cosa sono e cosa servono gli allergeni e gli epitopi ricombinanti nella diagnosi di allergia...

Cosa sono e cosa servono gli allergeni e gli epitopi

ricombinanti nella diagnosi di allergia alimentare

Dott. Alberto Martelli

Melloni Pediatria Milano

Milano

1 Febbraio 2008

Variabilità degli estratti per prick e RAST

Estratti di fonti diverse, pur se definiti allo stesso modo possono contenere miscele di proteine qualitativamente e quantitativamente molto diverse tra loro, il che ovviamente condiziona molto l’esito dei test

Grier TJ et al. Allergy Asthma Proc 2002;23:125-31.

Dolen WK. Ann Allergy Asthma Immunol 1995;75:81-2.

Come si ottengono gli allergeni? L’estrazione e la purificazione

Gli allergeni possono essere proteine solubili e glicoproteine. Le strategie utilizzate per la loro purificazione sono le stesse di quelle adottate per la purificazione delle proteine in generale.

Il primo passo consiste nell'estrarre dal materiale grezzo la massima quantità di allergene, con la minima degradazione o denaturazione possibile.

Scheurer S. Clin Exp Allergy 2006;36:1483-6.

L'identificazione e la caratterizzazione degli allergeni avviene per mezzo di tecniche immunochimiche, biochimiche e di biologia molecolare. I metodi più comunemente usati sono:

- la immunoelettroforesi migrazione elettroforetica con Ab specifici

- la SDS - PAGE (sodium dodecyl sulphate - polyacrylamide gel electrophoresis): peso molecolare

-l'isoelettrofocalizzazione (IEF), in associazione con tecniche di immunoblotting: punto isoelettrico (è il valore di pH al quale una molecola non reca alcuna carica elettrica netta).

-Per alcune limitazioni di queste tecniche, spesso si rende necessario l'impiego contemporaneo di più metodi per poter giungere a risultati definitivi.

Tecniche per identificazione dell’allergene

SDS page

Isoelettrofocalizzazione

Libraries di un DNA complementare

Il principio della clonazione molecolare è basato sulla preparazione o l'isolamento del DNA che codifica il polipeptide rilevante per inserirlo in un plasmide o in un vettore batteriofagico, che può essere successivamente utilizzato per infettare un microrganismo come l'Escherichia coli.

Il plasmide o il batteriofago si moltiplicano all'interno dell'Escherichia coli producendo colonie trasformate (nel caso del plasmide) o placche (nel caso del batteriofago).

Braren I, et al. Clin Chem 2007;53:837-44.

284 aminoacidi del Pen a 1

Reese G, et al. Clin Exp Allergy 2006;36:517-24.

Reese G, et al. Clin Exp Allergy 2006;36:517-24.

Analisi spettroscopica

Cos’ è un epitopo?

L’epitopo, o determinante, é la componente strutturale dell’allergene responsabile dell’interazione specifica con l’anticorpo IgE.

Sampson HA. J Allergy Clin Immunol 2004;113:805-19.

Gli epitopi lineari e conformazionaliGli epitopi lineari e conformazionali

Siero albumina bovina

Epitopi della siero albumina bovina

Restani P. Allergy 2004;59 Suppl 78:21-4

Come possiamo utilizzare queste Come possiamo utilizzare queste informazioni nella diagnostica ?informazioni nella diagnostica ?

Diagnosi primaria di allergia alimentareDiagnosi primaria di allergia alimentare

Precoce predizione della persistenza dell’allergia Precoce predizione della persistenza dell’allergia

alimentarealimentare

Predizione di reazione severa al TpoPredizione di reazione severa al Tpo

Determinazione delle cross-reattivitàDeterminazione delle cross-reattività

Harwanegg C. et al. Clin Exp Allergy 2003;33:7-13.

La tecnica dei microarray

Diagnosi di sensibilizzazioneDiagnosi di sensibilizzazione

Hiller R, et al. FASEB J. 2002;16:414-6.

• r Dau c 1.0104, r Dau c 1.0201 e r Dau c 4 erano clonati attraverso E. Coli.

• Erano valutati i sieri di 40 pazienti allergici alla carota con challenge positivo

• 98% dei pazienti allergici alla carota erano positivi ad almeno un ricombinante 98 % rDau c 1.0104 65% rDau c 1.0201 38% to rDau c 4

Ballmer-Weber BK. Clin Exp Allergy 2005; 35:970–8

Allergia alla carota

Allergenitestati

Performancedel test

  Sen (%;CI) Spe(%;CI)

CM SPT 97.91(92.60-103.22)

76.00(60.44-91.55)

sp IgE Ab 100(100-100)

80(65.42-94.57)

nBos d4 62.5(44.49-80.50)

86(73.35-98.64)

nBos d5 62.50(33.50-70.65)

86(85.34-102.65)

nBos d8 58.33(40-76.66)

88(76.16-99.83)

 Fiocchi A. data on file

I test con l’allergene naturale purificato

Sampson HA. J Allergy Clin Immunol 2004;113:805-19.

Precoce predizione della persistenza Precoce predizione della persistenza dell’allergia alimentaredell’allergia alimentare

Ovomucoide ed epitopi lineari

• Ovomucoide è una proteina glicosilata composta da 186 aminoacidi (Gal d 1.1, 1.2 e 1.3).

