc2.6 nach der Nickel-Agarose-Aufreinigung wurden
mittels SDS-PAGE (10%-Gel) aufgetrennt und über Nacht auf eine PVDF-Membran
geblottet. Die Proteinbande der entsprechenden Größe wurde ausgeschnitten und über
Edmanabbau ansequenziert. Folgende N-terminale Sequenz wurde gefunden:
Ein Vergleich mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz des Taxadien-Synthase-Gens aus
T. baccata zeigt die Übereinstimmung der N-Termini.
Molekulargewichtsbestimmung der r ekombinanten Taxadien-Synthase Zur Größenbestimmung des in E. coli exprimierten Taxadien-Synthase-Proteins aus
T. baccata wurde eine Nickel-Agarose-gereinigte Fraktion von pcTBCyc2.6 über SDS-PAGE
(10%-Trenngel) aufgetrennt. Als Markerproteine wurden Enniatin-Synthetase (350 kDa),
Myosin (205 kDa), ß-Galactosidase (116 kDa), Phosphorylase G (97 kDa),
Rinderserumalbumin (66 kDa), Eialbumin (45 kDa) und Carbanhydrase (29 kDa) verwendet.
Für die Taxadien-
Synthase aus
T. baccata konnte
ein Molgewicht von
97 kDa bestimmt
werden, welches mit
der von der Gen-
Struktur abgeleiteten
Größe von 98 kDa
nicht 100%ig über-
einstimmt.
MRGSHHHHHHTDPPGCRNSMAQVektor pQE31 Restriktionsschnittstellen N-Terminus
Taxadiensynthase
1
10
10 0
100 0
0 2 4 6 8 10 12 14
cm
kD
a
M T
205
29
45
66
97116
kDa
Taxadiensynthase
Abbildung 11: Molekulargewichtsbestimmung der Taxadien-Synthase aus Taxus baccata unter denatur ierenden Bedingungen Halblogarithmische Auftragung der Markerproteingrößen. Kleines Foto: 10 %ige SDS-PAGE einer Taxadien-Synthase-haltigen Ni-Agarose-Fraktion, Coomassie Brill ant Blue gefärbt (T) und High Molecular Weight Marker (M)
Ergebnisse
48
Aktivitätstest
Der Aktivitätstest der Taxadien-Synthase wurde nach Willi ams und Mitarbeiter durchgeführt
(Willi ams et al., 2000). Nach der Expression des Klons pcTBCyc2.6 in M15[pREP4]-Zellen
wurden diese abzentrifugiert, mit flüssigem Stickstoff aufgeschlossen und nach einem
DNaseI-Verdau die lösliche Proteinfraktion für den Test eingesetzt. Unter Zugabe von
[1-3H]-Geranylgeranylpyrophosphat und Magnesium-Ionen erfolgte die Inkubation bei 32 °C
für eine Stunde. Anschließend wurde der Ansatz mit Hexan extrahiert, die Hexanphasen zum
Abtrennen der olefinhaltigen Fraktion über Kieselgel passagiert und anschließend im
Szintill ationszähler die Radioaktivität bestimmt. Nachdem dort kein Unterschied zur
Kontrolle (pQE31 in M15[pREP4]) auftrat, wurde die Proteinlösung zuerst entsalzt und dann
für den Test eingesetzt. Hier zeigte sich, dass nun ein deutlicher Anstieg der Radioaktivität
der Hexanphase bei pcTBCyc2.6 zu verzeichnen war Tabelle 2.
gemessene Radioaktivität (cpm)
pcTBCyc2.6 in M15[pREP4] 48
pcTBCyc2.6 in M15[pREP4], entsalzt 2402
pQE31 in M15[pREP4] 50
pQE31 in M15[pREP4], entsalzt 47
Tabelle 2: Vergleich der Radioaktivitätsmessung für den Taxadien-Synthase-Test
Für die GC-MS-Messung wurde der Assay wie oben beschrieben durchgeführt, nur diesmal
wurde nicht radioaktiv markiertes Geranylgeranylpyrophosphat eingesetzt. Je 1 µl der
eingeengten Hexanphase von pcTBCyc2.6 und pQE31 wurden zur GC-MS-Messung
eingesetzt. Leider war eine cool on-column injection nicht möglich, so dass die Probe bei
200 °C auf die Säule gegeben wurde (siehe auch Materialen und Methoden S. 30). Die
gaschromatographische Analyse beider Proben weist einen zusätzlichen Peak (Retentionszeit
von 16,45 min) für pcTBCyc2.6 in dem für das Ion m/z=122 extrahierten Elutionsprofil auf
Abb. 12 A und B. Das Massenspektrum für diesen Peak ist in Abb. 12 C gezeigt. Im
Vergleich dazu ist in Abb. 12 D das MS von Squalen dargestellt, einem aus
6 Isopreneinheiten bestehenden Molekül. Ein aus 8 Isopreneinheiten bestehendes Molekül
zeigt das gleiche Spektrum. Leider war in der Datenbank des Massenspektrometers kein
Massenspektrum von Taxadien (4 Isopreneinheiten) enthalten.
