cinÉtique enzymatique - esi
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BCM 2505 Cinétique enzymatique – 1 Page 1/15
Revue et prolongement du modèle michaelien
Modèle cinétique à un substrat :
- où E, S, ES et P symbolisent l'enzyme, le substrat, le complexe enzyme-
substrat, et les produits respectivement.
Selon ce modèle, lorsque la concentration de substrat devient suffisamment
importante afin de capter tout enzyme sous forme ES, la deuxième étape de la
réaction est limitante et la réaction globale devient insensible aux augmentations
supplémentaires en concentration de substrat.
- Dans une réaction enzymatique, le taux de catalyse (v) est dépendent de la
concentration du produit final par unité de temps.
- La vitesse de la réaction est donc représentée par :
- La vitesse de production de ES est la différence entre les vitesses des deux
réactions élémentaires décrivant la formation de ES et sa disparition:
- Cette équation différentielle ne peut pas être intégrée de façon explicite pour
tous les cas sans des approximations qui la simplifient.
k1 k2
E + S ⇌ ES E + P
k-1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Saturation
[S]
vit
esse
] ES [ k = t d
] S[ d - =
t d
] P [ d = v 2
] ES [ k -] ES [ k -] S[] E [ k = t d
] ES [ d 21-1
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1. Équilibre rapide
En 1913, Léonure Michaelis et Maud Menten ont assumé que k-1 >> k2 pour
que la première étape de la réaction soit toujours en équilibre. Donc Ks = k-1 /
k1 = [E][S] / [ES] qui est la constante dissociation du substrat de l'enzyme.
Le complexe non-covalent ES entre enzyme et substrat est connu par le nom
de complexe Michaelis.
2. État stationnaire
La concentration d'ES est relativement constante pendant la réaction si [S] >>
[E]. Donc, la vitesse de production de ES doit être égale à sa disparition pour
la plupart de la réaction. Par conséquent, si [ES] est relativement constant,
d[ES]/dt = 0. Désignation comme sous forme d'approximation de l'état
stationnaire proposé d'abord par Briggs et Haldane en 1925.
Points à noter dans des approximations Michaelis-Menten et Briggs-Haldane
1) La formation du produit est proportionnelle à la concentration du complexe
enzyme-substrat (ES)
2) Décomposition du complexe central représente l'étape limitante
3) Condition de mesure de vitesse doit minimiser la réaction du retour
E + P EP ES
4) Imposition de la notion de la vitesse initiale; autrement la solution est difficile
à aborder.
Traitement Briggs-Haldane; état stationnaire
L'approximation de l'équilibre rapide n’est pas appropriée dans les systèmes
biochimiques, et ce, pour plusieurs raisons :
1) Les intermédiaires enzymatiques sont chimiquement plus réactifs par rapport
à la notion de décomposition du ES lente vers le produit.
2) Le temps disponible pour une réaction d'atteindre son équilibre dans les étapes
précédentes de l'étape limitante est très souvent insuffisant; donc, pas
d'équilibre véritable entre des complexes intermédiaires.
3) Les systèmes biochimiques représentent fréquemment des séquences de
réactions consécutives où le produit devient le substrat de la réaction subsé-
quente, pas d'équilibre véritable possible.
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L’approximation simplifiée permet la dérivation mathématique d’une relation
explicite entre la vitesse d’une réaction catalysée enzymatiquement (v) et la
concentration du substrat (S); cette relation est connue sous le nom de Michaelis-
Menten.
où 1
212max ][
k
kkKetEkV MT
Donc kcat = Vmax / [E]T
Les paramètres VMAX et KM permettent de cerner trois aspects de la
catalyse :
1) Caractérisation de la spécificité enzymatique.
2) Type de mécanisme : « état stationnaire » ou « équilibre rapide ».
3) Rôle métabolique de l'enzyme.
][
][max
SK
SVv
M
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
[S]
Vit
es
se
KM
Courbe hyperbolique
Vmax
Vmax/2
Équation Michaelis-Menten Représentation graphique
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] S[] E [ K
k v
M
cat
1) Spécificité
Si la vitesse enzymatique est décrite par :
alors quand Km >> [S], [E]T [E]; donc
où kcat / Km représentent une constante apparente de deuxième ordre qui décrit la
réaction entre un enzyme libre et un substrat libre - spécificité.
- s’il y a deux substrats, S1 et S2, qui sont utilisés par le même enzyme.
- donc au même [S],
- Ce rapport de vitesses peut être utilisé afin d’évaluer la spécificité de l'enzyme
Exemple : fumarate hydratase
Substrat kcat/Km (M-1 s-1)
fumarate 1.6 x 108
fluorofumarate 9.8 x 107
chlorofumarate 2.0 x 105
bromofumarate 2.5 x 104
- L’enzyme est hautement spécifique pour le fumarate et le dérivé fluoro.
