cinética enzimática prof. dr. henning ulrich
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Cinética EnzimáticaCinética Enzimática
Prof. Dr. Henning Ulrich
Influência do SubstratoInfluência do Substrato
Concentração de substrato [S]: afeta a Concentração de substrato [S]: afeta a velocidade da reação;velocidade da reação;
Efeito de [S]: varia durante o curso de uma Efeito de [S]: varia durante o curso de uma reação reação SS PP;;
Velocidade inicial (Velocidade inicial (VV00): [S] >> [E] ): [S] >> [E] tempo tempo
muito curto muito curto [S] = constante. [S] = constante.
Influência do SubstratoInfluência do Substrato
[E] = cte
[S] = V0 linear
[S] = V0
V0 = Vmáx
Influência do SubstratoInfluência do Substrato
Alguns casos a Alguns casos a VV00 não pode ser medida não pode ser medida• Não existe técnica experimental;Não existe técnica experimental;• Equação química não representa a Equação química não representa a
transformação;transformação;
Velocidade da reação:Velocidade da reação:• Velocidade média de consumo ou Velocidade média de consumo ou
produção;produção;• Variação de uma propriedade no sistema.Variação de uma propriedade no sistema.
Influência do SubstratoInfluência do Substrato
Vitor Henri (1903): Vitor Henri (1903): EE liga-se ao liga-se ao SS para formar para formar ES ES passo obrigatório; passo obrigatório;
Leonor Michaelis e Maud Menten (1913)Leonor Michaelis e Maud Menten (1913)• EE combina-se reversivelmente com combina-se reversivelmente com SS ESES
kk11
E + S ES E + S ES kk-1-1
• ES se rompe ES se rompe E E ee P P kk22
ES E + PES E + P
Influência do SubstratoInfluência do Substrato
Qualquer instante da reação: Qualquer instante da reação: E E e e ESES;;
[S] [S] = velocidade da reação = velocidade da reação [S]; [S];
VVmáxmáx = todas as moléculas de = todas as moléculas de EE estiverem estiverem na forma na forma ESES enzima “saturada”; enzima “saturada”;
[S]: estado pré-estacionário [S]: estado pré-estacionário ESES;;• Estado estacionário Estado estacionário [ES] = cte; [ES] = cte;• VV00 estado estacionário. estado estacionário.
Equação Michaelis-Equação Michaelis-MentenMenten
Curva: possui a Curva: possui a mesma forma para a mesma forma para a maioria das enzimas;maioria das enzimas;
Expressa pela Expressa pela Equação de Equação de Michaelis e Menten;Michaelis e Menten;
Hipótese: limitante quebra de ES E + P.
Equação Michaelis-Equação Michaelis-MentenMenten Equação da velocidade para uma reação Equação da velocidade para uma reação
catalisada enzimaticamente e com um único catalisada enzimaticamente e com um único substrato;substrato;
Relação quantitativa entre a Relação quantitativa entre a VV00, a , a VVmáxmáx e a e a
[S] inicial relacionadas através de [S] inicial relacionadas através de KKmm..
SK
SVV
m
máx
0
Equação Michaelis-Equação Michaelis-MentenMenten
Relação numérica: Relação numérica: VV00 é metade de é metade de VVmáxmáx;;
kkmm = “afinidade” pelo = “afinidade” pelo substrato;substrato;
KKmm afinidade afinidade
máxVV 2
10
Vmáx é proporcional à [E].
Significado de KSignificado de Km m e Ve Vmáxmáx
Equação Michaelis e Menten = Equação Michaelis e Menten = dependência hiperbólica;dependência hiperbólica;
Mecanismos de reação diferentes Mecanismos de reação diferentes catalisam reações com 6 ou 8 passos;catalisam reações com 6 ou 8 passos;
Significado e magnitude de Significado e magnitude de VVmáxmáx e e KKmm varia;varia;
KKmm: depende de aspectos específicos do : depende de aspectos específicos do mecanismo de reação.mecanismo de reação.
Significado de KSignificado de Km m e Ve Vmáxmáx
KK22 << << KK-1-1 afinidade da enzima; afinidade da enzima;
KK22 >> >> KK-1-1;;
KK22 e e KK-1-1 são comparáveis a são comparáveis a KKmm função função
complexa;complexa; VVmáxmáx: número de passos da reação e : número de passos da reação e
identidade dos passos limitantes.identidade dos passos limitantes.
1
12
k
kkKm
Significado de KSignificado de Km m e Ve Vmáxmáx
Enzima na saturação: Enzima na saturação: EPEP e V e Vmáxmáx = = kk33.[Et];.[Et];
KKcatcat = velocidade limitante de qualquer = velocidade limitante de qualquer reação reação enzimas saturadas; enzimas saturadas;
KKcatcat e e KKmm = ambiente celular, concentração = ambiente celular, concentração do substrato e química da reação.do substrato e química da reação.
