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Bromatologia II
Paulo Figueiredo
paulo@pfigueiredo.org
Programa
1. Análise de carboidratos: extracção e separação; métodos de identificação. Determinação quantitativa: métodos físicos, químicos e biológicos. determinação de fibra.
2. Análise de lípidos: extracção e determinação quantitativa; identificação e quantificação de ácidos gordos.
3. Análise de proteínas: determinação de proteína total e azoto não proteico. Separação e identificação de proteínas e aminoácidos.
4. Análise da humidade: métodos físicos e químicos. Obtenção e determinação de cinzas.
6. Análise de minerais: identificação e determinção quantitativa.7. Análise de vitaminas: identificação e determinação quantitativa de
vitaminas hidrossolúveis e lipossolúveis.
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Bibliografia
1. P. Figueiredo (2016), Introdução à Química dos Alimentos: Métodos Analíticos. Novas Edições Acadêmicas.
2. Nielsen, S. S. (2017), Food analysis. New York: Springer, 5th edition. 3. Damodaran, S. & Parkin, K. L. (2017), Fennema’s Food Chemistry. Boca
Raton: CRC, 5th edition. 4. Nollet, L. M. L., Toldrá, F (2015), Handbook of Food Analysis. Boca
Raton: CRC, 3rd edition. 5. Coultate, T.. (2015), Food: The Chemistry of its Components.
Cambridge: Royal Society of Chemistry, 6th edition. 6. R. Owusu-Apenten, Introduction to food chemistry, 2004, CRC
Web
1. http://www.pfigueiredo.org/uatla.html
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Avaliação
A. Exame – 100 %
B. Avaliação contínua:1. 2 Frequências – 30 % + 30 %2. Discussão de artigos – 25 %3. Resolução de exercícios – 15 %
Componentes mais abundantes dos alimentosfunções:
nutrientesadoçantesmatéria-prima para produtos fermentadospropriedades reológicas da maioria dos alimentos de origem vegetalresponsáveis por reacções de escurecimento
Análise de carboidratos 6
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podem ocorrer isolados, ou física ou quimicamente associados a outras moléculas
glicoproteínasglicolípidos
fibras dietéticascarboidratos não digeríveislenhina
Análise de carboidratos 7
razões para determinação de tipo e concentração de carboidratos nos alimentos:
padronizaçãoalimentos devem ter composições que respeitem a legislação
rotulagem nutricionalinformação ao consumidor sobre teor nutricional
detecção de adulteraçõescada alimento tem a sua “impressão digital” de carboidratos
qualidade alimentarpropriedades físico-químicas dos alimentos dependem do tipo e
concentração de carboidratos presentesdoçura, aparência, estabilidade, textura
económicasevitar desperdício de ingredientes dispendiosos
processamentoeficácia de diversas operações depende do tipo e concentração
dos carboidratos presentes
Análise de carboidratos 8
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Amostragemmoídas
causar mínima alteração no teor de humidadelípidos e clorofila removidos por extracção com éter de petróleo
carboidratos insolúveisoutros interferentes removidos por:
descoloraçãoresinas de permuta iónicaprecipitação por agentes clarificantes
Análise de hidratos de carbono 9
agentes clarificantes:solução básica de acetato de chumbo
descolora a soluçãousado em polarimetria de soluções coloridas
ácidos fosfotungístico e tricloroacéticoprecipitam proteínas
ferricianeto de potássio e sulfato de zincoprecipitam proteínasdescoloram parcialmente a solução
sulfato de cobreespecífico para determinação da lactose em leite
Análise de carboidratos
Amostragem
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requisitos dos agentes clarificantes:remover completamente interferentes sem adsorver ou
modificar açúcaresexcesso de clarificante não deve afectar procedimentoprecipitado deve ser pequenoprocedimento relativamente simples
Análise de carboidratos
Amostragem
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remoção de etanolevaporação sob vácuo
Análise de carboidratos
Amostragem
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Análise de carboidratos
Amostragem
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Métodos qualitativosreacções colorimétricas
condensação de produtos de degradação de açúcares em ácidos fortes com compostos orgânicos
antrona e fenol são dos mais utilizadosantrona reage especificamente com carboidratos em
solução concentrada de H2SO4
cor verde azuladareacção com os produtos de degradação
hidroximetilfurfural ou furfural
Análise de carboidratos 14
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reacções colorimétricasreacção de fenol com H2SO4
método simples, rápido, sensível, exacto e específico
permite determinar quase todos os tipos de carboidratos
cor produzida é estávelresultados reprodutíveispoucos problemas com interferentes
Análise de carboidratos
Métodos qualitativos
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propriedades redutoras do grupo carbonilonão específicasrequerem remoção de outros agentes redutoressolução de Fehling é reagente mais conhecido
redução de cobre
Análise de carboidratos
Métodos qualitativos
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Métodos quantitativosMunson-Walker
método gravimétricoredução de cobre pelos grupos redutores dos carboidratos2 reagentes de Fehling