Ergebnisse
49
Das relativ stabile Fragment m/z=122 ist als Bruchstück von Taxadien durch zweifachen
Bruch einer C-Bindung und Wanderung von Wasserstoff beschrieben worden Abb. 13 (Lin et
al., 1996).
Auch das Fragment m/z=121 gehört zu dem C-Ring-Fragmentierungscluster von Taxadien,
wie es von Wildung und Croteau, 1996 beschrieben wurde.
Das Ion m/z=69 ist als einzelne Isopreneinheit (C5H9) zu erklären und das Ion m/z=136
entspricht genau der Hälfte des Molekulargewichts von Taxadien, also 2 Isopreneinheiten
(C10H16).
A
B
D
C
Abs
orpt
ion
Abs
orpt
ion
Retentionszeit
Abs
orpt
ion
Abs
orpt
ion
m/z
Abbildung 12: GC-MS-Analyse des Taxadien-Synthase-Tests. A) GC-Elutionsprofil von pQE31 für das Ion m/z=122, B) GC-Elutionsprofil für pcTBCyc2.6 für das Ion m/z=122. C) Massenspektrum des Ion m/z=122, D) MS von Squalen.
+.
H2
34
5
67
8
.+
m/z=272 m/z=122
Abbildung. 13: mögli che C-Ring-Fragmentierung von Taxadien
Ergebnisse
50
Vergleich der Taxadien-Synthasen aus T. baccata, T. brevifolia und T. chinensis Als Ausgangspunkt der Untersuchung an der Taxadien-Synthase aus T. baccata wurden die
Arbeiten von Wildung und Croteau, 1996 an T. brevifolia genommen. Sie isolierten einen
cDNA-Klon, der für die Taxadien-Synthase codiert. Im August 2000 veröffentlichten Wang
und Mitarbeiter in der Genbank von NCBI die Sequenz der Taxadien-Synthase aus
T. chinensis. Ein Vergleich dieser Taxadien-Synthasen zeigt eine 99,3 %ige Identität auf
Nucleotidbasis (PC-Gene) und eine 97%ige Identität auf Aminosäurebasis (Clustal W)
zwischen T. baccata und T. brevifolia; zwischen T. chinensis und den anderen beiden eine
98,6 %ige Identität auf Nucleotidbasis und 96 %ige Identität auf Proteinbasis. Abb. 14 zeigt
die Aminosäurepositionen, in denen sich die Proteinsequenzen unterscheiden (grün/gelb
markiert).
Tbacc MAQLSFNAALKMNALGNKAIHDPTNCRAKSERQMMWVCSRSGRTRVKMSRGSGGPGPVVMMSSSTG 66 Tbrev MAQLSFNAALKMNALGNKAIHDPTNCRAKSERQMMWVCSRSGRTRVKMSRGSGGPGPVVMMSSSTG 66 Tchin MAQLSFNAALKMNALGNKAIHDPTNCRAKSEGQMMWVCSGSGRTRVKMSRGSGGPGPVVMMSSSTG 66 Motiv I Motiv II Motiv III Tbacc TSKVVSETSSTIVDDIPRLSANYHGDLWHHNVIQTLETPFRESSTFQERADELVVKIKDMFNALGD 132 Tbrev TSKVVSETSSTIVDDIPRLSANYHGDLWHHNVIQTLETPFRESSTYQERADELVVKIKDMFNALGD 132 Tchin TSKVVSETSSTIVDDIPRLSANYHGDLWHHNVIQTLETPFRESSTYQERADELVVKIKDMFNALGD 132 Tbacc GDISPSAYDTAWVARVATVSSDGSEKPRFPQALNWVLNNQLQDGSWGIESHFSLCDRLLNTVNSVI 198 Tbrev GDISPSAYDTAWVARLATISSDGSEKPRFPQALNWVFNNQLQDGSWGIESHFSLCDRLLNTTNSVI 198 Tchin GDISPSAYDTAWVARVATISSDGSEKPRFPQALNWVFNNQLQDGSWGIESHFSLCDRLLNTTNSVI 198 Tbacc ALSVWKTGHSQVEQGTEFIAENLRLLNEEDELSPDFEIIFPALLQKAKALGINLPYDLPFIKSLST 264 Tbrev ALSVWKTGHSQVQQGAEFIAENLRLLNEEDELSPDFQIIFPALLQKAKALGINLPYDLPFIKYLST 264 Tbrev ALSVWKTGHSQVEQGTEFIAENLRLLNEEDELSPDFEIIFPALLQKAKALGINLPYDLPFIKYLST 264 Tbacc TREARLTDVSAVADNIPANMLNALEGLEEVIDWNKIMRFQSKDGSFLSSPASTACVLMNTGDEKCF 330 Tbrev TREARLTDVSAAADNIPANMLNALEGLEEVIDWNKIMRFQSKDGSFLSSPASTACVLMNTGDEKCF 