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i
DANILO SANTOS SOUZA
CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DA
POLPA LIOFILIZADA ENRIQUECIDA COM O EXTRATO AQUOSO DA
SEMENTE DE TAMARINDO (TAMARINDUS INDICA)
CAMPINAS
2015
ii
iii
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Engenharia de alimentos
DANILO SANTOS SOUZA
CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DA
POLPA LIOFILIZADA ENRIQUECIDA COM O EXTRATO AQUOSO DA
SEMENTE DE TAMARINDO (Tamarindus indica)
Tese apresentada à faculdade de Engenharia
de Alimentos da Universidade Estadual de
Campinas como parte dos requisitos exigidos
para obtenção do título de Doutor em
Ciência de Alimentos.
Orientadora: Profª Drª. Helena Teixeira Godoy
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À
VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA
PELO ALUNO DANILO SANTOS SOUZA, E
ORIENTADA PELA PROFª DRª HELENA
TEIXEIRA GODOY
_____________________________________
Assinatura da Orientadora
CAMPINAS
2015
iv
v
BANCA EXAMINADORA
Profª. Drª. Helena Teixeira Godoy
(Orientadora)
Drª. Cláudia Hoffmann Kowalski Schroder
(Membro Titular)
Laboratório Nacional Agropecuário - LANAGRO
Dr. Cristiano Augusto Ballus
(Membro Titular)
Departamento de Ciência de Alimentos - FEA - UNICAMP
Drª. Daniele Rodrigues
(Membro Titular)
Universidade Estadual de Londrina - UEL
Profº. Dr. Marcelo Alexandre Prado
(Membro Titular)
Faculdade de Engenharia de Alimentos - UNICAMP
Profº. Dr. Severino Matias de Alencar
(Membro Suplente)
ESALQ - USP
Profª. Drª. Juliana Azevedo Lima Pallone
(Membro Suplente)
Faculdade de Engenharia de Alimentos - UNICAMP
Drª Daniela de Queiroz Pane
(Membro Suplente)
Pesquisadora – São Paulo – SP
vi
vii
ABSTRACT
The seed of tamarind, responsible for the most amount of bioactive compounds of the fruit,
has only been marginally exploited for food purposes. The aim of the present study was to
characterize the fruit (pulp and seeds) regarding their antioxidant properties as well as
produce and characterize a lyophilized product made of pulp and aqueous extract of freeze-
dried tamarind seed, taking advantage of the functional properties (antioxidant) and at the
same time maintaining acceptable sensory characteristics. Tamarind fruits were acquired
from three different states of Brazil (MG, SP e BA). The lots were obtained in 2012 and
2013. The fatty acid profile and tocopherols seeds were also evaluated. The best conditions
for the extraction of bioactive compounds, from tamarind seed in aqueous phase, was set by
Central Composite Rotational Design (CCRD). The best extraction condition consisted of:
80 s of trituration with a ratio (w/v) of 1:3 (seeds:water), were the residue material was
extracted twice under the same conditions. The extracts were added to the pulps at the
concentrations [1] (0.3%), [2] (1.15%) and [3] (2.0%), relative to the in natura hydrated
pulp, to made the mixture (mix). The content of phenolic compounds (FT), antioxidant
capacity (FRAP, DPPH, ABTS and ORAC) and hemolytic activity were determined for the
pulps, seeds, freeze-dried seed extracts and freeze-dried mix of pulp and fruit seed extract.
The results were dependent on the origin of the fruit. The pulp enrichment were satisfactory
with substantial increase of the antioxidant capacity (ABTS∙) by 1910, 1300 and 937% for
mixtures of MG [3] SP [3] and BA [3], respectively. The samples acquired from São Paulo
and Bahia had the highest rates of hemolysis, especially for those in which high amount of
extract was added, reaching 98.8% of cell lysis for the SPsample [2] Lot 2, and 98.5% for
the BA sample [1] lot 1. Ten fatty acids from the seed oil were identified and quantified by
GC-FID technique, and 9 of them were confirmed by GC-MS. The oil seed presented 75%
and 25% of unsaturated and saturated fatty acids, respectively. Linoleic acid (C18:1n-6, cis)
was the major fatty acid (ranging from 145 to 270 mg.g-1
dry mass), followed by oleic acid (31
e 83 mg.g-1
d.m) and palmitic acid (21 to 47 mg.g-1
d.m). Isomers of tocopherols (α, β, γ e δ-
tocopherol) were detected and quantified, where α and γ-tocopherols were present in higher
amount (27 and 25 mg.kg-1
d.m., respectively). Sensory analysis for the difference from the
viii
control test showed that the concentrations 1.15 and 2% of the added extract have altered
the appearance attributes, aroma and taste of the nectar, however, this change was also
related to the origin of the fruits. On the other hand, the acceptance test showed high
variability in scores according to the assessors profile and a trend in reducing the nectar
acceptance when increasing the seed extract concentration.
Keywords: Lyophilization, hemolysis, phenolics compounds, tocopherols and fatty acids
ix
RESUMO
A semente do tamarindo, que possui boa parcela dos compostos bioativos do fruto, é pouco
aproveitada para fins alimentícios. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi caracterizar o
fruto (polpa e semente) com relação às propriedades antioxidantes, bem como elaborar e
caracterizar um produto liofilizado composto de polpa e extrato aquoso da semente de
tamarindo liofilizado de frutos oriundos de três estados do Brasil (MG, SP e BA) em lotes
obtidos nos anos 2012 e 2013, aproveitando assim, as propriedades funcionais
(antioxidante) e ao mesmo tempo que mantivesse as características sensoriais aceitáveis. O
perfil de ácidos graxos e tocoferóis das sementes também foram avaliados. Inicialmente,
foram determinadas as melhores condições para a extração em fase aquosa dos compostos
bioativos da semente de tamarindo por Delineamento Composto Central Rotacional
(DCCR). A melhor condição se deu com 80 s de trituração em uma relação (m/v) de 1:3
(semente:água), sendo o resíduo gerado reprocessado por mais duas vezes nas mesmas
condições. Os extratos foram adicionados às respectivas polpas nas concentrações [1]
(0,3%), [2] (1,15%) e [3] (2,0%) em relação à polpa hidratada in natura, para elaboração da
mistura (mix). O teor de compostos fenólicos totais (FT), a capacidade antioxidante (FRAP,
DPPH, ABTS e ORAC) e atividade hemolítica foram determinados para as polpas,
sementes, extratos liofilizados da semente e mix liofilizado de polpa e extrato da semente
dos frutos. Os resultados foram dependentes da origem dos frutos e o enriquecimento da
polpa se mostrou satisfatório com aumentos substanciais da capacidade antioxidante
(ABTS∙) de 1910, 1300 e 937%, para as misturas de MG[3], SP[3] e BA[3],
respectivamente. As amostras dos estados de São Paulo e Bahia tiveram os maiores índices
de hemólises, principalmente para aquelas em que se adicionaram concentrações elevadas
de extrato, chegando a 98,8% de lise para a amostra SP [2] do lote 2 e 98,5% para a
amostra BA [1] do lote 1. Dez ácidos graxos foram identificados e quantificados pela
técnica de GC-FID no óleo da semente, dentre os quais 9 foram confirmados por GC-MS.
Foram determinados cerca de 75% de ácidos graxos insaturados e 25% por saturados no
óleo da semente. O ácido linoleico (C18:1n-6, cis) foi o predominante com teores que
variaram de 145 até 270 mg.g-1
sólido seco, seguido pelo ácido oleico (31 e 83 mg.g-1
s.s) e ácido
x
palmítico que apresentaram concentrações de 21 à 47 mg.g-1
s.s,. Os quatro isômeros de
tocoferóis (α, β, γ e δ-tocoferol) foram detectados e quantificados, sendo que o α e γ-
tocoferóis se mostraram predominantes, com teores de 27 e 25 mg.kg-1
s.s., respectivamente.
O teste sensorial de diferença do controle mostrou que as concentrações 1,15 e 2% do
extrato adicionado alteraram os atributos de aparência, aroma e sabor do néctar, porém, esta
mudança também foi dependente da origem dos frutos. Por outro lado, o teste de aceitação
apresentou grande variabilidade de notas em função do perfil dos provadores e uma
tendência na redução da aceitação do néctar à medida que se adicionou mais extrato da
semente.
Palavras-chave: Liofilização, hemólise, compostos fenólicos, tocoferóis e ácidos graxos.
xi
SUMÁRIO
ABSTRACT ......................................................................................................................... vii RESUMO .............................................................................................................................. ix INTRODUÇÃO GERAL ....................................................................................................... 1
Referências .......................................................................................................................... 3 CAPÍTULO I .......................................................................................................................... 5 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................... 5
1. Tamarindo ....................................................................................................................... 6 2. Capacidade Antioxidante ................................................................................................ 7
3. Compostos fenólicos ..................................................................................................... 10 4. Tocoferóis e ácidos graxos............................................................................................ 12 5. Atividade Hemolítica .................................................................................................... 14
6. Secagem de alimentos por liofilização ......................................................................... 15 7. Análise Sensorial .......................................................................................................... 17 8. Referências Bibliográficas ............................................................................................ 18
CAPÍTULO II ....................................................................................................................... 29
OTIMIZAÇÃO DO PROCESSO PARA ELABORAÇÃO DE EXTRATO AQUOSO
LIOFILIZADO DA SEMENTE DE TAMARINDO (Tamarindus indica) ......................... 29
RESUMO .......................................................................................................................... 30 1. Introdução ..................................................................................................................... 31 2. Material e Métodos ....................................................................................................... 33
2.1 Obtenção e preparo de amostras ............................................................................. 33 2.2 Reagentes e padrões ................................................................................................ 33
2.3 Ensaios de otimização ............................................................................................. 34 2.4 Determinação de Fenólicos Totais .......................................................................... 34 2.5 Análise estatística .................................................................................................... 35
3. Resultados e Discussão ................................................................................................. 35 4. Conclusão ...................................................................................................................... 43
5. Referências Bibliográficas ............................................................................................ 43 CAPÍTULO III ..................................................................................................................... 47
INFLUÊNCIA DA ADIÇÃO DO EXTRATO AQUOSO LIOFILIZADO DA SEMENTE
SOBRE O TEOR DE FENÓLICOS TOTAIS, CAPACIDADE ANTIOXIDANTE E
ATIVIDADE HEMOLÍTICA DA POLPA DE TAMARINDO (Tamarindus indica L.) .... 47
RESUMO .......................................................................................................................... 48 1. Introdução ..................................................................................................................... 49 2. Material e Métodos ....................................................................................................... 51
2.1 Reagentes e padrões ................................................................................................ 51 2.2 Obtenção e preparo da matéria-prima ..................................................................... 52
2.3 Extração ................................................................................................................... 52 2.3.1 Preparo do extrato aquoso liofilizado .................................................................. 52 2.3.2 Preparo dos extratos para análises de antioxidantes e fenólicos totais ................ 53 2.3.3. Preparo dos extratos para análise de atividade hemólítica .................................. 53
2.4 Determinação de fenólicos totais ............................................................................ 54 2.5 Capacidade antioxidante ......................................................................................... 54
2.5.1 Ensaios de ABTS (2′2-azino-bis(3-etilbenzotriasolina-6-ácido sulfônico)) ........ 54
xii
2.5.2 Ensaios de DPPH (1,1-difenil-2-picrilidrazil) – Sequestro do radical livre ......... 55 2.5.3 Ensaios de FRAP (Poder Antioxidante de Redução do Ferro) ............................ 56 2.5.4 Ensaios de ORAC – Capacidade de Redução do Radical Oxigênio .................... 56 2.6 Atividade hemolítica ............................................................................................... 57 2.7 Análise estatística .................................................................................................... 58
3. Resultados e Discussão ................................................................................................. 59 3.1 Compostos fenólicos totais ..................................................................................... 59 3.2 Capacidade antioxidante ......................................................................................... 62 3.3 Atividade hemolítica ............................................................................................... 74
4. Conclusão ...................................................................................................................... 78
5. Referências Bibliográficas ............................................................................................ 78 CAPÍTULO IV ..................................................................................................................... 87 PERFIL QUANTITATIVO DE TOCOFERÓIS E ÁCIDOS GRAXOS DO ÓLEO
OBTIDO DA SEMENTE DE TAMARINDO (Tamarindus indica L.) PROVENIENTES
DE DIFERENTES ESTADOS DO BRASIL ....................................................................... 87 1. Introdução ..................................................................................................................... 89 2. Material e Métodos ....................................................................................................... 92
2.1 Reagentes e padrões ................................................................................................ 92 2.2 Obtenção e preparo da matéria-prima ..................................................................... 92
2.3 Procedimentos de extração ...................................................................................... 93 2.3.1 Lipídeos por Bligh-Dyer ...................................................................................... 93 2.3.2 Ésteres metílicos de ácidos graxos ....................................................................... 93
2.3.3 Tocoferóis ............................................................................................................ 94 2.4 Métodos de separação ............................................................................................. 95
2.4.1 Ésteres metílicos de ácidos graxos ....................................................................... 95 2.4.1.1 Identificação e quantificação por GC-FID ........................................................ 95 2.4.1.2 Identificação por GC-MS .................................................................................. 96 2.4.2 Tocoferóis ............................................................................................................ 97 2.5 Métodos de validação .............................................................................................. 98
2.5.1 Ácidos graxos ....................................................................................................... 98 2.5.2 Tocoferóis ............................................................................................................ 98
2.6 Análise estatística .................................................................................................. 100 3. Resultados e Discussão ............................................................................................... 101
3.1 Validação dos métodos ......................................................................................... 101
3.1.1 Limites de detecção (LD), quantificação (LQ) e linearidade, ............................ 102 3.1.2 Precisão e recuperação ....................................................................................... 105 3.2 Composição de ácidos graxos ............................................................................... 108 3.3 Composição de tocoferóis ..................................................................................... 115
4. Conclusão .................................................................................................................... 118
5. Referências Bibliográficas .......................................................................................... 119 CAPÍTULO V .................................................................................................................... 127 AVALIAÇÃO SENSORIAL DE NÉCTAR ELABORADO COM POLPA E EXTRATO
AQUOSO LIOFILIZADO DA SEMENTE DE TAMARINDO (Tamarindus indica L.) . 127
1. Introdução ................................................................................................................... 129 2. Material e Métodos ..................................................................................................... 131
2.1 Reagentes .............................................................................................................. 131
xiii
2.2 Obtenção da matéria-prima ................................................................................... 131 2.3 Preparo de amostras .............................................................................................. 131 2.4 Acidez total titulável e teor de sólidos solúveis totais .......................................... 132 2.5 Análise sensorial ................................................................................................... 132 2.5.1 Teste de diferença do controle ........................................................................... 133
2.5.2 Teste de aceitação pelos consumidores .............................................................. 134 2.6 Perfil do consumidor de suco ................................................................................ 135 2.7 Análise estatística .................................................................................................. 136
3. Resultados e Discussão ............................................................................................... 136 3.1 Determinação da acidez total titulável, teor de sólidos solúveis totais e ratio ...... 136
3.2 Análise sensorial ................................................................................................... 138 3.2.1 Teste de diferença do controle ........................................................................... 138 3.2.2 Teste de aceitação .............................................................................................. 141
3.3 Perfil do consumidor ............................................................................................. 145 4. Conclusão .................................................................................................................... 152 5. Referências Bibliográficas .......................................................................................... 153
ANEXOS ............................................................................................................................ 157
CONCLUSÃO GERAL ..................................................................................................... 160
xiv
xv
“Tá fechando sete tempo
qui mia vida é camiá
pulas istradas do mundo
dia e noite sem pará...
...tô de volta já faiz tempo
qui dexei o meu lugá
isso se deu cuano moço
qui eu saí a percurá
nas inlusão que hai no mundo
nas bramura qui hai pru lá
saltei pur prefundos poço
qui o Tioso tem pru lá
Jesus livrô derna d'eu môço
do raivoso me paiá
já passei pur tantas prova
inda tem prova a infrentá...”
Cantiga do estradar – Elomar F. Mello
“Determine, rapaz
Onde vai ser seu curso de pós-graduação
Se oriente, rapaz
Pela rotação da Terra em torno do Sol
Sorridente, rapaz
Pela continuidade do sonho de Adão”
Oriente – Gilberto Gil
xvi
xvii
Ao meu filhote Levi e à minha amada esposa Jane,
Aos meus pais Joel (in memorian) e Dilma,
Aos irmãos Jó e Joelson,
Aos meus sobrinhos João Marcelo e Marco Antonio,
Pelo imenso amor, apoio e confiança.
Dedico!
xviii
xix
AGRADECIMENTOS
À Deus, por tornar minha vida um palco de conquistas, possibilitando a realização
de mais um sonho.
À minha família pelo apoio e amor confiados a mim em tempo integral.
Ao cunhado irmão Marcelo pelo imenso incentivo e auxílio em todos os momentos.
Aos sogros D. Lúcia e Sr. Zé, por não hesitar em me ajudar o quanto necessário.
Aos amigos de Tanhas: Cinho, Vinícius, Babá, Júnior, Cassiano, Tonhão, Madson,
Minho e Léo pela amizade e companheirismo prestados mesmo na distância.
Ao grande amigo Janclei pelo incentivo e apoio para enfrentar esta jornada longe do
nosso sertão;
À professora Helena, pelo apoio, incentivo, confiança e por me orientar de forma
segura, sábia e competente.
Aos membros da banca Dr. Cristiano Augusto Ballus, Drª. Daniele Rodrigues, Profº.
Dr. Marcelo Alexandre Prado, Drª. Cláudia Hoffmann Kowalski Schroder, Profº. Dr.
Severino Matias de Alencar, Profª. Drª. Juliana Azevedo Lima Pallone, Drª Daniela de
Queiroz Pane pelo apoio e disponibilidade, fornecendo sugestões essenciais para melhoria
deste trabalho.
Aos amigos do Lab Análise, Alane, Cris, Dani Neves, Well Cabeça, Maria, Thaís,
Tayse, Lenaice, Marcela, Sr. Dirceu, Marla, Léo, Polly, Marcus, Matheus, Adriana,
Stefany, Kleidson, Juzinha, Ana Paula, Alisson, Sheila, Michelly e Suian pela companhia e
tolerância em todos esses anos.
À todos os professores e funcionários da FEA que de alguma forma contribuíram
para que este trabalho se concretizasse.
À FAPESP pelo apoio financeiro ao projeto (Processo: 2012/06806-4) durante todo
este período de doutorado.
À Faculdade de Engenharia de Alimentos e consequentemente à UNICAMP pela
oportunidade, estrutura e recepção.
xx
1
INTRODUÇÃO GERAL
Nos últimos anos, o consumidor vem se conscientizando cada vez mais sobre a
importância da inclusão de alimentos saudáveis na dieta que auxiliam na prevenção de
doenças e melhoria da qualidade de vida, o que resulta em um aumento na demanda destes
produtos no mercado (GURJÃO, 2006). De acordo com Silveira (2005), o Brasil tem se
destacado como importante produtor, consumidor e exportador de frutas tropicais,
expandindo o agronegócio e se adequando ao mercado externo. Segundo Brasil (2007),
tanto o consumo mundial per capita de frutas quanto o brasileiro continuarão crescendo a
taxas superiores à da economia mundial e doméstica.
O tamarindeiro se destaca dentre as várias espécies de árvores frutíferas exóticas
cultivadas no Brasil, pois tem apresentado alta capacidade de adaptação às condições
edafoclimáticas, principalmente nas regiões semi-áridas (PEREIRA et al., 2010). O fruto é
comumente consumido na forma de polpa, sucos, extrato, xarope, balas e outras
formulações para consumo oral, também podendo ser usado como expectorante, laxativo,
carminativo, além de ser indicado para infecções no estômago, fígado e na vesícula biliar
(QUEIROZ, 2010). No entanto, segundo Shiddhuraju (2007), a semente contém uma
importante parcela de compostos (ácidos fenólicos, tocoferóis, ácidos graxos, etc),
responsáveis pelas propriedades funcionais do fruto e geralmente não é reaproveitado para
estes fins nas indústrias de suco.
Boa parcela destes compostos que atribuem o potencial antioxidante aos alimentos
geralmente é degradado ao longo do processamento em razão da sua alta instabilidade
(CAMPOS et al., 2008). Desta forma, é de fundamental importância a escolha de um
2
método adequado para processar e aproveitar tais alimentos, visando conservar o produto e
manter as propriedades antioxidantes do fruto in natura. O método de extração aquosa é
muito empregado nas indústrias de alimentos visando a redução do uso de solventes tóxicos
e aumento da inocuidade dos produtos que consequentemente minimizam os impactos
ambientais e os causados à saúde do consumidor. Geralmente as técnicas de extração
aquosa estão associadas a um método de secagem para obtenção do produto final, a fim de
concentrar os compostos de interesse e melhorar o rendimento.
A secagem é um dos processos industriais que tem se mostrado eficiente para a
conservação de alimentos, uma vez que além de ser prático favorece a estabilidade do
produto. Porém, nem todo método de secagem é efetivo no benefício à manutenção da
qualidade de alimentos, sendo que há a ocorrência de uma série de reações oxidativas e
enzimáticas no produto, principalmente em vegetais (VASQUES et al., 2006). A
liofilização é um dos métodos de secagem que reduz alterações indesejáveis ao produto
como o encolhimento e a migração de sólidos solúveis no interior do material, devido a
ausência de água líquida e as baixas temperaturas requeridas no processo, além de manter a
estrutura porosa no material seco que facilita no processo de reidratação. Em consequência,
a retenção dos compostos bioativos e aromáticos é favorecida, enquanto que as reações
degradativas são minimizadas (MARQUES, 2008). Desta forma, para criar opções de
aproveitamento da semente de tamarindo e minimizar o seu descarte nas indústrias
processadoras do fruto, torna-se necessário elaborar um produto liofilizado conjugado de
polpa e extrato aquoso liofilizado da semente, com grande potencial para favorecer o uso
das propriedades funcionais e sensoriais do fruto, podendo assim, promover benefícios à
saúde do consumidor.
3
Referências
BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento – MAPA. Cadeia produtiva
de frutas. Agronegócios, v.7, f.102, 2007.
CAMPOS, F. M.; MARTINO, H. S. D.; SABARENSE, C. M.; PINHEIRO SANT‘ANA,
H. M.; Estabilidade de compostos antioxidantes em hortaliças processadas: uma revisão.
Alimentos e Nutrição. v. 19, n. 4, p. 481-490, 2008.
GURJÃO, K. C. de O.; Desenvolvimento, armazenagem e secagem de tamarindo
(Tamarindus indica L.). 142f, Tese (Doutorado em Agronomia) – Universidade Federal da
Paraíba – Centro de Ciências Agrárias, Areia, 2006.
IBRAF (INSTITUTO BRASILEIRO DE FRUTAS). Estatísticas. Disponível em:
<http://www.ibraf.org.br/x-es/f-esta.html> Acesso em: 02/05/2005.
MARQUES, L.G., Liofilização de frutas tropicais. 255f. Tese (Doutorado em Engenharia
Química), Universidade Federal de São Carlos – UFSCAR. São Carlos/SP. 2008.
PEREIRA, C. P.; MELO, B. de; FREITAS, R. S. de; TOMAZ, M. A.; FREITAS, C. de J.
P.; Mudas de tamarindeiro produzidas em diferentes níveis de matéria orgânica adicionada
ao substrato. Revista Verde, v.5, n.3, p.152-159, 2010.
QUEIROZ, J. M. de O.; Propagação do tamarindeiro (Tamarindus indica L.). Dissertação
(Mestrado em Ciências Agrárias) – Universidade Federal do Recôncavo da Bahia, Cruz das
Almas/BA. 78f. 2010.
SIDDHURAJU, P.; Antioxidant activity of polyphelolic compounds extracted from
defatted raw and dry heated Tamarindus indica seed coat. LWT, v. 40, p. 982-990, 2007.
4
SILVEIRA, N. S. S. da; MICHEREFF, S. J.; SILVA, I. L. do S. S. da; OLIVEIRA, S. M.
A. de; Doenças fúngicas pós-colheita em frutas tropicais: patogênese e controle. Caatinga,
Mossoró, v.18, n.4, p.283-299, out./dez. 2005.
VASQUES, A. R.; BERTOLI, S. L.; VALLE, R. C. S. C.; VALLE, J. A. B.; Avaliação
sensorial e determinação de vida-de-prateleira de maçãs desidratadas. Ciência e
Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 26, n. 4, p. 759-765, 2006.
5
CAPÍTULO I
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
TAMARINDO (Tamarindus indica): COMPOSIÇÃO E PARÂMETROS QUE
INFLUENCIAM EM SUA QUALIDADE
Danilo Santos Souza, Helena Teixeira Godoy
Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos,
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Rua Monteiro Lobato, 80, Cidade
Universitária Zeferino Vaz, 13083-862, Campinas, SP, Brasil
6
1. Tamarindo
O tamarindeiro (Tamarindus indica) é uma árvore nativa da África, porém se
desenvolve naturalmente em regiões tropicais e subtropicais, se destacando como um
recurso vegetal importânte como alimento e erva medicinal em diversas partes do mundo
(SIDDHURAJU, 2007; MAHMOUDZADEH-SAGHEB et al., 2010). Por apresentar
excelentes qualidades nutricionais, com agradável aroma e sabor ácido-doce, o fruto é
muito utilizado na fabricação de néctares, sorvetes, pastas, doces, licores, geleias e também
como ingrediente em condimentos e molhos (PEREIRA et al., 2004).
Apesar de bem adaptado, o tamarindo é pouco explorado no Brasil e boa parte da
sua produção é destinada ao consumo interno (BRASIL, 2007). O fruto é bastante utilizado
na medicina tradicional para tratar doenças como diabetes e infecções estomacais
(FERREIRA, 2008). Cada unidade possui de uma a 10 sementes, pesa de 10 a 15 g e suas
partes constituídas de casca, polpa e sementes, contribuem respectivamente com 30%, 30%
e 40% do peso do fruto inteiro (PEREIRA et al., 2010).
A polpa de tamarindo possui uma coloração marrom escura com quantidades
consideráveis de potássio, fósforo, cálcio e vitamina A, o que confere excelentes qualidades
nutricionais (DIALLO et al., 2008). No entanto, mesmo havendo muitas opções de
beneficiamento da polpa para elaboração de produtos alimentícios, as propriedades
funcionais do fruto ainda são pouco investigadas (GURJÃO, 2006).
As sementes que são envolvidas pela polpa, são muito utilizadas como fitoterápicos.
Possuem compostos bioativos, como ácidos graxos insaturados e compostos fenólicos,
como os taninos, em sua composição, aos quais se atribuem atividades antioxidantes,
7
antihepatotóxica, anti-inflamatória, antimutagênica, antidiabética e anti-aterosclerótica
(MAITI et al., 2004). Após processadas, podem ser utilizadas como estabilizantes de sucos
e alimentos industrializados, no entanto, sua grande aplicação é como goma (polissacarídeo
xiloglucona) para tecidos ou papel. A xiloglucona extraída da semente, também tem a
finalidade de substituir carboidratos e consequentemente reduzir o valor calórico de alguns
alimentos, sendo que a semente é a única fonte deste polímero disponível comercialmente.
Também é muito utilizado na indústria farmacêutica para controle de liberação de drogas
(IZYDORCZYK et al., 2005). O óleo presente na semente é composto em maior parcela
por ácido linoleico, caracterizado como um ácido graxo poli-insaturado com alto potencial
bioativo de grande interesse em produtos alimentícios (LUZIA & JORGE, 2011).