A – sulfato de cobreB – tartarato de sódio e potássio/NaOH
reacção com carboidratos redutoresforma precipitado de óxido de cobre
pp filtrado num cadinho de fundo porosopp lavado com água quentepp seco e pesado
Análise de carboidratos 17
Munson-Walkerredução não é estequiométrica
calibração com soluções padrão de cada carboidratotabelas relacionam peso do pp com a quantidade de
carboidrato, para cada carboidrato
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
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Lane-Eynonmétodo titrimétricoredução de cobre pelos grupos redutores dos carboidratosadição da solução de carboidrato a mistura (1:1) em
ebulição das soluções de Fehlingazul de metileno usado como indicador
mudança de cor no ponto de viragemmétodo não é estequiométrico
utilização de tabelas e padrões
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
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Somogyimétodo microtitrimétricoredução de cobre pelos grupos redutores dos carboidratosusado para determinar pequenas quantidades de carboidratosreagente de cobre contém:
tampão fosfatoiodeto de potássio
iodo vai oxidar ião cuprososulfato de sódio
minimiza oxidação do óxido cuproso por O2 do ar
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
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Somogyireagente adicionado em excesso, mas em quantidade
conhecidacarboidrato redutor reduz Cu a óxido cuprosoCu2O oxidado pelo iodoexcesso de iodo titulado com tiossulfato de sódio
reacção não estequiométricarequer padronização
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
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Métodos cromatográficoscarboidratos separados e determinados individualmente
separação baseada em:coeficiente de partiçãopolaridadetamanho
cromatografia em papelTLCcromatografia em colunaGC
requer amostras voláteisem geral, necessário derivatizar
HPLCactualmente mais rápido, específico, sensível e preciso
HPLC e GC usados em conjunto com NMR e MS
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
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Métodos cromatográficosHPLC
análise de monossacáridos e oligossacáridostambém permite análise de polissacáridos, após hidrólisemétodo rápido, com elevado grau de exactidãopode ser utilizado em ampla gama de concentraçõesnão requer derivatização
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
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HPLCfases estacionárias
permuta aniónicapermuta catiónicafase normalfase reversa
Análise de carboidratos
Métodos quantitativosMétodos cromatográficos
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HPLCfases estacionárias
permuta aniónicacarboidratos têm pKa entre 12-14
em solução básica, grupos OH podem ionizarseparados em permuta aniónica
sequência de eluição:açúcares álcoois (alditois)< monossacáridos
< dissacáridos < outros oligossacáridosgeralmente detectores electroquímicos
Análise de carboidratos
Métodos quantitativosMétodos cromatográficos
1. Glucose 2. Fructose 3. Maltose 4. Maltotriose 5. Maltotetraose 6. Maltopentaose 7. Maltohexaose 8. Maltoheptaose
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HPLCfases estacionárias
permuta catiónicaseparação por ordem decrescente de PM
oligossacáridos (DP>3) < trissacáridos < dissacáridos < monossacáridos < alditois
muito eficazes para resolver monossacáridos
Análise de carboidratos
Métodos quantitativosMétodos cromatográficos
1. Sucrose 2. Glucose 3. Fructose 4. Mannitol 5. Sorbitol
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HPLCfases estacionárias
fase normalfase estacionária polar
sílica gel com grupos aminofase móvel de polaridade crescente
acetonitrilo (50-85 %)/águamonossacáridos e alditois < dissacáridos < outros
oligossacáridosaçúcares redutores reagem com grupos amino
deterioração da coluna
Análise de carboidratos
Métodos quantitativosMétodos cromatográficos
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HPLCfases estacionárias
fase reversafase estacionária hidrofóbica
sílica gel com cadeias alquilo ou fenilofase móvel polar
habitualmente águamonossacáridos têm tempos de retenção muito curtos
tendem a eluir num único pico não resolvidoadição de sais pode aumentar Rt
presença de anómerosduplicação e/ou alargamento dos picosadição de uma amina à fase móvel acelera
anomerização e reduz problema
Análise de carboidratos
Métodos quantitativosMétodos cromatográficos
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HPLCfases estacionárias
fase reversa
Análise de carboidratos
Métodos quantitativosMétodos cromatográficos
1. Fructose 2. Glucose 3. Maltose 4. Maltotriose 5. Maltotetraose 6. Maltopentaose 7. Maltohexaose 8. Maltoheptaose 9. Maltooctaose
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HPLCdetectores
índice de refracçãoelectroquímicosderivatização pós-colunaderivatização pré-coluna
Análise de carboidratos
Métodos quantitativosMétodos cromatográficos
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HPLCdetectores
índice de refracçãoaplicável a todos os carboidratosmedidas lineares numa larga gama de concentraçõesprincipais limitações:
não permite utilização de gradientes de eluiçãodetecção mede massas, não concentrações