330 Tchin TREARLTDVSAAADNIPANMLNALEGLEEVMDWKKIMRFQSKDGSFLSSPASTACVLMNTGDEKCF 330 Tbacc TLLNNLLDKFGGCVPCMYSIDLLERLSLVDNIEHLGIGRHFKQEIK VALDYVYRHWSERGIGWGRD 396 Tbrev TFLNNLLDKFGGCVPCMYSIDLLERLSLVDNIEHLGIGRHFKQEIKGALDYVYRHWSERGIGWGRD 396 Tchin TFLNNLLVKFGGCVPCMYSIDLLERLSLVDNIEHLGIGRHFKQEIK VALDYVYRHWSERGIGWGRD 396 Tbacc SLVPDLNTTALGLRTLRTHGYDVSSDVLNNFKDENGRFFSSAGQTHVELRSVVNLFRASDLAFPDE 462 Tbrev SLVPDLNTTALGLRTLRMHGYNVSSDVLNNFKDENGRFFSSAGQTHVELRSVVNLFRASDLAFPDE 462 Tchin SLVPDLNTTALGLRTLRTHGYDVSSDVLNNFKDENGRFFSSAGQTHVELRSVVILFRASDLAFPDE 462 Tbacc GAMDDARKFAEPYLRDALATKISTNTKLYKEIEYVVEYPWHTSIPRLEARSYIDSYDDDYVWQRKT 528 Tbrev RAMDDARKFAEPYLREALATKISTNTKLFKEIEYVVEYPWHMSIPRLEARSYIDSYDDNYVWQRKT 528 Tchin GAMDDARKFAEPYLRDALATKISTNTKLFKEIEYVVEYPWHMSIPRSEARSYIDSYDDDYVWERKT 528 Tbacc LYRMPSLSNSKCLELAKLDFNIVQSLHQEELKLLTRWWKESGMADINFTRHRVAEVYFSSATFEPE 594 Tbrev LYRMPSLSNSKCLELAKLDFNIVQSLHQEELKLLTRWWKESGMADINFTRHRVAEVYFSSATFEPE 594 Tchin LYRMPSLSNSKCLELAKLDFNIVQSLHQEELKLLTRWWKESGMADINFTRHRVAEVYFSSATFEPE 594 Tbacc YSATRIAFTKIGCLQVLFDDMADIFATLDELKSFTEGVKRWDTSLLHEIPECMQTCFKVWFKLMEE 660 Tbrev YSATRIAFTKIGCLQVLFDDMADIFATLDELKSFTEGVKRWDTSLLHEIPECMQTCFKVWFKLMEE 660 Tchin YSATRIAFTKIGCLQVLFDDMADIFATLDELKSFTEGVKRWDTSLLHEIPECMQTCFKVWFKLIEE 660
Ergebnisse
51
Tbacc VNNDVVKVQGRDMLAHIRKPWELYFNCYVQEREWLEAGYIPTFEEYLKTYAISVGLGPCTLQPILL 726 Tbrev VNNDVVKVQGRDMLAHIRKPWELYFNCYVQEREWLEAGYIPTFEEYLKTYAISVGLGPCTLQPILL 726 Tchin VNNDVVKVQGRDMLAHIRKPWELYFNCYVQEREWLDAGYIPTFEEYLKTYAISVGLGPCTLQPILL 726 Tbacc MGELVKDDVVEKVHYPSNMFELVSLSWRLTNDTKTYQAEKARGQQASGIACYMKDNPGATEEDAIK 792 Tbrev MGELVKDDVVEKVHYPSNMFELVSLSWRLTNDTKTYQAEKARGQQASGIACYMKDNPGATEEDAIK 792 Tchin MGELVKDDVVEKVHYPSNMFELVSLSWRLTNDTKTYQAEKARGQQASGIACYMKDNLGATEEDAIK 792 Tbacc HICRVVDRALKEASFEYFKPSNDIPMGCKSFIFNLRLCVQIFYKFIDGYGIANEEIKDYIRKVYID 858 Tbrev HICRVVDRALKEASFEYFKPSNDIPMGCKSFIFNLRLCVQIFYKFIDGYGIANEEIKDYIRKVYID 858 Tchin HICRVVDRALKEASFEYFKPSNDIPMGCKSFIFNLRLCVQIFYKFIDGYGIANEEIKDYIRKVYID 858 Tbacc PIQV 862 Tbrev PIQV 862 Tchin PIQV 862 Abbildung 14: Alignment der Aminosäuresequenzen der Taxadien-Synthasen aus Taxus baccata (Tbacc), Taxus brevifolia (Tbrev) und Taxus chinensis (Tchin). Die unterschiedli chen Aminosäurepositionen sind gelb bzw. grün markiert. Das Peptid, das zur Antikörpergewinnung gegen Taxadien-Synthase eingesetzt wurde, ist blau markiert. Motiv I, II und III markieren die homologen Bereiche für Transitpeptide wie sie von Karlin-Neumann und Tobin, 1986 beschrieben wurden.
Wie das Alignment zeigt, sind es 30 Aminosäurepositionen, in denen sich die Taxadien-
Synthasen unterscheiden. Die Taxadien-Synthasen aus T. baccata und T. brevifolia
unterscheiden sich in 19 Aminosäurepositionen, der C- und N-terminale Bereich ist
konserviert. T. chinensis unterscheidet sich gegenüber T. baccata und T. brevifolia in
20 AS-Positionen, auch im C- und vor allem im N-terminalen Bereich sind Unterschiede zu
verzeichnen Tabelle 3.
