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DESARROLLO DE NUEVAS ESTRATEGIAS PARA LA
GENERACIÓN DE CÉLULAS PRODUCTORAS DE INSULINA
A PARTIR DE CÉLULAS SOMÁTICAS Y PLURIPOTENTES
INDUCIDAS
Rosa Gasa Arnaldich
Institut d'Investigació Biomèdica August Pi i Sunyer
Sylvia Bedford
CMRB Centre Medicina Regenerativa de Barcelona
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1. Resumen del proyecto
La pérdida de células β pancreáticas causa la diabetes tipo 1 (DT1). La terapia celular
es una alternativa prometedora a las inyecciones diarias de insulina para el tratamiento
de esta enfermedad. En la actualidad la única fuente de células β son los islotes
pancreáticos procedentes de donantes, pero su disponibilidad es limitada. El desarrollo
de terapias basadas en el uso de células madre, embrionarias e inducidas (o iPSC) ha
abierto la esperanza a una cura para la diabetes, pero los protocolos de diferenciación
dirigida no son lo suficientemente eficientes y las células β generadas son inmaduras
desde el punto de vista funcional.
Los mecanismos epigenéticos son claves en la determinación del linaje celular. Entre
estos, la metilación de las histonas altera la estructura de la cromatina y regula los
cambios de perfiles transcripcionales asociados a los programas de diferenciación.
Propusimos que la modulación de estas modificaciones epigenéticas podría ser una
estrategia para promover el destino β en protocolos de diferenciación dirigida a partir
de células madre. Por otra parte, la utilización de células pluripotentes como fuente de
células β para el trasplante conlleva el riesgo de tumorogénesis asociado a estados de
pluripotencia. Por esta razón, en el marco de este proyecto también hemos investigado
la posibilidad de convertir fibroblastos del piel humanos en células productoras de
insulina mediante el proceso de reprogramación o transdiferenciación directa (sin pasar
por un estado intermedio de pluripotencia) combinando factores de transcripción
promotores de linaje β con moduladores de la cromatina.
2. Resultados
El factor epigenético Jarid2 participa en la diferenciación terminal de las
células β durante el desarrollo embrionario.
Hemos observado que los progenitores endocrinos pancreáticos embrionarios están
enriquecidos en el factor epigenético Jarid2 y que la expresión génica de este factor
está modulada positivamente por el factor proendocrino Neurogenina3 in vitro. La
eliminación de Jarid2 en progenitores pancreáticos murinos resulta en una disminución
de la masa celular β al nacer y en intolerancia a la glucosa en la edad adulta. Mediante
el estudio de perfiles transcripcionales globales en el páncreas de embriones control y
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embriones deficientes en Jarid2, hemos concluido que este factor es necesario para la
activación adecuada de genes que codifican proteínas involucradas en la función β pero
no para la de genes involucrados en la activación inicial del programa de diferenciación
endocrino-pancreático. Este papel es independiente de cambios en la marca de
histonas represiva H3K27m3 y se asocia a una disminución de la deposición de la RNA
polimerasa fosforilada en Ser5 en la región promotora de los genes afectados.
Los reguladores de la marca represiva H3K27me3 participan en la actividad
transcripcional del factor proendocrino Neurogenina3.
La actividad proendocrina del factor de transcripción Neurogenina3 se asocia a la
pérdida de la marca represiva H3K27me3 en las regiones promotoras de sus genes
diana. Investigamos la relevancia de este cambio en la cromatina sobre la actividad
transactivadora de este factor. La inhibición de las demetilasas Jmjd3/Utx bloquea la
actividad transcripcional de Neurogenina3 en células en cultivo. Al contrario, la
inhibición de la metiltransferasa EZH2 permite un mayor grado de activación de los
genes diana de Neurogenina3.
Generación de células iPSC de dos pacientes con DT1.
A partir de biopsias dermales de dos pacientes con DT1 se obtuvieron clones de células
iPSC (uno por paciente) mediante tecnología de reprogramación retroviral clásica. Para
mejorar el potencial traslacional de estas células se hicieron nuevas reprogramaciones
con métodos no-integrativos, primero con virus tipo Sendai y luego mediante
electroporación con vectores episomales. Una vez caracterizados, todos estos clones se
han registrado en el Banco Nacional de Células.
Protocolo de diferenciación dirigida a célula β a partir de células
pluripotentes.