2. Capacidade Antioxidante
O estudo da capacidade antioxidante in vitro ou in vivo de compostos presentes
naturalmente no Tamarindus indica vem sendo foco de estudos científicos devido ao seu
potencial para o tratamento e combate a doenças (SIDDHURAJU, 2007; RAZALI et al.,
2012).
Compostos antioxidantes podem ser definidos como quaisquer substâncias que
atrasam ou inibem a oxidação de substrato oxidável de maneira eficaz, mesmo quando
presentes em baixas concentrações (SIES & STAHL, 1995; SHAMI & MOREIRA, 2004).
A utilização de compostos antioxidantes, encontrados na dieta ou mesmo sintéticos, é um
dos mecanismos de defesa contra os radicais livres que podem ser empregados nas
8
indústrias de alimentos, cosméticos, bebidas e também na medicina (DOROSHOW, 1983;
HALLIWELL et al., 1995).
A obtenção de energia para o desenvolvimento dos processos biológicos em seres
vivos depende diretamente do processo oxidativo, porém, produzem radicais livres e outras
espécies de oxigênio altamente reativas. Os produtos dessa oxidação podem reagir
desordenadamente com os lipídeos da membrana celular dentro do organismo humano, e
também com outros compostos como proteínas e ácido desoxirribonucleico (DNA),
favorecendo o desenvolvimento de doenças degenerativas como artrite, aterosclerose,
diabetes e cirrose, além de contribuir para o envelhecimento humano e risco de câncer
(SATO et al., 1996; HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999).
Os seres humanos, igualmente aos demais seres aeróbicos, conseguem tolerar a
presença dessa oxidação natural graças a mecanismos de defesa adquiridos em muitos anos
de evolução, onde usam sistema de transporte de elétrons e sistemas enzimáticos para
protegerem o organismo como um todo dos efeitos tóxicos do oxigênio, ou seja,
mecanismos de ação antioxidante. O corpo humano, muitas vezes, é submetido a condições
extremas de oxidação, intensificadas pela ação de poluentes e contaminantes químicos, de
modo que a formação de radicais livres estaria muito acima da capacidade das defesas do
corpo humano de removê-las, ocasionando o ―estresse oxidativo‖ (AROUMA et al., 1991).
A principal fonte natural de compostos com ação antioxidante como, por exemplo, o
ácido ascórbico e tocoferol (vitaminas C e E, respectivamente), além de compostos
fenólicos como antocianinas e flavonoides, são os alimentos. Alguns minerais presentes na
alimentação como zinco, selênio e ferro também são considerados antioxidantes, pois são
9
constituintes de algumas enzimas envolvidas na proteção contra o estresse oxidativo
(PRAKASH, 2001; SIMPSON, 2006).
Os vegetais em geral, assim como todos os alimentos e bebidas derivadas destes,
são ricos em vários tipos de antioxidantes, como vitaminas C, α-tocoferol, β-caroteno e
compostos fenólicos, os quais constituem a maioria dos compostos com atividade
antioxidante (MOURE et al., 2001). A maioria dos compostos antioxidantes numa dieta
típica é derivada de fontes vegetais e pertencem a várias classes de compostos com uma
grande variedade de propriedades físicas e químicas. Na ciência de alimentos, os
antioxidantes têm um amplo espectro de atuação, no qual se incluem componentes que
previnem rancidez em óleos, assim como os antioxidantes da dieta (PRAKASH, 2001;
FENNEMA, 2004; SIMPSON, 2006).
Desta forma, o consumo de frutas não está sendo encarado apenas como um gosto
preferencial ou pessoal por parte dos consumidores, mas com o objetivo de manter uma
dieta saudável e rica em nutrientes. Além de compostos essenciais, a maioria das frutas
apresenta quantidades consideráveis de micronutrientes, tais como fibras, minerais,
vitaminas e compostos fenólicos secundários de extrema importância para a saúde humana
(RUFINO et al., 2010).
Alimentos ricos em fenólicos, bebidas e extratos de plantas, tais como vinho tinto,
extratos de semente de uva, chá verde e tamarindo (Tamarindus indica), são apresentados
como fontes promissoras de compostos com tais características, uma vez que eles têm
demonstrado atividade hipolipemiante, anti-aterosclerótica, antioxidante, anti-inflamatória
e imunomoduladora (PAULA et al., 2009).
10
3. Compostos fenólicos
Os compostos fenólicos podem ser definidos como um conjunto de substâncias
heterogêneas que apresentam em sua estrutura vários grupos benzênicos característicos,
substituídos por grupamentos hidroxilas (SOARES et al., 2008). Eles têm atraído muita
atenção nos últimos anos, devido a sua forte relação no combate a doenças degenerativas e
envelhecimento (GIRI et al., 2012). Agem como antioxidantes não somente pela sua
habilidade em doar hidrogênio ou elétrons, mas também por causa de seus radicais
intermediários estáveis, que impedem a ação de radicais livres no organismo e a oxidação
de vários ingredientes da indústria alimentícia, particularmente de ácidos graxos e de óleos
(TREMOCOLDE, 2011).
Nos vegetais, os compostos fenólicos podem ser divididos em dois grupos: os
flavonoides e os não flavonoides, em que ambos são metabólitos secundários
(DEGÁSPARI & WASZCZYNSKYJ, 2004). Os flavonoides compõem uma ampla classe
de substâncias de origem natural, cuja síntese não ocorre na espécie humana (LOPES et al.,
2012). Englobam uma classe muito importante de pigmentos naturais e têm a estrutura
química C6-C3-C6, sendo que as duas partes da molécula com seis carbonos são anéis
aromáticos (VOLP et al., 2008). Os não flavonoides são classificados como: os derivados
das estruturas químicas C6-C1 específicas dos ácidos hidroxibenzóico, gálico e elágico; os
derivados das estruturas químicas C6-C3 específicas dos ácidos caféico e p-cumárico
hidroxi cinamatos e os derivados das estruturas químicas C6-C2-C6 específicas do trans-
resveratrol, cis-resveratrol e transresveratrol-glucosídio (BURNS et al., 2001).
11
Segundo Shan et al. (2005), os principais compostos fenólicos podem ser divididos
em 4 grupos: os ácidos fenólicos (gálico, protocatecúico, caféico e rosmarínico), diterpenos
fenólicos (carnosol e ácido carnósico), flavonoides (quercetina e catequina) e óleos voláteis
(eugenol, carvacrol, timol e mentol). Os ácidos fenólicos são compostos que possuem
propriedades antioxidantes devido a presença de um ou mais anéis benzênicos, um
grupamento carboxila e um ou mais grupamentos de hidroxila e/ou metoxila na molécula
(SOARES, 2002). Estão presentes nos alimentos, principalmente vegetais, na forma livre
(agliconas), ésteres, glicosídeos e/ou na forma complexada (ROCKENBACH et al., 2008;
ROSS et al., 2009).
Segundo Robbins (2003), os ácidos fenólicos são uma subclasse de uma larga
categoria de metabólitos comumente conhecidos como ―compostos fenólicos‖.
Ultimamente eles têm recebido uma atenção especial, principalmente em relação às
técnicas de extração e obtenção, devido ao seu papel eficaz na prevenção de várias doenças
humanas nas quais atuam em uma variedade de ações biológicas, tais como radical livre, a
quelação de metais, a modulação da atividade enzimática, a aterosclerose, antimutagênica e
atividade anticancerígena (LAGHARI et al., 2011). Os ácidos fenólicos também são
considerados fortes antioxidantes capazes de prevenir ou retardar a taxa de oxidação para
reações em cadeia nos materiais autoxidáveis, podendo ser identificados por métodos de
separação, como a cromatografia líquida (TARNAWSKI et al., 2006).
Os taninos são componentes polifenólicos encontrados em alimentos, bebidas e
principalmente em vegetais, na qual estão distribuídos nas raízes, casca, seiva, folhas,
frutos e sementes (PANSERA et al., 2003; BATTESTIN et al., 2004). Possuem alto peso
12
molecular, solubilidade em água e têm habilidade para precipitar proteínas formando
ligações cruzadas estáveis (HELBIG, 2000).
Estando na forma não oxidada, os taninos reagem com proteínas por meio de pontes
de hidrogênio ou ligações hidrofóbicas. Por outro lado, quando oxidados, se transformam
em compostos quinonas, formando ligações covalentes com alguns grupos funcionais das
proteínas, principalmente os grupos sulfídricos da cisteína e ω-amino da lisina (NOZELLA,
2001).
Segundo Sigleton & Kratzer (1973), os taninos podem ser classificados como
hidrolisáveis e não hidrolisáveis ou condensados. Os taninos hidrolisáveis quando sofrem
hidrólise ácida produzem ácidos fenólicos: gálico, caféico, elágico e um açúcar
(NOZELLA, 2001). Os taninos não hidrolisáveis ou condensados (proantocianidinas) são
polímeros dos flavonoides formados por unidades de catequina e leucoantocianidina,
presentes em maior quantidade nos alimentos normalmente consumidos (SILVA & SILVA,
1999).
4. Tocoferóis e ácidos graxos
Os tocoferois são considerados os melhores antioxidantes naturais para a indústria e
são amplamente aplicados como meio para inibir a oxidação de óleos e gorduras
comestíveis, prevenindo a oxidação dos ácidos graxos insaturados (RAMALHO & JORGE,
2006). São naturalmente encontrados na maioria dos óleos vegetais, alguns tipos de
pescados e atualmente pode ser obtido por síntese (ZARROUK et al., 2009). Formam um
grupo de quatro (α, β, γ e δ) antioxidantes lipofílicos sintetizados por organismos
13
fotossintéticos, predominando geralmente em folhas e sementes (MUNNE-BOSCH &
ALEGRE, 2002).
A atividade antioxidante dos tocoferóis se dá principalmente pela sua capacidade
em doar hidrogênios aos radicais livres lipídicos, fazendo com que a propagação da
oxidação em cadeia seja interrompida (SZYMANSKA & KRUK, 2008). Por esta razão, são
aplicados para inibir a oxidação de ácidos graxos livres (RAMALHO & JORGE, 2006).
Os ácidos graxos são compostos por uma cadeia carbônica, cujo comprimento varia
de 4 a 36 átomos de carbono, com um grupo metil (CH3) em uma extremidade e um grupo
carboxil (COOH) na outra (LESKANISH & NOBLE, 1997). Estão presentes nas mais
diversas formas de vida, desempenhando importantes funções na estrutura das membranas
celulares e nos processos metabólicos (MARTIN et al., 2006). A presença dos ácidos
graxos, principalmente os poli-insaturados da família do ômega-3 e ômega-6, nos
alimentos, desempenha muitos benefícios à saúde humana (LUZIA & JORGE, 2011).
Ocorrem sob a forma livre ou sob formas covalentemente ligadas a álcoois e a outros
componentes, e podem ser liberados através de hidrólise química ou enzimática (SILVA,
1996). Como fazem parte da fração lipídica, assim como os tocoferóis, são extraídos
juntamente com o óleo nas indústrias, seja por extração a frio, com o uso de prensas ou
solventes orgânicos, ou por extração a quente, sendo que esta última favorece na
degradação destes compostos termolábeis (SOTO et al., 2007).
14
5. Atividade Hemolítica
Atualmente, diversos produtos naturais têm mostrado variadas propriedades
biológicas, algumas das quais são deletérias e outras benéficas para os seres humanos. Os
efeitos biológicos do extrato aquoso de semente de tamarindo ainda são pouco estudados e
não há na literatura dados que caracterizem esse extrato como agente causador da hemólise
celular.
A atividade hemolítica representa um dos vários efeitos biológicos causados por
agentes tóxicos e fatores antinutricionais (WOLDEMICHAEL & WINK, 2001; HASSAN
et al., 2010). Deve-se à capacidade que glicosídeos contidos na amostra têm de se combinar
com as moléculas de colesterol presentes na membrana dos eritrócitos, perturbando seu
equilíbrio célular e promovendo sua ruptura com consequente liberação da hemoglobina
(KAWASHIMA et al., 1972).
A investigação da atividade hemolítica constitui um modelo experimental em
células vermelhas de sangue tendo como alvo as membranas, para compreender melhor o
mecanismo citopático frente a um agente causador da hemólise (CARLI & TASCA, 2002).
Alguns trabalhos associam o efeito tóxico de compostos com o seu potencial em causar
hemólise em células do sangue. Fook et al. (2005), ao avaliar in vitro a influência de
inibidores protéicos encontrados no extrato da semente de tamarindo, não detectaram nem
atividade citotóxica e nem hemolítica. Yu et al. (2007) correlacionaram positivamente os
efeitos tóxicos promovidos pelo veneno de água-viva com sua alta capacidade em provocar
lise nos eritrócitos do sangue. Dharmananda (2000) determinou a toxicidade de saponinas
encontradas em plantas ao perceber que doses elevadas do composto rompiam as células
15
vermelhas do sangue após promover a lise de suas membranas. Desta forma, a atividade
hemolítica vem sendo diretamente relacionada ao estudo da inocuidade do produto, em que
os resultados são interpretados como indicativos de toxicidade.
6. Secagem de alimentos por liofilização
A liofilização é o processo em que a umidade da emulsão congelada é retirada por
sublimação, sob alto vácuo e baixa temperatura. O produto obtido é um tipo de esponja
seca, que pode facilmente ser reduzida a pó (FODA et al., 1972). A mudança de estado
físico da água pode resultar em produtos com maior suscetibilidade a oxidação, uma vez
que propicia o rompimento da matriz de sólidos disponibilizando-os para tais reações
(DESOBRY et al.,1997).
O grande diferencial da liofilização está no fato do produto permanecer no estado
sólido durante todo o processo. A maior parte da água passa do estado sólido para o vapor
sem passar pelo estado líquido, preservando assim a estrutura original do produto, obtendo-
se ao final do processo, um produto poroso e com baixa umidade residual. Modificações
físico-químicas são inibidas, minimizando a perda de constituintes voláteis ou a perda de
atividade biológica ou outra atividade na preservação da estrutura molecular (FORD &
DAWSON, 1994; PITOMBO et al., 1994). Os constituintes não aquosos são concentrados
em uma pequena quantidade de água, resultando em alterações significativas das
propriedades da fase não congelada (pH, acidez titulável, força iônica, viscosidade, ponto
de congelamento, tensão superficial e interfacial, além do potencial de óxido-redução).
Ademais, a estrutura da água e a interação soluto-água podem ser alteradas (PITOMBO,
1994).
16
Segundo Oetjen (2004), um processo de liofilização otimizado pode ser obtido, se as
condições de operação forem controladas, com o objetivo de reduzir o tempo de processo e
consequentemente minimizar o consumo de energia, sem que ocorra a perda na qualidade
do produto liofilizado.
Um dos principais problemas da liofilização é seu alto custo, tanto para o capital de
investimento como para a operação do processo. Outro problema está relacionado ao longo
tempo de secagem que varia de 1 a 3 dias. Isto ocorre devido à baixa transferência de calor
dentro do produto, assim como a baixa pressão de operação do processo. A sublimação
consome quase metade da energia total necessária ao processo (45%). O congelamento
consome pouca energia, 4%, e a redução da pressão e a condensação dividem igualmente o
restante da energia (KHALLOUFI & RATTI, 2006).
Segundo Marques (2009), apesar do alto custo do processo e consequentemente do
produto final, a liofilização preserva as propriedades químicas e/ou físicas do material,
reduz o encolhimento e não ocorre a formação de camadas duras e impermeáveis, além de
ser amplamente difundida e utilizada por indústrias farmacêuticas, alimentícias e institutos
de pesquisa.
A secagem por liofilização ocorre em baixas temperaturas e apesar dos aspectos
positivos de conservação que confere ao produto, pode alterar as características sensoriais e
o valor nutricional de frutos, além disso, o grau de alterações depende de parâmetros
utilizados na elaboração e características particulares de cada produto. As frutas liofilizadas
tendem a preservar o sabor, o aroma, cor e textura originais do fruto fresco, necessitando de
testes sensoriais eficientes para avaliar a intensidade de mudanças ocorridas após o
processo (SOUZA et al., 2014).
17
7. Análise Sensorial
Devido às constantes alterações nos hábitos alimentares, crescente produção e
desenvolvimento de novos produtos alimentícios, a utilização de testes que representam a
opinião do consumidor com segurança e eficiência se torna necessária. Desta forma, testes
sensoriais são realizados em produtos específicos, como frutas desidratadas, para direcionar
o gosto e a preferência do público alvo em questão (SANTOS, 2011).
Os métodos sensoriais são divididos em dois grandes grupos: analíticos e afetivos.
Os métodos analíticos são aplicados em avaliações que necessitam de seleção e/ou
treinamento da equipe, como também se faz necessário avaliar objetivamente os
consumidores onde são consideradas as preferências ou opiniões pessoais dos membros da
equipe (ABNT, 1993). O método se divide em dois grandes grupos: testes discriminativos
(de diferença) e descritivos (FERREIRA et al., 2000).
Os testes afetivos avaliam diretamente a opinião (preferência e/ou aceitabilidade) do
consumidor, sobre características específicas do produto ou ideia sobre o mesmo, sendo
também chamado de teste do consumidor. O teste afetivo se divide em dois: teste de
aceitação e teste de preferência (MEILGAARD et al., 1991). A escolha do teste é
extremamente importante para a avaliação sensorial, pois a correta aplicação definirá a
relevância das respostas obtidas para o sucesso do estudo.
Com a alta suscetibilidade a rejeição sensorial de alimentos ricos em taninos devido
a sua adstringência, a análise sensorial torna-se uma ferramenta essencial e necessária para
avaliar os níveis de aceitabilidade para adição do extrato da semente de tamarindo à
mistura.
18
8. Referências Bibliográficas
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28
29
CAPÍTULO II
OTIMIZAÇÃO DO PROCESSO PARA ELABORAÇÃO DE EXTRATO AQUOSO
LIOFILIZADO DA SEMENTE DE TAMARINDO (Tamarindus indica)
OPTIMIZATION OF PROCESS FOR PREPARING AQUEOUS EXTRACT
LYOPHILIZED OF THE TAMARIND (Tamarindus indica) SEED
Danilo Santos Souza1*
, Helena Teixeira Godoy1
SOUZA, D. S.; GODOY, H. T.
1Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos,
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Rua Monteiro Lobato, 80, Laboratório
de Análise de Alimentos – DCA/FEA. Cidade Universitária Zeferino Vaz, 13083-862,
Campinas, SP, Brasil
* Autor para correspondência: danilosantos_souza@yahoo.com.br
Fone: (19) 3521-4023
Colaborador: helena@fea.unicamp.br
Manuscrito em preparo para ser submetido ao periódico Food Science and Technology,
Campinas
30
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi determinar a melhor condição de processamento da semente
em que há a maior migração de compostos fenólicos totais para o extrato aquoso obtido. As
variáveis tempo (s) que corresponde ao tempo de trituração da mistura (semente e água) e a
variável m/v, que representa a relação massa de semente (g) fixada em 100 g e o volume
(mL) de água adicionado foram estudadas. A composição de fenólicos totais em
equivalência ao ácido gálico (mgAG/gs.s.) foi utilizado como resposta, a partir do método de
Folin-Coucalteau. A variável tempo (s) exerceu maior influência na extração dos
compostos fenólicos, assim sendo, o ensaio 8 (60 s e 1:3 m/v) respondeu como a melhor
condição de extração com 61,57 mgAG/gs.s., sendo que não houve interação considerável
entre os efeitos principais, porém o modelo foi significativo ao ajustar os dados
experimentais. De forma univariada, o acréscimo do tempo promoveu melhores resultados
de fenólicos (80 e 100 s de trituração), com 67,40±0,68 e 66,80±2,32 mgAG/gs.s.. Desta
forma, estabeleceram-se condições de extração dos compostos fenólicos totais da semente
em uma relação (m/v) de 1:3 de semente e água, a um período de trituração de 80 s em que
o mosto resultante seja processado mais uma vez.
Palavras chave: Extração aquosa, compostos fenólicos, liofilização, superfície de resposta.
31
1. Introdução
A crescente demanda por alimentos mais saudáveis visando favorecer uma melhor
dieta e a melhoria da qualidade de vida vem contribuindo para um aumento significativo
neste segmento da indústria de alimentos (Oliveira et al., 2013). No entanto, a quantidade
consumida destes alimentos está longe de se equiparar ao volume de produção, devido às
dificuldades de escoamento da matéria-prima, transporte inadequado, maus tratos pós-
colheita, déficit de planejamento no preparo e baixa acessibilidade à população. Além
disso, existe uma grande dificuldade em encontrar opções de alimentos que reúnam as
características sensoriais e funcionais aceitáveis. Os alimentos funcionais fazem parte de
uma nova concepção de alimentos e são definidos como qualquer alimento que, além de
possuir as características nutricionais básicas, auxilia na prevenção e redução do risco de
doenças crônicas acarretando em supostos benefícios fisiológicos (Stratton et al., 2015).
O tamarindo é um fruto tropical que possui diversas propriedades funcionais devido
a presença de minerais, açúcares, vitaminas e alguns compostos, como os fenólicos e
tocoferóis, aos quais se atribuem sua atividade antioxidante (Siddhuraju, 2007). No entanto,
as sementes que compõem boa parcela do fruto ainda são pouco reaproveitadas para fins
alimentícios e são consideradas como resíduos em grandes indústrias de suco, sendo
destinada às indústrias têxtil ou simplesmente descartadas, gerando altos custos com
tratamento visando minimizar os impactos ambientais provocados. A semente apresenta
capacidade antioxidante e presença de compostos fenólicos (Tsuda et al., 1994) e
tocoferóis (Luzia & Jorge, 2011) em sua composição. Alguns estudos também mostraram
que o extrato aquoso da semente de tamarindo apresentou consideráveis atividades anti-
32
hiperlipidêmica e antidiabética, reduzindo o açúcar do sangue, colesterol total e triglicerois
em ensaios com ratos (Maiti et al., 2004; Maiti et al., 2005). Para consumo humano, na
Índia alguns povos utilizam a semente de tamarindo torrada e triturada em substituição ao
café, utilizando água quente para obtenção da bebida (Siddhuraju, 2007).
O enriquecimento de alimentos surgiu como estratégia para combater algumas
deficiências nutricionais em populações de risco (Reilly, 1996). No entanto, com a busca
por alimentos mais saudáveis, os consumidores estão dando preferência para alimentos que
além de possuir as qualidades nutricionais, promovam certa funcionalidade, favorecendo
uma melhoria na qualidade de vida.
Considerando todo potencial funcional atribuído à semente de tamarindo, a
elaboração de um produto estável concentrado de bioativos a base de semente pode ser uma
alternativa para o enriquecimento de diversos tipos de alimentos, além de criar novas
formas de utilização da semente, maximizando o aproveitamento do fruto e minimizando a
geração de resíduos. Ferramentas estatísticas multivariadas vêm sendo muito utilizadas na
pesquisa para otimização de diferentes técnicas, sendo muito úteis nos campos da
engenharia e química (Breitkreitz et al., 2009). Diferentes trabalhos utilizando a otimização
multivariada para extração de compostos bioativos podem ser encontrados na literatura
(Kaiser et al., 2013; Sharif et al., 2014; Wong et al., 2015). Desta forma, o objetivo deste
trabalho foi determinar a melhor condição de extração aquosa da semente de tamarindo de
modo a obter um produto liofilizado com o maior teor de compostos fenólicos, e com isso,
favorecer o potencial antioxidante deste produto concentrado.
33
2. Material e Métodos
2.1 Obtenção e preparo de amostras
Os frutos de tamarindo foram adquiridos dos estados de Minas Gerais, São Paulo e
Bahia, das cidades de Patos de Minas (18° 34' S e 46° 31' O), Campinas (22º 49' 3'' S e 47°
4' 11" W) e Tanhaçu (14° 1' 11'' S e 41° 14' 7'' O), respectivamente, nos anos de 2012 e
2013. Após a aquisição, foram descascados e a semente envolvida pela polpa ficou de
molho por 24 hs, para hidratação e facilitar a separação. Posteriormente, a mistura foi
pulsada em liquidificador industrial (modelo AR 2L, Colombo®, 800 W e 60 Hz) e filtrada
em peneira comum para separar a polpa da semente.
Para facilitar o processamento da semente, as amostras homogeneizadas dos 3
estados, foram previamente triturada em liquidificador industrial para romper a camada
rígida da semente e então deixada de molho com água na mesma proporção 1:1 (m/v) por
24 h à 18°C. Após sua hidratação, uma alíquota foi retirada de cada amostra para realização
da análise de umidade em estufa a 105ºC e o restante submetida aos ensaios de otimização.
2.2 Reagentes e padrões
Foram utilizados os reagentes Folin-Ciocalteau (Dinâmica, Brasil), carbonato de
sódio (Synth, Brasil) e o padrão de ácido gálico (Sigma Aldrich, EUA).
34
2.3 Ensaios de otimização
Nos ensaios para o planejamento em Delineamento Composto Central Rotacional
(DCCR) foram estudadas duas variáveis independentes em seus respectivos níveis,
conforme mostrado na Tabela 1. A variável tempo (s) corresponde ao tempo de trituração
da mistura (semente e água) em liquidificador industrial. Por outro lado, a variável m/v,
representa a relação massa de semente (g) fixada em 100 g e o volume (mL) de água
adicionado.
Tabela 1. Distribuição dos níveis para o planejamento experimental.
Fatores
Níveis
-1,42 -1 0 +1 +1,42
Tempo (s) 20 26 40 54 60
m/v (g/mL) 100:100 100:159 100:300 100:441 100:500
Após os ensaios, a mistura obtida foi filtrada em peneira comum com área de malha
de 1 mm2. Posteriormente uma alíquota do extrato foi submetida à análise de compostos
fenólicos totais e o restante ao processo de liofilização para obtenção do pó.
2.4 Determinação de Fenólicos Totais
O conteúdo total de compostos fenólicos do extrato aquoso das amostras foi
determinado pelo método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau (Singleton et al., 1999).
35
Para a realização da análise, o extrato foi filtrado através do papel filtro tipo Watman®
nº1
com auxílio de vácuo e uma alíquota de 25 μL do extrato aquoso foi transferida para
microplaca de 96 poços e adicionado 125 μL do reagente Folin-Ciocalteau, diluído em água
destilada na proporção de 1:10. A mistura permaneceu em repouso por 5 minutos. Em
seguida, foi adicionado 100 μL de carbonato de sódio 4% e deixados em repouso por 2
horas, ao abrigo da luz. A absorbância (740 nm) foi medida em microleitora BMG
Labtech®
modelo Fluostar Omega (EUA). Uma amostra controle e o branco (água
destilada) foram conduzidos nas mesmas condições e os resultados dos compostos
fenólicos totais foram expressos em equivalente de ácido gálico, com base em uma curva
de calibração de ácido gálico variando de 5 a 100 μg/mL.
2.5 Análise estatística
Para determinar os efeitos do processo de preparo do extrato sobre a resposta da
composição de fenólicos totais foi aplicada a análise de variância (ANOVA). Foram
avaliadas a significância dos efeitos principais e a interação entre eles, além da falta de
ajuste do modelo teórico para a superfície de resposta obtida com os dados experimentais
utilizando o software Statistica 7.0.
3. Resultados e Discussão
As distribuições dos experimentos juntamente com os respectivos resultados do teor
de compostos fenólicos totais (FT) para cada ensaio estão apresentadas na Tabela 2.
36
Tabela 2. Distribuição dos ensaios de extração aquosa da semente para o delineamento
composto central.
Experimentos
Tempo
(s)
Relação (m/v)
(g/mL)
FT
(mgAG/gs.s.)
