細胞の増殖とdna複製 - kpuseika.kpu.ac.jp/~k_ushida/seiri8(08).pdf5' 5' 3'...

細胞の増殖とDNA複製

M期

S期

G１ 期

G２ 期G０ 期

増殖

細胞周期とその調節

Ｓ期

間期

分裂準備

２ｈ

細胞分裂

２ｈ

Ｇ１期

Ｇ０期静止期

WT1

RBp53

ガン抑制遺伝子産物によるブレーキング

Ras

Myc

Fos

Jun

ガン遺伝子による加速

Ｇ２期 Ｍ期

5'

5'

3'

3'

5'

5'

3'

3'

ＤＮＡポリメラーゼは5' 3'方向に複製していく．

複製のとっかかり（ プライマー ）が必要＝ＲＮＡ

リーディング鎖のコピーは一気に．ラギング鎖のコ

ピーは小さい 岡崎フラグメント をつなぎ合わせるや

りかたで．このRNAプライマーは消失後すぐにＤＮ

Ａリガーゼで修復される

5'

5'

5'5'

5'

複製のリーディング鎖

複製のリーディング鎖 複製のラギング鎖

複製のラギング鎖

5'

5'

3'

3'

3'

5'

5'

3'

末端ＲＮＡは分解され消失する

１１

複製基点の認識

ヘリカーゼ 二本鎖DNAの水素結合切断（ATPの消費）

DNAジャイレース（トポイソメラーゼ）：DNA二本鎖切断、鎖を回転、切れ目を閉じる

1本鎖DNA結合タンパク質（SSB) 再会合（アニーリング）の防止

RNAポリメラーゼ（プライマーゼ）複製基点にRNAプライマー（4-15ｂｐ）を作る

DNAポリメラーゼ RNAプライマーの後ろ（3’末端から）に5’→3’方向に合成（リーディング鎖）

DNAポリメラーゼ RNAプライマーの後ろ（3’末端から）に5’→3’方向に合成（リーディング鎖）

DNAポリメラーゼ：二量体（リーディング鎖用とラギング鎖用）

ラギング鎖の合成 DNAポリメーラーゼが鋳型配列を読み取る方向と合成方向が逆向き

ラギング鎖の鋳型鎖をねじってポリメラーゼの中を通す

細胞分裂と寿命の問題を考える寿命はなぜ決まっているのか老化、加齢の問題とは何か

DNA複製における末端の問題

加齢による機能の衰え＝老化老化：多細胞生物に固有の現象

単細胞生物 細胞分裂をしながら現在まで何億年も生存してきた．

多細胞生物 種に固有の平均寿命を持っている．

老化の現象４０㎠の傷の治癒日数

14 28 42 56 700

40

30

20

10

0

40才

30才

20才

この遅延化は，

①細胞自身の持つ増殖能力にあるのか

②細胞が増殖するために必要な細胞外環境にあるのか細胞自身に原因を求める

コラーゲンの劣化，ホルモンや免疫系の衰え血管系の障害の進行

細胞の分裂寿命

（Proliferative lifespan）

組織

トリプシンでほぐす

シャーレにまく

２代培養細胞1 PDL

集団倍加レベル

（Population doubling level=PDL）

仮に，継代のたびに４倍希釈でまき直

せば１継代毎に2PDLずつ増加

８倍希釈してまき直せば3PDLずつ増加

＊初代培養でシャーレ一杯になるま

での分裂回数がわからないのでこれ

は無視する

ヒト胎児器官から分離した細胞の分裂寿命

起源組織

心臓

肝臓

肺臓

平均ＰＤＬ

9.85

19.75

46.24

いくらでも増殖を続ける細胞はない．100回を越える

分裂寿命を持つものはない

分裂寿命は，由来臓器によって異なる

分裂寿命は細胞固有の性質である

５０回の分裂の最期に近づくと増殖が次第に遅くなって

細胞はG0期にはいって戻らなくなる

75

50

25

0

PDL

0-

10

10-

20

20-

30

30-

40

40-

50

50-

60

60-