AS-Position 32 40 112 148 151 169 194 211 214 235 261 276 295 298 332
Tbrev R R Y L I F T Q A Q Y A I N F
Tbacc R R F V V L V E T E S V I N L
Tchin G K Y V I F T E T E Y A M K F
AS-Position 338 377 414 418 450 463 478 491 504 509 521 525 658 696 783
Tbrev D G M N N R E F M L N Q M E P
Tbacc D V T D N G D Y T L D Q M E P
Tchin V V T D I G D F M S D E I D L
Tabelle 3: Gegenüberstellung der unterschiedli chen Aminosäuren und deren Positionen in den Taxadien-Synthasen aus T. baccata, T. brevifolia und T. chinensis.
Alignment der Aminosäuresequenz verschiedener Isoprensynthasen aus Pflanzen In der Literatur sind für alle Isoprensynthasen konservierte Bereiche beschrieben. Dabei ist
das Motiv DDXXD in der Aminosäuresequenz aller Isoprensynthasen zu finden (Stofer Vogel
et al., 1996). Ein Vergleich verschiedener Isoprensynthasen miteinander sollte weitere
konservierte Bereiche, bzw. die Verwandtschaft der Synthasen untereinander aufzeigen. Ein
Alignment der beiden Taxadien-Synthasen aus T. baccata und T. brevifolia (Accession
Ergebnisse
52
number U48796), der Linalool-Synthase aus Clarkia concinna (AF067603), der 5-epi-
Aristolochen-Synthase aus Nicotiana tabacum (U50768), Limonen-Synthase aus
Mentha spicata (L13459), Casben-Synthase aus Ricinus communis (L32134), Abietadien-
Synthase aus Abies grandis (U50768), ent-Kauren-Synthase B aus Cucurbita maxima
(U43904) und E-α-Bisbolen-Synthase aus Abies grandis (AF006195) ist in Abb. 15
dargestellt. Der Sequenzvergleich erfolgte mit Hilfe des Programms ClustalW im Genedoc-
Programm-Paket. Wie zuvor schon beschrieben, ist auch hier der konservierte Bereich mit
dem Motiv1 DDXXD für alle Synthasen zu finden. Doch auch die Bereiche davor und danach
zeigen hohe Homologien zwischen den Synthasen. Der konservierte Asparaginsäure-Rest
(758D für TS) im Motiv2 gehört zu einem Bereich, der bei Röntgenstrukturanalysen dem
Motiv1 direkt gegenüber liegt (Cane und Kang, 2000). Weitere, für verschiedene Terpen-
Synthasen beschriebene, konservierte Aminosäurereste sind in der Abbildung mit Pfeilen
markiert: die Tyrosine 585Y und 841Y, die Cysteine 329C und 650C und die Histidine 370H, 415H, 503H und 555H (Stofer Vogel et al., 1996). Doch wie sich zeigt, sind diese Reste nicht bei allen
Isopren-Synthasen zu finden. Auffälli g ist der homologe N-terminale Bereich der „großen“
Terpen-Synthasen (>700 Aminosäuren). Insbesondere das Motiv3 ist, mit Ausnahme der
Casben-, 5-epi-Aristolochen- und Limonen-Synthase bei allen anderen Synthasen zu finden.
3
Ergebnisse
53
Abbildung 15: Alignment verschiedener Isoprensynthasen aus Pflanzen. 80-100%ige Identitäten sind rot, 60-79%ige sind gelb und 40-59%ige Identitäten sind grau unterlegt. TSbacc: Taxadien-Synthase aus Taxus baccata, TSbrev: Taxadien-Synthase aus T. brevifolia, TSchin: Taxadien-Synthase aus T. chinensis, AS: Abietadien-Synthase aus Abies grandis, LiS: Linalool-Synthase aus Clarkia concinna, KSB: ent-Kauren-Synthase B aus Arabidopsis thaliana, EBS: E-α-Bisbolen-Synthase aus Abies grandis, CS: Casben-Synthase aus Ricinus comunis, EAS: 5-epi-Aristolochen-Synthase aus Nicotiana tabacum, LS: Limonen-Synthase aus Mentha spicata. Das Alignment wurde mit dem Programm Clustal W aus dem Genedoc-Programm-Paket erstellt und die Maske Blossum 62 verwendet.
1
2
Ergebnisse
54
Für den Vergleich der Sequenzen untereinander sind die Identitäten in Tabelle 4 dargestellt.
Diese variieren von nur 7% Identität zwischen Casben-Synthase aus Ricinus communis und
Linalool-Synthase aus Clarkia breweri, und 97% Identität zwischen den beiden Taxadien-
Synthasen aus T. baccata und T. brevifolia.