E + S ES EP E + PK1 K2 K3
K-1 K-2
Complexo enzima-substrato: ESv (formação) = k1 [S] [E] { v (“degradação”) = k-1[ES] + k2 [ES] = (k-1 + k2) [ES]
Estado estacionário (“steady state”): [ES] = constante
v de formação = v de “degradação” ou: k1 [S] [E] = (k-1 + k2) [ES]
[S] [E] / [ES] = (k-1 + k2) / k1 { (k-1 + k2) / k1 = Km
Constante de Michaelis
[ES] = [S] [E] / Km { [E] = [ET] – [ES] { [ES] = ([ET] – [ES]) [S] / Km
[ES] = [ET] [S] / Km – [ES] [S] / Km {[ES] + [ES] [S] / Km = [ET] [S] / Km
([ES] Km + [ES] [S]) / Km = [ET] [S] / Km { [ES] (Km + [S]) / Km = [ET] [S] / Km
[ES] = [ET] [S] / Km + [S]
[ES] = [ET] ( [S] / Km + [S] )
[ES] = v / k2 [ET] = Vmax / k2
v / k2 = Vmax / k2 ( [S] / Km + [S] )
Variável dependente:velocidade de reação, função de [S].
Constante*:velocidade máxima
Variável independente:concentração do substrato.
Constante de Michaelis:KD aparente de ES.
* “Constante”: Vmax é função de [E]total
Parâmetros CinéticosParâmetros Cinéticos
Exemplo:Exemplo:
[S] (g/L) [S] (g/L) VVoo (g/L.h)(g/L.h)
0,25 0,780,25 0,78
0,51 1,250,51 1,25
1,03 1,661,03 1,66
2,52 2,192,52 2,19
4,33 2,354,33 2,35
7,25 2,577,25 2,57
0,0
1,0
2,0
3,0
0 2 4 6 8
[S] (g/L)
Vo
(g/L
.h)
Parâmetros CinéticosParâmetros Cinéticos
Exemplo: Lineweaver-Burk
y = 0,228x + 0,3668
R2 = 0,9991
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
0 1 2 3 4 5
1/[S] (L/g)
1/V
o (
L.h
/g)
L
gK
V
K
hL
gV
V
SV
VSV
K
V
mmáx
m
máxmáx
máxmáx
m
622,0228,0
73,23668,01
Portanto,
3668,01
228,01
111
0
0
Inibidores CompetitivosInibidores Competitivos Forma estrutural = substrato Forma estrutural = substrato
competição;competição;
Porcentual de inibição Porcentual de inibição concentrações concentrações e afinidade pela enzima.e afinidade pela enzima.
Inibidores CompetitivosInibidores Competitivos
[S] [S] VVmáx máx ==
KKmm Experimento Experimento • 1º 1º [E], [S] = cte [E], [S] = cte• 2º 2º [E], [I] = cte [E], [I] = cte
1/V0 x 1/[S]
Inibidores CompetitivosInibidores Competitivos
Equação de Equação de Michaelis e MentenMichaelis e Menten
Lineweaver-BurkLineweaver-Burk
SKIK
SVV
Im
máx
1
SV
KIK
VV máx
Im
máx
11
11
Inibidores CompetitivosInibidores Competitivos
ISKK
K
V
V
mI
m
I
10
Relação entre as velocidades com e Relação entre as velocidades com e sem inibidorsem inibidor
[S] [S] = influência = influência do [I] desprezível.do [I] desprezível.
Inibidores Não-Inibidores Não-CompetitivosCompetitivos
Ocupa outro sítio Ocupa outro sítio ESES, , EI EI ee EIS EIS;;
[S] [S] = não leva = não leva todas as todas as EE produtiva;produtiva;
VVmáxmáx e e KKmm normal.normal.
Inibidores Não-Inibidores Não-CompetitivosCompetitivos
Equação da Equação da velocidade:velocidade:
Lineweaver-BurkLineweaver-Burk
IIm
máx
K
IS
K
IK
SVV
11
ImáxImáx
m
K
I
VSK
I
V
K
V1
111
1
Inibidores IncompetitivosInibidores Incompetitivos
Bloqueio de ES;Bloqueio de ES;
2 sítios ativos 2 sítios ativos II se fixa no complexo se fixa no complexo ESES;;
ESIESI = não forma = não forma PP;;
VVmáxmáx e e KKmm
Inibidores IncompetitivosInibidores Incompetitivos
Equação da velocidade:Equação da velocidade:
Lineweaver-Burke:Lineweaver-Burke:
SK
IK
S
KIV
V
I
m
I
máx
1
1
Imáxmáx
m
K
I
VSV
K
V1
111
Inibidores IncompetitivosInibidores Incompetitivos
Inibidores IrreversíveisInibidores Irreversíveis
Combinam-se com um grupo funcional Combinam-se com um grupo funcional destruição;destruição;
União covalente União covalente inibidor e enzima. inibidor e enzima.