] S [] E [ )K
k( v ] S [] E [ )
K
k( v 2S
M
cat
S1SM
cat
S 2211
2
1
2
1
SM
cat
SM
cat
S
S
K
k
K
k
v
v
][
][][
SK
SEkv
M
Tcat
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2) Type de mécanisme
Si k2 > k-1 (forme extrême de l’« état stationnaire »)
Km = k2/k1 et puisque kcat = k2
kcat/Km = k1 qui est la constante de vitesse d'association entre enzyme et
substrat
L’association entre enzyme et substrat est limitée par diffusion, donc k1 ne
peut pas dépasser la valeur de la constante de diffusion du substrat ~ 109 M-1 s-1.
si kcat/Km sont de cet ordre de valeur, le mécanisme « état stationnaire » est
applicable.
Enzyme kcat/Km (M-1s-1)
fumarate hydratase 1.6 X 108
catalase 4 x 107
triosephosphate isomérase 2.4 x 108
si kcat/Km est plus petit, le mécanisme de type "équilibre rapide" s’applique.
3) Rôle métabolique
Le rôle de l'enzyme dans le métabolisme peut être évalué en comparaison avec
son KM et la concentration in vivo du substrat;
o Par exemple, l'isozyme IV de la glucokinase provenant du foie possède un KM
à 10mM tandis que les isozymes I - III (qui se retrouvent partout dans le
corps) ont tous des KM ~ 40 µM.
o Chez un individu à jeun, les niveaux de glucose sanguins sont ~ 5mM.
A cette concentration, les isozymes I-III fonctionnent "à planche"
tandis que l’isozyme IV est seulement ~25% activé. Après un repas
d’hydrates de carbone, la concentration de glucose sanguin monte à
10mM et isozyme IV fonctionnera à Vmax/2
o à cause du Km élevé de l'isozyme IV, le foie est capable de gérer le glucose
supplémentaire en glucose-6-P
o cette réaction représente la première étape de glycolyse.
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] ES [ ) k - ] P [ k+] S[ k
) k + k (] S[ k ( = v 1-
2-1
21-1
Prolongement du modèle
i) réaction réversible
La condition de conservation de masse pour la réaction avec une intermédiaire
est [E]T = [E] + [ES] et en utilisant la condition du régime stationnaire de
qui simplifie à
En faisant la substitution pour [E]= [E]T - [ES]
]ES [ 1) + ] P [ k+] S[ k
k + k( = ] E [
2-1
21-
T
La vitesse de la réaction s’exprime par
] ES [ k -] S[] E [ k = t d
] S[ d - = v 1-1
qui se simplifie en utilisant l’expression pour [E]
et en combinant avec la relation entre [E]T et [ES] on obtient
] E [ ) ] P [ k+] S[ k + k + k
] P [ k k -] S[ k k ( = v
T
2-121-
2-1-21
E + S ⇌ ES|EP ⇌ E + P
k1
k-1 k-2
k2
0 =] ES [ k -] ES [ k -] P [] E [ k +] S[] E [ k = t d
] ES [ d 21-2-1
] ES [ )] P [ k+] S[ k
k + k( =] E [
2-1
21-
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] E [ )
] P [ k + k
k+] S[
k + k
k + 1
] P [ k + k
k k -] S[
k + k
k k
( = v T
21-
2-
21-
1
21-
2-1-
21-
12
La division par (k-1 + k2) dans le numérateur et dénominateur donne ensuite
Si on définit les termes suivants :
V fmax = k2[E]T ; V rmax = k-1[E]T ;
K SM = (k-1 + k2) / k1 ; K PM = (k-1 + k2) / k-2
on obtient la relation de Michaelis-Menten pour une réaction réversible avec un
intermédiaire
Par exemple, lorsque [P] = 0, v = v0, la vitesse initiale, et l’équation devient
identique à celle de Michaelis-Menten.
Relation Haldane
À l’équilibre, v = 0, et la relation ci-haut peut être résolu et donne
o par cette relation on démontre que les paramètres cinétiques d’une réaction
réversible catalysée de façon enzymatique ne sont pas indépendants l’un
de l’autre,
o les paramètres cinétiques sont en effet reliés à travers la constante
d’équilibre de la réaction globale qui est indépendante de la présence de
l’enzyme
K
] P [ +
K
] S[ + 1
] P [ K
V -] S[
K
V
= v
PM
SM
PM
r
SM
fMAXMAX
K V
K V =
] S[
] P [ = K S
Mr
PM
f
eq
MAX
MAX
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ii) Plus qu'un intermédiaire
où ES‡ représente un intermédiaire activé
En appliquant les équations « état stationnaire », on obtient la même forme
d'équation que celle de M-M réversible sauf que l'interprétation des Vmax et Km pour
les réactions en avant et de retour seront plus compliquées puisqu’ils représentent
des fonctions de six paramètres cinétiques k1, k2, k3, k-1, k-2, et k-3.