1 26 (-1) 100:159 (-1) 42,81
2 54 (+1) 100:159 (-1) 54,76
3 26 (-1) 100:441 (+1) 33,49
4 54 (+1) 100:441 (+1) 48,61
5 40 (0) 100:100 (-1,42) 47,63
6 40 (0) 100:500 (+1,42) 41,38
7 20 (-1,42) 100:300 (0) 26,19
8 60 (+1,42) 100:300 (0) 61,57
9 40 (0) 100:300 (0) 47,53
10 40 (0) 100:300 (0) 45,60
11 40 (0) 100:300 (0) 49,13
Aplicando a análise de superfície de respostas (Figura 1) é possível observar que a
variável tempo (s) exerceu maior influência na extração dos compostos fenólicos, sendo
que, quanto maior o tempo de trituração com água, maior o conteúdo de fenólicos extraído,
assim como, quanto menor o tempo, menor a eficiência da extração dos fenólicos. Por outro
lado, a relação m/v mostrou não ter tanta influência no processo de extração, porém seu
comportamento indica uma tendência para uma maior extração quando a relação entre
volume e massa for menor. Desta forma, o ensaio 8 se apresentou como a melhor condição
37
de extração, com uma concentração de fenólicos totais de aproximadamente 61,57
mgAG/gs.s. e, o ensaio 7 com o menor teor, ou seja, de 26,19 mgAG/gs.s.
Figura 1. Influência do tempo de trituração (s) e relação volume/massa (mL/g) na extração
de fenólicos totais (FT) obtidos da semente de tamarindo.
A partir da análise de variância (ANOVA) apresentada na Tabela 3 é possível
observar que os efeitos principais foram significativos, a p≤0,05, para o modelo linear (L).
Porém, a variável m/v, apesar de significativa, se manteve próximo do limiar, indicando
que o tempo foi, de fato, o efeito mais significativo no processo. Analisando os efeitos de
interação entre as variáveis, observa-se também que não foram significativos, indicando
que elas não agem em conjunto para melhoria da extração dos compostos fenólicos. Da
mesma forma, nenhum dos efeitos foi significativo para o modelo quadrático (Q), o que
aparentemente aponta uma relação direta na variação dos níveis com a resposta.
38
Tabela 3. Análise de Variância (ANOVA) do delineamento experimental para extração
aquosa de compostos fenólicos totais da semente de tamarindo.
Soma Quadrática GL MS F P
(1)Tempo(s)(L)* 744,1369 1 744,1369 237,5446 0,004183
Tempo (s) 14,3410 1 14,3410 4,5780 0,165761
(2) v/m (L) 73,8176 1 73,8176 23,5642 0,039914
v/m (Q) 9,2459 1 9,2459 2,9515 0,227936
1L x 2L 2,5307 1 2,5307 0,8079 0,463612
Falta de Ajuste 71,6206 3 23,8735 7,6209 0,118202
Erro Puro 6,2652 2 3,1326
Total 916,7274 10
*Valores em negrito foram significativos (p≤0,05).
Também pode ser observado, que a falta de ajuste não foi significativa (p=0,118),
portanto, o modelo linear teórico se ajusta aos dados experimentais, obedecendo a
distribuição normal. Para melhor visualizar o comportamento da resposta sobre as variáveis
e sua interação, os efeitos estão representados na Figura 2.
39
Figura 2. Efeito das variáveis sobre a extração aquosa de compostos fenólicos totais
da semente de tamarindo.
Observa-se que o efeito principal Tempo (s) foi positivo e apresentou maior
significância, ou seja, se o tempo de trituração for aumentado, o teor de compostos
fenólicos totais também aumentará. Já a relação m/v foi significativa, porém, com pouca
relevância e de forma negativa em que a resposta é reduzida se a relação for aumentada. De
forma ilustrativa, também se pode notar que os efeitos principais para o modelo quadrático
e a interação entre eles não foram significativos, sendo que não atingiram valores iguais ou
superiores a 5% de probabilidade.
A partir dos resultados obtidos no planejamento DCCR, observou-se uma tendência
linear positiva na concentração de fenólicos no extrato aquoso à medida que se aumentava
o tempo de trituração, enquanto que a variável relação m/v não apresentou forte
significância no processo de extração. Desta forma, seria necessário aumentar o tempo de
trituração em um experimento univariado, o que levou ao planejamento de um novo
experimento.
40
Como o objetivo era utilizar a menor quantidade de massa possível e o modelo
mostrou que à medida que se aumenta a relação m/v, melhora a eficiência de extração, foi
estabelecido o valor máximo de 100 g para os próximos ensaios univariados a partir do
efeito Tempo (s).
A segunda etapa de otimização consistiu em prolongar o tempo de extração para
mais 5 ensaios em triplicata, a partir do ponto mais eficiente (ensaio 8) obtido no
delineamento experimental DCCR em que usa-se a uma relação m/v de 100:300 e um
tempo de 60 s, e assim avaliar até onde a variável Tempo (s) continuaria apresentando
efeito linear de extração. Foram acrescidos intervalos de 20 s até os 160 s, como mostrado
na Tabela 4, juntamente com as respostas para cada ensaio.
Tabela 4. Influência do tempo de trituração na extração de compostos fenólicos
totais (FT) da semente de tamarindo.
Tempo (s) FT (mgAG/gs.s.) DP
60 61,57ab*
±1,29
80 67,40a ±0,68
100 66,80a ±2,32
120 64,83ab
±3,08
140 60,80ab
±3,64
160 58,49b ±2,47
*Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna não apresentam diferença
significativa entre si a p≤0,05 pelo teste de Tukey; n=3.
41
Pode ser observado que os extratos obtidos dos ensaios em 80 e 100 s de trituração
tiveram os maiores resultados em concentração de compostos fenólicos totais, com
67,40±0,68 e 66,80±2,32 mgAG/gs.s., respectivamente, apesar de mostrarem igualdade
significativa com os tempos 60, 120 e 140 s. A partir de 120 s de trituração a concentração
dos fenólicos começou a diminuir no extrato, sendo que no tempo 160 s já apresentou
diferença significativa dos tratamentos anteriores, com resultado aproximado de 58,49±2,47
mgAG/gs.s.. Sendo assim, o comportamento de extração com o aumento do efeito principal
Tempo (s) em experimento univariado, tende a ter um comportamento quadrático e não
mais linear como visto nos resultados do planejamento DCCR. Pelos tempos de trituração
estudados, apesar de não ser significativo, notou-se um decaimento nos valores de
compostos fenólicos totais a partir de 80 s, tendendo a se reduzir ainda mais com o aumento
do tempo.
Com os resultados obtidos a partir da segunda etapa de extração, em que se estendeu
o tempo de trituração da semente, foi determinado os melhores pontos (80 e 100 s) com
igualdade significativa a p≤0,05 entre ambos, para dar sequência à terceira etapa do
processo de extração, que visa aumentar as etapas de trituração e melhorar a eficiência na
retirada dos compostos fenólicos. Já que os ensaios com 80 e 100 s foram
significativamente iguais, escolheu-se o menor valor, tendo como critério a redução do
tempo de experimento e o gasto de energia.
A terceira etapa consistiu em extrair novamente o mosto resultante do ensaio em 80
s de trituração, com o mesmo volume de água adicionado inicialmente (300 mL), por mais
4 vezes, totalizando 5 extrações sucessivas. A Figura 3 apresenta a influência do número de
extrações do mesmo mosto da semente sobre a concentração de FT. Observa-se que houve
42
um decréscimo significativo nos valores de FT à medida que as extrações vão sendo
realizadas, até ficar constante nas últimas etapas. Também se notou que a 2ª extração
representa quase 50% da 1ª e as 3ª, 4ª e 5ª extrações foram significativamente iguais entre
si, porém diferentes das duas primeiras.
1º 2º 3º 4º 5º
0
10
20
30
40
50
60
70
ccc
b
FT
(m
gA
G/g
s.s
.)
Extrações
a
Figura 3. Influência do número de extrações sucessivas sobre o teor de compostos fenólicos
totais extraídos da semente de tamarindo. Médias seguidas pela mesma letra apresenta
igualdade significativa entre si (p≤0,05)
A partir dos resultados obtidos com as etapas de otimização da extração aquosa de
compostos fenólicos da semente do tamarindo, estabeleceu-se as condições que resultaram
na maior eficiência no processo de extração, as quais foram então utilizadas para recuperar
os compostos fenólicos da semente de tamarindo. Tais condições representam uma relação
m/v de 1:3 de semente e água, submetidos a um período de trituração de 80 s em que o
mosto resultante do primeiro processo é utilizado novamente nas mesmas condições de
extração. O extrato líquido foi congelado a -18ºC e submetido ao processo de liofilização
43
por 48 horas a uma pressão de 87 µmHg. O pó obtido após a liofilização teve umidade de 2
g/100 g em base úmida e um rendimento de, aproximadamente 25% de sólidos secos em
relação à semente in natura, ou seja, para cada 100 g de sólidos secos da semente in natura,
têm-se um rendimento de aproximadamente 25 g de sólidos secos do pó.
4. Conclusão
Utilizando o Delineamento Composto Central Rotacional e experimentos
univariados, foi possível estabelecer a melhor condição de extração aquosa da semente de
tamarindo frente ao teor de compostos fenólicos totais. Para uma extração mais eficiente foi
estabelecido condições em que se tenha uma relação (m/v) de 1:3 de semente e água sob
um período de trituração de 80 s, em que o mosto resultante seja novamente processado
mais uma vez. O pó resultante do processo de liofilização poderá ser uma opção de uso
para enriquecer outros alimentos com a função de melhorar a bioatividade com
características sensoriais aceitáveis.
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46
47
CAPÍTULO III
INFLUÊNCIA DA ADIÇÃO DO EXTRATO AQUOSO LIOFILIZADO DA
SEMENTE SOBRE O TEOR DE FENÓLICOS TOTAIS, CAPACIDADE
ANTIOXIDANTE E ATIVIDADE HEMOLÍTICA DA POLPA DE TAMARINDO
(Tamarindus indica L.)
Danilo Santos Souza1*
, Helena Teixeira Godoy1
SOUZA, D. S.; GODOY, H. T.
1Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos -
UNICAMP, Brasil.
*Rua Monteiro Lobato, 80, Laboratório de Análise de Alimentos – DCA/FEA. Cidade
Universitária Zeferino Vaz, 13083-862, Campinas, SP, Brasil
* Autor para correspondência: danilosantos_souza@yahoo.com.br
Fone: (19) 3521-4023
Colaborador: helena@fea.unicamp.br
Manuscrito em preparo para ser submetido ao periódico Journal of Food Science and
Technology
48
RESUMO
A semente do tamarindo em sua forma natural é rica em compostos fenólicos que
promovem sua funcionalidade. O objetivo do trabalho foi avaliar a influência da adição do
extrato aquoso liofilizado da semente sobre a polpa em resposta ao teor de fenólicos totais,
capacidade antioxidante e atividade hemolítica de frutos oriundos de diferentes regiões do
Brasil (Minas gerais, São Paulo e Bahia), em safras de 2012 e 2013. O extrato aquoso da
semente foi liofilizado para obtenção de um pó, que por sua vez foi adicionado em
diferentes concentrações à polpa (0,3, 1,15 e 2%). O teor de fenólicos totais foi obtido
seguindo o método de Folin-Cioucalteou, sendo que a adição gradativa de extrato aquoso
liofilizado da semente à polpa promoveu um aumento significativo, principalmente para as
amostras adquiridas do estado da Bahia, alcançando 46,88±2,13 mgAG/gs.s. A capacidade
antioxidante pelos métodos DPPH, ABTS, FRAP e ORAC mostraram que a adição de
extrato aquoso liofilizado à polpa elevou de forma considerável a capacidade antioxidante
da mistura, dando destaque para as amostras de Minas Gerais, com aumentos de até 1942%
com o método ABTS na adição de 2% de extrato. A atividade hemolítica das amostras (São
Paulo e Bahia) realizada com eritrócidos de sangue humano apresentou altos índices de
hemólise, chegando a 98,8% de lise para São Paulo (1,15%) do lote 2 e 98,5% para Bahia
(0,3%) do lote 1. Mudanças do local de colheita e diferentes lotes influenciaram na
variações das respostas e o extrato aquoso liofilizado se mostrou eficiente para enriquecer a
polpa com compostos antioxidantes.
Palavras chave: Extrato aquoso, liofilização, fenólicos totais, PCA.
49
1. Introdução
O tamarindo (Tamarindus indica) é um fruto produzido nas regiões tropicais e
subtropicais do mundo e atualmente é um dos mais importantes vegetais utilizados como
fonte de alimentos em algumas regiões (Elumalai et al. 2015). Normalmente a polpa de
tamarindo é consumida na forma in natura ou é usada como matéria-prima para a produção
de bebidas, doces, sorvetes e como temperos para outros tipos de alimentos (Komutarin et
al. 2004). O Brasil é um dos maiores produtores de frutos e, em razão das boas condições
climáticas o tamarindo se adaptou bem ao território, sendo produzido em todas as regiões
do país (Silva et al. 2000). Os estudos farmacológicos da planta revelam que o tamarindo
possui atividades que combatem a ação do veneno de cobra, antibacteriana, antifúngica,
anti-inflamatória, antioxidante, além de atividades hepatoregenerativas (De et al. 2013).
Também é muito utilizado na medicina tradicional para o controle da diabetes mellitus
(Maiti et al. 2004).
O consumo de alimentos que contêm grandes quantidades de compostos com alta
capacidade antioxidante é sugerido como sendo capaz de reduzir riscos de doenças
degenerativas (Li et al. 2015). Alguns trabalhos de pesquisa mostram que a semente de
tamarindo tem apresentado grande potencial antioxidante, sendo que a atividade é atribuída
à forma de componentes antioxidantes isolados, como o 2-hidroxi-30,40-
dihidroxiacetofenona, metil 3,4-dihidroxibenzoato,3,4-dihidroxifenilacetato e (-)-
epicatequina, além de proantocianidinas oligoméricas e taninos poliméricos (Tsuda et al.
1993; Tsuda et al. 1994). Alimentos, bebidas e extratos de plantas ricos em fenólicos, como
o vinho tinto, extrato da semente de uva, chá verde e frutos in natura, vem sendo
50
consumido com mais frequência, pois tem se mostrado ser promissoras fontes de
compostos com tais características, uma vez que eles apresentam atividades hipolipidêmica,
antiaterosclerótica, antioxidante, anti-inflamatórias e imunomoduladoras (Paula et al.
2009).
Os métodos utilizados para determinação da capacidade antioxidante são
classificados de acordo com sua natureza, seja biológica com ensaios realizados em animais
(in vivo) e em sangue (in vitro) ou de natureza química por meio dos mecanismos de ação,
priorizados pela transferência de elétrons ou de hidrogênio (Tsoi et al. 2015; Chisté et al.
2014; Apak et al. 2013). Geralmente, os mais utilizados são os métodos in vitro que se
baseiam na captura ou eliminação de radicais livres gerados na reação ou redução de íons
metálicos (Tsoi et al. 2015). Porém, alguns trabalhos sugerem a utilização e correlação de
diversos métodos em paralelo para determinação da capacidade antioxidante, devido à
geração de resultados distintos produzidos por cada um deles (Pérez-Jiménez et al. 2008;
RUFINO et al. 2010; NIKI 2011; HE et al. 2015).
Para utilizar extratos vegetais na dieta humana como forma de enriquecimento de
alimentos é necessário e essencial avaliar os aspectos de segurança e especialmente o
potencial toxicológico do produto (Liang et al. 2015). A determinação da toxicidade é um
fator importante para distinguir os produtos a serem consumidos, e a atividade hemolítica
representa um ponto de partida fundamental, que fornece uma informação primária sobre a
interação entre as moléculas biológicas do produto com células do sangue (Kumar et al.
2011). Sendo assim, de forma geral, a atividade hemolítica representa um indicador de
citotoxicidade de qualquer composto em relação a células normais e saudáveis do sangue
(Silva et al. 2004). Devido à relevância do potencial bioativo apresentado pela semente de
51
tamarindo em diversos trabalhos encontrados na literatura, decidiu-se obter um extrato
aquoso desidratá-lo por liofilização e adicionar este produto à polpa como forma de
enriquecimento e aproveitamento do fruto. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi
avaliar a capacidade antioxidante, teor de fenólicos totais e atividade hemolítica do
tamarindo, colhido em diferentes estados do Brasil, na forma de polpa e semente, extrato
aquoso liofilizado da semente e sua aplicação em diferentes concentrações na mistura com
a polpa liofilizada.
2. Material e Métodos
2.1 Reagentes e padrões
Foram utilizados os reagentes metanol p.a (Synth, Brasil), etanol p.a (Synth, Brasil),
fosfato de sódio monobásico p.a (Êxodo, Brasil), fosfato de sódio dibásico p.a (Êxodo,
Brasil), cloreto de sódio p.a (Synth, Brasil), Folin-Ciocalteau (Dinâmica, Brasil), carbonato
de sódio (Synth, Brasil), ABTS - 2′2-azino-bis(3-etilbenzotriasolina-6-ácido sulfônico
(Sigma Aldrich, EUA), persulfato de potássio p.a (Synth, EUA), DPPH - 1,1-difenil-2-
picrilidrazil (Sigma, Aldrich, EUA), TPTZ - 2,4,6-Tripyridyl-s-Triazine (Sigma Aldrich,
EUA), cloreto férrico p.a (Synth, EUA), acetato de sódio p.a (Nuclear, Brasil), ácido
acético p.a (Synth, EUA), fluoresceína p.a (Synth, EUA), AAPH - 2,2'-azobis(2-metil-
propianamidina)dicloridrato (Sigma Aldrich, EUA), fosfato de potássio monobásico p.a
(J.T. Baker, EUA), fosfato de potássio dibásico p.a (J.T. Baker, EUA), SDS – dodecil
sulfato de sódio p.a (Sigma Aldrich, EUA) e os padrões de ácido gálico (Sigma Aldrich,
EUA) e Trolox (Sigma Aldrich, EUA).
52
2.2 Obtenção e preparo da matéria-prima
Os frutos de tamarindo foram adquiridos dos estados de Minas Gerais, São Paulo e
Bahia, das cidades de Patos de Minas (18° 34' S e 46° 31' O), Campinas (22º 49' 3'' S e 47°
4' 11" W) e Tanhaçu (14° 1' 11'' S e 41° 14' 7'' O), respectivamente, nos anos de 2012 e
2013. Todas as amostras foram colhidas no período de setembro dos respectivos anos. Após
a aquisição, foram descascados e a polpa juntamente com a semente ficou de molho por 24
hs para hidratação e facilitar a separação. Posteriormente, a mistura foi pulsada em
liquidificador industrial (modelo AR 2 L, Colombo®, 800 W e 60 Hz) e filtrada em peneira
comum para separar a polpa da semente. Parte da polpa e semente foram liofilizados e
submetidos à análise de umidade em estufa a 105ºC.
2.3 Extração
2.3.1 Preparo do extrato aquoso liofilizado
O extrato aquoso da semente foi obtido a partir da moagem da semente em uma
relação m/v de 1:3 de semente e água, submetidos a um período de trituração de 80 s em
que o mosto resultante do primeiro processo foi utilizado mais uma vez nas mesmas
condições de extração. O extrato obtido foi congelado em bandejas com 1 cm de espessura
e posteriormente liofilizado em um equipamento da marca Terroni®
modelo LS3000 por
um período de 48 h, até umidade constante de, aproximadamente, 2,00 gágua/100 g.
53
Para obtenção da mistura de extrato aquoso e polpa, as amostras dos respectivos
estados de origem foram homogeneizadas nas concentrações de [1] – 0,3%, [2] – 1,15% e
[3] – 2,0% de extrato liofilizado na polpa in natura. Depois de adicionados, o míx foi
liofilizado e embalado a vácuo sobre o abrigo da luz até o momento da análise.
2.3.2 Preparo dos extratos para análises de antioxidantes e fenólicos totais
Os extratos da polpa, semente, extrato aquoso da semente liofilizado e mistura de
polpa e extrato da semente foram obtidos de acordo a metodologia proposta por
Shivashankara et al. (2004), com algumas modificações. Aproximadamente, 3 g para
amostras úmidas (polpa in natura e semente hidratada) e 0,5 g para amostras liofilizadas
(extrato aquoso e mistura de polpa e extrato) foram homogeneizadas com 20 mL de mistura
metanol:água (80:20) usando Turrax®. A mistura foi sonicada em ultrassom por 45 minutos
e centrifugada a 4200 rpm por 15 minutos à 4°C. O sobrenadante foi coletado e o
precipitado foi extraído mais duas vezes com 5 mL de metanol:água (80:20) nas condições
previamente descritas. Os dois sobrenadantes coletados foram misturados e filtrados em
papel filtro tipo Whatman nº 1.
2.3.3. Preparo dos extratos para análise de atividade hemólítica
Após seguir o mesmo procedimento do item 2.2.1 para antioxidantes e fenólicos, os
filtrados foram concentrados até a secura em evaporador rotativo, e ressuspendidos em 2
54
mL de tampão PBS (tampão fosfato salino) previamente esterilizado. Depois, foram
armazenados à -26°C até o momento das análises de atividade hemolítica.
2.4 Determinação de fenólicos totais
O conteúdo total de compostos fenólicos do extrato das amostras foi determinado
pelo método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau (Singleton et al. 1999). Para a
realização da análise, uma alíquota de 25 µL do extrato metanólico foi transferida para o
poço da microplaca e adicionado 125 µL do reagente Folin-Ciocalteau, diluído em água
destilada 1:10. A mistura permaneceu em repouso por 5 minutos. Em seguida, foi
adicionado 100 µL de carbonato de sódio 4% e a mistura deixada em repouso por 2 horas,
ao abrigo da luz. A absorbância foi medida em microleitora da marca BMG Latech®,
modelo Fluostar Omega. a 740 nm. Uma amostra em branco foi conduzida nas mesmas
condições e os resultados dos compostos fenólicos totais foram expressos em equivalente
de ácido gálico (mgAG/g s.s.), com base em uma curva de calibração de ácido gálico com
concentrações variando de 16 a 72 μg/mL.
2.5 Capacidade antioxidante
2.5.1 Ensaios de ABTS (2′2-azino-bis(3-etilbenzotriasolina-6-ácido sulfônico))
A atividade antioxidante foi determinada pelo método ABTS conforme metodologia
descrita por Rufino et al. (2010). O radical ABTS•+
foi formado pela reação de 7 mM de
55
ABTS com 140 mM de persulfato de potássio, armazenado ao abrigo da luz à temperatura
ambiente, por 16 horas. Uma vez formado, o radical foi diluído com etanol até a obtenção
da absorbância de 0,700 ± 0,05 a 734 nm. Cada extrato (polpa, semente, extrato aquoso da
semente liofilizado e mistura de polpa e extrato da semente) foi diluído conforme
necessidade. Em ambiente escuro, uma alíquota de 2,5 µL de cada diluição do extrato foi
transferida para poços de microplaca e uma mistura com 250 µL do radical ABTS•+
também foi adicionada na sequência. As absorbâncias foram então lidas a 734 nm em
microleitora da marca BMG Latech®, modelo Fluostar Omega. , após 6 minutos da reação,
utilizando o etanol como branco. O Trolox (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-
carboxílico), foi utilizado como antioxidante padrão para elaboração da curva de
calibração, nas concentrações de 17 a 850 μmol.L-1
, e os resultados foram expressos em
equivalente de μM Trolox/g ss.
2.5.2 Ensaios de DPPH (1,1-difenil-2-picrilidrazil) – Sequestro do radical livre
A determinação da atividade antioxidante utilizando a redução do radical livre
DPPH• foi baseada na metodologia adaptada de Brand-Williams et al. (1995). Uma solução
de metanol contendo 0,06 mmol.L-1
de DPPH• foi preparada. A microleitora foi calibrada
em uma absorbância de 515 nm utilizando o metanol como branco, e uma alíquota de 6 µL
do extrato, obtido anteriormente, foi adicionada a 234 µL da solução de DPPH• ajustada a
absorbância de 0,7±0,05. Após a mistura, a absorbância foi lida após 2 horas de reação
estabelecida em ensaios preliminares até a estabilização da absorbância. O padrão Trolox
56
foi utilizado para elaborar a curva de calibração com concentrações variando de 17 a 850
μmol.L-1
e a atividade antioxidante foi expressa em equivalente Trolox (μM Trolox/g s s.).
2.5.3 Ensaios de FRAP (Poder Antioxidante de Redução do Ferro)
A capacidade antioxidante das amostras estimada pelo ensaio de FRAP foi realizada
baseando-se na metodologia de Benzie and Strain (1996) com algumas modificações. O
reagente FRAP foi preparado na hora da análise com TPTZ, FeCl3 e um tampão acetato
utilizado como branco para calibrar espectrofotômetro a uma absorbância de 595 nm. Uma
mistura foi formada com uma alíquota de 7,35 μL do extrato, 220,6 µL do reagente FRAP e
22,6 μL de água destilada e permanecida em banho-maria a 37°C por 30 minutos antes da
leitura. O padrão Trolox foi utilizado para elaborar a curva de calibração com
concentrações variando de 17 a 850 μmol.L-1
e os resultados foram expressos em
equivalente Trolox (μM Trolox/g ss).
2.5.4 Ensaios de ORAC – Capacidade de Redução do Radical Oxigênio
Este método é baseado na capacidade fluorescente da fluoresceína sódica na
presença de radicais de oxigênio e foi realizado conforme a metodologia de Dávalos et al.
(2004). Primeiramente preparou-se uma solução de tampão fosfato (75 mmol.L-1
, pH 7,4)
que foi utilizada para solubilizar a fluoresceína e o AAPH (2,2'-azobis(2-metil-
propianamidina)dicloridrato). Para a análise, uma mistura de 120 µL de solução de
fluoresceína sódica, 20 µL de extrato e 60 µL de solução de AAPH foram adicionados à
57
microplaca e incubados a 37ºC. A leitura foi realizada em 520 nm de emissão e 485 nm de
excitação, através do decaimento da emissão de fluorescência em função do tempo até a
estabilização. O padrão Trolox foi utilizado para elaborar a curva de calibração com
concentrações variando de 35 a 220 μmol.L-1
e a atividade antioxidante foi expressa em
equivalente Trolox (μM Trolox/g s s.).
2.6 Atividade hemolítica
A atividade hemolítica foi realizada com eritrócitos nativos de sangue venoso
humano, coletados em tubos de vácuo contendo heparina sódica. Aproximadamente 2 mL
de sangue foram transferidos para microtubos e centrifugados a 1500 rpm a 4ºC. O plasma
foi descartado e os eritrócitos foram lavados 3 vezes com PBS (Tampão fosfato, pH 7,4)
estéril. Após a lavagem, preparou-se uma suspensão de 0,5% eritrócitos em PBS. Uma
alíquota de 200 µL de extrato (item 2.3.3) foi adicionada a 300 µL da suspensão de
eritrócitos e posteriormente incubada a 37ºC por uma hora em microplaca para cultura de
células de 48 poços sob agitação linear lenta. Após o período de incubação, a solução foi
transferida para microtubos de 1,5 mL e centrifugadas a 1500 rpm por 5 minutos à 4ºC. A
fase superior (200µL) foi transferida para microplacas de 96 poços, onde foi medida a
absorbância em um comprimento de onda de 540 nm. A atividade hemolítica foi expressa
em porcentagem de hemólise seguindo a equação abaixo.