Hemos establecido un protocolo de diferenciación dirigida hacia células β a partir de
células pluripotentes que sigue cinco estadios secuenciales con una duración total de
21 días. El protocolo incluye modificaciones puntuales a protocolos publicados que
mejoran la eficiencia de formación de células β. Este protocolo funciona con células
madre embrionarias, células iPSC controles y células iPSC de DT1 (generadas en el
marco de este proyecto). La adición de inhibidores de la metiltransferasa EZH2 en el
estadio previo al estadio de formación de progenitores pancreáticos (estadio 3)
aumenta el número de células β al final del protocolo.
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Establecimiento de un protocolo de transdiferenciación de fibroblastos
humanos hacia células productoras de insulina.
Hemos establecido un protocolo de
transdiferenciación de fibroblastos hacia
células productoras de insulina basado en la
introducción de cinco factores de transcripción
que son importantes para la diferenciación y
funcionalidad de las células β. En un plazo de
10 días tras la introducción de los primeros
factores, se alcanzan niveles de expresión del
gen de la insulina del orden de 106 veces
sobre el control y unas 100 veces menor que
la expresión en islotes humanos aislados. No
solo se activa el gen de la insulina sino que
también se induce la expresión de genes de diferenciación y de genes marcadores de
células β diferenciadas. Estas activaciones génicas van acompañadas de la represión de
genes característicos de fibroblastos, confirmando así el cambio de linaje celular. Junto
a estas líneas se muestran imágenes de inmunofluorescencia con anticuerpos
específicos para insulina y péptido C (derivado del procesamiento de la proinsulina).
Puede observarse la tinción citoplasmática (en rojo) para estos dos marcadores en
fibroblastos reprogramados y no en fibroblastos controles. En azul se muestran los
núcleos celulares.
Los resultados derivados de este proyecto se han presentado en los siguientes
congresos:
EASD Islet Study Group: Beta-cell Regeneration and Genome Regulation. Sitges, 2013
Cervantes S, Fontcuberta Pi-Sunyer M, Tutusaus A, Sánchez L, Lee Y and Gasa R.
Exploring the potential role of Jarid2 in pancreatic endocrine cell formation
Congreso Anual de la Sociedad Española de Diabetes. Valencia, 2015
Fontcuberta Pi-Sunyer M, Cervantes S, García A, Sánchez L, Gomis R and Gasa R.
Uso the inhibidores epigenéticos para la mejora de la diferenciación endocrina in vitro
Annual Meeting of the European Association for the Study of Diabetes, Stockholm 2015
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Fontcuberta Pi-Sunyer M, Cervantes S, García A, Sánchez L, Gomis R and Gasa R.
Use of epigenetic inhibitors to modulate endocrine differentiation
Congreso Anual de la Sociedad Española de Diabetes. Barcelona, 2017
Fontcuberta Pi-Sunyer M, Cervantes S, Sánchez L, Soler A, Montserrat N, Novials A,
Gomis R and Gasa R.
Generación de celulas productoras de insulina a partir de cèlulas de la piel.
3. Relevancia y posibles implicaciones
Conseguir un control glucémico adecuado es un hito terapéutico básico en el
tratamiento de la diabetes. En este sentido, la terapia celular sustitutiva dirigida a
restituir la masa β perdida con nuevas células β sustitutas es una de las estrategias
más prometedoras que puede conducir a la curación definitiva de esta enfermedad.
Idealmente, las células sustitutas deberían poderse derivar a partir de fuentes celulares
de fácil obtención y renovables como podrían ser las células madre embrionarias o
células pluripotentes inducidas (iPSC) generadas a partir de fibroblastos. Aunque en los
últimos años se han producido grandes avances en el diseño de protocolos de
diferenciación dirigida a partir de células pluripotentes, los actuales protocolos son aún
ineficientes y las células β obtenidas son funcionalmente inmaduras. Nuestros
resultados sobre el uso de inhibidores de la metiltransferasa EZH2 y la función del
regulador epigenético Jarid2 abren la posibilidad de mejorar los protocolos aplicando
estos nuevos conocimientos.
Por otra parte, el uso de células iPSC generadas a partir de fibroblastos de piel del
propio paciente como fuente de células β para el trasplante abre la puerta a la
posibilidad de realizar autotrasplantes (el paciente recibe sus propias células),
evitándose así el riesgo de rechazo del injerto. A pesar de ello, emplear células que han
pasado por un estadio de pluripotencia lleva asociado el riesgo de tumorogénesis. En
este sentido, nuestro protocolo de reprogramación directa de fibroblastos de piel con
factores de transcripción endocrinos supondría una mejora, pues se evitaría tanto el
rechazo (trasplante autólogo) como el riesgo de tumores. Creemos que este
descubrimiento abre la puerta a investigar y optimizar protocolos de reprogramación
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directa como estrategia alternativa para generar células β sustitutas para la curación
de la diabetes.
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