cÁc phƯƠng phÁp xÁc ĐỊnh trÌnh tỰ dna

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ DNA.

I.Phương pháp Maxam-Gilber

1.Nguyên tắc : thủy giải đặc trưng phân tử ADN cần xác định trình tự bằng phương pháp hóa học.

2.Phương pháp:Phân tử DNA được đánh dấu đồng vị phóng

xạ P32 ở đầu 5’ của mạch đơn.Sau đó, chúng được chia thành 4 hoặc 5

phân đoạn, mỗi phân đoạn chịu một xử lý hóa học chuyên biệt.

Ống Xử lí đặc hiệu Vị trí cắt

1 Dimethyl sulphat Cắt tại G

2 Acid (pH=2) Cắt tại A và G

3 Hydrazin Cắt tại A và C

4 Hydrazin + NaCl Cắt tại C

5 NaOH Cắt tại A hoặc C (A>C)

I.Phương pháp Maxam-Gilber

Cuối cùng các phân đoạn trên được đen đi phân tách trên gel polyacrylamide.

Vị trí của các oligonucleotide trên gel tương ứng với kích thước của chúng và được phát hiện nhờ đầu đánh phóng xạ.

I.Phương pháp Maxam-Gilber

Ưu điểm:• Phương pháp này dễ tiến hành.• Chi phí thấp.Nhược điểm:• Độ chuẩn xác không cao.• Không được sử dụng rộng rải do độc tính

của hoá chất.

II.Phương pháp Sanger (phương pháp enzyme):

1.Nguyên tắc: dựa vào sự tổng hợp nhờ enzyme ADNpolymerase mạch bổ xung cho trình tự ADN mạch đơn cần xác định.

Sử dụng thêm bốn loại dideoxynucleotide (ddNTP) là những loại deoxynucleotide (dNTP) bị mất cả hai nhóm OH ở carbon số 2 và số 3, hoặc có thể dùng dideoxynucleotides triphosphate (didNTP) bị mất nhóm OH ở carbon số 3.

II.Phương pháp Sanger (phương pháp enzyme):

Phương pháp Sanger (phương pháp enzyme):

2.Phương pháp: Sanger thiết lập 4 lọ phản ứng riêng biệt

Lọ 1 Lọ 2 Lọ 3 Lọ 4

DNA template DNA template DNA template DNA template

1 primer ngắn (khoãng 20 nucleotide)

1 primer ngắn (khoãng 20 nucleotide)

1 primer ngắn (khoãng 20 nucleotide)

1 primer ngắn (khoãng 20 nucleotide)

DNA polymerase III

DNA polymerase III

DNA polymerase III

DNA polymerase III

4 loại dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP )

4 loại dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP )

4 loại dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP )

4 loại dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP )

didNTP – A didNTP – T didNTP – C didNTP – G

Sau đó, bốn phản ứng tổng hợp sẽ được đem phân tách trên gel polyacrylmide.

II.Phương pháp Sanger (phương pháp enzyme):

Ưu điểm:• Đơn giản, có độ chính xác cao.• Có thể dùng chung mồi cho nhiều đối

tượng khác nhau.Nhược điểm:• Chỉ đọc được một đoạn trình tự ngắn.• Các đoạn ADN cần được tách dòng trước

khi tiến hành giải trình tự ADN.

III.Giải trình tự DNA bằng máy tự động

III.Giải trình tự DNA bằng máy tự động

1.Nguyên tắc: dựa trên phương pháp Sanger.

2.Phương pháp:

Mỗi loại dideoxynucleotide được đánh dấu bằng một fluochrome có màu khác nhau.

Dùng tia laser để xác định bước sóng để từ đó định ra nucleotide tương ứng.

IV.Phương pháp PCR dùng trong xác định trình tự nucleic acid

1.Nguyên tắc: phối hợp giữa phương pháp PCR và phương pháp sử dụng các dideoxynucleotide.

2.Phương pháp:Đọan DNA cần xác định sẽ đượ khuếch đại

bằng phương pháp PCR.Các bước tiếp theo tiến hành giống như

phương pháp Sanger.

THANK YOU!