% de Hemólise = (Absamostra - Absbranco)
Abscontrole - Absbranco x 100
58
Em que, Absamostra é a absorbância da amostra incubada com os eritrócitos, a Absbranco é a
absorbância do PBS incubado com os eritrócitos e a Abscontrole, referente à adição de uma
solução de 1% de SDS (Dodecil Sulfato de Sódio) incubado com os eritrócitos nas mesmas
condições experimentais (Dresch et al. 2005).
2.7 Análise estatística
Todos os experimentos foram realizados em triplicata e os resultados foram
apresentados como a média e seu desvio padrão (DP). Análises de Variância (ANOVA)
foram aplicadas juntamente com o teste de Tukey para identificar se há diferença
significativa entre as médias, usando um software estatístico (Statistica® versão 8.0, EUA).
Diferenças entre as médias no nível de 5% (p≤0,05) foram consideradas significantes. A
Análise de Componentes Principais foi aplicada de forma exploratória, para avaliar
possíveis relações entre amostras de diferentes lotes e regiões do país, bem como a
influência da adição do extrato aquoso liofilizado da semente à polpa sobre o teor de
fenólicos totais e capacidade antioxidante, utilizando o software Pirouette 3.11 (Infometrix,
EUA).
.
59
3. Resultados e Discussão
3.1 Compostos fenólicos totais
O teor de compostos fenólicos do tamarindo em forma de polpa, semente, extrato
aquoso da semente liofilizada e da mistura de extrato e polpa liofilizados podem ser
encontrados na Tabela 1. Nota-se que o extrato aquoso da semente e a semente detiveram
os maiores teores de compostos fenólicos totais dentre as amostras analisadas e à medida
que se aumentou a concentração do extrato aquoso na polpa o teor de fenólicos foi
diretamente acrescido. A polpa teve os menores teores de fenólicos mesmo variando de
região ou ano de colheita.
Em se tratando da polpa, pode-se observar que a região de origem influenciou
significativamente no teor de fenólicos, sendo que a polpa oriunda do estado da Bahia (BA)
apresentou a maior concentração independente do lote, com 21,73±0,22 mgAG/gs.s. para o
lote 1 e 21,35±0,40 mgAG/gs.s. não identificando diferença significativa entre os anos de
colheita. Por outro lado, a polpa do fruto adquirido dos estados de São Paulo e Minas
Gerais apresentaram diferenças dependentes dos anos de colheita. Para PSP lote 1, por
exemplo, o teor de fenólicos totais foi maior (11,49±0,22 mgAG/gs.s.) do que a polpa do lote
2, que teve aproximadamente, 9,14±0,17 mgAG/gs.s. A mesma situação se repetiu para a
polpa do fruto adquirido no estado de Minas Gerais.
60
Tabela 1. Composição de compostos fenólicos totais para a polpa, semente, extrato aquoso
da semente e mix liofilizado de Tamarindo de diferentes estados do Brasil.
Amostras FT (mgAG/gs.s.)
***
Lote 1 Lote 2 Média
PMG**
7,63±0,25cA*
6,94±0,19cB
7,28±0,43c
PSP 11,49±0,22bA
9,14±0,17bB
10,32±1,30c
PBA 21,73±0,22aA
21,35±0,40aA
21,54±0,36a
SMG 281,09±11,09cA
281,29±10,28cA
276,19±9,57c
SSP 326,53±13,05bA
330,20±9,60bA
328,37±10,44b
SBA 359,39±8,56aA
365,16±7,73aA
362,27±7,95a
EMG 346,37±0,25cB*
368,45±4,27cA
357,41±13,35c
ESP 424,83±12,74bA
433,84±0,22bA
429,34±11,65b
EBA 464,73±7,22aA
475, 03±9,08aA
470,02±9,35a
MG [1] 12,28±1,16fA
11,82±1,65fA
12,05±1,29f
MG [2] 26,44±0,86eA
26,07±1,26eA
26,25±0,98e
MG [3] 41,59±2,10cA
40,81±1,94cA
41,20±1,86c
SP [1] 17,58±1,65fA*
13,94±1,57fA
15,76±2,46f
SP [2] 33,40±2,77dA
33,75±2,05dA
33,57±2,19d
SP [3] 53,01±1,99bA
50,68±2,52bA
51,85±2,40b
BA [1] 28,49±2,50deA
25,74±2,21eA
27,12±2,59de
BA [2] 46,18±2,76cA
47,58±1,51bA
46,88±2,13c
BA [3] 63,54±3,33aA
66,08±1,13aA
64,81±2,63a
*Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na linha não representa diferença
significativa entre si a p<0,05 pelo teste de Tukey. **
P – polpa; S – semente; E - extrato aquoso; MG – Minas
Gerais; SP – São Paulo; BA – Bahia. Concentração de extrato aquoso na polpa: [1] – 0,3%, [2] – 1,15% e
[3] – 2,0%. ***
FT – Fenólicos Totais; AG – Ácido Gálico. n=3.
Para o teor de compostos fenólicos da semente a mesma sequência se repetiu, com a
maior concentração encontrada para as amostras oriundas do estado da Bahia, com
aproximadamente, 359,39±8,56 e 365,16±7,73 mgAG/gs.s. para os lotes 1 e 2,
respectivamente, seguida pelas amostras dos estados de São Paulo e posteriormente Minas
61
Gerais, não apresentando diferença significativa entre si. O extrato aquoso da semente de
tamarindo foi superior às demais amostras em relação ao teor de fenólicos, uma vez que ele
está sendo produzido com o intuito de enriquecer outros tipos de alimentos, inclusive a
polpa do próprio fruto, que apresentou baixo conteúdo de fenólicos. A ordem de grandeza
dos extratos se repetiu da mesma forma que os encontrados para semente e polpa, em que o
extrato elaborado em média com a semente oriunda da Bahia (470,02±9,35 mgAG/gs.s.) se
despontou das demais, seguido pelo extrato da semente de São Paulo e Minas Gerais com,
aproximadamente, 429,34±11,65 e 357,41±13,35 mgAG/gs.s. As misturas obtidas da junção
da polpa com o extrato da semente liofilizado tiveram aumentos significativos no teor de
fenólicos totais para todos os níveis de concentração adicionadas. Quanto maior a
concentração de extrato aquoso adicionado, maior foi o teor de fenólico obtido. Dentre os
tratamentos, destaca-se o mix dos frutos originados da Bahia que tiveram os maiores
resultados. O tratamento BA [2] que possui o segundo nível de adição de extrato aquoso à
polpa foi significativamente igual à MG [3] que possui a maior concentração de extrato do
estado de Minas Gerais, com 46,88±2,13 e 41,20±1,86 mgAG/gs.s, respectivamente. Sendo
assim, fica evidente que o teor de fenólicos pode variar de região para região de origem,
devido às mudanças no clima, principalmente em relação à incidência solar e índices
pluviométricos. Para o tratamento em que se adicionou 0,3% de extrato à polpa, os
aumentos, em média, ocorreram em uma taxa de 60%, 50%, e 28% para os estados de MG,
SP e BA, respectivamente, em relação à polpa in natura. Já para o segundo nível, com
adição de 1,15% do extrato à polpa, os aumentos em porcentagem média dos dois lotes
ficaram em torno de 260%, 265% e 117% para MG, SP e BA, respectivamente. E para o
terceiro nível, os aumentos foram de 465%, 400% e 200% para os estados de MG, SP e
62
BA, respectivamente. Observando os resultados das misturas, não houve diferença
significativa para o teor de compostos fenólicos totais com a variação do ano de colheita.
Alguns trabalhos relataram valores inferiores para os frutos de tamarindo do Brasil em
relação ao teor de compostos fenólicos totais extraídos da polpa, com valor de 3,35±0,02
mgAG/gs.s. (Tril et al. 2014) e para semente teores de 272±18,2 mgAG/gs.s. (Razali et al.
2012), utilizando metanol como solvente extrator.
O conteúdo de fenólicos dos vegetais está diretamente relacionado à sua capacidade
antioxidante, uma vez que a maioria destes compostos desempenha um papel importante na
neutralização ou sequestro de radicais livres e quelação de metais de transição, gerando
intermediários estáveis devido à ressonância do anel aromático presente na estrutura destas
substâncias (Naczk and Shahidi, 2004, Sousa et al. 2007).
3.2 Capacidade antioxidante
Atualmente, a capacidade antioxidante de materiais biológicos vem sendo estudada
com grande atenção, em que na maioria das pesquisas encontradas utiliza-se de dois ou
mais métodos químicos in vitro, com o objetivo de simular reações de inibição de radicais
responsáveis pela oxidação, através de possíveis antioxidantes presentes nas amostras
(Zulueta et al. 2009; Wang et al. 2010; Rufino et al. 2010; Souza et al. 2015). O grau de
capacidade antioxidante de materiais vegetais pode variar muito, atingindo grandes
discrepâncias devido a vários fatores, inclusive às propriedades dos substratos, condições e
estágios de oxidação, localização dos antioxidantes nas diferentes fases do processo de
oxidação, mesmo se o fruto for colhido da mesma planta e em épocas diferentes (Frankel
63
and Meyer, 2000; Wang et al. 2012). Em razão disto, os resultados para capacidade
antioxidante do tamarindo encontrados na Tabela 2 seguiram a mesma linha, mostrando
que o ano de colheita não implica necessariamente na igualdade dos resultados para frutos
de mesma origem. Observa-se de forma geral que as polpas apresentaram os menores
valores de capacidade antioxidante ao ser comparada com o restante das amostras,
independente do método utilizado. Dentre elas, a amostra originária da Bahia se destacou
alcançando os maiores valores. No entanto, apenas para o método ABTS, o segundo lote
PBA foi significativamente igual à polpa originária de São Paulo, com 29,2 e 25,3
mMTrolox/gs.s., respectivamente. As polpas PSP detiveram a segunda maior capacidade
antioxidante entre os estados, chegando a níveis de 125,4 mMTrolox/gs.s. pelo método ORAC.
Porém, nos ensaios de DPPH estas apresentaram menores desempenhos, também abaixo
das obtidas pelas amostras PMG com potencial variando de 26 mMTrolox/gs.s para o lote1 e
16,9 mMTrolox/gs.s para o lote 2. O método do DPPH é uma forma que se tem para sequestrar
radicais livres específicos, neste caso o próprio DPPH• como radical, se tratando assim de
uma estratégia predominante para identificar a atividade antioxidante dentre os ensaios in
vitro (Sascha et al. 2014). Possivelmente por estas razões, explica-se a igualdade
significativa (p<0,05) obtida entre as amostras PMG e PSP para o Lote 1 nos ensaios de
redução do ferro (FRAP). Ambas tiveram, aproximadamente, 12 mMTrolox/gs.s. de
capacidade antioxidante, representando um potencial 3 vezes menor que o conteúdo
encontrado para PBA, de 40,2 mMTrolox/gs.s. Em comparação aos outros métodos, o FRAP
respondeu com similaridade ao ABTS para PMG, apresentando valores inferiores. Por
outro lado, ao avaliar a PBA, o método também respondeu em conformidade com o DPPH
para ambos os lotes. A mesma relação foi encontrada por Liu et al. (2013) ao estudar a
64
capacidade antioxidante da manga. Para que os compostos presentes no FRAP tenham uma
melhor capacidade para ser relacionado como agente antioxidante, eles devem
necessariamente possuir um potencial padrão de reação para reduzir do Fe3+
para Fe2+
, o
que limita o método de abranger a classe de compostos que possuem capacidade
antioxidante e não são englobadas no método (Benzie and Strain 1999). Esta pode ser uma
possibilidade para os baixos resultados encontrados para a polpa de tamarindo pelos ensaios
de FRAP em comparação com outros métodos. As análises realizadas utilizando o método
de ORAC apresentaram as maiores valores para a polpa entre os ensaios de antioxidante, na
mesma ordem de classificação entre os estados de origem (MG, SP e BA), não havendo
igualdade significativa entre eles. A polpa PBA obteve a melhor resposta ao método, com,
aproximadamente 196 e 186 mMTrolox/gs.s., para lote 1 e lote 2, respectivamente. Na
sequência, a amostra PSP, teve valores equivalentes a, aproximadamente, 118 mMTrolox/gs.s.
para o lote 1 e 125 mMTrolox/gs.s. para o lote 2. Já entre os lotes, apenas as polpas oriundas
do estado de MG (PMG), apresentaram diferença significativa (p<0,05) entre si, com 71,4
mMTrolox/gs.s. e 105,6 mMTrolox/gs.s., para lote 1 e lote 2, respectivamente.
Com relação à semente, como era de se esperar, os métodos responderam de forma
distintas, chamando a atenção para a similaridade nos valores encontrados para os ensaios
realizados com o ABTS e ORAC, que não se repetiu para a polpa. Nota-se que os
compostos presentes na semente reagiram bem aos mecanismos de sequestro do radical
DPPH• e em consequência apresentou os maiores resultados em equivalência ao ácido
gálico.
65
Tabela 2. Capacidade antioxidante em Equivalente Trolox (ET) da polpa, semente, extrato da semente e mix de Tamarindo oriundo de
diferentes estados do Brasil.
*Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na linha para cada classe de amostra não representa diferença significativa entre si
a p<0,05 pelo teste de Tukey. n=3. **
P – polpa; S – semente; E - extrato aquoso; MG – Minas Gerais; SP – São Paulo; BA – Bahia. Concentração de
extrato aquoso na polpa: [1] – 0,3%, [2] – 1,15% e [3] – 2,0%. n=3.
Amostra
ABTS
ET (mMTrolox/gs.s.)
DPPH
ET (mMTrolox/gs.s.)
FRAP
ET (mMTrolox/gs.s.)
ORAC
ET (mMTrolox/gs.s.)
Lote 1 Lote 2 Lote 1 Lote 2 Lote 1 Lote 2 Lote 1 Lote 2
PMG**
6,5±0,9cD
13,4±1,7cD
38,7±3,9aC
31,3±1,8aC
12,4±1,8bD
12,9±0,4cD
71,4±5,0cB
105,6±11,6cA
PSP 13,4±0,9bB
25,3±1,0bB
26,0±2,2bB
16,9±1,0cB
12,7±4,7bB
24,0±2,4bB
118,6±10,0bA
125,4±11,7bA
PBA 40,1±3,7aB
29,2±1,5bB
42,0±2,1aB
36,8±1,3aB
40,2±1,5aB
30,4±3,0aB
196,6±6,9aA
186,4±14,6aA
SMG 508,2±57,2bCD
613,4±41,3bBC
1299,0±65,8cA
1321,1±133,2bA
778,6±76,6bB
702,3±41,1bB
526,8±18,7bCD
561,7±31,6aC
SSP 597,2±37,4bC
862,6±70,2aB
1481,7±97,3bA
1614,0±15,8bA
905,6±106,4bB
938,5±19,9aB
885,9±76,6aB
976,3±64,2aB
SBA 991,5±69,1aBC
976,5±51,1aBC
2056,8±39,9aA
2311,4±204,7aA
1229,6±116,3aB
1068,0±7,6aBC
956,7±56,3aC
744,5±40,6bCD
EMG 1718,4±151,8cBC
2200,8±208,4cA
2008,8±17,4bAB
1917,5±211,2cAB
1673,2±275,4cBC
1245,0±28,6bC
1425,4±192,0bC
1662,3±88,2cBC
ESP 2127,5±186,8bAB
2531,6±106,4bAB
1927,2±187,7bBC
2577,8±247,2bA
1922,1±169,6bBC
1384,7±111,1bC
2619,1±358,8aA
2681,5±254,0aA
EBA 2988,6±75,8aAB
3003,8±154,0aAB
2636,4±161,0aBC
3444,4±459,0aA
2554,0±179,6aBC
1806,1±125,3aD
2736,9±243,5aBC
2241±157,4bCD
MG [1] 35,3±9,5gD
41,8±2,0gD
63,7±6,0dC
66,2±10,1eC
37,2±3,7eD
32,3±3,6fD
94,2±5,8eB
119,4±5,9fA
MG [2] 101,0±8,8deD
143,4±4,5eBC
155,7±102,3bcD
119,2±9,9dCD
94,1±7,1cdDE
69,4±5,9deE
154,7±12,6dB
196,4±12,6eA
MG [3] 153,8±38,7cCD
227,6±5,5cAB
192,1±12,2bABC
174,5±27,9cBCD
166,6±7,3bCD
122,7±10,1bD
204,2±13,7cdABC
251,3±30,0cdA
SP [1] 45,0±6,4fgBC
64,2±2,2fB
28,9±2,0eC
53,5±4,3eBC
36,0±4,9eBC
48,9±3,6efBC
163,7±28,5dA
173,5±15,1eA
SP [2] 138,7±4,8cdC
176,3±5,5dB
111,7±3,6cB
136,2±5,4cdB
110,1±8,4cCD
76,3±6,3cdD
242,0±27,7cA
264,5±14,3cA
SP [3] 215,9±7,2bCD
276,3±5,3bB
178,9±15,4bDE
247,4±11,4bBC
172,6±6,1bE
129,7±12,9bF
358,2±19,8bA
376,8±19,1aA
BA [1] 86,4±2,1efB
75,9±4,9fBC
46,5±1,5eD
39,1±3,0eD
78,7±9,4dBC
58,1±5,7deCD
235,2±11,8cA
215,7±14,7deA
BA [2] 209,1±2,5bB
179,6±4,5dBC
137,0±5,8cDE
174,0±14,6cBCD
154,5±10,2bCD
97,5±7,9cE
344,4±31,7bA
321,7±14,3bA
BA [3] 322,0±14,9aC
327,2±14,1aC
245,5±13,6aD
340,1±16,9aC
248,9±14,8aD
174,9±14,6aE
464,5±12,6aA
399,1±16,7aB
66
A diferença de grandeza dos resultados das sementes sobre a polpa no método
DPPH chegou a níveis médios de, aproximadamente 37, 71 e 55 vezes mais, para frutos
oriundos dos estados de MG, SP e BA, respectivamente. Isso representa em termos
percentuais, a uma diferença de, aproximadamente 3700, 7100 e 5500% a mais na ordem
de grandeza para a capacidade antioxidante da semente sobre a da polpa. Tais resultados
revelam o grande potencial antioxidante que a semente de tamarindo possui, mas que não é
aproveitado nas indústrias de beneficiamento do fruto. Levando em consideração a
comparação entre lotes em um método específico, observa-se que a amostra SBA apareceu
com as melhores respostas para a maioria deles, exceto o resultado obtido para o lote 2 na
análise de ORAC, seguido pela polpa de SP e de MG.
A elaboração e aplicação do extrato aquoso como forma de aproveitar melhor o
potencial bioativo de vegetais vêm sendo muito estudado em trabalhos científicos, visto que
extratos produzidos com a maioria dos solventes orgânicos podem apresentar toxicidade e
atribuir prejuízos à saúde do consumidor ou paciente (Adeneye et al. 2006; Ndiaye, et al.
2008; Prudência, et al. 2012; Dias et al. 2015). A determinação da capacidade antioxidante
do extrato aquoso da semente de tamarindo pode favorecer em um melhor aproveitamento
do fruto, visto que o produto pode apresentar um grande potencial a ser utilizado na
indústria de alimentos. Como mostra a Tabela 2, todos os extratos aquosos liofilizados
analisados apresentaram capacidade antioxidante superior à da semente. Isto indica o
quanto o processo de extração foi eficiente em migrar e concentrar os compostos bioativos
da semente para o extrato. O procedimento de extração utilizando a trituração com água e a
liofilização possibilitou a concentração dos compostos no pó resultante, com isso a relação
de compostos e peso do produto favoreceu no aumento da capacidade antioxidante final,
resultando em superioridade aos resultados obtidos da semente. A ordem de grandeza entre
67
a capacidade antioxidante dos extratos seguiu a mesma lógica da semente, sendo que as
amostras obtidas do estado da Bahia (EBA) tiveram as maiores respostas para quase todos
os métodos, exceto para os ensaios de ORAC, em que o lote 1 foi significativamente igual
ao extrato ESP com valores de 2736,9±243,5 e 2619,1±358,8 mMTrolox/gs.s.,
respectivamente. Por outro lado, o lote 2 da EBA (2241,2±157) teve capacidade inferior ao
ESP (2681,5±254,0), mostrando diferença significativa (p<0,05). A aplicação do extrato
aquoso da semente de tamarindo vem sendo muito estudado com sucesso na atualidade,
principalmente em ensaios in vivo envolvendo ratos, na tentativa de atribuir uma relação
com a redução de diabetes melittus nos animais (Maiti et al. 2004; Leite et al. 2007; De et
al. 2013), antibactericida e antifúngico (Elumalay et al. 2015) e no combate ao colesterol
alto (Martinello et al. 2006; Librandi et al. 2007).
As formulações compostas por polpa de tamarindo liofilizada e extrato aquoso da
semente de tamarindo liofilizado mostraram de forma geral que a adição de extrato aquoso
à polpa elevou de forma considerável a capacidade antioxidante da mistura (Tabela 2).
Pode-se notar que, na maioria das vezes, o aumento foi diretamente proporcional à
quantidade de extrato adicionado à polpa e que cada nível de concentração acrescido foi
significativamente diferente dos demais. Os outros métodos também tiveram aumentos
significativos na mesma faixa. Observa-se para o método ORAC, que os resultados foram
superiores aos demais métodos, devido à maior proporção de polpa das amostras como
visto maiores resultados quando se avaliou apenas a polpa in natura. No método FRAP, os
menores valores foram encontrados para o lote 1 da amostra SP [1] com teor de 28,9
mMTrolox/gs.s., seguida pela BA [1] com valor igual a 36,5 mMTrolox/gs.s.., sendo que tais
valores não tiveram diferenças significativas. O mesmo comportamento se repetiu para o
lote 2, com SP [1] apresentando valores de 53,5 mMTrolox/gs.s. e BA [1] de 39,1
68
mMTrolox/gs.s., também sem mostrar diferença significativa entre si (p<0,05). Não foram
encontrados trabalhos na literatura que relataram o uso de extrato aquoso da semente do
tamarindo para fins alimentícios.
Em relação à polpa, o crescimento foi substancial, indicando a eficiência no
enriquecimento do produto com compostos que conferem o poder antioxidante.
Considerando o método regido pelo radical ABTS•, pode-se notar que a adição da maior
concentração de extrato às polpas, obteve-se um resultado com aumento médio de 1910,
1300 e 937%, para as misturas de MG [3], SP [3] e BA [3], respectivamente, em relação às
polpas in natura. Os resultados de percentagem do aumento da capacidade antioxidante das
misturas em relação à polpa podem ser encontrados na Figura 1. A adição de extrato aquoso
liofilizado à polpa surtiu efeito direto no potencial antioxidante para todas as amostras de
tamarindo estudadas. Para a maioria destas, o aumento foi gradual à medida que se
acrescentou maiores concentrações, exceto para as misturas SP[2] e SP[3] que praticamente
não se alterou os níveis da capacidade antioxidante em resposta ao radical ABTS•. No
mesmo método, os aumentos da capacidade antioxidante em relação à polpa chegaram a
329, 1218 e 1942%, para MG[1], MG[2] e MG[3], respectivamente.
69
ABTS DPPH FRAP ORAC
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
2250
2500
Aum
ento
da
Cap
acid
ade
Anti
oxid
ante
(%
)
Métodos
MG[1]
MG[2]
MG[3]
SP[1]
SP[2]
SP[3]
BA[1]
BA[2]
BA[3]
Figura 1. Porcentagem de aumento médio da capacidade antioxidante para os lotes
das misturas de polpa e extrato da semente de tamarindo liofilizado em relação à polpa in
natura.
Os menores aumentos obtidos para o método ABTS foram atribuídos à SP [1] e BA
[1] com 194 e 137%, respectivamente, ainda assim, mostra ser um acréscimo considerável
(Figura 1). Para o método DPPH, a sequência de aumento na percentagem com a adição de
extrato foi proporcional, sendo que as maiores atividades foram obtidas com as maiores
concentrações. Da mesma forma, os menores acréscimos foram atribuídos às menores
quantidades de extrato aquoso adicionado para as misturas SP [1], MG [1] e BA [1], com
valores aproximados de 88, 113 e 8%, respectivamente. Os métodos FRAP e ORAC
seguiram a mesma lógica de proporcionalidade. No entanto, nota-se que a magnitude de
percentagem de aumento gerada pelo método ORAC é inferior aos demais. Isso pode ser
justificado pela afinidade dos compostos antioxidante da polpa em resposta ao método,
como já foi confirmado na Tabela 2. Assim, o aumento da capacidade antioxidante com a
adição do extrato aquoso não teve a mesma proporcionalidade que os outros métodos,
70
porém, o aumento ainda foi substancial, chegando a atingir 162, 201 e 125% para MG [3],
SP [3] e BA [3], respectivamente. A grande variação observada nos valores médios
percentuais dos aumentos da capacidade antioxidante das misturas pode ser atribuída à
diferença nas características dos frutos obtidos do mesmo lote e de épocas de colheita
diferentes, como já foi observada na classificação da Tabela 2.
De maneira geral, os dados dos ensaios para determinar a capacidade antioxidante
do fruto do tamarindo mostra que a semente possui um grande potencial bioativo e seu
extrato aquoso liofilizado consegue manter ou elevar os níveis desta propriedade na mistura
polpa e extrato aquoso liofilizado. Com relação às diferenças encontradas nos valores da
capacidade antioxidante dos frutos para cada estado de origem, pode-se supor que as
condições climáticas influenciaram de forma significativa nas características dos frutos,
como já foi relatado em outros trabalhos científicos (Gao et al. 2011; Teles et al. 2014).
Os coeficientes de correlação entre os métodos para determinar a capacidade
antioxidante das amostras de tamarindo estão apresentados na Tabela 3. Nota-se que as
maiores correlações foram obtidas para a correlação entre o método ABTS e ORAC
(0,963), seguido de ABTS e FRAP (0,941). Nestes casos, a correlação indica o quanto
houve de variação nos valores da capacidade antioxidante, sendo que na maioria das vezes
todos os potenciais eram acrescidos de forma geral quando se analisava matrizes com
maiores capacidades. Porém, ao se avaliar o extrato da semente, o método DPPH teve os
maiores resultados, enquanto que o ORAC apresentou os menores, isso justifica o menor
valor de correlação entre esses dois métodos (0,849). De forma geral, os métodos obtiveram
elevados valores de correlação além de exercerem relação positiva. Entretanto, alguns
trabalhos demonstram que não é possível comparar os diferentes métodos para determinar a
71
capacidade antioxidante, devido às diferentes reações químicas envolvidas nos mecanismos
de inibição de radicais específicos (Huang et al. 2005).
Tabela 3. Coeficientes de correlação (r) entre os métodos de determinação da capacidade
antioxidante da polpa, semente, extrato aquoso da semente e mix liofilizado de Tamarindo.
R ABTS DPPH FRAP ORAC FT
ABTS 1
DPPH 0,918 1
FRAP 0,941 0,920 1
ORAC 0,963 0,849 0,927 1
FT 0,899 0,978 0,936 0,854 1
Em razão da característica de sequestrar radicais específicos, cada método pode
responder de forma diferente à variedade de compostos que desempenham a função
antioxidante. Na maioria das vezes, o perfil de compostos fenólicos e outros antioxidantes
apresentado por cada amostra pode gerar resultados distintos em cada método específico
utilizando a mesma matriz (Liu et al. 2013). Essas variações nas respostas antioxidantes em
diferentes métodos de análises também foram encontradas em trabalhos com diversas
matrizes, como a manga (Mangifera indica L.) (Ribeiro et al. 2007), romã (Punica
granatum L.) (He et al. 2011), limão (Citrus limon) (Dahmoune et al. 2013), tamarindo
(Tamarindus indica) (Tril et al. 2014) e abacate (Persea americana Mill) (Souza et al.