Análise de carboidratos
Métodos quantitativosMétodos cromatográficos
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HPLCdetectores
electroquímicosdetector de amperometria pulsada (PAD) usado
habitualmente com cromatografia de permuta aniónicapermite utilização de gradientesrequer utilização a pH elevado
Análise de carboidratos
Métodos quantitativosMétodos cromatográficos
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HPLCdetectores
derivatização pós-colunaaumento da sensibilidade de detecção por adição de um
grupo substituinteconcentração medida por UV/Vis ou fluorescência
maior sensibilidade que detectores de índice de refracção
Análise de carboidratos
Métodos quantitativosMétodos cromatográficos
33
HPLCdetectores
derivatização pré-colunareacções têm que ser estequiométricasderivatização de oligossacáridos com grupos aromáticos
aumento de resolução com HPLC em fase normal
Análise de carboidratos
Métodos quantitativosMétodos cromatográficos
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Métodos cromatográficosGC
análise quantitativa e qualitativanecessário converter os carboidratos em compostos
voláteis, por derivatizaçãoperacetatos de alditolperacetatos do ácido aldónico
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
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GCprincipal problema:
necessários 2 passos de preparaçãoredução dos grupos aldeído a álcoois primáriosconversão do carboidrato reduzido num éster de
peracetato volátil ou num éter pertrimetilsililadocada passo tem que ser estequiométrico
Análise de carboidratos
Métodos quantitativosMétodos cromatográficos
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GCaplicação a carboidratos neutros
1.redução a alditoiscarboidratos obtidos a partir do extracto com 80 %
EtOH ou por hidrólise de polissacáridosredução com borohidreto de sódio dissolvido em
hidróxido de amónio (T ambiente)adição de ácido acético, gota a gota
até parar libertação de H2
destruição do borohidreto em excessosolução evaporada até securaadição de metanol e evaporação até eliminação de iões
boratose frutose estiver presente
reduzida a D-glucitol + D-manitol
Análise de carboidratos
Métodos quantitativosMétodos cromatográficos
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GCaplicação a carboidratos neutros
2. acetilação de alditoisadição de anidrido acético
balão fechado e aquecido a 121 ºCarrefecido
adição de águadecomposição do anidrido acético em excesso
evaporação até secura3. GC dos peracetatos
resíduo dissolvido em clorofórmiocromatografia isotérmica
identificação através dos Rt relativamente a hexaacetato de inositol
padrão interno
Análise de carboidratos
Métodos quantitativosMétodos cromatográficos
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GCaplicação a hidrolisados de polissacáridos contendo ácidos urónicos
necessário um método diferente1.redução
hidrolisado evaporado até securaresíduo dissolvido em sol. carbonato de sódio
tratado com borohidreto de sódio em excessoadição de ácido acético
decomposição do borohidreto em excessoadição de metanol e evaporação até eliminação de iões
boratoácidos urónicos reduzidos a ácidos aldónicos e
aldoses a alditois
Análise de carboidratos
Métodos quantitativosMétodos cromatográficos
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GCaplicação a hidrolisados de polissacáridos contendo ácidos urónicos
2. preparação dos derivados trimetilsililados e cromatografiaácidos aldónicos convertidos em éteres de per-TMSdirectamente injectados
necessário utilizar gradiente de temperaturaidentificação através dos Rt
Análise de carboidratos
Métodos quantitativosMétodos cromatográficos
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GCdetector mais usado
FID
Análise de carboidratos
Métodos quantitativosMétodos cromatográficos
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Métodos cromatográficosTLC
usado em análise de rotinaanálise rápida e simultânea de diversas amostras
identificação e quantificação de carboidratos em melaços
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
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Espectrometria de massapouco usada
não rotineiroMALDI-TOF em análise de séries homólogas de oligossacáridos
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
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Métodos electroforéticoscarboidratos derivatizados por reacção com boratos
tornam-se electricamente carregadoscarboidratos aplicados num gel ao qual se aplica uma
voltagemseparação baseada no tamanho
moléculas menores movem-se mais rapidamente no campo eléctrico
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
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Métodos ópticosrefractometria
índice de refracção da solução de carboidratosdeterminação de açúcares totais, como sólidos solúveisutilização em controlo de qualidade
xaropes, geleias, sumos de frutapolarimetria
polarímetro mede rotação óptica de uma solução pura de um carboidrato
densimetriamedida da gravidade específica de uma solução açucarada
densidade é função da concentração de carboidratoa uma dada temperatura (20 ºC)
resultados exactos para soluções purasresultados aproximados para alimentos açucarados
(xaropes, ...)