70

70-

80

80-

90

繊維芽細胞供与者の年齢と分裂寿命の関係

Martinら　1970

（才）

遺伝的早老症（Progeria）

ワーナー症候群（Warner Syndrome）

老化を支配する遺伝子？

早く老化してしまう病気（遺伝病）

75

50

25

0

PDL

0 10 20 30 40 50 60 70 80

繊維芽細胞分裂寿命と早老症

（Goldstein,1978）

対照群平均

細胞の分裂寿命は遺伝子に

支配されている

セントロメア

テロメア

（telomere）

１．ヒト遺伝子の構造

ヒト染色体

細胞分裂中期の様相

細胞分裂に先立って複製された染

色体がセントロメア（動原体）に

よって束ねられている

原核生物（細菌）の遺伝子構造

真核生物（菌類・高等植物・動物）

の遺伝子構造

テロメア領域

直鎖の２本鎖構造・端がある

テロメア領域

5'- TTAGGG TTAGGG TTAGGG -----3'

６塩基を単位とする反復配列（repeated

sequence）（TTAGGG）n.

ヒトでは2,000以上反復（１２Ｋｂ）

５’ ３’遺伝子 遺伝子 遺伝子

染色体のＤＮＡ分子

テロメア テロメア

サブテロメアサブテロメア

ＤＮＡ複製のたびにテロメアは短くなる

９

線状２本鎖ＤＮＡの複製問題

5'

5'

3'

3'

5'

5'

3'

3'

ＤＮＡポリメラーゼは5' 3'方向に複製していく．

複製のとっかかり（ プライマー ）が必要＝ＲＮＡ

リーディング鎖のコピーは一気に．ラギング鎖のコ

ピーは小さい 岡崎フラグメント をつなぎ合わせるや

りかたで．このRNAプライマーは消失後すぐにＤＮ

Ａリガーゼで修復される

5'

5'

5'5'

5'

複製のリーディング鎖

複製のリーディング鎖 複製のラギング鎖

複製のラギング鎖

5'

5'

3'

3'

3'

5'

5'

3'

末端ＲＮＡは分解され消失する

１１

1930年代　B. McClintock

　　　　　 H.J. M u ller

末端を欠いた染色体が融合しやすいことを発見

Muller : テロメア(telomere)という用語の提唱

1972年　E.H. Blackburn

ゾウリムシ( Tetrahymena)でテロメアDNAの

繰り返し配列を発見

1972年　J.D. Watson

５’末端の末端複製問題の提起

1984年　C.W. Greider

テトラヒメナにおいてテロメラーゼ活性の検出

1973年　A.M. Olovnikov

５’末端の末端複製問題と分裂時計、細胞老化機構の関連

について提案

早老症患者の細胞のテロメアも短い

10

5

0

早老症患者 対照群

kbp

(Allsoppら1992)

5 7 9 11

20

40

60

ＰＤＬ

平均テロメアサイズ（kb)

0-25歳26-51歳

51-76歳

種々の年齢のヒトから採取された繊維芽細胞の分裂可能

回数とテロメアサイズの相関

1988 年 C.W. Greider

ヒト細胞の継代培養に伴うテロメア長の短縮の発見

1990年 N.D. Hastie

ヒト組織で年齢とともにテロメア長が短縮

癌組織でテロメアが短い

1992年 C.M. Counter

テロメア短縮によって細胞の寿命がつきる

ことを証明

TAGGGTTAGGGTTAGGGTTA GGGTTAGGGTTAGGGTT

短縮したテロメアの修復酵素＝テロメラーゼ

（telomerase）

不完全な新生鎖

TAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGG-3'

ATCC-5'