2015). É importante observar nos resultados para capacidade antioxidante, que com a
mudança da matriz analisada, cada método respondeu de forma diferente. Como aconteceu,
por exemplo, nos ensaios de ORAC, as polpas tiveram respostas superiores aos outros
72
métodos para ambos os lotes, porém, quando a matriz foi alterada para semente, os demais
métodos responderam com maior magnitude, o que justifica a possibilidade de cada classe
de compostos reagirem a radicais específicos no processo de inibição.
A análise de componentes principais (PCA) foi aplicada para determinar possíveis
relações entre as amostras frente aos diferentes métodos utilizados para determinar a
capacidade antioxidante e teor de fenólicos totais. Os resultados estão apresentados na
Figura 2.
Figura 2. Gráficos de escores para componentes principais da capacidade antioxidante e
fenólicos totais da polpa, semente, extrato aquoso e mix de tamarindo. (A) PC para todas as
amostras; (B) PC para os métodos correlacionados com todas as amostras, (C) PC da polpa
e mix e (D) PC para os métodos relacionados a polpa e mix.
Por meio da análise de PC1 e PC2 (Figura 2A), foi possível observar que as duas
componentes explicaram 97,9% da variação observada, sendo que o PC1 elucidou 93,49%
A B
C D
73
da variação, promovendo a separação de 3 grandes grupos. O primeiro se refere a todas as
amostras que contém polpa em sua formulação, as quais tiveram menores capacidades
antioxidantes para todos os métodos. O segundo agrupa as sementes de todos os estados,
tanto para o lote 1 quanto para o lote 2, que apresentaram maiores valores de capacidade
antioxidante pelo método DPPH e FT. O terceiro grupo engloba todos os extratos aquosos
liofilizados obtidos das sementes de tamarindo, independente do lote ou estado de origem.
De forma geral, os grupos 2 e 3 se destacaram com capacidade antioxidante e teor
de fenólicos totais muito superiores à das amostras do grupo 1 para todos os métodos
estudados. Possivelmente, a grande diferença na magnitude dos valores de capacidade
antioxidante apresentadas pelas amostras do grupo 1 (polpa e mix), quando comparadas
com os outros grupos (semente e extrato liofilizado), foram fundamentais para promover a
separação.
Em virtude da não separação das amostras que possuem polpa em sua composição,
decidiu-se avaliar as amostras do grupo 1 de forma isolada (Figuras 2C e 2D), excluindo-se
as sementes e extratos aquosos liofilizados da análise. Com isso, observou-se que PC1 e
PC2 conseguiram explicar, aproximadamente, 96,18% das variações observadas, onde se se
notou uma tendência na separação das amostras em relação à adição gradual das
concentrações dos extratos da semente à polpa. Como observado, o enriquecimento da
polpa com extrato aquoso da semente liofilizado, influenciou diretamente no aumento da
capacidade antioxidante para todos os métodos estudados.
Ao aplicar a análise de componentes principais em diferentes métodos in vitro para
determinar a capacidade antioxidante de alguns compostos fenólicos, Hossain et al. (2011)
encontraram correlações significativas entre os métodos de DPPH, FRAP, ORAC e ABTS.
Muitos trabalhos vêm utilizando a PCA como ferramenta para correlacionar resultados
74
obtidos a partir dos métodos in vitro para determinar o potencial antioxidante de diversas
matrizes (Huang et al. 2009; Patras et al. 2011; Fernandes et al. 2013; Casoni and Sârbu,
2014).
3.3 Atividade hemolítica
A atividade hemolítica para avaliar a citotoxidade das amostras de tamarindo foi
analisada em células vermelhas do sangue humano em solução com PBS (Tampão fosfato,
pH 7,4) usando SDS como controle positivo. O estudo da citotoxidade de extratos de
vegetais é de fundamental importância como parâmetro preventivo, pois ainda que o extrato
possua grande potencial bioativo, a sua utilização na culinária ou medicina seria
prejudicada se houvesse a confirmação desses efeitos hemolíticos causados pela presença
de agentes tóxicos, principalmente as saponinas (Zubair et al. 2013). As percentagens de
lise causada nos eritrócitos do sangue humano estão apresentadas na Tabela 4.
75
Tabela 4. Atividade hemolítica em percentagem de hemólise causada pelo extrato da polpa e mix de polpa e extrato aquoso da
semente de Tamarindus indica em diferentes concentrações.
*Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na linha para cada classe de amostra não representa diferença significativa entre si
a p<0,05 pelo teste de Tukey. ** Concentração de extrato aquoso na polpa: [1] – 0,3%, [2] – 1,15% e [3] – 2,0%. n=3.
[ ]
(µg/mL)
LT
Hemólise (%)
PMG MG[1]**
MG[2] MG[3] PSP SP[1] SP[2] SP[3] PBA BA[1] BA[2] BA[3]
0,08
L1 1,7±0dC*
1,4±0cC
3,5±1cdC
0,7±0fC
8,0±4dAB
4,9±0deBC
1,1±0fC
2,6±0eC
1,0±0eC
9,7±1gA
4,1±1efBC
2,99±0dC
L2 1,4±0dCD
1,8±0bcCD
1,4±0efCD
1,2±0fCD
5,6±1dB
0,3±0eD
2,5±0fC
2,5±0eC
1,4±0eCD
7,7±1gA
1,4±0eCD
0,7±0dD
38,5
L1 2,1±0cdFG
1,3±0cFG
3,3±0cdeEF
5,2±0cDE
12,6±1dA
7,5±1deCD
5,2±1fDE
10,1±1deB
7,1±1deCD
0,7±0gG
13,5±1eA
7,9±1dBC
L2 1,5±0dEF
1,0±0c 1,7±0
defEF 4,6±0
cCDE 7,7±1
dC 15,6±1
dA 4,2±1
fDEF 15,8±1
deA 14,4±2
cdeAB 11,8±2
gB 11,6±1
eB 5,8±0
dCD
76,9
L1 2,4±0cdE
1,7±0bcE
4,8±0abcE
1,9±0defE
44,8±4bB
58,4±5cA
41,6±3eBC
21,0±2cdD
16,7±4cdD
46,4±2fB
35,6±3dC
41,9±4cBC
L2 1,7±0dE
1,1±0cE
1,0±0fE
1,6±0efE
12,3±2dD
55,9±5cA
56,8±4dA
30,3±3cBC
26,7±3cC
55,3±5efA
25,9±2dC
38,9±4cB
115,3
L1 6,4±1bF
3,5±2bcF
3,6±1cdF
3,4±0cdeF
93,4±3aA
78,3±6bB
59,5±5dCD
51,3±5bDE
66,7±6bBC
63,3±5deCD
46,8±4cE
46,7±6cE
L2 2,1±0cdF
1,5±0cF
5,6±0abF
2,3±0defF
24,6±1cE
65,3±6cAB
65,9±6dA
34,8±3cDE
53,1±6bBC
68,8±6cdA
46,8±4cCD
35,6±6cDE
153,7
L1 10,5±aC
2,9±1bcC
3,9±0bcC
14,6±2aC
94,0±6aA
81,7±5bA
85,3±4bA
65,1±4bB
92,3±5aA
89,1±8abA
67,8±6bB
64,7±5bB
L2 2,8±0cdE
1,8±0bcE
1,9±0defE
9,5±1bE
48,9±3D 74,4±8
bAB 75,7±4
cAB 59,3±8
bCD 83,3±3
aA 78,6±7
bcAB 70,2±7
bABC 69,3±7
bBC
192
L1 12,5±2aB
6,5±1aB
6,5±1aB
3,7±0cdB
93,0±2aA
96,2±3aA
97,7±2aA
89,5±8aA
89,5±7aA
98,5±1aA
97,0±2aA
95,6±4aA
L2 3,9±0cC
4,5±1abC
6,5±1aC
4,5±0cC
93,4±4aAB
89,7±8abAB
98,8±1aA
80,6±9aB
90,0±8aAB
98,0±2aA
98,4±1aA
89,6±7aAB
76
As polpas e mix liofilizado dos estados de São Paulo e Bahia tiveram os maiores
índices de hemólises para a maior concentrações da amostra na solução, chegando a 98,8%
de lise para SP [2] do lote 2 e 98,5% para BA [1] do lote 1. Já as amostras do estado de
Minas Gerais alcançaram no máximo 12% de lise das células para as maiores concentração
de amostra (192 µg/mL), caracterizando um índice bem inferior às amostras dos outros
estados. Para a menor concentração de estudo (0,08 µg/mL), a maioria das amostras
provocaram baixos índices de hemólise nas células, com maiores valores atribuídos para
BA [1] lote 1 e PSP lote 1, causando percentuais de lises de 9,7 e 8,0%, respectivamente.
Exceto para as amostras oriundas do estado de Minas Gerais, o percentual de hemólise sobe
substancialmente a partir da concentração de 76,9 µg/mL na solução, em alguns casos
chegando a ultrapassar 50% de células rompidas. Nesta faixa, SP [1] lote 1 e 2, SP [2] lote2
e BA [1] lote 2, provocaram os maiores percentuais de lise.
Também foi observado na Tabela 4, que à medida que se aumentou a concentração
de extrato aquoso liofilizado à polpa, o percentual de hemólise tendeu a se reduzir. Tal
efeito se torna mais nítido a partir da concentração de 76,9 ug/mL de amostra na solução
(Figura 3). O lote 1 de SP, por exemplo, a polpa sem adição de extrato (PSP) causa,
aproximadamente 44% de rompimento das células, enquanto que SP[1], SP[2] e SP[3]
seguem com 58, 41 e 21% de hemólise, resultados significativamente diferentes (p<0,05).
Para o lote 1 do mix da Bahia, a percentagem de lise teve um aumento significativo de PBA
para BA [1], seguido de um decréscimo para BA [2] e manutenção do valor em BA [3].
Nos ensaios em que a concentração de amostra na solução é de 153,7 ug/mL, este mesmo
comportamento é observado, porém com maior intensidade.
77
[0,08] [38,48] [76,88] [115,28] [153,68] [192]
0
20
40
60
80
100%
Hem
óli
se
(ug/mL)
PMGL1
PMGL2
PSPL1
PSPL2
PBAL1
PBAL2
A
[0,08] [38,48] [76,88] [115,28] [153,68] [192]
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
% H
emóli
se
(ug/mL)
MG[1]L1
MG[1]L2
MG[2]L1
MG[2]L2
MG[3]L1
MG[3]L2
B
[0,08] [38,48] [76,88] [115,28] [153,68] [192]
0
20
40
60
80
100
% H
emó
lise
(ug/mL)
SP[1]L1
SP[1]L2
SP[2]L1
SP[2]L2
SP[3]L1
SP[3]L2
C
[0,08] [38,48] [76,88] [115,28] [153,68] [192]
0
20
40
60
80
100
% H
emó
lise
(ug/mL)
BA[1]L1
BA[1]L2
BA[2]L1
BA[2]L2
BA[3]L1
BA[3]L2
D
Figura 3. Perfil de hemólise da polpa (A), mix de Minas Gerais (B), mix de São Paulo (C) e
mix da Bahia (D), em diferentes lotes e concentrações.
A atividade hemolítica para a semente e extrato da semente liofilizado não foi
registrada nos ensaios, pois a absorbância adquirida, independente da concentração, foi
inferior à absorbância do branco (eritrócitos + PBS). Sendo assim, após conversão, eram
obtidos valores negativos em percentagem. O fato pode ser atribuído à precipitação de
proteínas causada pelos taninos presentes nos extratos, uma vez que a semente de
tamarindo é muito rica nesses compostos e a parede celular dos eritrócitos é constituída boa
parcela de proteínas (Cazzola et al. 2011; Canon et al. 2014). Valores negativos para
percentagem de hemólise em células do sangue de coelho também foram registrados
utilizando extratos de Astragalus membranaceus (Yang et al. 2005).
78
4. Conclusão
Os frutos de tamarindo obtidos de diferentes regiões do Brasil apresentaram
distintos comportamentos em relação aos métodos in vitro para determinação da capacidade
antioxidante, bem como, grandes variações foram observadas quando os frutos foram
colhidos em anos diferentes. A polpa apresentou baixa capacidade antioxidante em relação
à semente e ao extrato aquoso liofilizado, porém, quando adicionado diferentes
concentrações do extrato, o potencial da mistura foi acrescido significativamente. Isto
mostra a importância de se aproveitar de forma mais eficiente os compostos bioativos
presentes na semente podendo ser aplicado também em outros tipos de produtos
alimentícios.
A polpa mostrou possuir ação hemolítica à medida que se aumentou a sua
concentração na presença de eritrócitos humanos. No entanto, por se tratar de um fruto
tradicionalmente consumido em diversas regiões do mundo, sua ação hemolítica não deve
ter relação citotóxica como apresentado por saponinas de algumas plantas. Por outro lado, a
ação hemolítica da semente e extrato aquoso liofilizado não foi observada, dando indício de
que a mistura contendo polpa e extrato aquoso liofilizado pode ser consumido.
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87
CAPÍTULO IV
PERFIL QUANTITATIVO DE TOCOFERÓIS E ÁCIDOS GRAXOS DO ÓLEO
OBTIDO DA SEMENTE DE TAMARINDO (Tamarindus indica L.)
PROVENIENTES DE DIFERENTES ESTADOS DO BRASIL
Danilo Santos Souzaa, Cristiano Augusto Ballus
a, Wellington da Silva Oliveira
a, Helena
Teixeira Godoya
a Departamendo de Ciência de Alimentos – FEA, Universidade Estadual de Campinas,
Brasil.
* Autor para correspondência: Rua Monteiro Lobato, 80, Lab Análise, FEA-DCA, CEP:
13083-862, Cidade Universitária, Campinas-SP.
E-mail: danilosantos_souza@yahoo.com.br (Souza, D. S.).
Manuscrito em preparo para ser submetido ao periódico Food Research International
88
RESUMO
Apesar de possuir grande potencial para aproveitamento industrial a semente de tamarindo
ainda é pouco reaproveitada nas indústrias. O objetivo do trabalho foi adaptar e validar um
método para quantificação de tocoferóis, bem como quantificar tocoferóis e ácidos graxos
do óleo da semente de tamarindo colhido em 3 diferentes regiões do Brasil (Minas gerais,
São Paulo e Bahia), das safras de 2012 e 2013. Utilizou-se o método de Bligh-Dyer para
obtenção do óleo da semente. Para análises de tocoferóis (HPLC-FL), cerca de 0,1 g do
óleo foi diluído em 2 mL de n-hexano e injetado em sistema isocrático. O método foi
validado de acordo à precisão, linearidade e recuperação dos padrões de α, β, γ, δ-tocoferol.
Para α e γ-tocoferol, o lote 2 de Minas Gerais apresentou os maiores valores com, 25,5 e
31,1 mg.kg-1 s.s., respectivamente. O menor conteúdo foi encontrado no lote 2 de São
Paulo com, aproximadamente, 16,4 mg.kg-1s.s. Os ácidos graxos do óleo da semente de
tamarindo foram quantificados em GC-FID e confirmados em GC/MS, após esterificação
das amostras. Dez diferentes ésteres metílicos de ácidos graxos do óleo da semente foram
quantificados por padronização interna e 9 confirmados. O ácido linoleico (18:1n-6, cis)
apresentou as maiores concentrações, variando de 145 até 270 mg.g-1
s.s., seguido pelo ácido
oleico que variou de 31 a 83 mg.g-1
s.s. A variação nos resultados mostraram que a origem
dos frutos e os fatores climáticos do local de produção têm grande influências na
composição de tocoferóis e ácidos graxos do óleo da semente de tamarindo.
Palavras chave: Fração lipídica, HPLC, GC-FID, GC-MS, óleo de semente.
89
1. Introdução
Atualmente, um dos principais problemas encontrados pelas agroindústrias em todo
mundo é o destino e tratamento da grande quantidade de resíduos gerados após o
processamento da matéria-prima (Lutterodt, Slavin, Whent, Turner & Yu, 2011). O
acúmulo destes resíduos na natureza gera perda de recursos e principalmente favorece a
degradação ambiental (Domínguez-Bocanegra, Torres-Muñoz & López, 2014). O Brasil é
um dos maiores produtores mundiais de frutos tropicais, em consequência disto, se tornou
um grande polo de processamento destas matérias-primas, que por sua vez gera toneladas
de resíduos agroindustriais diariamente (Silva & Jorge, 2014). O tratamento destes resíduos
para minimizar os impactos ambientais caracteriza perdas consideráveis no rendimento da
empresa e na maioria das vezes a matéria-prima é subutilizada resultando em desperdício
de boa parcela do seu potencial nutricional e industrial (Schieber, Stintzing & Carle, 2001).
O emprego de resíduos na elaboração de biocombustível, aproveitamento de nutrientes,
elaboração de novos produtos, fertilizantes, compostagem e alimentação animal vem sendo
utilizado frequentemente como forma de minimizar as perdas e reduzir os impactos
causados pelas agroindústrias (Lario, Sendra, García-Pérez, Fuentes, Sayas-Barberá,
Fernández-López & Pérez-Alvarez, 2004; Ruiz, Silva, Ruzene, Lima, Vicente & Teixeira,
2012; Crizel, Jablonski, Rios, Rech & Flôres, 2013). Sendo assim, surge a necessidade de
caracterizar a composição dos resíduos (bagaço, cascas e sementes) gerados pelas indústrias
de suco e celulose para direcionar na melhor forma de aproveitamento, até mesmo serem
incorporados na dieta humana (Silva & Jorge, 2014).
90
O Tamarindus indica é pertencente à subfamília das Caesalpiniodeae que por sua
vez pertence à família das Leguminosae (Fabaceae). É uma árvore nativa da África, porém
se desenvolve naturalmente em regiões tropicais e subtropicais do mundo (Siddhuraju,
2007). O tamarindo é bem adaptado ao território brasileiro sendo produzido em todas as
regiões do país, porém, é pouco explorado e boa parte da sua produção é destinada ao
consumo interno (Brasil, 2007). A polpa do fruto possui sabor ácido-doce e é muito
utilizado na fabricação de néctares, sorvetes, pastas, doces, licores, geleias e também como
ingrediente em condimentos e molhos (Pereira, Melo, Frazão & Alves, 2004). As sementes,
envolvidas pela polpa, representam a maior porção do fruto, chegando a 40% do seu peso
total. Por possuir em sua composição compostos bioativos, como tocoferóis, ácidos graxos
insaturados e compostos fenólicos são atribuídos atividades antioxidantes, antihepatotóxica,
anti-inflamatória, antimutagênica, antidiabética e antiaterosclerose são muito utilizadas
como fitoterápicos (Maiti, Jana, Das & Ghosh, 2004). O óleo presente na semente (14%) é
composto em maior parcela por ácido linoleico (18:2 n-6), seguido do ácido oleico (18:1 n-
9) e ácido palmítico (16:0) (Ajayi, Oderinde, Kajogbola & Uponi, 2006). O ácido linoleico
é caracterizado como um ácido graxo poli-insaturado de grande qualidade para qualidade
de alimentos industrializados (Luzia & Jorge, 2011). Pesquisas relacionam o uso do ácido
linoleico à prevenção de doenças, principalmente relacionadas à inibição do processo
cancerígeno (Ip, Singh, Thompson & Scimeca 1994; Yang, Holcroft, Glickman & Boer,
2003). Além de ácidos graxos, a semente também possui grande quantidade de tocoferóis
em sua fração lipídica que confere potencial antioxidante ao fruto (Tsuda, Watanabe,
Ohshima, Yamamoto, Kawakishi & Osawa 1994). Os tocoferóis são classificados como os
mais importantes antioxidantes naturais para produtos alimentícios e estão presentes, na
91
maioria das vezes, em vegetais e seus subprodutos (Górnas, 2015). Existem quatro
isômeros (α-, β-, γ-e δ-tocoferol) diretamente relacionados com a vitamina E, porém, o α-
tocoferol desempenha maior atividade biológica, que por sua vez é muito importante na
dieta humana. (Eitenmiller & Lee, 2004; Karmowski, Hintze, Kschonsek, Killenberg, &
Bohm, 2015). A atividade antioxidante dos tocoferóis se dá principalmente pela sua
capacidade em doar átomos de hidrogênio aos radicais livres lipídicos, fazendo com que a
propagação da oxidação em cadeia seja interrompida (Szymanska & Kruk, 2008).
Atualmente, já são encontrados tocoferóis sintetizados e a sua principal função na indústria
é a de proteger os ácidos graxos poli-insaturados contra oxidação (Ramalho & Jorge, 2006;
Zarrouk, Carrasco-Pancorbo, Zarrouk, Segura-Carretero & Fernández-Gutiérrez, 2009).
Segundo Burton (1994), devido às suas funções de agir como potente antioxidante a nível
molecular acredita-se que os tocoferóis reduzem o risco de doenças cardiovasculares e
certos tipos de câncer. A polpa de tamarindo juntamente com a semente, é usada pela
indústria na prevenção de rancidez (peroxidação de lipídeos), com o objetivo de aumentar a
vida de prateleira de óleo de amendoim e óleo de coco (Siddhuraju, 2007).
Apesar de possuir grande potencial para aproveitamento industrial com alto teor em
matéria graxa e compostos bioativos na fração lipídica, a semente de tamarindo ainda é
pouco reaproveitada após processamento da matéria-prima nas indústrias, tornando seu
potencial subutilizado. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi adaptar e validar um
método para quantificação de tocoferóis, bem como quantificar tocoferóis e ácidos graxos
da semente de tamarindo colhido em 3 diferentes regiões do Brasil, em dois períodos, bem
como avaliar a influência do local de produção do fruto e o seu valor em matéria graxa para
futuramente favorecer novas alternativas de aplicação industrial.
92
2. Material e Métodos
2.1 Reagentes e padrões
Foram utilizados os reagentes metanol p.a (Synth, Brasil), clorofórmio p.a (Synth,
Brasil), sulfato de sódio monobásico p.a (Êxodo, Brasil), hidróxido de sódio (Synth,
Brasil), trifluoreto de boro (Merck, Alemanha), hexano grau HPLC (Macron, EUA),
isopropanol grau HPLC (J.T. Baker, EUA), ácido acético grau HPLC (J.T. Baker, EUA) e
os padrões de tocoferóis – α, β, γ e δ (Supelco, EUA), ésteres metílicos do C4 ao C24
(FAME Mix, Supelco, EUA) e ácido tricosanoico – 23:0 (Supelco, EUA).
2.2 Obtenção e preparo da matéria-prima
Os frutos de tamarindo foram adquiridos dos estados de Minas Gerais, São Paulo e
Bahia, das cidades de Patos de Minas (18° 34' S e 46° 31' O), Campinas (22º 49' 3'' S e 47°
4' 11" W) e Tanhaçu (14° 1' 11'' S e 41° 14' 7'' O), respectivamente, nos anos de 2012 e
2013. Todas as amostras foram colhidas no período de setembro (entre inverno e
primavera) dos respectivos anos. Após a aquisição, foram descascados e a polpa juntamente
com a semente ficou de molho por 24 h para hidratação e facilitar a separação.
Posteriormente, a mistura foi pulsada em liquidificador industrial (modelo AR 2 L,
Colombo®, 800 W e 60 Hz) e filtrada em peneira comum para separar a polpa da semente.
As sementes foram liofilizadas, parte das amostras foi submetida à análise de umidade em
estufa a 105ºC e a outra parte foi triturada em moinho analítico modelo Q-298A (Quimis,
Brasil) e, então submetidas à análise de extração de lipídeos.
93
2.3 Procedimentos de extração
2.3.1 Lipídeos por Bligh-Dyer
A extração de lipídeos pela metodologia de Bligh & Dyer (1959) é uma das mais
versáteis e efetivas. Utiliza-se uma mistura ternária de água, metanol e clorofórmio que tem
a capacidade de extrair tanto os lipídeos neutros quanto os lipídeos polares de forma
eficiente. É um método de extração a frio caracterizado por não causar danos à qualidade da
matéria graxa extraída (Brum, Arruda & Regitano-D‘Arce, 2009). Aproximadamente, 1 g
de amostra foi pesada em tubo de ensaio com tampa. Foi adicionado 5 mL de clorofórmio,
10 mL de metanol e 4 mL de água, formando uma proporção de 1:2:0,8, respectivamente.
Os tubos foram agitados por 15 minutos e posteriormente foi adicionado 5 mL de
clorofórmio e 5 mL de solução aquosa de sulfato de sódio (1,5%). Os tubos foram
novamente agitados por 2 min e centrifugados a 3000 rpm por 5 minutos a 4ºC. O
sobrenadante foi descartado e a fase inferior foi filtrada em papel tipo Whatman nº1, com
aproximadamente, 1 g de Na2SO4 anidro. O filtrado foi evaporado até a secura com N2. O
óleo obtido foi armazenado a -18ºC até o momento da análise.
2.3.2 Ésteres metílicos de ácidos graxos
Inicialmente, 1 mg.mL-1
do padrão interno ácido tricosanoico (23:0) foi adicionado
aos tubos de ensaio e concentrados com H2. Posteriormente, cerca de 25 mg de óleo
extraído da semente foi pesado em tubos de ensaio com tampa e adicionados 4 mL de
94
NaOH 0,5 mol L-1
em solução com metanol. Os tubos foram aquecidos em banho a uma
temperatura de 100ºC por 10 minutos. Posteriormente foram adicionados aos tubos, 3 mL
de BF3 12% em solução com metanol e levados novamente ao aquecimento por 5 minutos.
Depois de resfriados à temperatura ambiente, 4 mL de uma solução saturada de NaCl foi
adicionada no tubo sob agitação. Depois, 4 mL de hexano foi adicionado e submeteu toda a
mistura a agitação vigorosa em vórtex. Os tubos foram repousados até a obtenção da
separação de fases. A fase superior foi recolhida e o resíduo foi lavado com 2 mL de
hexano por 3 vezes. As fases recolhidas foram misturadas e concentradas até a secura em
evaporador rotativo e ressuspendida em 2 mL de hexano. O extrato foi armazenado a -18ºC
até o momento da análise. Todo o experimento foi preparado em triplicata (n = 3). O
procedimento foi uma adaptação do método proposto por Joseph & Ackman (1992).
2.3.3 Tocoferóis
Para análise de tocoferóis, foi aplicada a metodologia utilizada nos trabalhos de
Dionisi, Prodoiliet, Tagliaferri (1995) e Pinheiro-Sant‘anna, Guinazi, Oliveira, Lucia, Reis,
& Brandão (2011). Aproximadamente 20 mg de óleo obtido da semente de tamarindo foi
diluído em 2 mL de hexano contendo 0,01% de BHT. A solução foi filtrada em membrana
PVDF de 0,22 µm (Millipore, USA) e injetada diretamente em coluna no sistema de
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC). Todos extratos foram preparados em
triplicata (n = 3).
95
2.4 Métodos de separação
2.4.1 Ésteres metílicos de ácidos graxos
2.4.1.1 Identificação e quantificação por GC-FID
Um cromatógrafo a gás modelo 7890A (Agilent, Alemanha) equipado com detector
por ionização em chama (FID), com injetor tipo split/splitless no modo split (1:50) e uma
coluna capilar de sílica fundida com 50% de cianopropil metil polisiloxano modificado (60
m de comprimento x 0,25 mm de diâmetro interno x 0,25 µm de espessura do filme) (Part
number: 122-2362, Agilent, Alemanha) foram usados para determinação de ésteres
metílicos de ácidos graxos (FAMEs). Os parâmetros otimizados foram: temperatura do
injetor (250ºC); temperatura do detector (280ºC); H2 como gás de arraste, taxa de fluxo de
1,0 mL min-1
; taxa do fluxo de gás no detector (H2:N2:ar sintético – 30:30:300 mL min-1
);
programação da temperatura do forno inicialmente de 50ºC por 1 min, aquecendo para
175ºC a uma taxa de 25ºC min-1
e posteriormente aumentando para 230ºC a uma taxa de
4ºC min-1
, totalizando 35,5 min de corrida. A identificação dos compostos foi feita por
comparação dos tempos de retenção dos padrões com os tempos de retenção dos compostos
encontrados nas amostras, nas mesmas condições de separação.