TSbacc TSbrev TSchin AS LiS KSB EBS CS EAS LS
TSbacc 100%
TSbrev 97% 100%
TSchin 96% 96% 100%
AS 43% 43% 42% 100%
LIS 16% 16% 16% 18% 100%
KSB 22% 22% 22% 23% 17% 100%
EBS 41% 41% 41% 42% 16% 24% 100%
CS 14% 14% 14% 14% 7% 10% 14% 100%
EAS 12% 12% 12% 13% 9% 10% 13% 30% 100%
LS 13% 13% 13% 14% 10% 11% 14% 25% 27% 100%
Tabelle 4: Vergleich der Identitäten der Isoprensynthasen in Prozent
Auf Grundlage dieser Identitäten wurde ein phylogenetischer Stammbaum erstellt, der den
Verwandtschaftsgrad der Terpensynthasen untereinander aufzeigt Abb. 16. So kann man
diese in drei verschiedene Gruppen aufteilen. Die Limonen-Synthase aus Mentha spicata, die
Casben-Synthase aus Ricinus communis und die 5-epi-Aristolochen-Synthase aus Nicotiana
tabacum gehören einer Gruppe an. Der Verwandtschaftsgrad zwischen der 5-epi-
Aristolochen-Synthase und der Casben-Synthase ist aber höher (30% Identität) als der
Verwandtschaftsgrad der beiden zur Limonen-Synthase (25% und 27% Identität). Die
Linalool-Synthase aus Clarkia concinna und die ent-Kauren-Synthase aus Cucurbita maxima
bilden eine weitere Gruppe mit 17% Identität zueinander. Zu der dritten Gruppe gehören die
beiden Taxadien-Synthasen aus T. baccata und T. brevifolia, die mit 97% Identität am
stärksten verwandt miteinander sind, die Abietadien-Synthase aus Abies grandis und die
E-α-Bisbolen-Synthase aus Abies grandis.
Ergebnisse
55
Anlegen einer T. baccata-Genbank Für die Untersuchung von regulatorischen up- und downstream-Bereichen des Taxadien-
Synthase-Gens sollte eine genomische Genbank angelegt, und nach einem geeigneten Klon
gesucht werden. Es konnte keine Genbank mit einem das ganze Genom repräsentierenden
Titer hergestellt werden. 10 µl einer Genbank ergaben ca. 30 Plaques formende Einheiten
(pfu). Bei Annahme, dass pro Plaque 20 kb des Genoms von T. baccata verpackt sind,
ergeben sich für eine Genbank (= 500 µl) 30 Mb. Das Genom von Koniferen ist aber im
Gegensatz dazu ca. 30 Gb groß (persönliche Mitteilung von R. Croteau). Das heißt, dass nur
ein tausendstel des Genoms von T. baccata nach einem für die Taxadien-Synthase
codierenden Gen durchsucht wurde. Alle möglichen Faktoren bei der Präparierung (DNA-
Isolierung und –Aufreinigung, Verpacken der DNA in einen λ-Phagen oder Cosmid-Vektor
und die Wahl der Hostbakterien) wurden variiert. Durch all diese Faktoren ließ sich der Titer
der Genbank nicht steigern und durch ein Screening konnte kein Klon isoliert werden, der das
0.1
LiS
KSB
LSCS
EAS
AS
TSbacc TSbrev
EBS
TSchin
Abbildung 16: Phylogenetischer Stammbaum verschiedener Isoprensynthasen aus Pflanzen, in Form eines Sterns gezeichnet. Der Stammbaum ist mit dem Programm Clustal W kalkuliert. Die Armlängen sind proportional zu den phylogenetischen Distanzen zwischen den Terpensynthasen. 0,1 = Armlängenmarker; repräsentiert den Abstand, bei der eine Aminosäure-Substitution in jeder 10. Position gefunden wurde. TSbacc: Taxadien-Synthase aus Taxus baccata, TSbrev: Taxadien-Synthase aus T. brevifolia, TSchin: Taxadien-Synthase aus T. chinensis, AS: Abietadien-Synthase aus Abies grandis, LiS: Linalool-Synthase aus Clarkia concinna, KSB: ent-Kauren-Synthase B aus Arabidopsis thaliana, EBS: E-α-Bisbolen-Synthase aus Abies grandis, CS: Casben-Synthase aus Ricinus comunis, EAS: 5-epi-Aristolochen-Synthase aus Nicotiana tabacum, LS: Limonen-Synthase aus Mentha spicata
Ergebnisse
56
Gen für die Taxadien-Synthase enthielt. Es konnten zwar in der ersten Screening-Runde
positive Plaques identifiziert werden, aber eine Anreichung und Reinigung dieser Klone war
nicht möglich.
Diskussion
57
Diskussion In der vorliegenden Arbeit wurde das Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase-Gen aus Taxus baccata
isoliert, die Genstruktur charakterisiert, mit verschiedenen Genen anderer Isoprensynthasen
aus Pflanzen verglichen und die rekombinante Taxadien-Synthase aus T. baccata in E. coli
exprimiert. Des Weiteren sollte eine genomische λ-Genbank von T. baccata zur
Untersuchung der flankierenden Bereiche des isolierten Gens konstruiert werden.