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
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Métodos enzimáticosrápidos, muito específicos e sensíveis para baixas concentraçõessequência de reacções enzimáticas é método preferencial para
determinação de amidorequerem pouca preparação da amostra
alimentos líquidos podem ser analisados directamentealimentos sólidos requerem prévia dissolução em água
existem diversos kits comerciais para analisar carboidratosespecíficos
métodos mais frequentemente usados para determinar concentrações:
permitir que a reacção enzimática finalize e medir a concentração do produto
proporcional à concentração do substrato inicialmedição da velocidade inicial da reacção enzimática
proporcional à concentração do substrato
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
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Métodos enzimáticos
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
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Métodos enzimáticospreparação da amostra
recomendada utilização do tratamento de Carrezadição de sol. de hexacianoferrato de potássioadição de sol. de sulfato de zincoadição de sol. de NaOH
destrói emulsõesprecipita proteínasabsorve algumas cores
suspensão filtradafiltrado límpido usado directamente para ensaios
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
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Métodos enzimáticosex: D-glucose/D-frutose
1) conversão de glucose em glucose-6-fosfatopor hexacinase e ATP
2) G6P oxidada por NADP+, na presença de G6P-desidrogenaseG6P + NADP+ ↓ Gluconato-6-fosfato + NADPH + H+
NADPH formado proporcional à concentração de G6P na amostra
medido por espectrofotometria a 340 nmconcentração de frutose determinada por conversão da frutose
em glucose (por via enzimática) e repetição do procedimento
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
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Métodos enzimáticosex: maltose/sacarose
1) maltose e sacarose hidrolisadas por a-glucosidasemaltose ↓ 2 Glu; sacarose ↓ Glu + Fru
2) concentrações de glucose e frutose determinadas pelo método anterior
problema:se existirem outros oligossacáridos, estes também são
hidrolisados
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
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Métodos físicospolarimetria
mede o ângulo de rotação da luz polarizada no plano, ao atravessar uma solução
extensão da polarização proporcional à concentração das espécies opticamente activasa = [a]lc
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
Polarímetro:•fonte de luz monocromática•polarizador•porta-amostra•analisador (mede ângulo de rotação)
a – ângulo de rotação medido[a] – actividade óptica (constante
para cada espécie)l – percurso ópticoc - concentração
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Métodos físicosângulo de rotação depende da temperatura e comprimento
de ondausam-se condições padrão da risca D do sódio
T = 20 ºC; l = 589.3 nmprepara-se uma curva de calibração a vs. c
ou[a] tirado da bibliografia
concentração do carboidrato determinada por medição do seu ângulo de rotação e comparando com valores da curva de calibração
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
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Métodos físicosrefractometria
determinação do índice de refracção (n)
medição do ângulo de refracção (r) e do ângulo de incidência (i) numa zona fronteira entre o material da amostra e um padrão
para carboidratos, o material de referência é quartzo
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
m
cn
c c – velocidade da luz no vácuo
cm – velocidade da luz no material
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Métodos físicosíndice de refracção de carboidratos aumenta
proporcionalmente à concentraçãoíndice de refracção depende de temperatura e
comprimento de ondamedidas feitas a 20 ºC e 589.3 nm
método rápido e simplesuso rotineiro na indústria
análise de xaropes, mel, melaços, compotas, …
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
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Métodos físicosinfra-vermelho
restantes componentes principais dos alimentos não absorvem radiação IV no mesmo comprimento de onda
possibilidade de determinar concentraçõesprocesso rápido e não destrutivo
densidadedensidade de soluções aquosas aumenta com aumento da
concentração de carboidratosdensidade medida por densímetros ou garrafas de
densidadeuso de rotina na indústria
determinação em sumos e outras bebidas
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
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Ensaios imunológicosespecíficos para carboidratos de baixo peso molecular
carboidrato de interesse ligado a uma proteínainjectado num animalanimal desenvolve anticorpos específicos para o
carboidratoanticorpos podem ser extraídos
usados como parte de kits para determinação da concentração do carboidrato em alimentos
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
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Reagentesamostra500 mL solução A: sulfato cúprico + H2SO4
500 mL solução B: tartarato de sódio e potássio + NaOHsolução de ferrocianeto de potássio 0.025 Msolução de acetato de zinco 1.0 M, com ác. acético 20 mL/Lsolução de azul de metileno 1 %HCl conc.papel indicador de vermelho CongoNaOH 40 %HCl 1 NNaOH 0.1 N
Análise de carboidratos
Ex: Determinação de carboidratos totais e redutores
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Preparação da amostrapesar ou pipetar quantidade suficiente para obter 250 mL de sol.