- ceci est également juste s’il s’agit de trois ou plus intermédiaires
Il n’est pas possible de caractériser une réaction de plus qu’un seul
intermédiaire à partir des quatre paramètres cinétiques : V fmax , V r
max , KSM , et
KPM,
Les mesures cinétiques faites en régime stationnaire fournissent une
description phénoménologique du comportement de l’enzyme et laissent la nature
des intermédiaires indéterminée. Les intermédiaires doivent être caractérisés par
d’autres moyens, par exemple la spectroscopie.
Une analyse en régime stationnaire ne peut pas démontrer de façon non
équivoque le mécanisme d’une réaction. Cependant si les paramètres
cinétiques ne sont pas cohérents avec un mécanisme, ce mécanisme doit être
rejeté.
iii) Inhibition par substrat
- Décroissance de la vitesse v à hautes concentrations de substrats.
Dans la représentation double réciproque, ceci signifie une courbure croissante à la
valeur 1/[S] faible.
o Une explication possible est la liaison avec un 2e site de substrat de faible
affinité qui inhibe l'activité
k-1 k-2
E + S ⇌ ES ⇌ ES‡ ⇌ E + P k1 k2
k-3
k3
Inhibition par excès de substrat
• Cas particulier de l’inhibition incompétitive : 2 molécules de S peuvent se lier à E, mais ne
peuvent être transformées en P (autorégulation de l’activité enzymatique).
Exemple de l’excès d’acétylcholine vs acétylcholinestérase :
Site allostérique
Site actif
PDB 2HA4
E + S ES E + P
+
S
ESS
kcat
KS
KI
inactif
Bourne et al., J. Biol. Chem. 2006, 281, 29256
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Inhibition par excès de substrat (suite)
[ES]
[E][S]m K
[ESS]
[ES][S]i K
Vo = kcat[ES]
[E]T = [E] + [ES] + [ESS] i
2
m
max
[S][S]
[S]VVo
KK
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Effet du pH sur les réactions enzymatiques
Le changement de pH peut avoir plusieurs effets directs sur des réactions
catalysées de façon enzymatique :
1) inactivation de l'enzyme
2) changement dans l'état d'ionisation du substrat
3) changement dans l'équilibre d'une réaction
o par exemple :
Créatine + MgATP2- ⇌ Phosphocréatine + MgADP2-+ H+
L’augmentation du pH favorise la synthèse de phosphocréatine.
a) Dérivation du profil pH
L’effet indirect est celui du changement de l'état d'ionisation des chaînes
latérales des acides aminés, et qui sont essentiels pour l'expression de l'activité
catalytique. L'effet du pH sur la vitesse d'un enzyme peut être complexe puisque
Vmax et Km sont à la fois perturbés.
Considérant le cas où il y aurait deux chaînes latérales dont l'état d'ionisation
influence la liaison du substrat et possiblement deux autres dont l'état d'ionisation
modifie l'activité de l'enzyme
La compréhension réside dans le fait que la protonation et la déprotonation
soient parmi les réactions les plus rapides et par conséquent, ils sont toujours en
équilibre rapide avec l’enzyme. On peut donc résumer la répartition des
intermédiaires enzymatiques en fonction des constantes d’équilibres.
Par exemple, dans la réaction avec l’enzyme libre ci-haut pour les étapes:
EH + H+ ⇌ EH2+ et E- + H+ ⇌ EH
EH + S ESH +E P
E-
ES-
EH2+
ESH2+
k2k1
k-1
KE2
KE1
KES2
KES1
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Les constantes d’équilibre (dissociation) sont définies par KE1 =
[H+][EH]/[EH2+] et KE2 = [H+][E-]/[EH] (une pareille relation définie les autres
constantes d’équilibres - KES1, KES2).
La condition de conservation de l’enzyme exige, où [E]T représente la
concentration de l’enzyme totale, que :
[E]T = [ESH]T + [EH]T
Les deux termes [ESH]T et [EH]T peuvent être récrit en fonction des constants
d’équilibres en définissant :
[EH]T = [EH+2] + [EH] + [E-]
qui devient
de façon similaire, [ESH]T = [ESH+2] + [ESH] + [ES-] et qui devient
En utilisant la notion du régime stationnaire,
0][][]][[][
211 ESHkESHkSEHkdt
ESHd.