Para quantificação dos ácidos graxos, foi utilizado o método da padronização
interna com um padrão de ácido tricosanoico (23:0) (Sigma, USA) de acordo com a
metodologia de Joseph & Ackman (1992). Para determinação das concentrações de cada
éster metílico, foram utilizados os valores médios do fator de correção experimental (FCE)
96
para o detector por ionização em chamas (FID) a partir de 10 injeções dos padrões de
ácidos graxos FAME mix C4-C24, Supelco - Alemanha, (Sigma-Aldrich, USA)
(Visentainer, 2012). O fator de correção experimental foi calculado de acordo a Equação 1.
FCE = A . Mx
Mp . Ax
(1)
Em que: Ap = área do padrão interno; Mp = massa do padrão interno; Ax = área do éster
metílico de ácido graxo; Mx = massa do éster metílico de ácido graxo.
O teor de ácidos graxos (AG) foi calculado em mg.g-1
de lipídeos totais pela
Equação 2 e convertidos em sólidos secos (mg g-1
s.s.) da semente.
AG = Ax . Mp . FCE
Ap . Mx . FCAE
(2)
Em que: AG = concentração de ácidos graxos (mg.g-1
) de lipídeos totais; Ax = área
do pico para cada composto; Ap = área do pico do padrão interno (C:23); Mp = massa do
padrão interno (C:23) e mg; Mx = massa do óleo (mg); FCE = fator de correção experimental
e FCAE é o fator de conversão éster metílico para ácido graxo.
2.4.1.2 Identificação por GC-MS
Os ésteres metílicos de ácidos graxos foram identificados em cromatógrafo a gás
(GC) 7890A (Agilent, Alemanha) acoplado a um detector de massas (MS) com analisador
de m/z o quadrupolo e impacto de elétrons (EI) como fonte de ionização. Para separação
dos ésteres, utilizou-se uma coluna HP-5 (Agilent, Alemanha) de 30 m de comprimento x
97
0,32 mm com fase estacionária de 0,50 µm de espessura do filme. Os ésteres (1 µL) das
amostras foram injetados em modo split (1:45) à 250ºC no injetor com temperatura inicial
do forno em 50ºC aquecendo a uma taxa de 1ºC/min até atingir uma temperatura de 110ºC.
Posteriormente, aumentou-se a taxa para 3ºC/min até uma temperatura de 310ºC, mantendo
por 3 min, totalizando uma corrida de 129,67 minutos. O fluxo do gás de arraste (He) foi
ajustado para 0,5 mL/min.
O fluxo de saída da coluna do GC para o espectrômetro de massas foi ajustado a
uma temperatura de 250ºC. A fonte de ionização por elétrons (EI) do MS foi ajustada a 70
eV em uma temperatura de 200ºC. O sistema quadrupolo foi operado a uma temperatura de
150ºC no modo scan, em que se monitoraram todos os íons gerados pela fonte EI com
intervalo entre 50 e 500 m/z. O equipamento GC-MS foi acoplado a um PC com software
ChemStation® (USA), utilizado para aquisição e processamento dos dados. A identificação
dos ésteres metílicos de ácidos graxos foi realizada por tentativa em comparação com os
espectros da biblioteca virtual NIST® versão 2011
e de forma positiva na comparação de
espectros com os de padrões analíticos injetados.
2.4.2 Tocoferóis
A separação dos tocoferóis foi possível usando um HPLC Agilent 1100 (Agilent
Technologies, Germany) acoplado a um detector de fluorescência, um sistema de bomba
quaternária, injetor automático e um forno para controle de temperatura da coluna. As
condições do método foram baseadas nos trabalhos de Pinheiro-Sant‘anna, Guinazi,
Oliveira, Lucia, Reis, & Brandão (2011). Um coluna de fase normal com dimensões de 150
98
mm x 4,6 mm x 3,0 µm (Hypersil Silica, Thermo, Germany) foi utilizada. A fase móvel
consistia em um sistema isocrático composto de hexano:isopropanol:acido acético
(98,9:0,6:0,5) com uma vazão de 1,0 mL.min-1
. A temperatura foi mantida a 30ºC, e o
volume de injeção foi de 100 µL. O detector de fluorescência foi ajustado em λex 290 nm e
λem 330 nm. Os compostos foram identificados por comparação com o tempo de retenção
dos compostos encontrados em amostra e padrões de tocoferóis separados nas mesmas
condições. As amostras foram injetadas em triplicata (n = 3).
2.5 Métodos de validação
2.5.1 Ácidos graxos
A precisão do método para separação dos ésteres metílicos de ácidos graxos foram
avaliada por meio da precisão instrumental intra-dia (n=10), com a injeção de padrões de
ésteres metílicos.
2.5.2 Tocoferóis
O método para tocoferóis foi validado de acordo as normas descritas no Guia
Harmonizado para análise e validação de métodos laboratoriais (Thompson, Ellison &
Wood, 2002). O limite de detecção (LD) foi determinado a partir de sucessivas diluições
dos padrões até que a relação da altura do pico originado da massa do padrão (ng)
alcançasse uma razão de três unidades da altura do ruído. O limite de quantificação (LQ)
99
foi determinado a partir de diluições sucessivas até que altura relativa à massa do padrão
(ng) injetado atingisse uma razão de 7 vezes a altura do ruído. A precisão instrumental
intra-dia foi avaliada a partir de 10 injeções da concentração de padrões referente ao LQ. A
linearidade das diferentes concentrações de padrões foi estudada individualmente para cada
composto, com curvas de calibrações distribuídas em 10 pontos elaboradas com a injeção
aleatória de padrões em triplicata. As soluções de α, β, γ e δ-tocoferol, usadas para
elaboração da curva de calibração foram preparadas de acordo com a quantidade esperada
dos compostos na semente de tamarindo. A análise da falta de ajuste foi aplicada para cada
curva de calibração distinta entre os compostos. A precisão instrumental intra-dia foi
determinada com 10 injeções consecutivas de uma solução contendo os 4 tocoferóis (α, β, γ
e δ-tocoferol) em diferentes níveis de concentração para cada composto e a precisão em
amostra com 10 injeções em volumes diferentes. A precisão instrumental inter-dia foi
determinada pela repetição do procedimento de injeção em três dias consecutivos para os
padrões. O primeiro nível (N1) dos tocoferóis consistiu em injetar 47,5 ng de α-tocoferol,
8,0 ng de β-tocoferol, 89 ng de γ-tocoferol e 1,35 ng de δ-tocoferol. Para o nível 2 (N2) foi
injetado 475 ng de α-tocoferol, 80 ng de β-tocoferol, 890 ng de γ-tocoferol e 13,5 ng de δ-
tocoferol. O nível 3 (N3) consistiu em injetar 950 ng α-tocoferol, 160 ng de β-tocoferol,
1780 ng de γ-tocoferol e 27 ng de δ-tocoferol. Para precisão em amostra foram injetados
diferentes volumes de 5 µL para N1, 50 µL para N2 e 100 µL para N3.
Os ensaios de recuperação também foram executados em três níveis diferentes para
estimar a validade da técnica de extração, uma vez que não há materiais de referência
certificados para os compostos em semente de tamarindo. Os valores injetados no primeiro
nível (N1) se repetiram como no procedimento de precisão. Para o N2, foram injetados
100
332,5 ng de α-tocoferol, 56 ng β-tocoferol, 623 ng de γ-tocoferol e 10,2 ng de δ-tocoferol.
No terceiro nível (N3) foram injetados 430,0 ng de α-tocoferol, 90 ng de β-tocoferol, 1000
ng de γ-tocoferol e 20 ng de δ-tocoferol. Para determinar a recuperação dos tocoferóis, o
volume contendo a concentração necessária de cada composto para os respectivos níveis foi
adicionado aos tubos de ensaio antes da pesagem da amostra para o início do processo de
extração de lipídeos pelo método de Bligh & Dyer (1959). Os padrões adicionados foram
concentrados com N2 até a secura e posteriormente as amostras foram adicionadas aos tubos
dando sequência aos ensaios de extração. Foi utilizada a semente do estado de Minas
Gerais (SMG), escolhida aleatoriamente para os ensaios. A recuperação, expressa em %, foi
calculada para cada composto, descontando o conteúdo dos mesmos presentes naturalmente
na amostra. Os ensaios foram realizados em triplicada para cada nível estabelecido (n = 3).
2.6 Análise estatística
Todos os experimentos foram realizados em triplicata e os resultados foram
apresentados como média e seu desvio padrão (DP). Análise de Variância (ANOVA) foi
aplicada juntamente com o teste de Tukey para identificar possíveis diferenças
significativas entre as médias, usando o software Statistica®
versão 8.0 (Statsoft, USA).
Diferenças entre as médias no nível de 5% (p≤0,05) foram consideradas significantes.
101
3. Resultados e Discussão
3.1 Validação dos métodos
Na Figura 1A e 1B estão apresentados os perfis cromatográficos da separação de
ácidos graxos por GC-FID e dos tocoferóis por HPLC-FL obtidos do óleo da semente de
Tamarindus indica. Além do padrão interno (PI) ácido tricosanóico adicionado, foi possível
separar e identificar 10 diferentes ésteres metílicos de ácidos graxos saturados e insaturados
por comparação com tempo de retenção de padrões. Na Figura 1B estão apresentados os 4
isômeros de tocoferóis (α, β, γ e δ-tocoferol) identificados no óleo da semente.
102
Figura 1. Cromatograma da composição de ácidos graxos por CG-FID (A) e tocoferóis por
HPLC-FL (B) do óleo da semente de tamarindo.
3.1.1 Limites de detecção (LD), quantificação (LQ) e linearidade,
Os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ), assim como a precisão e os
ensaios de linearidade estão presentes na Tabela 1. Os valores de LD para tocoferóis
103
variaram de 0,85 ng para α-tocoferol e 3,03 ng para γ-tocoferol. O β-tocoferol e δ-tocoferol
apresentaram LD de 1,28 e 0,9 ng, respectivamente. Para limites de quantificação (LQ),
considerando a altura do pico 7 vezes maior que a altura do ruído, os valores variaram de
1,98, 2,99, 7,07 e 2,20 ng para α, β, γ e δ-tocoferol, respectivamente.
A linearidade estudada foi testada com 10 diferentes níveis de volume de injeção
executados em triplicata (n = 3) para cada ponto, convertido para nano grama (ng) de
composto injetado. As faixas de trabalho, bem como as equações geradas, o coeficiente de
determinação (r2) e probabilidade de falta de ajuste podem ser observadas na Tabela 1. As
distintas faixas estudadas para cada composto foi aplicada com o intuito de abranger a
maior variação do conteúdo nas amostras. De acordo com os índices de falta de ajuste, os
modelos para os compostos α, β, e δ-tocoferol não apresentaram falta de ajuste significativa
com p>0,05.
Tabela 1. Parâmetros para validação do método de separação de tocoferóis.
Tocoferóis LD*
(ng)
LQ*
(ng)
Precisão
Intra-dia
(%)
Linearidade
(ng) Equação r
2
Falta
de
Ajuste
α-tocoferol 0,85 1,98 3,42 47,5-902,5 y = 4,4317x - 97,64 1 0,073
β-tocoferol 1,28 2,99 3,48 8-152 y = 5,3434x – 20,9284 0,999 0,732
γ-tocoferol 3,03 7,07 3,18 89-1691 y = 3,7832x – 61,9527 0,999 0,001
δ-tocoferol 0,90 2,10 5,12 1,25-25,65 y = 5,2638x – 7,0716 0,996 0,121
* LD – Limite de Detecção; LQ – Limite de Quantificação;
Na validação do modelo para predição de γ-tocoferol, apesar de possuir uma
variação explicada de 99,99%, a equação apresentou falta de ajuste significativa com
104
p<0,05, devido à alta precisão do equipamento (HPLC-FL) utilizado, o que indicou a
possibilidade de o modelo não ser aplicado. Porém, ao analisar a relação entre os valores
preditos e valores reais experimentais (Figura 2 e Tabela 2), nota-se que o erro puro obtido
nos dados experimentos foi muito baixo, com valores estimados pelo modelo muito
próximos dos valores experimentais, caracterizando a falta de ajuste apresentada pela
ANOVA como um resultado falso-positivo.
Figura 2. Valores preditos e valores reais para o modelo matemático e dados experimentais
utilizados para quantificação de γ-tocoferol.
Tabela 2. Análise de Variância para o ajuste do modelo linear utilizados para quantificação
de γ-tocoferol.
Fonte de
Variação
Soma
Quadrática
Graus de
Liberdade
Soma
Quadrática
Média
Fcalculado p
Regressão 112238070 1 112238070 780576,6 0,000000
Falta de Ajuste 6148 8 768 5,3 0,001112
Erro Puro 2876 20 144
SQTotal 112247093 29
105
Os valores da Soma dos Quadrados (SQ) da Falta de Ajuste e do Erro Puro são
muito inferiores à SQ da regressão que por sua vez é próxima do valor de SQTotal, ou seja,
o modelo é mais explicado pela regressão linear do que pelos resíduos. Segundo Barros
Neto, Scarminio & Bruns (2010) e Souza & Menezes (2008), quando a magnitude do erro
puro é muito inferior à dos resíduos, o modelo pode apresentar falta de ajuste, no entanto,
ainda sim pode ser utilizado para fins preditivos. Sendo assim, os modelos encontrados para
representar a faixa linear de concentração de cada composto podem ser utilizados para
prever resultados.
3.1.2 Precisão e recuperação
A precisão instrumental intra-dia em termos percentuais de coeficiente de variação
(%) para o método de separação dos padrões de ácidos graxos apresentou valores inferiores
a 1,75% para todos os compostos, sendo que a maioria dos compostos injetados teve uma
precisão inferior a 1%. Os valores de precisão instrumental intra-dia mostram que o método
aplicado apresentou resultados satisfatórios com concordância entre os ensaios
independentes para determinação de ácidos graxos.
As precisões instrumentais intra e inter-dia para padrões de tocoferóis e presentes
nas sementes de tamarindo podem ser observadas nas Tabelas 1 e 3. O maior coeficiente de
variação obtido nos ensaios de precisão intra-dia (n=10), foram atribuídos para o δ-
tocoferol, de aproximadamente, 5%. Para α, β e γ-tocoferol, os coeficientes variaram de
3,42, 3,48 e 3,18%, respectivamente. De acordo com a Tabela 3, observa-se que a precisão
instrumental intra e inter-dia em padrão foi relativamente inferior aos valores dos
106
coeficientes de variação encontrados para precisão em amostra. Para precisão instrumental
intra-dia, considerando os três níveis de concentração de padrões, os valores encontrados
variaram entre 1,88 e 7,6%. Por outro lado, os valores encontrados para os diferentes
volumes de injeção de amostra variaram em uma faixa de 0,63 e 16,81%. De forma geral, a
precisão para o δ-tocoferol alcançou as maiores percentagens de variação, podendo ser
atribuído às menores concentrações trabalhadas em relação aos outros compostos. Nos
ensaios para precisão inter-dia pode ser observado que as percentagens de variação são
superiores às encontradas para precisão intra-dia. Os índices de variação em amostra foram
acrescidos à medida que se reduziu os volumes de injeção. Para precisão instrumental inter-
dia em padrões, os valores variaram de 5,25 % no N2 do β-tocoferol até 10,89% do N2 em
δ-tocoferol. Em amostra, os índices variaram de 2,7% para N3 e 15,9% no N1 do γ-
tocoferol. Outro fato observado para precisão inter-dia em amostras é que o volume de
injeção é inversamente proporcional ao CV, ou seja, quanto maior for o volume de injeção,
maior a precisão em amostra. Na maioria das vezes, nos ensaios inter-dia para padrões o δ-
tocoferol, permaneceu com os maiores índices de variação em relação aos outros
compostos. Este resultado foi diferente do encontrado para precisão em amostras, onde o
comportamento foi bastante variado, principalmente para os ensaios que se trabalhou com o
menor nível (N1).
107
Tabela 3. Precisão instrumental da separação de tocoferóis em mix de padrões e semente de
tamarindo juntamente com os valores de recuperação para o método de extração.
Precisão Tipo Níveis Tocoferóis
α-tocoferol β-tocoferol γ-tocoferol δ-tocoferol
Intra-dia
(%, n=10)
Padrãoa
N1 3,00 2,38 1,84 5,66
N2 2,77 2,82 2,84 7,6
N3 1,98 2,70 2,69 5,88
Amostrab
N1 3,62 5,59 5,82 16,81
N2 0,63 3,11 1,04 9,28
N3 3,98 10,20 4,20 9,30
Inter-dia
(%, n=5)
Padrão
N1 7,08 5,36 9,61 10,60
N2 9,46 5,25 9,02 10,89
N3 10,58 5,57 9,25 10,72
Amostra
N1 15,41 12,05 15,90 14,64
N2 10,60 10,82 11,29 12,31
N3 11,00 5,60 2,70 4,29
Recuperação
(%, media ± DP, n = 3)c
N1 74,39±5,48 75,71±7,35 64,45±3,41 64,54±5,64
N2 87,72±7,31 80,55±7,07 73,02±4,34 66,90±4,03
N3 85,60±3,28 84,15±7,42 75,96±6,76 69,74±3,68
a Concentração dos padrões: N1: 47,5 ng de α-tocoferol; 8,0 ng de β-tocoferol; 89 ng de γ-tocoferol; 1,35 ng
δ-tocoferol. N2: 475 ng de α-tocoferol; 80 ng de β-tocoferol; 890 ng de γ-tocoferol; 13,5 ng de δ-tocoferol;
N3: 950 ng de α-tocoferol; 160 ng de β-tocoferol; 1780 ng de γ-tocoferol; 27 ng. de δ-tocoferol; b Volume de
injeção de amostra: N1: 5µl; N2: 50µl; N3: 100µl. c N1: igual anterior; N2: 332,5 ng de α-tocoferol, 56 ng
de β-tocoferol, 623 ng de γ-tocoferol e 10,2 ng de δ-tocoferol. N3: 430,0 ng de α-tocoferol; 90 ng β-tocoferol;
1000 ng de γ-tocoferol; 20 ng de δ-tocoferol;
Nos ensaios de recuperação, pode-se observar que os resultados variaram de 64 a
87%, dependendo do composto e dos níveis de concentração avaliados. De forma geral,
nota-se que o processo de extração por completo, incluindo o método de Bligh & Dyer
(1959) para lipídeos totais influenciou na redução dos valores de recuperação encontrados
para os compostos estudados. O δ-tocoferol independente da concentração estudada teve os
108
menores índices de recuperação, chegando a 69% no maior nível (N3). Os maiores índices
foram obtidos com o α-tocoferol, que apresentou 74% no N1 e 85% no N3. Os baixos
índices de recuperação obtidos podem estar atribuídos à fase de extração de lipídeos por
Bligh-Dyer que naturalmente apresenta grande variação nas respostas, com baixa exatidão
para quantificação de matéria graxa (Oftedal, Eisert & Barrel, 2014). Trabalhos
encontrados na literatura relataram valores de recuperação superiores, variando de 90 a
110%, ao estudar isômeros de tocoferóis diretamente em óleos, sem incluir a fase de
extração lipídica (Taibi & Nicotra, 2002; Irakli, Samanidou & Papadoyannis, 2011; Ballus,
Meinhart, Campos, Silva, Oliveira & Godoy, 2014).
3.2 Composição de ácidos graxos
A Tabela 4 apresenta os resultados para quantificação de ácidos graxos presentes no
óleo da semente de T. indica colhidos em 3 diferentes estados do Brasil. Dez ácidos graxos
foram identificados e quantificados pelo método de GC-FID, dentre eles estão: ácido
mirístico (14:0), ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1n-9, cis),
ácido linoleico (18:2n-6cis), ácido α-linolênico (18:3n-3cis), ácido araquídico (20:0), ácido
11-eicosenoico (20:1n-9cis), ácido beênico (22:0) e ácido lignocérico (24:0).
109
Tabela 4. Perfil de ácidos graxos presentes na fração lipídica da semente de Tamarindus indica.
Ácidos
Graxos
Teor de ácidos graxos (mg.g-1
s.s.)
SMG SSP SBA
L1 L2 L1 L2 L1 L2
14:0 0,35±0,04eC*
0,32±0,02hiC
0,38±0,05eC
0,80±0,07gB
0,85±0,09dB
1,07±0,04fA
16:0 23,49±2,63cdC
21,50±0,92cdC
23,84±1,33bC
45,27±2,49cAB
38,70±3,36cB
47,28±5,11cA
18:0 14,12±1,48cdeCD
13,76±0,69efCD
10,13±0,48cdD
19,13±0,88efBC
22,65±3,27cdAB
26,03±3,50deA
18:1n9c 45,83±3,76bCD
40,32±1,64bD
31,80±2,03bD
60,97±3,01bBC
78,24±13,80bAB
83,06±9,67bA
18:2n6c 153,76±20,13aB
145,5±7,14aB
145,13±10,20aB
269,0±12,84aA
230,97±44,70aA
230,7±21,40aA
18:3n3 0,40±0,03eC
0,44±0,05hiC
0,42±0,04eC
1,45±0,24gA
0,86±0,11dB
1,06±0,06fB
20:0 5,92±0,64eB
5,75±0,33ghB
5,12±0,38deB
9,83±0,41fgA
9,30±1,69cdA
9,13±0,46efA
20:1n9 2,10±0,21eB
1,99±0,09hiB
1,57±0,14eB
3,12±0,14gA
3,30±0,50dA
3,29±0,07fA
22:0 9,75±0,96deB
8,96±0,54fgB
11,07±1,03cdB
21,22±0,90eA
11,16±1,50cdB
12,09±1,62efB
24:0 14,97±1,39cdeB
16,21±1,05deB
13,34±1,08cB
26,38±1,18deA
24,50±4,46cdA
24,02±1,86deA
Sat (%)**
26,42±1,08bA
27,22±0,33bA
27,44±0,48bA
27,97±0,20bA
26,61±1,42bA
27,31±2,15bA
Ins (%) 73,58±1,79aA
72,78±0,49aA
72,56±0,50aA
72,03±0,22aA
73,39±1,41aA
72,39±2,41aA
*Médias seguidas pela mesma letra minúscula na comparação entre ácidos graxos e maiúscula para comparação entre lotes não representa diferença
significativa entre si a p<0,05 pelo teste de Tukey.** Saturados e Insaturados.
110
De forma geral, o ácido linoleico (18:1n-6, cis) apresentou as maiores concentrações
nas amostras entre todos os ácidos graxos estudados, variando de 145 até 270 mg.g-1
s.s.,
seguido pelo ácido oleico que variou de 31 a 83 mg.g-1
s.s e ácido palmítico, onde foram
encontrados concentrações de 21 à 47 mg.g-1
s.s. Os ácidos mirístico e α-linolênico tiveram
as menores proporções em relação aos outros ácidos graxos encontrados no óleo da
semente de tamarindo, com variações entre 0,35 e 1,07 mg.g-1
s.s e 0,40 à 1,45 mg.g-1
s.s,
respectivamente. Estes resultados estão em conformidade aos encontrados por Luzia &
Jorge (2011) para tamarindos oriundos do estado de São Paulo, em que os ácidos graxos
majoritários variaram nas mesmas proporções. Avaliando o perfil de ácidos graxos do óleo
da semente de T. indica oriundos da Nigéria, Ajayi, Oderinde, Kajogbola & Uponi (2006)
encontraram 11 compostos entre eles os ácidos cis-11,14,17-eicosatrienóico (20:3) e cis-
11,14-eicosadienóico (20:2), não constatados nas sementes oriundas de MG, SP e BA. Em
contrapartida, os autores não observaram a presença do ácido mirístico (14:0) e ácido α-
linolênico (18:3n-3) encontrados neste presente trabalho. Diferente do perfil de ácidos
graxos das sementes estudadas do Brasil, as da Nigéria tiveram similaridades nas
proporções dos ácidos 16:0, 18:1 e 18:2, com 27,41, 24,13 e 24,75%, respectivamente.
Levando em consideração o estado produtor, as sementes dos frutos adquiridos da BA se
destacaram com as maiores concentrações dos ácidos graxos estudados em relação à
matéria seca, exceto quando levado em consideração o ácido beênico (22:0) e o ácido α-
linolênico (18:3n-3, cis), onde as concentrações foram maiores nas amostras SSP. Alguns
autores relataram que a concentração de ácidos graxos depende diretamente do método de
extração do óleo e local de origem da semente (El-Shami, El-Mallah, & Mohamed, 1992;
Lutterodt, Slavin, Whent & Turner, 2011). Por outro lado, as amostras de SMG e lote 1 de
111
SSP se equipararam em concentração para todos os compostos. No entanto, o lote 1 de SSP
obteve valores significativamente maiores em relação às outras amostras. Também pode ser
observado, em relação à comparação entre lotes de cada estado, que não houve variações
significativas (p<0,05) entre as concentrações de todos os ácidos graxos quantificados em
lote 1 e lote 2 do estado de Minas Gerais (MG).
Com relação ao teor de ácidos graxos saturados e insaturados, a Tabela 4 mostra que
o óleo presente na semente de T. indica possui cerca de 75% de ácidos graxos insaturados,
sendo que nesta faixa as maiores parcelas são atribuídas ao ácido linoleico (53%) e ácido
oleico (19%), enquanto que a fração saturada corresponde a apenas 25%. Na parcela da
fração saturada, cerca de metade corresponde ao ácido palmítico, chegando a 10% do total.
Também pode ser observado na Tabela 4 que não houve variações significativas
(p<0,05) entre as proporções de ácidos graxos saturados e insaturados com a mudança do
local e ano de colheita dos frutos, em que a fração insaturada foi significativamente maior
que a parcela saturada. Alguns autores afirmam que a qualidade do óleo vegetal está
diretamente relacionada à grande predominância de ácidos graxos insaturados, uma vez que
o grau de saturação está relacionado à degradação do produto (Lutterodt, Slavin, Whent &
Turner, 2011; Saha & Ghosh, 2011). O consumo de óleo com alto grau de saturação está
diretamente ligado ao aparecimento de doenças no ser humano (Willett, 2012, Ruiz-Núñez,
Kuipers, Luxwolda, Graaf, Breeuwsma, Dijck-Brouwer & Muskiet, 2014). O ácido
linoleico, por exemplo, é sem dúvidas um dos ácidos graxos insaturados mais importantes
na alimentação humana, devido à sua ação preventiva de doenças, redução da pressão
sanguínea e colesterol (Omode, Fatoki & Olaogun, 1995; Walker, Jebb, Calder & Phil,
2013). O ácido oleico também foi citado como sendo importante na dieta humana, com
112
ação redutora da gordura de baixa densidade (LDL), melhorando os sintomas de doenças
inflamatórias e reduzindo a pressão arterial (Hostmark & Haug, 2013). A presença dos
ácidos graxos chamados essenciais, como o linoleico, no óleo da semente de tamarindo faz
com que esta fração lipídica seja interessante do ponto de vista nutricional, uma vez que
este ácido graxo não é produzido pelo organisno, porém é responsável para formação de
membranas celulares, vitamina D e vários hormônios (Veronezi & Jorge, 2015).