com ~1 % de carboidratosjuntar 50 mL H2O
agitarneutralizar até pH 7.00
com NaOH 0.1 Npassar sol. para balão volumétrico de 250 mLclarificar
volumes iguais de K4Fe(CN)6 e Zn2(CH3COO)2
agitarcompletar volume do balão com H2Ofiltrar sobre papel de filtro secoobtém-se sol. a
Análise de carboidratos
Ex: Determinação de carboidratos totais e redutores
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Inversão da sacarose para determinação de carboidratos totaispipetar 50 mL da sol. a para balão volumétrico de 100 mLadicionar 5 mL HCl conc.aquecer em banho-maria a 68-70 ºC (5 min)arrefecercolocar papel indicador no balãoneutralizar com NaOH 40 %
até papel ficar roxocompletar volume com H2O
agitarobtém-se sol. b
Análise de carboidratos
Ex: Determinação de carboidratos totais e redutores
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Método de Lane-Eynonpreparar licor de Fehling
misturar partes iguais de sols. A e Bagitar bem
1 mL = 5.00 mg glucosecolocar sol. a numa bureta de 50 mLpipetar 10 mL do licor de Fehling para erlenmeyer de 125 mL
juntar igual volume de H2Oaquecer em bico de Bunsen até fervura
juntar 5 mL da sol. adeixar ferver
adicionar 3-4 gotas de azul de metileno 1 %reiniciar titulação
adição de porções de 0.5 mL da sol. aperto do ponto final, cor da espuma sobrenadante começa
a desaparecerpp vermelho tijolo (óxido cuproso)
Análise de carboidratos
Ex: Determinação de carboidratos totais e redutores
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•31
Método de Lane-Eynoncontinuar titulação gota a gotano ponto final, sobrenadante totalmente incolor
repetir titulação com sol. aadicionar de uma vez o volume gasto na anterior, menos 1 mLao recomeçar a ferver, juntar 3-4 gotas de azul de metileno
continuar titulção gota a gota, até desparecer a correpetir procedimento com sol. b
Análise de carboidratos
Ex: Determinação de carboidratos totais e redutores
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Fibra brutamateriais não digeríveis e insolúveis em ácidos e bases diluídas
celulose, lenhina, pentosanassem valor nutritivo
acção peristáltica do intestinosegundo as funções:
polissacáridos estruturaiscelulose, hemicelulose, pectinas
compostos estruturais não polissacáridoslenhina
polissacáridos não estruturaisgomas, mucilagens, carragenano, agar
Análise de polissacáridos e fibra 62
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importância da determinação da fibra bruta em alimentos e raçõesavaliação nutritiva de rações
rações com muita fibra têm baixo valor nutritivoeficiência na moagem e refinação de farinhasverificação da maturação de fibras e vegetais
produtos muito maduros têm maior quantidade de fibraadulterações
cascas em nozes moídas, sementes em frutas processadas
Análise de polissacáridos e fibra 63
1967introdução do conceito de fibra dietética
digestão clássica com ácido e base para obter fibra bruta conduz a incertezas e variabilidade relativamente ao valor nutritivo
determinação inclui parte das proteínas e conduz a perca de parte da lenhina
mais adequado separar lenhina, celulose e hemicelulose e minimizar o teor de azoto
digestão enzimáticafibra dietética – matérias vegetais insolúveis que não são digeríveis
por enzimas proteolíticas e diastáticas e que não podem ser utilizadas, excepto por fermentação microbiana no sistema digestivo
Análise de polissacáridos e fibra 64
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fibra dietéticaconjunto de todos os componentes não digeríveis de um
alimentotodos os polissacáridos, excepto amilose e amilopectina
fibra insolúvelcelulose, celulose microcristalina, lenhina, hemiceluloses e
amido resistentefibra solúvel
restantes polissacáridos, pectina, gomas e hidrocolóides
Análise de polissacáridos e fibra 65
consumo tem benefícios fisiológicosprevenção de:
cancrosdoenças cardíacasdiabetes
Análise de polissacáridos e fibra 66
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Análise de amidoamostragem:
em alimentos naturais encontra-se sob forma de grânulosnecessário separá-lo dos outros componentes
secagem, trituração, maceração, filtração, centrifugação
em alimentos termicamente processados é uma mistura de amilose e amilopectina
secos, triturados e dispersos em EtOH/H2O (80:20)monossacáridos e oligossacáridos solúveisamido insolúvel
separado por filtração ou centrifugaçãose algum amido em grânulos estiver presente:
amostra dispersa em água quente (> 65 ºC) com ácido perclórico ou cloreto de cálcio
gelatinização do amido
Análise de polissacáridos e fibra 67
Análise de amidométodos para determinação da concentração:
enzimas adicionadas a uma solução de amido para o degradar a glucose
glucose analisada pelos métodos anterioresconcentração de amido calculada a partir da concentração
de glucoseadição de iodo leva à formação de um complexo insolúvel