Gen-Struktur der Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase aus Taxus baccata In Anlehnung an den von Wildung und Croteau, 1996 veröffentlichten cDNA-Klon der
Taxadien-Synthase aus T. brevifolia konnte mittels PCR das Taxadien-Synthase-Gen aus
T. baccata, pTBCyc4.0, isoliert werden, das einen ORF von 3980 bp repräsentiert und aus
dem sich für das Taxadien-Synthase-Protein eine Größe von 98 kDa vorhersagen lässt. Der
codierende Bereich der Taxadien-Synthase umfasst 13 Exons und 12 Introns, das konservierte
Motiv DDXXD, welches für alle Isoprensynthasen beschrieben ist, befindet sich zwischen
Intron IX und X.
Durch Southern Blot-Analyse konnte nachgewiesen werden, dass, im Gegensatz zur 5-epi-
Aristolochen-Synthase aus Tabak, das Taxadien-Synthase-Gen nur in einer Kopie im Taxus-
Genom vorhanden ist. Für die 5-epi-Aristolochen-Synthase konnten zwei strukturell
unabhängige Cyclase-Gene in dem Genom von Nicotiana tabacum gefunden werden
(Facchini und Chappell, 1992).
Ein Vergleich der Genstruktur, d.h. Lage der Introns und Größe der Exonbereiche
verschiedener Isoprensynthasen aus Pflanzen, die, mit Ausnahme der Linalool-Synthase aus
Clarkia concinna, auch Isoprencyclasen sind, zeigte für den C-terminalem Bereich große
Homologien für alle Synthasen. Vor allem aber der Bereich um das konservierte Motiv
DDXXD (Exon 10, 11 und 12 für die Taxadien-Synthase) ist in seiner Intron/Exon-Struktur
für all diese Isoprensynthasen hochhomolog und wurde für die Bindung des Komplexes aus
zweiwertigen Metalli onen und der jeweili gen Prenyleinheit charakterisiert (Starks et al.,
1997).
Cseke und Mitarbeiter beschreiben in ihrem Alignment verschiedener Terpensynthasen, dass
sich die Linalool-Synthase aus C. concinna im N-terminalen Bereich von denen der Limonen-
Diskussion
58
Synthase-ähnlichen Cyclasen deutlich unterscheidet (Cseke et al., 1998). In dieser Arbeit
konnte gezeigt werden, dass die Taxadien-Synthase aus T. baccata gerade in diesem Bereich
(Exon 3-9 der Taxadien-Synthase) mit der Linalool-Synthase und nicht mit den Limonen-
Synthase-ähnlichen Cyclasen übereinstimmt. Für die 5-epi-Aristolochen-Synthase aus
Nicotiana tabacum ist der entsprechende Bereich (Exon 2 und der überwiegende Teil von
Exon 3) als strukturverwandt zu Glycosylhydrolasen beschrieben worden und soll nicht in die
Terpenbiosynthese involviert sein. (Starks et al., 1997).
Die miteinander verglichenen Isoprensynthasen unterscheiden sich hinsichtlich der Größe des
ersten Exons, was auf die Größe des entsprechenden N-terminalen Transitpeptids
zurückzuführen ist, das zum Transfer des Proteins in die jeweili gen Plastide notwendig ist.
Rekombinante Taxadien-Synthase aus T. baccata Mittels RT-PCR wurde, auf der Basis der genomischen Sequenz von T. baccata, die cDNA
der Taxadien-Synthase amplifiziert und das Protein in E. coli exprimiert. Die Ausbeute an
Taxadien-Synthase betrug nach 16 stündiger Expression 10 mg pro 500 ml Kulturmedium.
Für eine einfache Aufreinigung des Proteins an Nickel-Agarose wurde der Sequenz der
Taxadien-Synthase ein His-Tag vorgeschaltet. Dadurch konnte in einem Reinigungsschritt ein
Reinigungsgrad von ca. 30 % erreicht werden. Für die anschließende Identifikation des
angereinigten Proteins als Taxadien-Synthase aus T. baccata wurde dieser Reinigungsgrad als
ausreichend betrachtet.
Für die Identifikation des Proteins als Taxadien-Synthase wurde zum einen das angereinigte
Protein N-terminal ansequenziert, mittels Western Blot-Analyse die Antikörper-Reaktion
gegen den His-Tag und gegen das Peptid aus der Taxadien-Synthase beobachtet und zum
anderen die Synthese von Taxadien durch Inkorporation von radioaktiv markiertem
Geranylgeranylpyrophosphat mit dem angereinigten Protein und mittels GC-MS-Analyse
nachgewiesen.
Durch eine denaturierende SDS-PAGE wurde für die rekombinante Taxadien-Synthase aus
T. baccata ein Molgewicht von 97 kDa bestimmt. Dies ist in guter Übereinstimmung mit der
von dem ORF abgeleiteten Größe von 98 kDa. Im Gegensatz dazu ist für die native Taxadien-
Synthase aus T. brevifolia eine Größe von 80 kDa beschrieben worden (Hezarin et al., 1995).
Diese Diskrepanz und die Tatsache, dass die Biosynthese von Terpenen in Plastiden
lokalisiert ist (West et al., 1979), lässt den Schluss zu, dass das rekombinante Protein
Diskussion
59
(Preprotein) aus einem Transitpeptid für das Plastid und der eigentlichen Isoprensynthase
besteht.