AATCCCAAT

TAGGGTTAGGGTTAGGGTTA GGGTTAAATCCCAAT

TAGGGTTAGGGTTAGGGTTA

ATCC-5'

CCCAATCCCAATCCCAATCCCAAT-5'

ATCC-5'

ATCC

DNAポリメラーゼによる伸長

テロメラーゼによる伸長

(Blackburn 1991)

多細胞生物におけるテロメラーゼの発見

テロメラーゼ触媒ユニット遺伝子のクローニング

Nakamuraら(1997)Meyersonら(1997)Kilianら(1997)

触媒サブユニットの遺伝子導入と発現

Weinrichら(1997)中山ら(1998)

、

Bordnarら(1998)の実験

テロメラーゼ触媒サブユニット遺伝子をヒト網膜上皮細胞および線維芽細胞に導入し発現させた

培養細胞のテロメア長が長くなった培養細胞の分裂回数が20回以上増加した

網膜上皮細胞 54回から74回へ線維芽細胞 64回から100回

テロメアとテロメラーゼの機能についての最終証明

クローン羊ドリーのテロメア長は？

大人の羊の体細胞からクローニングしたので普通の子羊よりテロメアが短いはず？

Shielsら(1999) Nature May 27日号399巻:(316-317)Analysis of telomere lengths in cloned sheep

ドリーのテロメア長が短いことを報告

有限寿命細胞： テロメ ラ ーゼの発現がない

細胞の不死化： テロメ ラ ーゼの発現が必申_

発生初期の細胞や生殖細胞： テロメ ラ ーゼ

の発現の可能ｫあり

生殖細胞のテロメ アは体細胞に比べ非常に

長い

体細胞へ分化： テロメ ラ ーゼ発現予制

ガン細胞と テロメ ア・ テロメ ラ ーゼ

PCR法PCR法(Polymerase Chain Reaction) Kary Mullis（1986）

DNAのクローニングを必要とせず、ごく微量のDNAがあれば、標的遺伝子を簡便に解析できる。分子生物学、基礎医学、遺伝学、育種、薬学、臨床診断、犯罪捜査、考古学などなどの幅広い分野で利用され、これらの分野の研究手法に一大革命をもたらした。1993年、その功績を讃え、Mullisにノーベル医学生理学賞が与えられた。

5’- atttactcca gccatgctaa gaaagctacc-3’

3’- taaatgaggt cggtacgatt ctttcgatgg-5’

5’- atttactcca gccatgctaa gaaagctacc-3’

3’- taaatgaggt cggtacgatt ctttcgatgg-5’

加熱して、一本鎖に解離させる。

確実に解離させるため94℃や95℃にする

A-TとG-Cでは、水素結合の数が違うので結合力が異なり、A-Tの方が低い温度で解離する。

水素結合

２

３

A T

G C

5’- atttactcca gccatgctaa gaaagctacc-3’

3’- taaatgaggt cggtacgatt ctttcgatgg-5’

配列がぴったりするように人工的に合成した短いDNA分子（プライマー）をくっつける。

ctttcgatgg 5’5’atttactcca

このとき、温度を下げる。プライマー配列のAT-GCの割合でくっつく温度が異なる。たいていは、55℃前後。

温度を下げすぎると、でたらめにくっつく。

TaqポリメラーゼによるDNA鎖合成

AＰＰＰ ＰＰＰ ＰＰＰ ＰＰＰ

G C T

合成する材料としてdNTPを加えてやる。

この反応は72℃でおこなう。

７２℃でだいたい10分くらい反応させると、反応が完成する。DNAのコピーは２倍になっている

ふたたび加熱して、一本鎖に解離させる。

TaqポリメラーゼによるDNA鎖合成

2コピーが4コピー

この調子で２５サイクルくりかえすと

225倍＝33,554,432倍つまり3000万倍に増幅される。

プライマーの設計さえ間違えなければ、目的の遺伝子を大量に手に入れることができる。