determinado por gravimetriasecagem e pesagem do precipitado formado
determinado por titulaçãoquantidade de iodo necessária para precipitar o amido
utilização de métodos físicosdensidade, refractometria, polarimetria
desde que não existam componentes interferentes na solução
Análise de polissacáridos e fibra 68
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Análise de amidoconcentrações de amilose e amilopectina determinadas pelos
mesmos métodos usados para amidonecessário primeiro separar a amilose da amilopectina
agentes químicos que precipitem selectivamente um dos dois
determinação da concentração do amido resistentenecessário adicionar DMSO
dissolve o amido antes de prosseguir com a análise
Análise de polissacáridos e fibra 69
Análise de amido
Análise de polissacáridos e fibra 70
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Análise de amidoex:
amostra finamente trituradaadicionado EtOH 80 %adição de DMSOagitar e aquecer em banho-mariaadicionar sol. tamponizada de a-amilase
agitar em vortexrecolocar no banhoapós 5 min, levar a 50 ºCadicionar sol. de glucoamilase e tampão de acetato de sódio
(pH 4.5)misturar e incubar a 50 ºC
transferir para balão volumétrico e perfazer volume com H2Otirar aliquotas
tratar com reagente glucose oxidase/peroxidase e incubar a 50 ºC
medir absorvância
Análise de polissacáridos e fibra 71
Análise de gomas e hidrocolóidespolissacáridos adicionados aos alimentos + gelatina
produtos cárneos processadoschocolates e derivadosgeladosmolhos para saladas
análise difícil:estruturas químicas diversasdiferentes solubilidadesdiversos pesos moleculares
procedimento geral:extracção da goma e fraccionamento do extracto
identificação e quantificação dos monossacáridos após hidrólise ácida
fraccionamento provoca alguma perca de material
Análise de polissacáridos e fibra 72
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Análise de gomas e hidrocolóides
Análise de polissacáridos e fibra 73
Análise de gomas e hidrocolóidesamostra seca e pulverizada
preferível por liofilizaçãoremoção de substâncias lipídicas
extracção em Soxhletclorofórmio/metanol (95:5)
solvente removido por secagem ao ar, seguido de exsicador
Análise de polissacáridos e fibra 74
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•38
Análise de gomas e hidrocolóidesadição de EtOH 80 %
remoção de carboidratos solúveis, outros compostos de baixo PM e cinzas
remoção de proteínas (para facilitar digestão)extracto disperso em tampão de acetato de sódio (pH 6.5),
com NaClmistura aquecida
adição de papaínamistura incubada
arrefecimento da mistura e adição de NaCladição de 4 volumes EtOH
polissacáridos precipitammistura centrifugada
Análise de polissacáridos e fibra 75
Análise de gomas e hidrocolóidesresíduo suspenso em tampão acetato (pH 4.5)adicionar sol. de glucoamilase/amiloglucosidase, no mesmo tampão
incubarremoção de amido e fibra insolúvel por centrifugação
arrefecer e adicionar NaCladicionar 4 volumes EtOH
precipita polissacáridos solúveismistura centrifugada
resíduo insolúvel é a fibra dietética solúvelresíduo suspenso em água desionizada
diálise contra azida de sódioanti-microbiana
diálise contra água desionizadaremoção da azida
resíduo liofilizado
Análise de polissacáridos e fibra 76
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•39
Análise de gomas e hidrocolóidesresíduo colocado em frasco fechado
adicão de ácido trifluoroacéticosolução aquecida
arrefecer e evaporar até securacorrente de ar ou N2
determinação de monossacáridosHPLC ou GC
Análise de polissacáridos e fibra 77
Análise de pectinanão é uma substância única
diversos graus de esterificação e amidaçãoprincipal componente comum:
éster metílico do ácido a-D-galacturónico
não existem métodos oficiais para determinaçãoestratégia mais comum:
precipitação com álcool
Análise de polissacáridos e fibra 78
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•40
Análise de pectinadifícil hidrolisar ligações glicosídicas em ácidos urónicos
provoca decomposiçãonão é possível usar hidrólise ácida seguida de cromatografia
saponificação em NaOHacidificaçãoadição de Ca2+
precipitação da pectinapectato de cálcio lavado, seco e medido por gravimetria
Análise de polissacáridos e fibra 79
Análise de pectinagrau de esterificação
parâmetro importante em produtos naturais ou em que se adiciona pectina
directamente medido por titulaçãoantes ou depois da saponificação
pectina isolada lavada com EtOH acidificadogrupos carboxilato convertidos em grupos ácido
carboxílico livresácido em excesso eliminado
dispersão do ácido pectínico em água titulada com base diluída (NaOH), em excesso
saponificação dos grupos metiléstertitulação com ácido
determinação de base não saponificadagrau de esterificação
Análise de polissacáridos e fibra 80
