começando a decifrar... o fenômeno de restrição-modificação infecções com bacteriófagos em...
Post on 07-Apr-2016
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Começando a decifrar...
O fenômeno de restrição-modificação
K B
Cepa K OK
Cepa B OK
Infecções com bacteriófagos em diferentes cepas bacterianas produziam o fenômeno de restrição-modificação.
Arber, 1962Nathans & Smith, 1962
Enzimas de restrição
Clivagem de restrição
Sítio de Restrição
Nomenclatura das enzimas de restrição
EcoRI Escherichia coliBamHI Bacillus amyloliquefaciens RHBglII Bacillus globigiiPvuII Proteus vulgarisHindIII Haemophilus influenzae RdHinfI Haemophilus influenzae RfSau3A Staphylococcus aureusAluI Arthrobacter luteusTaqI Thermus aquaticusHaeIII Haemophilus aegyptiusNotI Nocardia otitidis-caviarum
Fracionamento de DNA
Mapa de Restrição
Utilização do Mapa
Detectar mutações
Comparação de Mapas
Fracionamento de DNA
Como reconhecer o fragmento de interesse?
Complementariedade
Hibridação
Calor ou pH = desnaturação
Reassociação
Temperatura e força iônica
Sonda
Marcação da sonda
Estringência
Reação de Hibridação e Lavagem:• especificidade da sonda• tamanho da sonda• temperatura (T’m)• força iônica
Especificidade : identidade de seqüência
Tamanho: fragmento/ oligonucleotídeo
Temperatura: T’m - 25oC
Força iônica: NaCl
Southern blot
Resultado
Hibridação in situ
Localização de mRNA de ciclina (uma proteína que incita a célula a se dividir) = azul escuro
Em azul claro os núcleos corados com DAPI
Southern blot
Animação
Southern.exe
O que fazer com o fragmento?
Clonagem de DNA
A clonagem permite a eternizar o fragmento
Um pedaço de DNA de um eucarioto poderia ser
produzido por um procarioto.
Vetores de clonagem
1. Replicação autônoma2. Marcas de seleção3. Sítio para clonagem
O que deve ter uma molécula para ser um veículo de clonagem?
Sítio de clonagem
O sítio de restrição deve estar nas duas moléculas a serem ligadas.Após a clivagem, as extremidades são recombinadas e a enzima LIGASE refaz a ligação fosfodiester.
Plasmídio recombinante
Transformação
Hospedeiro: E.coli fenótipo e genótipo seleção, contenção,multiplicação
Hospedeira transformada
Clonagem molecular
Outro vetor?
Bacteriófagos e, mais recentemente, cosmídios são utilizados como vetores de clonagem, principalmente quando se deseja inserir um fragmento de DNA com tamanho de ~40 kb.YACs - fragmentos maiores ainda.
Biblioteca Genômica
Genoteca
Varredura de biblioteca
Seqüenciamento de DNA
Princípios
Reação em cadeia de polimerização
1. Replicação
PCR
2. Amplificação
PCR - ANIMAÇÃO
Pcr.exe
Um momento, por favor, estou carregando o programa.
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