A análise por GC-MS de ésteres metílicos de ácidos graxos confirmou a presença
de 9 dos 10 compostos anteriormente detectados no ionizador em chama (FID), como
mostra a Tabela 5.
Tabela 5. Composição de ésteres metílicos de ácidos graxos do óleo da semente de
Tamarindus indica identificados por GC-MS.
Nº Nome Nome usual
Fórmula
Molecular
Massa
molecular
Nº CAS*
1 n-Tetradecanoato Mirístico C15H30O2 242 124-10-7
2 Palmitato Palmítico C17H34O2 270 112-39-0
3 9,12-Octadecadienoico Linoleico C19H34O2 294 112-63-0
4 9-Octadecenoico Oleico C19H36O2 296 112-62-9
5 n-Octadecanoico Esteárico C19H38O2 298 112-61-8
6 cis-11-Eicosenoico 11-eicosenoico C21H40O2 324 2390-09-2
7 Eicosanoico Araquídico C21H42O2 326 1120-28-1
8 Docosanoato Beênico C23H46O2 354 929-77-1
9 Tetracosanoico Lignocérico C25H50O2 382 2442-49-1
* Chemical Abstracts Service
113
Apenas o ácido α-linolênico (18:3n-3) não foi observado pelas condições do
método aplicado, provavelmente sua identificação foi afetada pela condição do método que
não favoreceu a separação do composto que acaba sendo ionizado concomitantemente com
outro de mesma natureza, prejudicando sua identificação. Para melhor eficiência na
detecção individual de cada composto, os ácidos graxos devem estar previamente separados
ou isolados para então serem ionizados na fonte EI, pois a energia da ionização por elétrons
quebra as moléculas do íon molecular em fragmentos distintos que se misturados a outros
compostos de mesmas características (principalmente isômeros) dificultam a identificação
pelo quadrupolo, gerando o mesmo padrão de fragmentação, confundindo o perfil de
intensidade para os íons do analito em questão (Hoffmann & Stroobant, 2001). A
percentagem de similaridade para identificação por comparação dos compostos com a base
de dados (biblioteca virtual NIST®) variou de 76 à 98%.
A Figura 3 mostra os espectros de massas representativos para o ácido esteárico
(18:0), oleico (18:1c) e linoleico (18:2c), saturado, monoinsaturado e di-insaturado,
respectivamente. Apesar da diferença de intensidades apresentadas pelos padrões de
fragmentos dos ésteres metílicos de ácidos graxos, saturados e insaturados, não foi possível
alterar o modo de monitoramento dos íons para melhor detecção, uma vez que os ácidos
graxos possuem os mesmos fragmentos, porém com intensidades diferentes o que geraria
espectros não representativos. Além de ésteres metílicos, foram identificados vários outros
compostos de natureza distinta dos ácidos graxos, mostrando que a boa sensibilidade do
método GC-MS não interferiu na ausência do ácido α-linoléico, reforçando o motivo da
sobreposição de picos da saída do sistema cromatográfico para a fonte EI.
114
Figura 3. Espectro de massas representativo para ésteres metílicos de ácidos graxos. A –
saturado (Esteárico 18:0); B – monoinsaturado (Oleico 18:1 n-9, cis); C – di-insaturado
(Linoleico 18:2 n-6, cis).
115
3.3 Composição de tocoferóis
Os quatro isômeros de tocoferóis (α, β, γ e δ-tocoferol) foram encontrados e
quantificados para todas as amostras do óleo da semente de tamarindo estudadas,
independente da origem do fruto e da época de colheita estudada. Os resultados mostrados
na Tabela 6 revelam que o γ-tocoferol foi o composto predominante encontrado no óleo da
semente com concentração variando de 20 a 27 mg.kg-1
s.s.. Na sequência, o α-tocoferol foi
quantificado nas amostras de semente com relevância entre, aproximadamente, 16 a 25
mg.kg-1
s.s.. Por outro lado, o β e δ-tocoferóis apresentando baixos teores mostrando
diferenças significativas entre si quando comparados em conjunto com os demais para
todos os óleos das sementes. Entretanto, nota-se que o β-tocoferol teve uma maior
predominância em relação ao δ-tocoferol presentes nas amostras, tendo a máxima
concentração encontrada para o lote 1 de SBA, com teor de 2,96±0,18 mg.kg-1
s.s., enquanto
que a máxima obtida para δ-tocoferol alcançou 1,03±0,11 mg.kg-1
s.s.. Os tocoferóis α e γ
são os tocoferóis homólogos mais comumente encontrados em óleos de vegetais (Sen
Khanna, Rink & Roy, 2006). Entretanto, as diferentes proporções destes tocoferóis nos
óleos vegetais são bem apresentadas na literatura. Em trabalhos com azeite de oliva
produzidos em diferentes regiões do Brasil, Ballus, Meinhart, Campos, Silva, Oliveira &
Godoy (2014) detectaram valores de β e γ-tocoferol muito abaixo do α-tocoferol em todas
as amostras, além de não verificar a presença do δ-tocoferol. Kodad, Estopañán, Juan,
Alonso, Espiau & Company (2014) verificaram a maior predominância de α-tocoferol em
óleo de 44 espécies de amêndoas produzidas na Espanha, com baixos teores de β, seguido
de γ-tocoferol e ausência de δ-tocoferol. Nedhi, Sbihi, Tan & Al-Resayes (2014)
116
encontraram grande quantidade de δ-tocoferol em óleo de coral fungo (Ramaria stricta) em
relação aos outros isômeros, porém, o óleo de Girassol mostrou ausência de δ e
predominância de α-tocoferol. Por outro lado, o óleo de soja apresentou grandes
quantidades de γ e δ-tocoferóis em relação aos α e β-tocoferóis.
Tabela 6. Composição de tocoferóis presentes no óleo da semente de Tamarindus indica
oriundo de diferentes estados do Brasil.
Tocof
Teor de tocoferóis (mg.kg-1
s.s.)
SMG SSP SBA
L1 L2 L1 L2 L1 L2
α-toc 21,8±0,98bAB*
25,5±2,69eA
21,3±0,83bABC
16,4±1,90bC
19,4±2,50bBC
17,1±1,66aBC
β-toc 2,3±0,21cC
2,8±0,03cAB
2,3±0,05cC
2,0±0,16cC
3,0±0,18cA
2,4±0,33bBC
γ-toc 27,0±2,58aAB
31,1±1,35aA
25,6±1,22aABC
23,0±2,09aiBC
25,9±2,03aABC
20,4±2,60aC
δ-toc 0,3±0,03cD
0,6±0,07cB
0,5±0,01cBC
0,4±0,01cCD
1,0±0,11cA
0,3±0,02bD
*Médias seguidas pela mesma letra minúscula para comparação entre tocoferois e maiúscula para
comparação entre lotes e estados não representa diferença significativa entre si a p<0,05 pelo teste de Tukey.
n=3.
Em relação aos lotes, nota-se que houve variações nas intensidades dos compostos,
para a maioria dos casos, quando o fruto foi colhido em diferentes anos. O óleo da semente
oriunda do estado de Minas Gerais teve as maiores concentrações do composto α-tocoferol
de 21,8±0,98 a 25,5±2,69 mg.kg-1
s.s. para L1 e L2, respectivamente, não apresentando
diferenças significativas entre si (p<0,05). Já para as amostras SSP e SBA, a composição de
α-tocoferol não se diferiu entre si (p<0,05). Para β-tocoferol, a maior concentração foi
encontrada para L2 de SMG e L1 de SBA, com valores de 2,8 a 3,0 mg.kg-1
s.s.,
respectivamente. Com relação aos teores de γ-tocoferol, as amostras L1 e L2 de SMG
apresentaram teores significativamente maiores que as demais avaliadas, uma vez que estes
117
resultados alcançaram aproximadamente, 27 e 31 mg.kg-1
s.s., respectivamente. As diferenças
se repetiram para o composto δ-tocoferol, sendo que os menores valores foram encontrados
para L1 de SMG, L2 de SSP e L2 de SBA. O conteúdo de tocoferóis encontrados está
proporcionalmente compatível com os dados da literatura para o óleo da semente de T.
indica, porém, o conteúdo de α e δ-tocoferóis superestimaram os resultados encontrados
por Luzia & Jorge (2011) para o óleo da semente de 12,4±0,16 e 0,2±0,01 mg.kg-1
,
respectivamente. Alguns estudos sugerem que a presença de compostos como flavonoides,
ácido ascórbico, vitamina E, β-caroteno e polissacarídeos em T. indica conferem ao fruto
um poder de proteção à doenças do fígado (Shammi, Choudhry, Khan & Hossain, 2013;
Samal & Dangi, 2014). O uso dos extratos de folhas e sementes de T. indica no tratamento
de doenças relacionadas ao fígado de ratos foram estudadas em trabalhos científicos, onde
se encontrou um efeito significante no combate à doença (Joyeux, Mortier, Pleurentin,
1995; Pimple, Kadam, Badgujar, Bafna & Patil, 2007). Os tocoferóis e tocotrienóis são
derivados naturais da vitamina E e estão quimicamente disponíveis em formas de isômeros
(Sem, Khanna, Rink & Roy, 2007). A efetividade da vitamina E no combate a doenças
hepáticas já foram comprovadas na ciência (Sario, Bendia, Taffetani, Omenetti,
Candelaresi, Marzioni, Minicis & Benedetti, 2005; Aboul-Soud, Al-Othaman, El-Desoky,
Al-Othman, Yusuf, Ahmad & Al-Khedhairy, 2011). Além da importância farmacológica,
os tocoferóis desempenham papéis importantes na conservação de óleos poli-insaturados,
uma vez que os mesmos promovem a estabilidade oxidativa inibindo a ação de radicais
livres.
O δ-tocoferol é pouco encontrado em grande parte dos vegetais e na maioria das
vezes está presente em baixas concentrações (Nehdi, Sbihi, Tan & Al-Resayes, 2014).
118
Wells, Jennings, Rome, Hadjivassiliou, Papas & Alexander.(2010) mencionam que a
presença de δ-tocoferol na dieta retarda muitas atividades inflamatórias e do câncer. A falta
de δ-tocoferol na maioria das formulações de vitamina E pode ser um limitante para
efetividade do produto na promoção da saúde (Salden & Salden, 2005). Assim sendo,
devido à grande predominância dos antioxidantes naturais α e γ-tocoferóis e principalmente
pela presença de δ-tocoferol no óleo, a semente de tamarindo pode ser uma fonte
importante destes compostos a ser explorada industrialmente.
4. Conclusão
A composição de ácidos graxos e tocoferóis do óleo da semente de Tamarindus
indica de três estados do Brasil foi avaliada a partir dos métodos analíticos validados para
cada classe distinta de compostos. A origem e época de colheita dos frutos não
influenciaram na relação de ácidos graxos e tocoferóis identificados no óleo da semente,
porém, provocou variações nas intensidades dos compostos de forma significativa para a
maioria deles.
O perfil de ácidos graxos saturados e insaturados também não sofreu variações e se
mostrou muito favorável para um óleo com característica desejável. Assim sendo, o óleo
obtido da semente de tamarindo sugere possuir grande potencial nutracêutico na fração
lipídica por meio de elevadas concentrações de ácidos graxos insaturados e tocoferóis.
119
5. Referências Bibliográficas
Aboul-Soud, M. A., Al-Othaman, A. I., El-Desoky, G. E., Al-Othman, Z. A., Yusuf, K.,
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127
CAPÍTULO V
AVALIAÇÃO SENSORIAL DE NÉCTAR ELABORADO COM POLPA E
EXTRATO AQUOSO LIOFILIZADO DA SEMENTE DE TAMARINDO
(Tamarindus indica L.)
Danilo Santos Souzaaa*
, Janclei Pereira Coutinhoa, Tayse Ferreira Ferreira da Silveira
a,
Erick Almeida Esmerindob, Helena Maria Andre Bolini
b, Helena Teixeira Godoy
a
a Departamendo de Ciência de Alimentos – FEA, Universidade Estadual de Campinas,
Brasil.
b Departamento de Alimentos e Nutrição – FEA, Universidade Estadual de Campinas,
Brasil.
* Autor para correspondência: Rua Monteiro Lobato, 80, Lab Análise, FEA-DCA, CEP:
13083-862, Cidade Universitária, Campinas-SP.
E-mail: danilosantos_souza@yahoo.com.br (Souza, D. S.).
Manuscrito em preparo para ser submetido ao periódico LWT - Food Science and
Technology
128
RESUMO
A semente de tamarindo que possui boa parcela dos compostos bioativos do fruto é pouco
aproveitada nas indústrias, desta forma, o objetivo do trabalho foi determinar o perfil do
consumidor de suco e elaborar um néctar a base de polpa e extrato aquoso liofilizado da
semente de tamarindo, de modo a aproveitar as propriedades funcionais da semente ao
mesmo tempo em que mantenha características sensoriais aceitáveis. Os frutos foram
adquiridos dos estados de Minas gerais, São Paulo e Bahia. Os néctares foram elaborados a
partir da adição de 0,3, 1,15 e 2% de extrato aquoso liofilizado, em relação a quantidade de
polpa hidratada. O teste sensorial de diferença do controle foi aplicado para 31 julgadores e
o teste de aceitação por 60 consumidores avaliando os atributos de aparência, aroma, sabor
textura e impressão global. Para o atributo sabor no teste de diferença do controle,
observou-se que não houve diferença significativa em relação ao padrão quando se
adicionou a menor concentração de extrato (0,3%). No teste de aceitação, de forma geral
variaram de ―desgostei ligeiramente‖ à ―gostei ligeiramente‖, no entanto, a variância ficou
entre 40 e 50%. A maior nota foi atribuída para a amostra controle da Bahia, com
aproximadamente, 5,44±2,21. Os testes sensoriais mostraram que a concentração do extrato
adicionado altera as características sensoriais do refresco, porém, esta mudança também é
dependente da origem dos frutos. Por outro lado, houve grande variabilidade de notas e
uma tendência em reduzir a aceitação do refresco quando for adicionado mais extrato da
semente.
Palavras chave: Extrato aquoso, escala hedônica, biofortificação, suco, liofilização.
129
1. Introdução
Atualmente, a busca dos consumidores por alimentos mais saudáveis e práticos vem
crescendo a cada dia no Brasil e no mundo, principalmente pela vinculação da alimentação
com a promoção de saúde (Azevedo, 2008). A conscientização sobre a importância da
inclusão de alimentos saudáveis na dieta que auxiliam na prevenção de doenças e melhoria
da qualidade de vida consequentemente resulta em um aumento na demanda destes
produtos no mercado, principalmente de frutas e derivados (Lock, Pomerlau, Causer,
Altmann & MCkee, 2005). O tamarindo é comumente consumido na forma de polpa, sucos,
extrato, xarope, balas e outras para consumo oral, também podendo ser usado como
expectorante, laxativo, carminativo, além de ser indicado para infecções estomacais, no
fígado e vesícula biliar (Queiroz, 2010). O suco da polpa é muito apreciado nos países
tropicais pelo seu sabor agridoce e propriedades refrescantes (Manohar, Ramakrishna &
Udayasankar, 1991). No entanto, a semente, que compõe a maior parcela do fruto, detém
uma importante quantidade de compostos responsáveis pelas propriedades funcionais e
geralmente não é reaproveitada para estes fins nas indústrias de suco, surgindo a
necessidade de se elaborar um néctar conjugado composto de polpa e semente que
aproveite tais propriedades e ao mesmo tempo mantenha características sensoriais
aceitáveis (Shiddhuraju, 2007).
De acordo com o Art. 21 do Decreto nº 6871/2009, néctar ―é a bebida não
fermentada, obtida da diluição em água potável da parte comestível do vegetal e açúcares
ou de extratos vegetais e açúcares, podendo ser adicionada de ácidos, e destinada ao
consumo direto‖. Não é permitida a associação de açúcares e edulcorantes hipoenergéticos
e não-energéticos na fabricação de néctar (Brasil, 2009). O Art. 3º, da Instrução Normativa
130
nº 12, define que: ―o néctar cuja quantidade mínima de polpa de uma determinada fruta não
tenha sido fixada em Regulamento Técnico específico deve conter no mínimo 30% (m/m)
da respectiva polpa, ressalvado o caso de fruta com acidez ou conteúdo de polpa muito
elevado ou sabor muito forte e, neste caso, o conteúdo de polpa não deve ser inferior a 20%
(m/m)‖. O Art. 2º, da Instrução Normativa nº 12, considera o tamarindo ―como frutas
polposas de origem tropical‖, porém só pode ser considerado um suco tropical se a
concentração de polpa tiver um mínimo de 50% (m/m) da respectiva polpa, com ressalvas
no caso de a fruta possuir acidez alta ou conteúdo de polpa muito elevado ou sabor muito
forte que, neste caso, o conteúdo de polpa não deve ser inferior a 35% (m/m) (Brasil, 2003).
Devido aos constantes avanços no desenvolvimento de novos produtos
alimentícios, a utilização de análises que representam a opinião do consumidor com
segurança e eficiência se torna imprescindível (Yoo, Shin & Park, 2015). Assim sendo,
testes sensoriais são realizados em produtos específicos para direcionar o gosto e a
preferência do público alvo em questão. Apesar da grande variedade de frutas tropicais
produzidas no Brasil, não há registro de nenhum néctar de fruta creditado pelos órgãos
competentes que utilizem extratos vegetais como aditivo visando melhoramento das
propriedades funcionais. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo desenvolver
formulações de néctar de tamarindo que envolva a mistura de polpa liofilizada e extrato
aquoso liofilizado da semente liofilizado em diferentes concentrações, bem como avaliar
suas propriedades sensoriais com testes de diferença do controle e aceitação pelos
consumidores, como forma alternativa de aproveitamento tecnológico da semente de
tamarindo.
131
2. Material e Métodos
2.1 Reagentes
Foram utilizados os reagentes hidróxido de sódio p.a (Synth, Brasil) e bifitalato de
potássio p.a (Merck, Alemanha).
2.2 Obtenção da matéria-prima
Os frutos de tamarindo foram adquiridos dos estados de Minas Gerais, São Paulo e
Bahia, das cidades de Patos de Minas (18° 34' S e 46° 31' O), Campinas (22º 49' 3'' S e 47°
4' 11" W) e Tanhaçu (14° 1' 11'' S e 41° 14' 7'' O), respectivamente, nos anos de 2012 e
2013. Todas as amostras foram colhidas no período de setembro (entre inverno e
primavera). Após a aquisição, foram descascados e a polpa juntamente com a semente ficou
de molho por 24 h para hidratação e facilitar a separação. Posteriormente, a mistura foi
pulsada em liquidificador industrial (modelo AR 2 L, Colombo®, 800 W e 60 Hz) e filtrada
em peneira comum para separar a polpa da semente.
2.3 Preparo de amostras
As amostras de néctar de tamarindo foram elaboradas com a polpa e o extrato
aquoso liofilizado da semente. Para cada estado, utilizou-se seu respectivo extrato aquoso
liofilizado da semente em diferentes concentrações, sendo que o controle [0] não foi
adicionado do extrato, a concentração [1] com 0,6gextrato/L, [2] – 2,3gextrato/L e [3] –
4,0gextrato/L que correspondem, respectivamente, a 0,3%, 1,15% e 2%, de extrato liofilizado
132
em relação à polpa hidratada. As amostras foram preparadas imediatamente antes da análise
sensorial na proporção de 7:2:1,3 de água:polpa:açúcar.
O extrato aquoso liofilizado da semente foi obtido a partir da moagem da semente
em uma relação m/v de 1:3 de semente e água, submetidos a um período de trituração de 80
s em que o mosto resultante do primeiro processo foi utilizado mais uma vez nas mesmas
condições de extração. O extrato obtido foi congelado em bandejas com 1 cm de espessura
e posteriormente liofilizado em um equipamento da marca Terroni®
modelo LS3000 por
um período de 48 h, até umidade constante de, aproximadamente, 2,00 gágua/100 g.
2.4 Acidez total titulável e teor de sólidos solúveis totais
A acidez total titulável foi medida conforme a metodologia da Association of
Official Analytical Chemists (AOAC, 2010) e os resultados foram expressos em
equivalência ao ácido tartárico (gácido tartárico/100gss), predominante na polpa de tamarindo.
O teor de sólidos solúveis totais foi determinado pelo método de refratometria
(AOC, 2010) com resultados expressos tem (ºBrix).
O ratio foi calculado por meio da razão entre o teor de sólidos solúveis totais sobre
a acidez total titulável em unidade adimensional.
2.5 Análise sensorial
A análise sensorial é uma ciência que utiliza as qualidades psicológicas e
fisiológicas do ser humano para avaliar e gerar respostas sobre as características de
133
aparência, aroma, sabor e textura de alimentos. Por se tratar de uma análise fundamental no
desenvolvimento de novos produtos e utilizar seres humanos como principal critério de
avaliação, foi solicitado e concedido o consentimento de um comitê de ética para avaliar e
autorizar tais análises (parecer consubstanciado em anexo). Assim, os testes afetivos de
Diferença do Controle e de Aceitação foram realizados seguindo as normas do Comitê e
utilizando os padrões de Boas Práticas de Fabricação (BPF), no Laboratório de Análise
Sensorial do Departamento de Nutrição da Faculdade de Engenharia de Alimentos - FEA –
UNICAMP.
2.5.1 Teste de diferença do controle
Um teste sensorial discriminativo de Diferença do Controle avalia o grau de
diferença entre as amostras com adição de 0,3%, 1,15% e 2%, de extrato liofilizado em
relação à polpa hidratada e o controle que não foi adicionado do extrato. O teste foi
aplicado para 31 julgadores e a ordem de apresentação das amostras foi balanceada em
copos codificados com números aleatórios de três dígitos. A amostra controle foi também
servida entre as amostras codificadas. Foi utilizada uma escala estruturada mista em que 0
(nenhuma diferença do Padrão) e 8 (extremamente diferente do Padrão), conforme consta
na ficha de aplicação do teste (Figura 1). Também foi servido 1 copo com água e bolacha
água e sal para descansar as papilas entre as diferentes amostras.
134
NOME:________________________________________________ DATA: / /
Você está recebendo uma amostra padrão (P) de néctar e mais 4 amostras codificadas.
Primeiramente prove a amostra padrão (P) e em seguida, da esquerda para a direita, prove
cada amostra codificada de néctar. Utilizando a escala abaixo, indique o grau de diferença
quanto à APARÊNCIA, AROMA e SABOR, entre cada amostra codificada e a amostra P.
AMOSTRA APARÊNCIA AROMA SABOR
0 nenhuma diferença ______ ______ ______ ______
1
2 ligeiramente diferente ______ ______ ______ ______
3
4 moderadamente diferente ______ ______ ______ ______
5
6 muito diferente ______ ______ ______ ______
7
8extremamente diferente Figura 1. Ficha de aplicação do Teste Diferença do Controle para néctar de tamarindo.
2.5.2 Teste de aceitação pelos consumidores
O teste de Diferença do Controle mostra se há diferença, e o grau desta diferença,
entre as amostras estudadas e a amostra Padrão. No entanto, as amostras podem ser
diferentes, mas, ainda assim, terem aceitabilidade pelo consumidor. Portanto, utilizou-se
um teste sensorial de aceitação para avaliar a aceitação e/ou rejeição dos consumidores às
amostras de néctar de tamarindo elaborado com a polpa liofilizada e enriquecido com o
extrato liofilizado da semente em diferentes concentrações. Uma amostra de cada estado de
origem sem adição de extrato e mais 3 com adição, totalizando 4 amostras para cada estado
foram avaliadas. Desta forma, o teste de aceitação foi composto de 12 amostras, levando
em consideração os estados de MG, SP e BA.
A aceitação de cada tratamento foi avaliada por sessenta consumidores em uma
ficha de avaliação integrada ao software Fizz by Biosystemes® (EUA). Os julgadores
135
avaliaram todas as amostras, indicando em uma escada hedônica estruturada de 9 pontos, o
quanto gostaram ou desgostaram da aparência, textura, sabor e da amostra de um modo
geral.
Os indivíduos foram ainda questionados quanto à intenção de compra dos produtos,
indicando de acordo com uma escala estruturada de nove pontos, o grau de certeza em que
comprariam ou não o produto. A ordem de apresentação das amostras foi balanceada entre
os julgadores em copos codificados com números aleatórios de três dígitos e as amostras
foram servidas de forma monádica, para evitar o efeito comparativo entre as amostras.
2.6 Perfil do consumidor de suco
O perfil do consumidor foi obtido a partir da aplicação de um questionário
estruturado (Anexo 1) entregue ao provador no intervalo das análises do teste de aceitação
com o intuito de caracterizar a população participante dos testes sensoriais para o néctar de
tamarindo. Foram incluídas perguntas sobre sexo, faixa etária, ocupação e região de
origem. Informações como o modo de consumo de suco, preferências do tipo de suco,
opiniões sobre sua funcionalidade, critério de compra e frequência de consumo também
foram avaliadas. As frutas escolhidas para representar os tipos de sucos foram baseadas nas
mais consumidas no Brasil segundo IBRAF (2006). Os dados sobre o conhecimento do
suco de tamarindo, aliados à nota do quanto o consumidor gosta do suco são de
fundamental importância para explicar os comportamentos nos resultados dos testes. Por
fim, a disposição para o consumidor pagar mais por um produto enriquecido em
propriedade funcional relaciona ao objetivo do trabalho de desenvolver um novo produto à
136
base de polpa e extrato aquoso liofilizado da semente de tamarindo. Os resultados foram
expressos em percentagem através da estatística descritiva utilizando os softwares
Microsoft Office Excel 2010 e o Origin 8.0.
2.7 Análise estatística
Os resultados do teste de Aceitação foram avaliados por ANOVA e teste Tukey
(p≤0,05) utilizando-se o software SAS 9.0 e os gráficos de frequência foram montados
utilizando-se o software OriginPro® 8.0. Utilizou-se o teste de média Dunnett para a análise
estatística do teste sensorial de Diferença do Controle das amostras de néctar o qual foi
feito pelo software SAS®
9.0.
3. Resultados e Discussão
3.1 Determinação da acidez total titulável, teor de sólidos solúveis totais e ratio
A Tabela 1 apresenta os dados da acidez total titulável, sólidos solúveis totais e
ratio das polpas de tamarindo nos dois lotes oriundas das regiões de Minas Gerais, São
Paulo e Bahia. Observa-se que a polpa proveniente do estado da Bahia apresentou as
maiores médias de acidez e sólidos solúveis totais, seguida do estado de São Paulo e Minas
Gerais, sendo o segundo lote significativamente maior que o primeiro para ambos os
parâmetros. Para acidez, a polpa PBAL1 teve 28,11±2,07 gácido tartárico/100 gss e no segundo
lote 31,01±0,17 gácido tartárico/100 gss. Já PMGL1 e PMGL2 tiveram valores iguais a
137
14,51±0,07 e 16,60±0,51 gácido tartárico/100 gss, respectivamente. Com relação ao teor de
sólidos solúveis totais, PBAL1 e PBAL2 tiveram valores superiores aos demais estados
com 127,26±0,45 e 146,65±1,39 ºBrix, respectivamente. Por outro lado, a PMGL1 e
PMGL2 tiveram maiores concentrações de sólidos solúveis quando comparadas com as
polpas oriundas do estado de São Paulo, com 105,33±1,28 e 93,69±1,17 ºBrix,
respectivamente.