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•41
Análise de pectinagrau de esterificação
também pode ser medido por GCmedição do MeOH libertado pela saponificação
medição por NMR
Análise de polissacáridos e fibra 81
Análise de fibrasprocedimentos habituais:
remoção de lípidosamostra seca, finamente trituradalípidos removidos por extracção com solvente
remoção de proteínashidrolisadas e solubilizadas
enzimas, ácidos fortes, bases fortesaminoácidos separados da fibra por filtração ou
precipitação selectiva com soluções de EtOHremoção de amido
amido gelatinizado em água quenteamido hidrolisado e solubilizado
enzimas, ácidos fortes, bases fortesglucose separada por filtração ou precipitação
selectiva com soluções de EtOH
Análise de polissacáridos e fibra 82
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•42
Análise de fibrasprecipitação selectiva de fibras
fibras separadas por precipitação selectiva com soluções de EtOH
análise de fibrasteor em fibra determinado por gravimetria
pesar uma fracção de fibra insolúvel, isolada da amostra
teor em fibra determinado quimicamentefibra hidrolisada a monossacáridos
concentração medida pelos métodos descritos
Análise de polissacáridos e fibra 83
Análise de fibras
Análise de polissacáridos e fibra 84
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•43
Análise de fibrasmétodos gravimétricos
carboidratos digeríveis, lípidos e proteínas solubilizados selectivamente por reagentes químicos ou hidrolisados enzimaticamente
matéria não solúvel ou não digerida filtradaresíduo de fibra calculado por gravimetria
métodos químicoscarboidratos digeríveis removidos por via enzimáticacomponentes da fibra hidrolisados por ácido
monossacáridos obtidos medidos (valor da fibra)
Análise de polissacáridos e fibra 85
em ambos os métodos é necessário remover completamente o amido digerível
provoca sobreestimação do valor da fibra
Análise de polissacáridos e fibra
Análise de fibras
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•44
preparação da amostraamostras com > 10 % lípidos
remoção de lípidos por extracção com éter de petróleo ou hexano
centrifugação para remover solventeextracção repetida 2 vezesamostra seca a 70 ºC
estufa de vácuo, durante a noiteamostra triturada
passar num filtro com malha de 0.3-0.5 mmregista-se a perca de peso para corrigir no cálculo de fibra dietética
devida a perca de gordura e humidade
Análise de polissacáridos e fibra
Análise de fibras
87
preparação da amostraamostras não sólidas com < 10 % fibra
liofilizadas antes da análiseamostras não sólidas com > 10 % fibra
liofilização não necessária
Análise de polissacáridos e fibra
Análise de fibras
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•45
métodos gravimétricosmétodo da fibra bruta
simples; não adequado para análise de alimentosdetermina celulose e lenhina mas não hemiceluloses,
pectinas e hidrocoloidesdigeridos pelo ácido e pela basetende a cair em desuso
valor aproximado da fibra não digerível nos alimentosextracção sequencial de uma amostra (após remoção de
lípidos) com 1.25 % H2SO4 e 1.25 % NaOHresíduo insolúvel recolhido por filtração
seco, pesado e incinerado (correcção para contaminação com minerais)
Análise de polissacáridos e fibra
Análise de fibras
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Análise de polissacáridos e fibra
Análise de fibras
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•46
métodos gravimétricosmétodo da fibra total
sancionado pela AOACutilizado pela indústria para vários alimentosisolamento da fracção de interesse por precipitação selectiva
determinação da sua massa por pesagemalimento sofre eliminação de gorduras, secagem e
gelatinizaçãodigestão enzimática do amido e proteínas
a-amilase, amiloglucosidase, protease
adição de 95 % EtOHprecipitação de toda a fibra
solução filtradafibra recolhida, seca e pesada
Análise de polissacáridos e fibra
Análise de fibras
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amostra misturada com tampãoadição de a-amilase
ajuste de pHmistura aquecida em banho-maria
gelatinização e digestão do amidoarrefecimento e adição de protease
digestão da proteínaajuste do pH e adição de glucoamilase
total digestão do amidopassos subsequentes dependem de se querer determinar fibra total,
insolúvel ou solúvel
Análise de polissacáridos e fibra
Análise de fibras método da fibra total
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•47
determinação de fibra insolúvel e solúvelmistura filtrada sob Celite
fibra insolúvel retida no filtrolavada com água
o filtrado contém fibra solúveladição de EtOH e lavagem com água
pp fibra solúvelfiltrada sob vácuo, com Celiteresíduo lavado 3 vezes com EtOH
Análise de polissacáridos e fibra
Análise de fibras método da fibra total