Für die Bestimmung der exakten Schranken zwischen Transitpeptid und der prozessierten
Synthase können nur Sequenzvergleiche herangezogen werden, da der N-Terminus der
nativen Taxadien-Synthase geblockt ist (Wildung und Croteau, 1996).
Karlin-Neumann und Tobin beschreiben 1986 konservierte Transitpeptidstrukturen für den
Transport in Chloroplasten, die auch in der N-terminalen Sequenz des Preproteins der
Taxadien-Synthase aus T. baccata zu finden sind. Auf Grundlage dieser Studien ist die
mögliche Schranke in Aminosäureposition 60 des Preproteins zu erwarten. Jedoch hätte das
resultierende prozessierte Protein eine Größe von 91 kDa (803 AS). Ausgehend von einem
Molgewicht von 80 kDa (analog der Taxadien-Synthase aus T. brevifolia) ergäbe sich eine
Schnittstelle nach Aminosäureposition 125. In dem Sequenzbereich zwischen AS 60-125
lassen sich auch Strukturen finden, die für Transitpeptide aus Pflanzen beschrieben sind. So
sind diese Bereiche vor allem Serin-, Threonin- und Asparagin-reich, wohingegen positiv
geladene Reste unterrepräsentiert sind (Bruce, 2000). Eine Serie von verkürzten Taxadien-
Synthasen aus T. brevifolia zeigte, dass die um 59 AS verkürzte Taxadien-Synthase eine
höhere Syntheseaktivität als das Preprotein hat. Aber schon eine Verkürzung um 93 AS hatte
eine völli gen Verlusst der Aktivität zur Folge (Willi ams et al., 2000). Deshalb ist es
wahrscheinlich, dass die gesuchte Schranke für das Transitpeptid zwischen AS 60 und 93
liegt.
Vergleich der Taxadien-Synthasen aus T. baccata, T. brevifolia und T. chinensis Ein Vergleich der Aminosäure-Sequenzen der Taxadien-Synthasen aus T. baccata,
T. brevifolia (Wildung und Croteau, 1996) und T. chinensis (Genbank von NCBI) zeigt, dass
der Verwandtschaftsgrad der Synthasen aus T. baccata und T. brevifolia untereinander höher
ist als zu der Taxadien-Synthase aus T. chinensis. In zusätzlich 11 Aminosäurepositionen sind
Unterschiede in der AS-Sequenz für T. chinensis zu finden. Auch im N- und C-terminalen
Bereich, in denen die Taxadien-Synthasen aus T. baccata und T. brevifolia konserviert sind,
sind Austäusche für AS zu verzeichnen. Doch liegen sämtliche Austäusche außerhalb der für
alle Isoprensynthasen beschriebenen konservierten Bereiche.
Diskussion
60
Alignment der Aminosäure-Sequenz verschiedener Isoprensynthasen aus Pflanzen
Das Alignment der Taxadien-Synthasen mit anderen Isoprensynthasen aus Pflanzen zeigte
nicht nur große Homologien im Bereich des konservierten Motivs DDXXD, sondern es lässt
sich auch darstellen, dass viele weitere Bereiche homolog sind. Es ließ sich zeigen, dass die
im Alignment verglichenen Synthasen in drei Gruppen eingeteilt werden können, unabhängig
von dem Substrat ihrer Cyclisierungsreaktion. Die eine Gruppe sind die Limonen-Synthase-
ähnlichen Cyclasen (Limonen-Synthase (Monoterpencyclase), Casben-Synthase
(Diterpencyclase) und 5-epi-Aristolochen-Synthase (Sesquiterpencyclase)). Eine zweite
Gruppe wird aus den Taxadien-Synthasen (Diterpencyclasen), der Abietadien-Synthase
(Diterpencyclase) und der E-α-Bisbolen-Synthase (Diterpencyclase) gebildet. In die dritte
Gruppe werden die ent-Kauren-Synthase B, eine Diterpencyclase, und die Linalool-Synthase,
eine Monoterpenhydroxylase, eingeordnet. Dieses Ergebnis deckt sich mit der Beobachtung
von Bohlmann und Mitarbeiter, dass Isoprensynthasen innerhalb der Familie der
Gymnospermen oder der Familie der Angiospermen näher miteinander verwandt sind als
durch die Abhängigkeit vom Substrat. (Bohlmann et al., 1997).
Genbank
Für die Charakterisierung der up- und downstream Bereiche sollte eine genomische Genbank
von T. baccata konstruiert und ein Klon isoliert werden, der Aufschluss über die
flankierenden Bereiche des Taxadien-Synthase-Gens geben würde. Zum einen sollten
regulatorische Elemente untersucht werden und zum anderen besteht die Vermutung, dass
weitere, an der Biosynthese von Taxol beteili gte, Enzyme geclustert vorliegen. Es wurden
z.B. verschiedene Pilze gefunden, die, unabhängig von ihrem Taxol-produzierenden Wirt,
eigenständig Taxol synthetisieren (Taxomyces andreanae, Stierle et al., 1993; Pestalopsis
microspora, Strobel et al., 1996). Diese Fähigkeit kann Folge eines horizontalen Gentranfers
von dem Wirt auf den Pilz sein. Auch die Tatsache, dass in der Haselnuss Taxol gefunden
wurde (Hoffmann, 2000), unterstützt diese Theorie.