Tabela 1. Acidez Total Titulável, Sólidos Solúveis Totais e Ratio da polpa de tamarindo de
diferentes estados do Brasil normalizados em base seca.
Amostras ATT
(gácido tartárico/100 gss)
SST
(ºBrix)
Ratio
(SST/ATT)
PMGL1** 14,51±0,07e*
105,33±1,28c 7,26±0,19
a
PSPL1 18,91±0,28c 90,94±1,10
d 4,81±0,11
c
PBAL1 28,11±2,07b 127,26±0,45
b 4,54±0,35
c
PMGL2 16,60±0,51d 93,69±1,17
d 5,65±0,20
b
PSPL2 18,69±0,40c 87,46±0,24
e 4,68±0,11
c
PBAL2 31,01±0,17a 146,65±1,39
a 4,73±0,02
c
*Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna não apresenta diferença
significativa entre si a p<0,05. n=3. ** 1 – Lote 1, 2 – Lote 2. PMG – Polpa de Minas
Gerais; PSP – Polpa de São Paulo; PBA – Polpa da Bahia; L1 – Lote 1; L2 – Lote 2;
O ratio que representa a razão entre sólidos solúveis totais e acidez total titulável, é
um indicativo do estádio de maturação dos frutos devido às alterações nos níveis de
carboidratos à medida que os frutos amadurecem. Desta forma, pode-se observar que a
maioria das amostras apresentou o mesmo estádio de maturação, apenas as polpas obtidas
138
do estado de Minas Gerais tiveram valores superiores aos demais estados para ambos os
lotes com valores de 7,26±0,19 para PMGL1 e 5,65±0,20 PMGL2, com estádio de
maturação mais avançado.
3.2 Análise sensorial
3.2.1 Teste de diferença do controle
As notas indicadas para os atributos da aparência, aroma e sabor de néctar de polpa
liofilizada de tamarindo dos estados de Minas Gerais, São Paulo e Bahia enriquecido com
diferentes concentrações de extrato liofilizado estão mostrados na Tabela 2. Nota-se para as
amostras do estado de Minas Gerais que aparência da amostra MG[1] foi a única que não
diferiu do controle, recebendo uma nota aproximada de 1,81±1,42. Já as amostras MG[2] e
MG[3], que possuem maiores concentrações de extrato, tiveram alterações na aparência
como comprova as médias 2,55±1,69 e 3,16±1,90, respectivamente. Com relação ao
atributo aroma, observa-se que o único tratamento que obteve diferença significativa foi o
MG[3] sendo o que possui a maior concentração de extrato liofilizado com média de nota
igual a 2,45±2,13. As amostras MG[2] e MG[3] apresentaram diferenças significativas da
amostra padrão MG[0] com relação ao sabor, enquanto que não foi observada diferença
significativa para a amostra MG[1], de menor teor de extrato.
139
Tabela 2. Grau de diferença entre as amostras de néctar de tamarindo oriundas dos estados
de Minas Gerais, São Paulo e Bahia enriquecidas com extrato da semente.
Amostras
Médias das diferenças1
Aparência Aroma Sabor
MG[0]3 0,87±1,34 1,00±1,34 1,61±1,82
MG[1] 1,81±1,42 1,26±1,32 2,03±1,52
MG[2] 2,55±1,69* 2,00±2,02 2,90±1,56*
MG[3] 3,16±1,90* 2,45±2,13* 4,00±1,90*
M.D.S2 0,836 0,853 0,940
SP[0] 0,74±1,39 0,90±1,14 1,68±1,42
SP[1] 2,10±1,45* 1,19±1,30 2,39±1,63
SP[2] 2,87±1,75* 2,10±1,66* 3,13±1,86*
SP[3] 3,52±1,65* 1,90±1,68* 3,58±1,95*
M.D.S 0,791 0,710 0,980
BA[0] 1,06±1,73 1,00±1,10 1,45±1,59
BA[1] 3,52±2,22* 1,90±1,72 2,58±2,01
BA[2] 3,16±1,86* 2,10±1,78* 2,94±1,95*
BA[3] 4,00±2,07* 2,19±1,96* 4,42±2,01*
M.D.S 0,969 0,771 0,943
10=nenhuma diferença do Padrão; 8=muito diferente do Padrão; *Amostra difere do padrão
(controle) a p<0,05 de significância pelo teste de Dunnett. 2M.D.S = Mínima diferença
significativa. 3[0] – controle, [1] – 0,6gextrato/L, [2] – 2,3gextrato/L e [3] – 4,0gextrato/L. n=31
Para as médias das notas atribuídas às amostras de néctar elaboradas com polpa e
extrato liofilizados oriundos do estado de São Paulo, pode-se notar para o atributo
140
aparência, que todas as amostras diferiram significativamente do controle com a adição do
extrato, sendo que a nota mínima foi dada à amostra SP[1] (2,10±1,45), com menor adição
de extrato e seguindo a ordem, a maior para SP[3] (3,52±1,65) com maior adição de
extrato.
No atributo aroma, apenas a SP[1] não foi significativamente diferente do controle a
p<0,05, com nota igual a 1,19±1,30. Já a SP[2] e SP[3], se mostraram significativamente
diferentes com médias iguais a 2,10±1,66 e 1,90±1,68, respectivamente. Para o sabor
avaliado nas amostras, a igualdade com o padrão também se repetiu para a amostra SP[1],
indicando que a partir de 0,6 g de extrato adicionados a 1 litro de néctar, o sabor começa a
diferenciar da amostra controle. Por outro lado, para as amostras SP[2] e SP[3] foram
notadas diferenças significativas em relação ao controle, com 3,13±1,86 e 3,58±1,95,
respectivamente. O maior valor da mínima diferença significativa foi identificado para o
atributo sabor de 0,98, sendo que para aparência e aroma, os valores foram menores, com
0,79 e 0,71, respectivamente.
Com relação às amostras de néctar elaborado com frutos da Bahia, nota-se que
nenhum dos tratamentos foi classificado com sendo igual à amostra controle para
aparência, obtendo notas de 3,52±2,22, 3,16±1,86 e 4,00±2,07, para BA[1], BA[2] e BA[3],
respectivamente, enquanto que a amostra padrão teve nota igual a 1,06±1,73,
significativamente abaixo das demais. A adição de extrato ao néctar a partir de 2,3 g/L
mostrou que os provadores encontraram diferença na avaliação do atributo aroma, sendo
que a amostra BA[1] que está abaixo disto, com 0,6 gextrato/L, não caracterizou como
significativamente diferente. Com relação ao sabor, seguiu-se o mesmo padrão do atributo
aroma, apenas com a amostra BA[1] recebendo notas que apresentam igualdade
141
significativa com o padrão. As amostras BA[2] e BA[3] com mais concentração de extrato
foram distinguidas do controle pelos provadores, indicando que a adição do extrato causou
diferenças significativas. A maior nota foi atribuída ao tratamento BA[3], com 4,42±2,01 o
que indica maior diferença com o padrão, classificada entre moderadamente diferente e
muito diferente do controle. De forma geral, pode-se observar que à medida que se aumenta
a concentração de extrato liofilizado da semente ao néctar, as notas tendem a ser maiores, o
que indica um aumento do grau de diferença entre os atributos em relação à amostra
controle. Na opinião dos consumidores, todas as médias se apresentaram entre ligeiramente
diferente e moderadamente diferente do padrão para todos os atributos avaliados.
3.2.2 Teste de aceitação
Utilizou-se um teste sensorial de aceitação para avaliar a aceitação e/ou rejeição dos
consumidores em relação às amostras de néctar elaborado de frutos originados de diferentes
estados de origem com adição de diferentes concentrações de extrato aquoso liofilizado da
semente liofilizado. Os resultados podem ser encontrados na Tabela 3.
142
Tabela 3. Notas (médias e desvios padrões) de aceitação para as diferentes formulações de
néctar de tamarindo.
AMOSTRAS APARÊNCIA AROMA SABOR TEXTURA
IMPRESSÃO
GLOBAL
MG[0] 5,46±2,19a 5,38±2,16
a,b 5,60±2,25
a,b 6,13±1,91
a 5,66±2,09
a
MG[1] 5,33±2,13a 5,16±2,35
a,b,c 5,29±2,43
a,b,c 5,90±2,19
a,b,c 5,31±2,23
a,b
MG[2] 5,13±2,09a,b
4,85±2,39a,b,c
4,91±2,44a,b,c
5,57±2,27a,b,c,d
5,05±2,17a,b
MG[3] 5,12±2,26a,b
4,56±2,39c 4,80±2,22
a,b,c 5,09±2,11
c,d 4,80±2,04
b
SP[0] 5,62±2,36a 5,38±2,29
a,b 5,37±2,45
a,b 5,98±2,24
a,b 5,58±2,28
a
SP[1] 5,47±2,24a 5,31±2,60
a,b 5,23±2,59
a,b,c 5,96±2,22
a,b 5,40±2,30
a,b
SP[2] 5,16±2,21a,b
5,14±2,38a,b,c
5,18±2,32a,b,c
5,65±2,32a,b,c,d
5,12±2,27a,b
SP[3] 4,51±2,24b 4,79±2,25
a,b,c 4,37±2,10
c 4,98±2,22
d 4,74±1,96
b
BA[0] 5,43±2,28a 5,44±2,21
a 5,69±2,23
a 6,05±2,07
a 5,74±2,09
a
BA[1] 5,35±2,31a 5,24±2,40
a,b,c 5,69±2,29
a 6,00±2,00
a,b 5,69±2,12
a
BA[2] 5,21±1,95a 4,94±2,32
a,b,c 5,02±2,23
a,b,c 5,70±2,16
a,b,c,d 5,24±2,07
a,b
BA[3] 5,06±2,10a,b
4,69±2,39b,c
4,67±2,40b,c
5,20±2,50b,c,d
4,78±2,30b
*Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna para cada atributo não
apresentam diferença significativa entre si a p≤0,05. n=60. Descrição
das notas:
1=desgostei muitíssimo, 9=gostei muitíssimo.
Observando as médias para os atributos, de forma geral variaram de ―desgostei
ligeiramente‖ (4) à ―gostei ligeiramente‖ (6), independente do estado de origem ou
quantidade de extrato adicionado. No entanto, a variância ficou em torno de 40 a 50%,
indicando a grande discrepância na preferência dos julgadores. Este dado pode ser
confirmado ao se observar que os tratamentos que não tiveram adição de extratos, também
143
tiveram notas que variaram nesta faixa. Com relação ao atributo aparência, as médias
variaram em torno de ―nem gostei e nem desgostei‖ (5), sendo que o único tratamento que
recebeu a menor nota e diferiu da maioria foi o SP[3], com 4,51±2,24, aproximadamente.
Sendo assim, houve diferença significativa entre os outros tratamentos. Para o aroma, a
menor nota (4,56±2,39) foi dada para o tratamento MG[3], porém, devido a grande
variação de notas, muitos outros tratamentos se igualaram significativamente a ele. A maior
nota foi atribuída para a amostra BA[0], com aproximadamente, 5,44±2,21, mas a maioria
dos outros tratamentos também mostraram similaridade entre si.
Com relação ao atributo sabor, pode-se notar que a maioria dos tratamentos foram
significativamente iguais, no entanto, percebe-se que os tratamentos MG[3], SP[3] e BA[3],
que possuem as maiores concentrações, tiveram as menores médias, com 4,80±2,22,
4,37±2,10 e 4,67±2,40, respectivamente. Por outro lado, não demonstraram diferenças
significativas para vários outros tratamentos. Pode-se deduzir que à medida que se aumenta
a concentração do extrato de tamarindo ao néctar, as notas do atributo sabor tendem a
diminuir. Com relação ao atributo textura, também pode ser observado uma tendência do
consumidor a reduzir a aceitação à medida que a concentração de extrato for sendo
aumentada. Para o atributo impressão global, observou-se a mesma tendência obtida no
aspecto sabor, em que as amostras que tiveram as maiores concentrações de extrato
adicionado, também detiveram as menores médias, indicando a possibilidade de rejeição
por parte dos consumidores.
A Figura 2 mostra o gráfico de frequência de intenção de compra por parte dos
consumidores. Observa-se que a maior porcentagem de distribuição dos dados giram em
torno das notas 2, 3 e 4. Avaliando as notas de rejeição em ―certamente compraria‖ e
144
―possivelmente não compraria‖, observa-se que as amostras de Minas Gerais tiveram as
maiores frequências, seguidas pelos néctares elaborados com os frutos oriundos de São
Paulo. Já para as notas que indicam a possibilidade e certeza de compra, os néctares com
maiores frequências foram o SP[3] e BA[3]. Segundo Reis & Minin (2006), as
metodologias tradicionais para analisar dados de testes afetivos têm mostrado algumas
limitações, uma vez que os dados são analisados conjuntamente por ANOVA ou diferença
entre médias, não levando em consideração a opinião individual de cada provador.
1 2 3 4 5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Fre
quên
cia
(%)
Notas
MG[0]
MG[1]
MG[2]
MG[3]
SP[0]
SP[1]
SP[2]
SP[3]
BA[0]
BA[1]
BA[2]
BA[3]
Figura 2. Histograma de frequência para Intenção de Compra do néctares de tamarindo.
Descrição de notas: 1 - certamente não compraria, 2 - possivelmente não compraria, 3 - talvez
comprasse/talvez não comprasse, 4 - possivelmente compraria, 5 - certamente compraria.
145
O gráfico de frequência de intenção de compra evidencia o grau de incerteza por
parte dos consumidores, pois a discrepância e o desvio entre as notas para todos os
tratamentos foram muito altas. Assim, comparando com as notas obtidas no teste de
aceitação, nota-se que os néctares que receberam as menores notas de aceitabilidade, foram
os que tiveram maiores frequências de possibilidade e certeza de intenção de compra.
3.3 Perfil do consumidor
Na avaliação do perfil de 60 consumidores questionados, foi constatado que a
maioria (65%) pertence à faixa etária de 25 a 35 anos e 29% tem idade entre 36 e 50 anos,
sendo que a maior parcela (52%) é constituída pelo sexo masculino. Dentre os
entrevistados, 76% já possuem graduação completa com pós-graduação em andamento e
15% estão cursando a graduação, os demais 9% distribuíram-se entre cursando ensino
médio, funcionário, professor e outros. Com relação à região de origem, a maioria (52%)
dos provadores pertence à região Sudeste, 30% estão divididos igualmente entre a região
Norte e Sul, 7% são oriundos do Nordeste e 3 e 7% são de origem do Centro-Oeste e
estrangeiros (Peru, Argentina e Chile), respectivamente. A maior parcela característica para
a região Sudeste está diretamente ligada ao fato de o local (UNICAMP - Campinas/SP)
onde foi realizado as análises estar localizada nesta região. Os resultados para o perfil de
consumidores podem ser encontrados na Figura 3. O grau de instrução dos provadores
também está ligado ao fato de as análises terem sido realizadas em um ambiente
acadêmico. Este ponto pode influenciar de alguma forma nas respostas para os
questionamentos relacionados ao critério de compra e funcionalidade do produto. Kotler &
146
Armstrong (2004) afirmam que a tomada de decisão de um consumidor está diretamente
relacionada e sofre grande influência da sua classe social e seu grupo familiar de referência.
Figura 3. Distribuição de frequência para o perfil dos consumidores. A – Faixa etária; B –
Sexo; C – Ocupação; D – Região de origem.
A Figura 4 apresenta os dados de frequência dos consumidores para o critério de
compra do suco e se estão dispostos a pagar mais por um suco que possua uma maior
propriedade funcional. Observa-se que dentre os critérios estudados, a maioria absoluta
(75%), escolhe o produto pelo sabor e a minoria com 20 e 5%, adotam o critério de compra
para os aspectos nutricionais e o preço, respectivamente. Quando questionados sobre a
disposição em pagar mais por um produto de melhor qualidade funcional cerca de 88% dos
29%
65%
3% 3%
< 2525-3536-50> 50
48% 52%
Masculino
Feminino
3%
15%
76%
2% 2% 2%
Ensino médio
Graduação
Pós-graduação
Professor
Funcionário
Outros
15%
8%
3%
52%
15%
7% N
NE
CO
SE
S
Outro
país
A B
C D
147
provadores responderam que ―sim‖, pagaria a mais por uma maior propriedade funcional e
12% responderam que não. Todos os que aceitaram comprar um produto mais caro, desde
que a qualidade funcional seja maior, justificaram que os resultados seriam compensados
no benefício à saúde. Por outro lado, os que negaram pagar mais caro, disseram que
preferiam optar por outro tipo de suco in natura que possua uma qualidade funcional maior,
caso este fosse o intuito. Segundo Cavada, Paiva, Helbig & Borges (2012) e Kleef, Trijp &
Luning (2005), os consumidores estão dando preferência para alimentos relacionados à
saúde. Pesquisas apontam que 44% dos consumidores brasileiros da classe A e B escolhem
seus alimentos com base na relação que eles têm com a saúde, sendo um dos maiores
índices da América Latina (Raud, 2008).
Sabor Aspectos nutricionais Preço0
10
20
30
40
50
60
70
80
%
Critério de Compra
A
Sim Não0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
%
B
Figura 4. Frequência dos consumidores para critério de compra do suco (A) e se estão
dispostos a pagar mais por um suco com maior propriedade funcional (B).
A Figura 5A aborda a ordem da forma como os provadores costumam consumir os
5 tipos de suco sugeridos no questionário. Como primeira opção, a maioria (55%) relatou
que consome o suco na forma in natura, seguido do suco industrializado de caixa
148
consumido por 25% dos provadores como primeira opção. A polpa na forma congelada, o
suco artificial e o concentrado são consumidos por uma pequena faixa dos provadores
como primeira opção, com cerca de 8, 6 e 5%, respectivamente.
1 2 3 4 5
0
10
20
30
40
50
60
70
%
Ordem de Frequência do Consumo
innatura
Industrializado de caixa
Polpa congelada
Artificial
Concentrado
A
1 vez 2 vezes 3 vezes 4 vezes 5 vezes 6 vezes Diário
0
5
10
15
20
25
30
%
Consumo Semanal
B
Figura 5. Distribuição de frequência dos provadores para ordem do modo de consumo de
suco (A) e consumo semanal de suco (B). 1 – Primeira opção; 5 – Última opção.
Entre as ordens de frequências 2, 3 e 4, houve uma maior distribuição de frequência
do modo de consumo, para os tipos de suco industrializado de caixa e polpa congelada, não
havendo uma ordem preferencial. Porém, observa-se que a opção por consumir o suco
artificial é cada vez mais direcionada como última opção, ou seja, a maioria dos provadores
consome o suco artificial após o critério ter passado pelos outros tipos de suco. O fato é
evidenciado na opção 5 de consumo, com cerca de 65% dos provadores consumindo o suco
artificial em último caso. Observa-se também que a redução do consumo do suco in natura
está diretamente ligada à diminuição da prioridade de consumo. Isto indica que o suco in
natura está entre os primeiros critérios dos provadores entrevistados. Trabalhos científicos
sugerem um baixo consumo de alimentos naturais entre crianças e adolescentes, como
149
consequência, há um maior consumo de fast-foods, doces e bebidas artificiais com adição
de açúcar, como sucos e refrigerantes (Triches & Giugliane, 2005).
A Figura 5B mostra a frequência do consumo de suco pelos provadores durante a
semana. Nota-se que nenhum provador alegou consumir o produto uma única vez por
semana e à medida que o número de vezes é aumentado a frequência de consumidores
também é acrescida, o que indica que a maioria (28%) utiliza o suco diariamente. Uma
exceção é observada no número 6 de vezes de consumo, em que houve uma redução
drástica de 26% na frequência de 5 vezes para 8% em 6 vezes. De forma geral, o gráfico
mostra a importância de quanto o consumidor está ingerindo suco com mais frequência
uma vez que o consumo de suco é importante como alternativa de aproveitar as
propriedades nutricionais do fruto de forma prática quando esta opção tem por
consequência aumentar disponibilidade e vida de prateleira do produto (Cullen, Himes,
Baranowski, Pettit, Stevens, Slawson, Obarzanek, Murtaugh, Matheson, Sun & Tochon
(2004).
A relação de preferência do consumidor para o tipo de fruta que produz um suco
mais aceitável, saudável e funcional como opção está apresentada na Figura 6. Os escores
da Figura 6A mostram que o suco mais aceito pelos consumidores é o de laranja, com cerca
de 46% dos votos, seguido por maracujá e uva com 20% de aceitação cada. Em menor
escala como primeira opção também foram citados os sucos de abacaxi e tamarindo, além
de outros que englobam melancia, goiaba, cupuaçu e pêssego. Da segunda à quinta ordem
de preferência nota-se que houve um decréscimo substancial na frequência de aceitação dos
sucos de laranja e maracujá, em contrapartida um aumento para o suco de tamarindo. Esta
ordem de critério para o tamarindo pode ter influenciado diretamente nos resultados de
150
aceitação para as diferentes formulações de suco estudadas anteriormente, considerando
também que aproximadamente metade (48%) dos entrevistados nunca haviam provado o
suco do fruto. A variações com tendências para diminuir ou aumentar a frequência para
maracujá, uva e abacaxi não foram observadas entre as opções 3 e 5 de consumo. Os
entrevistados relataram uma série de outros frutos como, pêssego, maçã, melancia, jenipapo
e outros que seriam consumidos em último caso (ordem 6), motivo pelo qual esta
frequência atingiu 65%.
1 2 3 4 5 6
0
10
20
30
40
50
60
%
Ordem de Preferência
Laranja
Maracujá
Uva
Tamarindo
Abacaxi
Outros
A
1 2 3 4 5 6
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90%
Ordem de Opinião
Laranja
Maracujá
Uva
Tamarindo
Abacaxi
Outros
B
Figura 6. Ordem de opinião para qual tipo de fruta que produz um suco mais aceitável (A) e
suco mais saudável e funcional (B). 1 – Primeira opção; 6 – Última opção.
A Figura 6B, traz a frequência para a opinião dos provadores sobre qual fruto
apresenta características mais saudáveis e funcionais. Pode ser observado que na opinião da
maioria dos provadores, os sucos de laranja e uva apresentam as melhores qualidades
funcionais com cerca de 35 e 41% dos provadores, respectivamente. Em menores
proporções seguem o suco de tamarindo (8%), abacaxi (6%) e maracujá (5%). Em última
opção outros frutos não sugeridos formaram o maior percentual de hipóteses dos
151
consumidores com um somatório de 83%. Nenhum dos consumidores citou os sucos de
laranja e abacaxi na sexta ordem, sendo que houve uma queda considerável para frequência
dos entrevistados da ordem 5 para ordem 6 de 35% para 6%. A frequência obtida a respeito
da funcionalidade do tamarindo ficou bem distribuída entre as ordens, provando que houve
uma grande variação na opinião dos julgadores sobre o fruto.
A Figura 7 mostra as notas médias atribuídas pelos consumidores de diferentes
regiões para o suco de tamarindo. Nota-se que a média das notas dadas pelos provadores da
região Nordeste ao suco de tamarindo foi significativamente (p<0,05) maior que as notas
ofertadas pelos julgadores do Sudeste e Sul do Brasil. As demais regiões (Norte, Centro-
Oeste e outros países) tiveram notas intermediárias, se igualando significativamente aos
provadores do Nordeste, Sul e Sudeste. Estes comportamentos indicam que a região de
origem dos provadores pode influenciar diretamente nos resultados obtidos para o teste de
aceitação, uma vez que o paladar é formado pelos costumes e cultura regionais (Edwards,
Kipps & Thomson, 1988). O teste de aceitação realizado anteriormente pode ter
apresentado grandes variações nos resultados devido à grande discrepância das notas
atribuídas para cada provador que por sua vez esteve distribuído em diferentes regiões de
origem. Para o atributo sabor, por exemplo, as notas variaram de 4,37±2,10 à 5,69±2,29
com altos valores nos desvios padrões. Observando as notas dos provadores para cada
estado individualmente, também se pode notar que os coeficientes de variações também são
altos, exceto para os julgadores de ―outros países‖ que não apresentaram variação. Este fato
também pode ter colaborado para os resultados obtidos nos testes de aceitação. Porém, de
forma geral, é possível supor que o néctar de tamarindo não teria boa aceitação se
152
comercializados nas regiões Sul e Sudeste, em contrapartida, poderiam ser bem aceito pelos
consumidores das regiões Norte, Nordeste e outros países.
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Figura 7. Notas referentes ao quanto os consumidores de diferentes regiões gostam do suco
de tamarindo. Notas: 0 – 10;
4. Conclusão
Mudanças do local de colheita e os diferentes lotes do mesmo local apresentaram
diferenças nos resultados de acidez total titulável e teor de sólidos solúveis totais. O teste
sensorial de diferença do controle mostrou que a depender da concentração adicionada, o
consumidor passa a notar diferença entre as amostras para os diferentes atributos e a região
de origem do fruto em alguns casos influenciou nesta intensidade. Apesar da similaridade
encontrada entres os resultados de análise sensorial, notou-se que à medida que se adiciona
o extrato liofilizado ao néctar, a rejeição à amostra tende a ser aumentada.
153
De acordo com o perfil do consumidor que avaliou as amostras de néctar de
tamarindo, é possível que os critérios como o conhecimento do fruto e as diferentes regiões
de origem dos provadores tenham influenciado de forma significativa na aceitação do
produto. Desta forma, é levantada a hipótese de direcionamento futuro da produção para
uma região específica de maior aceitabilidade, como ficou evidenciado para o Nordeste.
Certamente os resultados seriam mais favoráveis se o teste fosse realizado com uma
população específica que tem o hábito de consumir o fruto, no entanto, investimentos no
marketing para revelar a importância e as propriedades do néctar de tamarindo também
podem influenciar o aumento do seu consumo nas regiões onde o fruto tem baixa aceitação.
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157
ANEXOS
158
159
160
CONCLUSÃO GERAL
Com base nos resultados, pode-se concluir que a adição do extrato aquoso
liofilizado da semente de tamarindo, obtido a partir da condição ótima de extração aquosa,
à polpa de tamarindo oriunda de diferentes regiões do Brasil, apresentou efeito significativo
no enriquecimento e aproveitamento do fruto. Com o acréscimo do extrato liofilizado à
polpa, houve um aumento significativo das propriedades antioxidantes do néctar, bem
como uma redução da ação hemolítica provocada nas células, podendo ser indicado como
uma boa opção de enriquecimento.
Da mesma forma, a semente de tamarindo mostrou um alto potencial em matéria
graxa com relação à composição de ácidos graxos insaturados e tocoferóis (considerados
antioxidantes naturais). Assim sendo, a exploração da semente em relação à fração lipídica
é uma alternativa de reaproveitamento de resíduos que pode ser estudada futuramente.
As características sensoriais do néctar elaborado com o extrato aquoso liofilizado da
semente e a polpa liofilizada mostrou possuir diferenças significativas com o néctar sem
adição de extrato, porém, sem prejudicar a sua aceitação. Desta forma, o enriquecimento da
polpa pode ser uma excelente alternativa para o reaproveitamento da semente do fruto. Nas
concentrações utilizadas, os extratos promoveram o aumento das propriedades bioativas,
bem como não provocaram rejeições por parte dos consumidores.
Assim sendo, o extrato aquoso em pó resultante do processo de liofilização do
extrato aquoso da semente de tamarindo poderá ser uma opção de uso para enriquecer
outros alimentos com a função de melhorar a bioatividade e manter as características
sensoriais aceitáveis, bem como melhorar o aproveitamento de resíduos das indústrias
processadores do tamarindo, aplicando o sub-produto para fins alimentícios.
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