Cette relation est résolue dans la même façon comme le précédent et après la
même démarche qu’avant on obtient
Avec
] S[ + ) f
f ( K
] S[ ] E [ f
k
=H] S[E k = v
2
1M
T
2
2
2
f] H E [ = ) ] H [
K+1 +
K
] H[ (] H E [ = ] H E [
1+
E2
E1
+
T
f] H S[E = ) ] H [
K+1 +
K
] H[ (] H SE [ = ] H SE [
2+
ES2
ES1
+
T
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En définissant des valeurs apparentes de KM et Vmax par
K’M = KM (f1 / f2) et V’MAX = VMAX / f2
ceci définit alors une relation Michaelis-Menten modifiée pour les effets de pH
Cette relation nous informe que :
1. Le changement en V’MAX reflète l'état d'ionisation d'enzyme-substrat f2.
2. Le changement en V’MAX / K’M reflète l'état d'ionisation de l'enzyme libre
f1.
3. Le changement en K’M reflète l'état d'ionisation de l'enzyme libre et son
complexe enzyme-substrat f1/f2.
La vitesse initiale de beaucoup
d'enzymes démontre en fonction du pH un
profil ressemblant à une cloche prédit par
une telle relation
- par exemple : la cinétique
d’aldolase de muscle de lapin
Il n’est pas toujours possible
d’observer tout le profil de pH, de façon
expérimentale, dus aux constantes
d’ionisation qui sont soit trop acides ou
basiques
voir comportement du mutant
Glu187Gln de l’aldolase de lapin.
Mutant
Native
ESH2+ ES-
] S[ + ’K
] S[ ’V= v
M
0MAX
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Rappel : Seulement EH et ESH contribuent à la valeur catalytique et
l’échange des protons est implicite dans le régime de l’équilibre rapide.
• Ceci est raisonnable puisque la constante de deuxième ordre pour l’échange
d'un proton est rapide ~ 109 M-1 s-1.
• L'échange rapide des populations fait en sorte que les espèces EH et ESH,
possédant de la compétence catalytique, sont réduites par des facteurs f1 et f2.
L'analyse des pKa
L’étude des profils de pH de l’enzyme consiste à analyser les paramètres
cinétiques, V’max et K’M, déterminés à des pH différents, en fonction des constantes
d'ionisation, KE1, KE2, KES1, et KES2.
• La variation de V’MAX en pH, décrite par la fonction f2, dépend uniquement
des valeurs de KES1 et KES2.
• La variation du rapport V’max/K’M en pH, décrite par la fonction f1, informe
uniquement sur les valeurs de KE1 et KE2.
• La détermination mathématique des valeurs KEi et KESi est faite par des
méthodes d’estimation non-linéaire disponibles sous forme logicielle.
Cependant, à partir d’inspection visuelle des graphiques, soit V’MAX vs pH ou
V’max/K’M vs pH, il est possible d’obtenir des estimations approximatives.
Les pKa (log KEi ou log KESi) fournissent des indices importants sur l'identité
des acides aminés au site actif.
Rappel : pKE1 = - logKE1, pKE2 = - logKE2, pKES1 = - logKES1, et pKES2 = - logKES2
Alors,
1. Les pKEi informent sur l’identité des acides aminés impliqués dans
l’interaction de l’enzyme avec le substrat
2. Les pKESi informent sur l’identité des acides aminés impliqués dans la
catalyse.
➢ pK ~ 4 suggère qu’un résidu Asp ou Glu soit essentiel pour l'activité de
l'enzyme.
➢ Des valeurs pK ~ 6 ou ~ 10 indiquent des résidus His ou Lys.
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Cependant, les pKa des acides aminés peuvent être modifiés au sein du site actif
de plusieurs façons importantes.
1. Le groupement carboxylate d'un résidu Asp en pont salin (électrostatique) avec
un groupement Lys est stabilisé par la charge positive de Lys et possède un pKa
plus bas (plus difficile à protoner).
2. Inversement un groupement aminé dans une région peu polaire est moins basique
que dans une région polaire. Dans ce cas, il s’agit du fait qu’un résidu chargé est
toujours plus difficile à stabiliser dans une région hydrophobe que sa forme
neutre correspondante.
3. Également, il existe la possibilité que deux acides aminés voisins (distance ~ 3-
4Å – pont hydrogène) possédant la même charge qui déstabilisera une des deux
charges en le rendant neutre.
Donc il faut être prudent dans l'identification des groupements essentiels pour
l'activité catalytique.
N C
O
O
H
HH
pKa
Lys Asp
NH3
pKa
NH2 Micro-environnement
hydrophobique
NH3
pKa
NH2NH3 NH3
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