• I 3 domini dell’ovomucoide erano isolati e valutati con sieri di pazienti allergici all’uovo.

• Una protratta allergia all’uovo è associata alla presenza di significative quantità di IgE anti epitopi lineari (sequenziali) mentre le forme a rapida tolleranza erano associate ad IgE verso epitopi conformazionali.

Cooke SK, et al. J Immunol 1997;159:2026-32.

Più lunga tolleranza all’uovo se IgE per lineari

2/3 degli allergici all’uovo sono tolleranti nei primi 5 anni di vita

- Si è valutato il legame delle IgE di bambini con allergia all’uovo, transitoria o persistente, rispetto agli epitopi conformazionali o sequenziali (lineari) di ovomucoide, ovoalbumina, ovotransferrina.

-I bambini con protratta allergia all’uovo presentano IgE elevate contro epitopi sequenziali dell’ovomucoide e dell’ovoalbumina (P < 0.01).

-La presenza sierica di IgE diretti contro epitopi lineari dell’ovomucoide dovrebbero essere usati come strumento per identificare i casi a più lenta risoluzione.

Järvinen KM, et al. Allergy 2007;62:758-65.

Järvinen KM, et al. Allergy 2007;62:758-65.

IgE contro epitopi lineari dell’ovomucoide

Beyer K, et al. J Allergy Clin Immunol 2005;116:704-5.

Le IgE leganti peptidi per il latte vaccino

Beyer K, et al. J Allergy Clin Immunol 2005;116:704-5.

Cosa accade per i singoli peptidi?

MAL D 1= difensina (termolabile)

MAL D 2 = poco importante allergologicamente

MAL D 3 = Lipid Transfer Protein (termostabile)

MAL D 4 = bet v2= può dare SOA

Predizione di reazione severa al TpoPredizione di reazione severa al Tpo

La peluria della pesca è ricca di LTP

• Allergia a LTP comune nell’area mediterranea ma assente nei Paesi nordici.

• Le pesche sono il principale agente sensibilizzante a LTP• Gli allergici a LTP della pesca spesso tollerano altre

Rosacee e sono cuti e RAST negativi alle loro LTP• La peluria della pesca contiene elevate quantità di LTP

che esiste anche nella buccia• La peluria della pesca induce la sensibilizzazione a LTP • La peluria viene eliminata durante il trattamento della

pesca mediterranea prima di andare a mercati lontani• La rimozione sistematica della peluria diminuisce

l’allergenicità della pesca.

Asero R, et al. Allerg Immunol (Paris). 2006;38:118-21.

Cross-sensibilizzazione: presenza di IgE che reagiscono con proteine di origine differente portatrici di epitopi simili od identici

Cross-reattività: reazione clinica ad agenti diversi, alimentari e/o inalanti, dovuta a cross-sensibilizzazione. 

Predizione della cross-reattività:

le definizioni

Brusic V. et al. Allergy 2003;58:1083–1092

CMA

BA

100%

13-20%

Frequenza di BA in CMA

Martelli A. et al. Ann Allergy Asthma Immunol 2002;89(6 Suppl 1):38-43.

La monosensibilizzazione é rara

Beyer K. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2003;3:189-97.

Probabilità di reazione

ad alimenticross reattivi

Sicherer SH.J Allergy Clin Immunol

2001;108:881-90

I limiti del test…

• Non è stata ancora segnalata la sensibilità e la specificità del test per singola molecola allergenica.

• Pochissimi lavori che esprimano la riproducibilità del test.

• A seconda della fase solida che lega l’allergene risultati possono essere differenti

• Difficile predizione della reazione clinica• Pertanto impossibile per ora collocarlo nell’iter

diagnostico

A cosa servono?

Diagnosi primaria di allergia alimentareDiagnosi primaria di allergia alimentare -

Precoce predizione della persistenza Precoce predizione della persistenza dell’allergia alimentaredell’allergia alimentare +/ -

Predizione di reazione severa al TpoPredizione di reazione severa al Tpo - /+

Determinazione delle cross-reattivitàDeterminazione delle cross-reattività +

Cosa speriamo di aspettarci

• Una specifica identificazione delle molecole allergeniche per il bambino allergico

• La riscrittura della storia naturale di alcune allergie alimentari in base alle molecole allergeniche coinvolte.

• Lo studio di sottogruppi, per le singole allergie alimentari, che potrebbero avere corrispondenza al test di provocazione orale

• La possibilità di utilizzare un vaccino sub-linguale specifico per desensibilizzare il bambino (esperienza in Spagna dell’LTP nello studio EXPO)

• Informazioni ulteriori per le cross-reattività • Sapere se c’è corrispondenza fra tipo di patologia allergica

espressa e la presenza di reattività a particolari molecole allergeniche.

Sarà così lo scenario futuro?

Harwanegg C. et al. Clin Exp Allergy 2003;33:7-13.

Conclusioni

• Il test permette di acquisire informazioni sempre più complete e dettagliate, ma anche di sempre più difficile interpretazione.

• Tali esami devono essere considerati come test di 3° livello, da effettuarsi per approfondire la diagnostica di particolari sottogruppi di bambini già sottoposti ai test classici.

• Molta strada va percorsa per conoscere vantaggi e limiti delle nuove tecnologie, definirne uso ed abuso, e arrivare infine a tracciare adeguate

linee-guida per il loro impiego clinico.