VVmáxmáx e e KKmm ==
Inibidores IrreversíveisInibidores Irreversíveis
Equação de Equação de Michaelis e Menten:Michaelis e Menten:
SK
SEIkVV
mmáxI
][3
Inibidores IrreversíveisInibidores Irreversíveis
Lineweaver-Burk:Lineweaver-Burk: SEIKV
K
EIKVV máx
m
máxI
111
33
Influência do pHInfluência do pH
Valor de pH ótimo = atividade máxima;Valor de pH ótimo = atividade máxima;
Velocidade da reação: Velocidade da reação: pH afasta do ótimo; pH afasta do ótimo;
Influência do pH: análise dos grupos Influência do pH: análise dos grupos dissociáveis;dissociáveis;
Ácidos (Brönsted): compostos capazes de Ácidos (Brönsted): compostos capazes de dissociar-se, liberando Hdissociar-se, liberando H++..
bHNHCHCHCHCHNHCHCHCHCH
aHCOOCHCOOHCH
2222232222
22
Influência do pHInfluência do pH
HA HA A + H A + H++
pH pH HA HA A A
Aminoácidos:Aminoácidos:
pH pH -COO -COO-- captam prótons = -COOH; captam prótons = -COOH; pH pH -NH -NH33
++ são dissociados = NH são dissociados = NH22;;
Ligação eletrostática = -COOLigação eletrostática = -COO-- -- NH -- NH33++..
Influência do pHInfluência do pH
pH ótimo depende do número e tipo de grupos pH ótimo depende do número e tipo de grupos ionizáveis ionizáveis estrutura primária; estrutura primária;
Variações do pH Variações do pH afeta substrato com grupos afeta substrato com grupos ionizáveis;ionizáveis;
Estabilidade da enzima: temperatura, força Estabilidade da enzima: temperatura, força iônica, concentração de substratos ou cofatores iônica, concentração de substratos ou cofatores da enzima e concentração da enzima, entre da enzima e concentração da enzima, entre outros.outros.
Influência do pHInfluência do pH
pH 5 e 8 = não afeta a atividade;
Declínio entre pH 6,8-8 e 6,8-5 = forma iônica não adequada;
5 > pH > 8 = inativação irreversível.
Influência da Influência da TemperaturaTemperatura TT velocidade de reação = velocidade de reação = energia energia
cinética;cinética;
T T muito elevadas = desnaturação da enzimamuito elevadas = desnaturação da enzima• Rompidas as pontes de hidrogênio Rompidas as pontes de hidrogênio
alterações estruturas = nova conformação;alterações estruturas = nova conformação;• TT desnaturação desnaturação pouco acima da pouco acima da T T ótima. ótima.
Influência da TemperaturaInfluência da Temperatura
Enzimas PM 1 cadeia polipeptídica e pontes dissulfeto = estáveis ao calor;
Efeito da T = pH, força iônica e a presença ou ausência de ligantes;
Substratos protegem a enzima da desnaturação.
Influência da TemperaturaInfluência da Temperatura
K é função da T Lei de Arrhenius
RTekk
0
Influência da TemperaturaInfluência da Temperatura
Enzimas são termolábeis reação enzimática = inativação términa
Efeito da T na velocidade das reações coeficiente de temperatura
• Velocidade quando a T 10ºC.
10
log3,2 1012 QTTREa
RTekk
'0
'
Regulação da AtividadeRegulação da Atividade
Sistema enzimático: produto da reação da 1ª enzima substrato da enzima subseqüente;
Enzimas reguladoras determina a velocidade da seqüência;
• Atividade catalítica ou sinais;
Moléculas sinalizadoras pequenos metabólitos ou cofatores.
Enzimas AlostéricasEnzimas Alostéricas
Ligação não-covalente e reversível modulador;
Inibição por retroalimentação• Enzima reguladora inibida pelo P final da
via reequilibra as necessidades celulares;
Moduladores: inibidores ou estimuladores.
Enzimas AlostéricasEnzimas Alostéricas
Modulador = substrato homotrópicas; Modulador substrato heterotrópicas;
Sítio alostérico específico para o modulador;
Curva de saturação sigmóide subunidades múltiplas.
Enzimas AlostéricasEnzimas Alostéricas
curvas de variação de atividade moduladores inibidores, ativadores ou os dois tipos.
Modificação CovalenteModificação Covalente
Ligação covalente de um grupo químico à Ligação covalente de um grupo químico à sua estrutura;sua estrutura;
Metabolismo alterado Metabolismo alterado aciona vias aciona vias inativas e inibem vias ativas.inativas e inibem vias ativas.
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