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resíduos de fibra (total, insolúvel ou solúvel) nos filtros lavados com EtOH 95 % e acetona
filtros secos na estufa, arrefecidos e pesadosalguma proteína e minerais complexam com constituintes da
parede celularnecessidade de corrigir
se se pretende determinar amido resistenteanálise de triplicado de amostra
se não se pretende determinar amido resistenteamostras em duplicado
uma amostra para determinar teor em azotoKjeldahl
outra incinerada para determinar teor em cinzas
Análise de polissacáridos e fibra
Análise de fibras método da fibra total
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•48
fibra dietética expressa em percentagem de peso secofibra dietética total = fibra insolúvel + fibra solúvel
Análise de polissacáridos e fibra
Análise de fibras método da fibra total
1 2R +R
Branco (mg) = -P-A2
1 2
1 2
R +R-P-A-B
2Fibra (%) = x100m +m
2
95
métodos gravimétricosmétodo da fibra total
processo alternativo:componentes da fibra solúveis em água e insolúveis
determinados após filtração da amostra digeridafibra solúvel fica no filtradofibra insolúvel no retentado
componente insolúvel seco e pesadocomponente solúvel precipitado por adição de
EtOH 95 %filtrado, seco e pesado
determina-se proteína e cinzas das diversas fracçõespara corrigir o resultado
fibra = peso residual – peso (proteína + cinza)tendência para sobrestimar o teor de fibra em alimentos com
teores elevados de monossacáridosmonossacáridos “presos” no pp
Análise de polissacáridos e fibra
Análise de fibras
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•49
métodos químicosteor de fibra considerado igual à soma dos monossacáridos mais a
lenhina restante (após remoção dos carboidratos)monossacáridos determinados segundo métodos descritos
Análise de polissacáridos e fibra
Análise de fibras
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métodos químicosmétodo Englyst-Cummings
elimina-se a gordura da amostraamostra aquecida em água
gelatinização do amidoamido e proteínas digeridos por enzimasfibra precipitada com EtOH 100 %
pp separado por centrifugação, lavado e secofibra hidrolisada por H2SO4 conc.
concentração dos monossacáridos obtidos determinada por colorimetria, cromatografia, ...
massa da fibra na amostra considerada igual à massa de monossacáridos
Análise de polissacáridos e fibra
Análise de fibras
98
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•50
métodos químicosmétodo Englyst-Cummings
teores de fibra solúvel e insolúvelpassos de separação semelhantes aos dos métodos
gravimétricosnão dá informação sobre teor de lenhina
digestão ácida não conduz à sua degradaçãoalimentos que contêm elevados teores de lenhina (raros)
analisados por outro método
Análise de polissacáridos e fibra
Análise de fibras
99
métodos químicosmétodo Englyst-Cummings
Análise de polissacáridos e fibra
Análise de fibras
100
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•51
métodos químicosmétodo Englyst-Cummings
mais rápidomenos requisitos técnicosequipamento menos especializadomais reprodutível que método da AOAC
Análise de polissacáridos e fibra
Análise de fibras
101
métodos detergentesfibra por detergente ácidoAcid Detergent Fibre (ADF)
muito utilizado em raçõesdeterminação de celulose + lenhina
Análise de polissacáridos e fibra
Análise de fibras
2
1
Wteor de fibra % = 100
W
W1 – peso da amostra (g)
W2 – peso do resíduo (g)
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métodos detergentesfibra por detergente neutroNeutral Detergent Fibre (NDF)
método oficial para determinação da fibra dietética em grãos de cereais
determinação de celulose + hemicelulose + lenhina
Análise de polissacáridos e fibra
Análise de fibras
(peso do cadinho + paredes celulares) - peso do cadinhoteor de fibra % = 100
peso da amostra
paredes celulares ≡ resíduos de fibra
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Reagentesamostra (ração animal)sol. detergente ácido
adicionar 20 g CTAB a um balão volumétrico de 1 Lacertar volume com H2SO4 1 N
Procedimentopesar 1 g da amostramoer finamente e secarcolocar em frasco de refluxo com 100 mL do detergente ácido
aquecer até ebulição (5-10 min)refluxar 60 min
terminar refluxoagitar o frasco e filtrar em cadinho previamente incinerado e
pesadoadicionar água quente (90-100 ºC) até 2/3 do cadinho
deixar repousar 15-30 s
Ex: Determinação de fibra por detergente ácido
Análise de polissacáridos e fibra 104
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•53
secar sob vácuorepetir lavagem com água quentelavar 2 vezes com acetona
até total desaparecimento da corsecar acetona sob vácuosecar cadinho com a fibra
estufa com ventilação (3 h, 100 ºC)pesar
Ex: Determinação de fibra por detergente ácido
Análise de polissacáridos e fibra 105
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