Im Rahmen dieser Arbeit war es aber nicht möglich, einen geeigneten Klon für diese
Untersuchungen zu isolieren. Sicherlich spielen viele Faktoren eine Rolle, nicht zuletzt ist
aber die Größe des Genoms von Koniferen (ca. 30 Gb) bei der Untersuchung von
unterrepräsentierten Genen hinderlich.
Diskussion
61
Ausblick In der vorliegenden Arbeit konnte die Isolierung des genomischen Klons der Taxadien-
Synthase gezeigt werden, der in seiner Genstruktur nicht den Limonen-Synthase-ähnlichen
Cyclasen gleicht, sondern strukturverwandt mit der Linalool-Synthase aus C. concinna ist, die
keine Cyclase sondern eine Hydroxylase ist. Bisher ist von keinen weiteren, nicht den
Limonen-Synthase-ähnlichen Isoprencyclasen die Genstruktur beschrieben worden. Es ist von
Interesse, ihre Intron/Exon-Struktur im Vergleich mit den anderen zu untersuchen.
Auch wurden bisher keine genauen Schnittstellen für die den Synthasen vorgeschalteten
Transitpeptide gefunden. Eine schrittweise Verkürzung des Preproteins konnte auch keine
zufriedenstellenden Ergebnisse liefern. Doch es wäre für enzymatische und
kristallographische Untersuchungen von Vorteil, wenn man in ausreichendem Maße natives
Protein erhalten könnte, und dies ist im Hinblick auf die Ausbeute bei der Isolierung aus den
natürlichen Ressourcen nur durch rekombinantes Enzym zu erreichen.
Für die Untersuchung von flankierenden Bereichen hat sich die Konstruktion einer
genomischen λ-Genbank nicht bewährt. Es wäre zu überlegen, ob eventuell die Konstruktion
einer Cosmidbank sinnvoll ist, und in wieweit die Untersuchung von up-und downstream-
Bereichen durch Genomwalking realisiert werden könnte.
Literatur
62
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Danksagung
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Danksagung Herrn Prof. Dr. U. Szewzyk danke ich für die Übernahme der Berichtertätigkeit meiner
Doktorarbeit.
Ganz besonders möchte ich mich bei Herrn Priv.-Doz. Dr. R. Zocher für die hervorragende
Betreuung und jederzeit gewährte Unterstützung bedanken.
Mein Dank geht auch an alle Mitglieder der Arbeitsgruppe Zocher für die einzigartige
Arbeitsatmosphäre und die hilfreiche Unterstützung bei dieser Arbeit.
Bei Frau Denaro möchte ich mich für die ausgezeichneten photographischen Arbeiten
bedanken.
Für die Durchführung der GC-MS-Messungen danke ich Stefanie Heimroth.
Anke Doller und Christine Hacker danke ich im besonderen für ihre Freundschaft und die
Hilfe in allen Lebenslagen.
Meinen Eltern danke ich insbesondere für den jederzeit gegebenen Rückhalt.
Ein besonderes Dankeschön an Reinhard; und nicht nur, weil ich ohne ihn diese Arbeit
wahrscheinlich nicht fertig gestellt hätte.
Lebenslauf
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Lebenslauf
Persönliche Daten
Name, Vorname: Görhardt, Bärbel
Straße: Friedrichstr.114
PLZ/Wohnort: 10117 Berlin
Geburtsdatum/-ort: 07.03.1970 / Berlin
Schulausbildung
von / bis 1976 - 1986 Oberschule in Berlin
1986 - 1988 Erweiterte Oberschule in Berlin
Juli 1988 Reifeprüfung bestanden
Studium
von / bis Sept. 1988 - Juli 1989 Praktikum im Institut für Lebensmittelhygiene des Fachbereichs Veterinärmed. der Humboldt-Uni zu Berlin
Sept. 1989 - Juli 1990 Studium an der TH Leuna Merseburg in Merseburg im Fachbereich Chemie
seit Oktober 1990 Studium an der TU Berlin im Fachbereich Chemie
März 1993 Diplom-Vorprüfung bestanden
Nov. 1994- Sept. 1996 Student. Hilfskraftstelle am Inst. f. Biochemie u. Mol. Biologie der TU-Berlin
19. 04. 1996 Beendigung des Studiums der Chemie an der TU Berlin mit Abschluss Diplom-Chemiker Beruflicher Werdegang
Okt. 1996 - April 1997 Werkvertrag mit TU-Berlin
01.05.1997 – 30.06.2000 wiss. Mitarbeiter am Max-Volmer-Institut für Biophysikalische Chemie und Biochemie
01.07.2000 - 31.12.2000 Promotionsabschlussstipendium der TU Berlin
19.01.2001 Promotionprüfung mit Prädikat „sehr gut“ bestanden
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